Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Häiriöt nucleolus johtaa usein aktivoitumiseen p53 tuumorisuppressorin reitin estämällä MDM2 joka välittyy vähäisempiä ribosomien proteiinien kuten RPL11 ja RPL5. Vaikutukset ribosomaalisen proteiinin tappion viljellyissä nisäkässoluissa ei ole tutkittu perusteellisesti. Täällä luonnehtia solustressiä vasteen aiheuttaman ehtyminen ribosomaalisen proteiinin S9 (RPS9).

Menetelmät /Principal Havainnot

ehtyminen RPS9 heikentynyt tuotannon 18S ribosomaalisen RNA: n ja indusoi p53 aktiivisuutta. Se edistää p53-riippuvaista morfologiset erilaistuminen U343MGa Cl2: 6 glioomasoluihin osoituksena tehostettua ilmaus glial fibrillary hapan proteiini ja syvällisiä muutoksia solujen muoto. U2OS luusarkoomasoluissa näkyy rajoitetusti vanhenemista vastaus lisääntynyt ilmentyminen DNA-vaurioita vastaus markkereita, kun taas HeLa kohdunkaulankarsinooma solujen koki solukuolema. Knockdovvn RPL11 alentunut p53-riippuvaista fenotyyppejä eri RPS9 köyhdytettyä soluviljelmissä. Tärkeää on, knockdovvn RPS9 tai RPL11 myös inhiboivat merkittävästi soluproliferaatiota kautta p53-riippumattomien mekanismien. RPL11 sitoutuminen MDM2 säilyi huolimatta alentuneesta RPL11 proteiinin seuraavista nucleolar stressiä. Näiden asetusten RPL11 oli kriittinen säilyttämään p53-proteiinin stabiilius, mutta ei ehdottoman välttämätöntä p53-proteiinin synteesiä.

Päätelmät

p53 on tärkeä rooli alkuperäisen rajoittaa solujen lisääntymistä, joka tapahtuu vastauksena laski tasolle RPS9. Tuloksemme eivät sulje pois mahdollisuutta, että muut nucleolar jännitystä mittaava molekyylejä toimimaan ylävirtaan tai rinnan RPL11 aktivoida p53. Ekspression inhiboimiseksi tiettyjen ribosomaalisen proteiineja, kuten RPS9, voisi olla yksi tehokas tapa aloittaa uudelleen erilaistumista prosesseja tai aiheuttaa vanhenemista tai apoptoosin nopeasti lisääntyvien kasvainsoluissa.

Citation: Lindström MS, Nister M (2010) Silencing ribosomien proteiini S9 saa aikaan lukuisia soluvasteita kasvun estämiseksi syöpäsoluja jälkeen p53 Activation. PLoS ONE 5 (3): e9578. doi: 10,1371 /journal.pone.0009578

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 28 tammikuu 2010; Hyväksytty: 11 helmikuu 2010; Julkaistu: 08 maaliskuu 2010

Copyright: © 2010 Lindström, Nister. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tehtiin mahdollista taloudellista tukea ML Åke Wiberg perustukselle, Karolinska Institutet varat ja Magnus Bergvall n perusta. ML on vastaanottaja apurahan palkinnon Ruotsin Cancer Society (Cancerfonden). Työ suoritettiin laboratoriossa MN, jota Ruotsin Cancer Society, Cancer Society Tukholmassa, Ruotsin Research Council, Ruotsin Childhood Cancer Foundation ja Karolinska University Hospital FoUU. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ribosomi biogeneesin on monimutkainen prosessi, jossa satoja erilaisia ​​proteiineja yhteistyötä ribosomaalisen RNA: ta (rRNA) synteesi, käsittelyä, ribosomien alayksikköä kokoonpano ja liikenne [1]. Nucleoli ovat todellisia sivustoja ribosomien biogeneesin mutta nämä rakenteet ovat myös liitetty muihin solun prosesseissa, kuten valvonta solusyklin, virusreplikaation solusignaalivälitysteitä tumasta p53, ja kantasolujen erilaistumista, tarkistetaan viittaukset [1] – [4]. Viime vuosikymmenen aikana, välinen yhteys tuumorisuppressoriproteiinia p53, tumajyväseen, ja ribosomin biogeneesin on vakiintunut. Expression of hallitseva negatiivinen mutantit nucleolar proteiinin Bop1 johti vikoja rRNA käsittely liipaisu p53 aiheuttama solukierron pysähtymisen [5]. p53 usein aktivoituu, kun hiljentäminen of nucleolar tai ribosomaalisen proteiinit (r-proteiineja), ja esimerkkeihin sisältyvät RPL23 [6], RPS6 [7], nucleostemin, [8] ja TIF1A [9]. Lisäksi inhibiittorit rRNA synteesi tai käsittely kuten aktinomysiini D ja 5-fluorourasiilin myös aktivoida p53 [10]. Kollektiivisesti nämä ehdot kutsutaan nucleolar tai ribosomaalisen stressiä. Kiinnitys todisteita useista hiirimalleissa osoittaa olemassaolon tämän p53-riippuvaista tarkastuspiste

in vivo

. Yksi hiirimallissa paljasti, että ribosomin biogeneesin on heikentynyt sen jälkeen, kun ehdollinen poistettaisiin yksi alleelin

Rps6

[11]. Mielenkiintoista, alkion kuolleisuutta aikana tapahtuneet gastrulaation näissä

Rps6

+/-

alkioiden aiheutti p53-riippuvaisen tarkastuspiste kuin yleiseen lasku translaation kapasiteetin [11]. Rpl22 puutos selektiivisesti pidätettiin kehittäminen alfa /beeta-linjan T-soluja, nivasteeseen aktivoimalla p53: n [12]. Puolestaan ​​p53 menetys palautettu kehittämistä Rpl22-puutteellisia tymosyyttejä.

mutaatiot on löydetty eri r-proteiinien potilailla, jotka kärsivät oireyhtymä tunnetaan Diamond-Blackfan anemia (DBA, MIM # 105650), tunnettu siitä, viallisen erytropoieesin synnynnäisiä epämuodostumia ja lisääntynyt syöpäriski [13], [14]. Geenin

RPS19

usein mutatoitunut DBA [15], mutta mutaatioita on löydetty myös

RPS24

,

RPS17

,

RPL35A

,

RPL5

,

RPL11

, ja

RPS7

[16], [17]. Eläinmalleissa DBA on luotu hiirillä ja seeprakala [18], [19]. Todettiin, että menetys

Rps19

on alkion tappava [20].

Rps19

puute heikentää ribosomaalisen biogeneesiä ja aktivoi p53 seeprakala, ja tukahduttaminen p53 ja deltaNp63 voi lievittää Rps19 puutosta fenotyyppi tässä mallissa [18]. Menetys muut r-proteiinien seeprakala, kuten Rps8, Rps11 ja Rps18 myös käynnistänyt p53 vastaus [18]. Rooli p53 DBA jää epäselväksi, mutta on huomattava, että hiirillä mutaatiot

RpS19

ja

Rps20

on pieni punasolumäärät joka voidaan palauttaa p53 puutteesta [21].

Miten p53 aktivoituu seuraavat nucleolar stressi? Useat ryhmät ovat osoittaneet, että r-proteiinit (RPL11, RPL5, RPL23 ja RPS7) vapautetaan nucleolus stressin aikana ja sitten sitoa MDM2 siten aktivoimaan p53: n [6], [22] – [29]. Myöhemmin havaittiin, että lisääntynyt käännös 5 ’päätteen oligopyrimidine (TOP) mRNA: t, mukaan lukien

RPL11

, tapahtuu vasteena häiritsi ribosomaalisen 40S-alayksikön biogeneesin mikä johtaa kasvuun RPL11 tuotannon [30]. Todellakin, seuraavat menetys RPS6 tai RPL24 p53-tuumorisuppressorin on aktivoitu tavalla riippuvainen RPL11 [30], [31]. Vaikka vähentynyt kuvaamaan joitakin r-proteiinit voivat aktivoida p53 osana solustressiä vastaus, on myös selvää, että joitakin muita r-proteiineilla on suora ja tarkempia rooleja

p53

mRNA käännös. Haploinsufficiency alijoukko r-proteiinien seeprakala liittyy kehittämiseen pahanlaatuisten ääreishermoston tuppi kasvaimia [32]. Mielenkiintoista, nämä hermo tuppi kasvaimet eivät tuota p53-proteiinin, vaikka läsnäolo

p53

mRNA [33]. Lisäksi RPL26 on rooli parantaa

p53

mRNA käännös aikana DNA-vaurioita vastaus suoralla vuorovaikutus sekä MDM2-proteiinin ja

p53

mRNA [34]. Siten, r-proteiineilla on dynaamisempi rooleja säätelyssä p53 kasvain vaimennin reitin kuin aiemmin on luultu, tarkistetaan [35] – [37].

Äskettäin RPS9 tunnistettiin uutena B23 (NPM /nucleophosmin ) vuorovaikutuksessa proteiini [38]. Alentuneet RPS9 liittyivät kertyminen solujen G

1 /(G

0) ja p21 induktioon U2OS luusarkoomasoluissa [38]. Täällä esitetyt tutkimiseksi edelleen eri solun stressistä aiheutuvat aiheuttama menetys RPS9. Ehtyminen RPS9 aiheuttanut nopea menetys nucleolar proteiinin allas, heikentynyt kypsän 18S ribosomaalisen RNA: n ja aktivointi p53 tuumorisuppressorin kautta. Huomasimme, että yhdistelmä viallisen ribosomien biogeneesiä reitin ja p53 aktivaation tuloksena poikkeuksellisen vahva anti-proliferatiiviset vasteet ihmisen tuumorisolulinjojen että sille on Vanheneminen, erilaistumista tai apoptoosin seuraavia ehtyminen RPS9.

Tulokset

nopea ehtyminen Nucleolar RPS9 jälkeen siRNA transfektio

sulake r-proteiinien kanssa GFP on osoittautunut hyödylliseksi välineeksi paremmin visualisoida lokalisointi ja liikevaihdon r-proteiinien ihmisen soluissa [39], [ ,,,0],40]. U2OS solut, jotka ilmentävät RPS9-GFP oli aiemmin vahvistettu [38]. Näissä soluissa RPS9-GFP-fuusioproteiini on lokalisoitu nucleolus ja sytoplasmaan. Jotta ymmärtää paremmin dynamiikkaa RPS9 suhteessa pudotus fenotyyppejä, käytimme RPS9-GFP U2OS soluissa yhdistettynä RNA-interferenssi visualisoida knockdovvn RPS9 elävissä soluissa (kuvio 1A). Transfektio U2OS solujen RPS9 siRNA osoitti nopeasta kierrosta nucleolar RPS9-GFP. Jo 24 tuntia transfektion jälkeen suurin osa soluista oli silmiinpistävä menetys nucleolar RPS9-GFP (kuvio 1 B). 72 tuntia transfektion jälkeen, useimmat solut oli GFP-signaalin havaittavissa vain sytoplasmassa. Käyttäen immunoblottaus RPS9-GFP havaittiin yhtenä nauhana odotettua kokoa, joka väheni, kun siRNA transfektion kahdella eri RPS9 siRNA: t # 1 ja # 2, kun taas pudotus oligo # 0 on tehotonta verrattuna kontrolliin siRNA, siCtrl (kuvio 1C). Allas on sytoplasminen RPS9-GFP-proteiinia pysyi useita päiviä kanssa tunnetun vakauden nisäkkäiden sytoplasmisen ribosomien. Emme ole pystyneet täysin heikentävistä solujen sytoplasmisen GFP reaktiivisuus mikä saattaa johtua siitä, että hiljentäminen siRNA ei ole 100%, tai että täydellinen menetys RPS9 ei ole yhteensopiva kestävän solujen lisääntymistä. Edelleen vahvistaa solujen jakautumista RPS9, U2OS solut värjättiin vasta-aineen kanssa ihmisen RPS9, kuten on kuvattu [38], ja identtinen nucleolar ja sytoplasmista värjäytymistä havaittiin. Nucleolar allas endogeenisen RPS9 voitaisiin nopeasti ja tehokkaasti vaiennettu in U2OS soluissa samanlainen kuin RPS9-GFP (kuvio S1A), ja tämä vahvistettiin immunoblottauksella (kuvio S1B). Yhteenvetona, olemme saaneet täydellinen ja tarkka ehtyminen nucleolar RPS9 käyttäen siRNA.

(A) tehokkuus RPS9-GFP pudotus in U2OS soluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti RPS9-GFP, kun käytetään kolmea eri siRNA: iden kohdistaminen ihmisen RPS9. Kuvia ekspressoivien solujen RPS9-GFP otettiin 48 tunnin kuluttua. (B) Suhteellinen U2OS soluja, jotka ilmentävät havaittavissa RPS9-GFP tumajyväseen eri aikapisteissä transfektion jälkeen RPS9-1 siRNA tai siCtrl. (C) yhtä suuri määrä soluja kokeesta (A) kerättiin ja kokosolu- uutteet valmistettiin puskuriin, joka sisälsi 2% SDS: ää. Proteiini lysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblotattu spesifisten vasta-aineiden EGFP, PCNA, β-aktiini, ja RPL11 kuten kuvassa.

induktio Limited Vanheneminen vaste U2OS Cells

Häiriöt nucleolus nähdään usein altistuksen jälkeen solujen erilaisia ​​kemiallisia ja fysikaalisia tekijöitä, jotka estävät transkription tai rRNA käsittely [10]. Läheinen tarkastus nucleoli osoitti, että ne pysyivät koskemattomina vastauksena hoitoon siRPS9 suostumuksella tutkimuksissa RPS6 [11], [30]. Mutta, olemme huomanneet, että nucleoli vuonna RPS9 köyhdytettyä U2OS solut enemmän vastakkain, pyöreä, ja vaihe-tiheä kuin siCtrl käsitellyissä soluissa osoittaa uudelleenjärjestely nucleolar rakenteen (kuva S2A). Nucleolar tiheä fibrillar keskukset olivat muutaman solun uudelleen paikallistettu kehän nucleolus, joka käy ilmi värjäyksiä fibrillarin, merkkiaine tiheä säikeisen osastoon nucleolus. Nämä nucleoli muistuttivat laajentuneen nucleoli havaittu U2OS soluissa köyhdytetty nucleostemin [8], joka on nucleolar proteiini osallistuu ribosomien biogeneesissä [41].

knockdovvn RPS9 aiheuttama kerääntymistä solujen G

1 ja kasvatti tasot p21 U2OS soluissa [38]. Tarkempi tutkiminen solujen paljasti, että vain murto-näytössä melko ”vakava” fenotyyppi muistuttava vanhenemista kanssa törkeän laajeneva sytoplasmaan johtaa meidät tutkimaan tarkemmin tässä vaste (kuvio 2A). Ehtyminen RPS9 indusoi lisääntyminen ja γ-H2A.X positiivisia soluja ja soluja, ydin- pesäkkeitä fosfo-ATM /ATR alustan proteiineja (kuvio 2B ja C). Analyysi paljasti kasvua vanhenemista liittyvän β-galaktosidaasi-positiivisia (SA-β-gal) U2OS soluja 0,4% positiivisia soluja siCtrl soluissa, 7% vuonna siRPS9 transfektoiduissa soluissa (kuvio 2D).

(A ) Faasikontrasti- kuvia paljastaa morfologia ihmisen U2OS luusarkoomasolujen transfektoitu siRNA kohdistamista RPS9 tai p53. (B-C) Lisääntynyt ilmentyminen DNA-vaurioita ja replikointi stressin markkereita U2OS soluissa tyhjentynyt RPS9 ja analysoitiin 72 tunnin kuluttua siRNA transfektion. U2OS solut kiinnitettiin ja värjättiin vasta-aineella kohti γ-H2AX ja fosfo-automaatti /ATR alustan vasta-aine. (D) kvantifiointi SA-β-gal positiivisia U2OS solujen viljelmissä tyhjentynyt RPS9. Näkyy on yksi edustava koe kahdesta. (E) transfektoitiin siCtrl, RPS9, RPL11, p53 tai p21 siRNA kuten on osoitettu. Soluja inkuboitiin BrdU 24 tunnin transfektion jälkeen vielä 24 tuntia ja sitten solut kiinnitettiin ja värjättiin anti-BrdU-vasta-aineiden ja keskiarvo BrdU-positiivisia soluja on esitetty (%). (F) Co-ehtyminen RPL11, p53 tai p21 heikensi osittain RPS9 pudotus-välitteisen soluproliferaation inhibointi. U2OS solut transfektoitiin siCtrl, siRPS9, sip53, sip21 tai siRPL11 yhdistelminä kuten on osoitettu. Lopullinen pitoisuus siRNA oli 100 nM kussakin tapauksessa ja korvaukset tehtiin siCtrl. Solut laskettiin 72 tuntia transfektion jälkeen ja esitetty on keskiarvo ja SEM kolmesta eri kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena riippumattomina ajankohtina ja normalisoitiin siCtrl asetettu 100%. (G) Co-knockdovvn RPL11 heikennettyjä induktion p21 ja MDM2-proteiinien aiheuttamat knockdovvn RPS9. U2OS solut transfektoitiin yhdistelmiä siRNA kuten on osoitettu. Solulysaatit altistettiin immunoblottaus ja p53: n, MDM2, p21, RPL11, RPL5 ja RPS9 määritettiin kuten on osoitettu. Proteiini lysaatti kukin näyte on jaettu kolmelle eri pyyhkii ja kunkin tutkittiin aktiini latauskontrollina. (H) U2OS solut transfektoitiin siRPS9-1 tai siRPL11-2 48 tuntia tai käsiteltiin 5 nM aktinomysiini D: ssa 18 tuntia, jonka jälkeen solut kerättiin suoraan 2% SDS: ää, joka sisälsi hajotuspuskuria. Solulysaatit altistettiin immunoblottauksella käyttäen vasta-aineita kohtaan RPL11 tai RPS9 (w.c.e = kokosolu-uutetta). (I) Co-immuunisaostuksessa MDM2 ja RPL11 in U2OS transfektoiduissa soluissa siRNA kohdistaminen RPS9. MDM2 immunosaostettiin N20-vasta seurasi havaitseminen kanssa SMP14 monoklonaalisia tai monoklonaalinen kohti RPL11. Huomaa, että eri valotusaikoja käytettiin RPL11 IP ja panos blotteja. (J) U2OS solut transfektoitiin siRPS9-1 yksin tai yhdessä siRPL5-2 72 tuntia, jonka jälkeen solut kerättiin ja taso p21 kirjoitussuojattuna pois p53-aktiivisuus analysoitiin immunoblottauksella.

muodollisesti osoittaa roolin p53 välittämisessä eston U2OS soluproliferaation teemme yhteistyötä köyhdytettyä p53 ja RPS9 tuloksena paluuta Vanheneminen fenotyypin (kuvio 2A ja D). Lisäksi, RPL11, p53 tai p21 co-ehtyminen siRPS9-käsitellyissä soluissa lisäsi BrdU Näiden viljelmien 24 tuntia transfektion jälkeen (kuvio 2E), yhdistettynä pelastus Vanheneminen kaltainen morfologia (kuvio S3). Halusimme tietää, miten tämä ”paeta” G

1 pidätys liittyvät solujen kasvua pitkällä aikavälillä, joten tutkimme myös soluproliferaatiota myöhemmin piste. Olemme havainneet, että siRPS9 käsitellyissä viljelmissä oli kasvanut 36% (± 9,2), kun taas siRPS9 + sip53 käsitellyt solut olivat kasvaneet 52% (± 6,5) verrattuna siCtrl arvioituna 72 tuntia transfektion jälkeen (kuvio 2F). Hiljentäminen RPL11 palautettu solumäärän tasolle nähdään soluissa kotransfektoitiin siRPS9 ja sip53, mutta se ei voinut palauttaa solujen määrä kuin vuonna siCtrl kulttuureissa, joten siRPS9 + siRPL11 käsitellyt solut olivat kasvaneet 56% (± 4,4) verrattuna ja siCtrl (kuvio 2F). Tämä osoitti, että hiljentäminen RPS9 tai RPL11 indusoi myös solujen proliferaatio on p53-riippumattomalla tavalla. Tämä vahvistettiin heikentävien RPS9 vuonna Hyväksytty WI38- ja WI38–E6 fibroblastit sekä SAOS2 luusarkoomasoluissa puuttuu p53 (kuvio S1D).

asetus p53 Response laukaisema RPS9 tappio U2OS Cells

vähentynyt ilmentyminen RPS9 vuonna U2OS solut eivät merkittävästi muuta tasoa p53, kuten on esitetty aiemmin [38], mutta indusoi lisääntyminen p21-proteiini, joka oli riippuvainen p53 (kuvio 2G). Induktio p21 oli merkittävästi heikentynyt transfektoimalla solujen RPL11 siRNA (kuvio 2G). Knockdovvn RPL11 käyttää siRPL11-1 johtivat alhaisempi p53, MDM2, ja erityisesti p21, myös normaaleissa olosuhteissa U2OS soluissa (kuvio 2G, kaista 6). Mielenkiintoista, ehtyminen RPS9 johti alhaisempi NP40-liukoisen RPL11 (kuvio 2G, kaista 2), mutta osa RPL11 sitoutuneen MDM2 pysyneet samoina ja ei vähentynyt (kuvio 2I). Halusimme tietää, jos vähennys RPL11 myös voidaan nähdä kokosoluekstraktien ja siksi U2OS solut transfektoitiin siRPS9 tai inkuboitiin 5 nM: aktinomysiini D: ssa 18 tuntia. Tämä keskittyminen aktinomysiini D: salpaa selektiivisesti RNA Pol I toimintaa ja estää ribosomin biogeneesin. Voisimme vahvistaa saadut tulokset käytettäessä miedompi lyysipuskuria myös kokosoluekstraktien mikä osoittaa vähentynyt yhteensä tasoja RPL11 (kuvio 2 H). Useimmat tutkimuksista alalla ovat luottaneet hiljentäminen RPL11 käyttäen yhtä tiettyä siRNA joten löysimme sen tärkeää verrata RPL11 kanssa RPL5. Huomasimme, että ehtyminen RPL5 voisi estää p21 induktio identtinen RPL11 vuonna RPS9 köyhdytettyä soluissa (kuvio 2J). Hiljentäminen RPL11 kanssa morpholinos indusoi p53-riippuvaisen apoptoottisen vasteen zebrafish [42], ja siksi halua sulkea pois, että RPL11 ja RPL5 menetys voi jossain määrin aiheuttaa p53 toimintaa tai harjoittaa p53 liittyviä reittejä

in vivo

. Teimme myös toinen havainto kokeilun kuvassa 2G. Ensinnäkin knockdovvn RPL11 aiheutti laskun RPL5 proteiinin tasolla samassa määrin kuin RPL11 (kuvio 2G, kaista 6). Tämä johtuu oletettavasti siitä 28S rRNA ei tehokkaasti käsitellä RPL11 tai RPL5 vajaiden solujen [43] johtavat ylijäämään suuren alayksikön r-proteiineja, jotka hajottavat nopeasti [44]. Se on äskettäin osoitettu muiden ryhmien, että ehtyminen on yksi yksilö r-proteiinin yhden ribosomin alayksikköön tuloksia down-regulation muita proteiineja samasta alayksiköstä [45]. Tämä havainto saattaa olla joitakin vaikutuksia, miksi sääntelyä MDM2 useat ribosomaalisen proteiineja näyttää esiintyvän ei-turha tavalla, mutta tämä ei voi olla ainoa selitys, koska silloin olisimme löytää että knockdovvn lähes jokainen r-proteiini voi estää p53 vakauttaminen jota emme näe. Yhteenvetona voimme päätellä, että RPL11 tarvitaan tehokkaan induktion p53-riippuvaisen vasteet RPS9 depletoiduista U2OS soluja.

Onko RPL11 Tarvitaan p53-mRNA: n kääntäminen jälkeen Nucleolar stressi?

Miten RPL11 ohjaus p53? Sitovat RPL11 ja RPL5 suoraan MDM2-proteiinin johtaa vakauttamiseen p53 eston kautta MDM2 E3 ubiqutin ligaasiaktiivisuus [46]. Muitakin myös osoittavat kriittiset roolit r-proteiinien

p53

mRNA käännös [33], [47]. Lisäksi merkitystä vuorovaikutusta MDM2 ja RPL11 /RPL5 suhteen mahdollisista vaikutuksista

p53

mRNA käännös on pysynyt jokseenkin epäselvä. Tämä voisi olla merkitystä tutkia, koska MDM2 voi lisätä

p53

mRNA käännös on kuvattu esiintyvän joitakin asetuksia [48], [49]. Todellakin, ehdotettiin, että vuorovaikutukset RPL11 /RPL5 ja MDM2 voi palvella kahta tarkoitusta estävän MDM2 E3 ligaasiaktiivisuus sekä edistämään

p53

mRNA käännös samanaikaisesti [48], [49]. Toisaalta, MDM2 sitoutuu RPL26 ja estää RPL26 välittämän stimulaatio p53 mRNA käännös [15]. Siksi päätimme uudelleen vierailla p53 puoliintumisaika ja hajaantuminen ja tutkimaan

p53

mRNA käännös seuraavat nucleolar stressiä U2OS solujen ja ilman RPL11. Ensin suoritettiin p53-proteiinin puoliintumisaika määritys vahvistaa lisääntynyt vakaus p53 jälkeen pienellä annoksella aktinomysiini D: altistuminen aiheuttaa nucleolar stressiä. Itse asiassa, vankka määrän kasvu ja stabiilisuus p53-proteiinin havaittiin, ja olennaisesti hyvin vähän, jos ollenkaan, hajoamista p53 tapahtui aktinomysiini D: käsitellyissä soluissa neljän tunnin chase (kuvio 3A). Sen sijaan, suurin osa p53-proteiinin DMSO käsitelty kontrolli solut hajotettiin sen jälkeen, kun alle yksi tunti sykloheksimidiä (kuvio 3A). Sitten transfektoidut U2OS solujen valvontaa tai siRPL11 24 tuntia ja seuraavaksi käsiteltiin kaikki transfektanttien 5 nM aktinomysiini D: yössä seuraa CHX Chase. Ladataan säädettiin antamaan vertailukelpoinen laskentapohjaa p53 helpottaa suoraa vertailua. p53 oli selvästi epästabiili RPL11 köyhdytettyä U2OS soluja (kuvio 3B). Jäljellä vakaa p53 siRPL11 näytteissä myöhäisemmässä vaiheessa luultavasti johtuu populaatiosta solut, jotka ovat vastanneet aktinomysiini D, mutta joita ei ole transfektoitu siRPL11. Me seuraavaksi perusteltu, että pieniä molekyylejä, jotka häiritsevät p53-MDM2 sitova, estää MDM2 transkription tai estää p53 hajoamista proteasomista mikä aiheuttaa p53 kertymistä ”default” toimisi riippumattomana ribosomaalinen proteiini-MDM2. Siksi käsitelty U2OS solujen Nutlin-3. Nutlin-3 yhdiste häiritsee p53-MDM2, mutta ei estä sitoutumista MDM2 ja p53-mRNA: n [48], [49]. Olemme transfektoitujen solujen kahdella eri RPL5 siRNA oligoja: ssa yön yli, jota seuraa solujen käsittely 5 nM aktinomysiini D tai 10 uM Nutlin-3 vielä 18 tuntia (kuvio 3C). Kumpikin RPL5 siRNA: t voivat tehokkaasti inhiboida p53 kumuloitumista 5 nM aktinomysiini D, ja erityisesti induktio p21 laski (kuvio 3C, kaista 3 ja 4). Sen sijaan vaikutus p53 ja p21-proteiinin tasoa, kun tyhjentynyt RPL5 läsnä ollessa Nutlin-3 oli marginaalinen, kun normalisoitiin aktiini. Siksi RPL5 ei ollut tarpeen vakauttamiseen p53, sekä induktio MDM2 ja p21-proteiineja, in Nutlin-3 käsiteltyihin soluihin. Seuraavaksi me halusimme nähdä, jos muut pientä alayksikköä r-proteiinit myös RPS9 vaaditaan p53 vakauttamisen jälkeen aktinomysiini D hoidon. Me köyhdytettyä solujen RPS6, RPS9, RPS17 ja RPS24 mutta hiljentäminen näiden proteiinien eivät estä p53-proteiinin stabilointi aiheuttamia aktinomysiini D (kuvio 3D). Tämä osoittaa, että RPL11 mutta ei RPS9 on kriittinen rooli p53 vasteen aktinomysiini D-käsittely.

(A) U2OS soluja käsiteltiin 5 nM aktinomysiini D: ssa 18 tunnin ajan tai DMSO: ta, mitä seurasi vain sykloheksimidiä chase ( CHX) arvioida p53-proteiinin heikentyä. Solulysaatteja kunakin ajankohtana tehtiin immunoblottaus ja p53: n, joka määritellään suhteessa aktiini tasolle. (B) U2OS solut transfektoitiin siCtrl tai siRPL11 yön yli ja sen jälkeen käsittelemällä aktinomysiini D: vielä 18 tuntia. Tätä seurasi CHX Chase kuten edellä ilmoitettuina ajankohtina. Tässä tapauksessa kuormitus säädettiin vertailukelpoisia perusmääriä p53 helpottavia analyysi hajoaminen, joka on nopeampaa RPL11 transfektoiduissa soluissa. (C) U2OS-solut transfektoitiin siRNA: illa kohdistaminen RPL5 tai siCtrl. Soluja käsiteltiin sitten Nutlin-3 (10 uM) tai aktinomysiini D (5 nM) 18 tuntia. Blottauskalvoa koestettiin RPL5, MDM2, p53 ja p21. (D) väheneminen ribosomien proteiinien RPS6, RPS9, RPS17 ja RPS24 ei estä p53 keskittymisen ja p21 induktio seuraava aktinomysiini D: hoitoa, mutta ehtyminen RPL11 teki. U2OS-solut transfektoitiin ilmoitetuilla siRNA: ssa 18 tuntia, jota seuraa käsittely aktinomysiini D (5 nM) vielä 18 tunnin ajan ja ekspressiotasot p53 ja p21 mitattiin immunoblottauksella. (E) p53 synteesiä aktinomysiini D: käsitellyissä soluissa tai ilman siRPL11. Yhteensä p53 ja RPL11 näkyy immunoblottauksella ja syntetisoituneeseen p53 immunosaostettiin DO1 vasta-aineella ja visualisoitiin autoradiografialla. Koe suoritettiin 36 tunnin kuluttua siRNA transfektion. (F) Arviointi p53 mRNA: n translaation U2OS soluissa köyhdytetty RPL11, RPS9, RPS9 + RPL11, tai solut, joita käsiteltiin aktinomysiini D (5 nM) läsnä ollessa tai puuttuessa RPL11 siRNA. Esitetty on määrä juuri syntetisoidun p53 15 minuutin aikana suhteessa kokonaismäärään p53, ja kun yleinen proteiinin tasoa havaittuna Ponceau S: Koe suoritettiin 36 tunnin kuluttua siRNA transfektion.

Lisäksi halusimme tutkia synteesi uusia p53-proteiinin olosuhteissa, aktinomysiini D altistumisen tai sen jälkeen vaiennettu RPS9, läsnä ollessa tai poissa ollessa siRPL11. Leimasimme U2OS soluja 15 minuuttia ja käytettiin p53 immunosaostus seurata koko ja syntetisoituneeseen p53 mutta ei havainnut merkkejä siitä RPL11 tarvitaan p53 proteiinisynteesiä tässä kokeellisessa ympäristössä (kuvio 3E ja F). Marginaalinen kasvu uusien p53-proteiini näkyi aktinomysiini D: käsitellyissä soluissa (kuvio 3E), mutta tulkinta on vaikeaa, koska aktinomysiini D voi myös vakauttaa altaan juuri syntetisoidun p53, ja yleistä tasoa käännös oli hieman suurempi tämä näyte. Tulokset otetaan kaikki yhdessä tukevat käsitystä, että RPL11 pääasiassa ohjaa p53 at translaation jälkeistä tasolla ja että RPL11 ei ehdottoman välttämätöntä p53 synteesiin tässä nimenomaisessa kokeellinen asetus, vaan ylimääräinen vähäinen vaikutus p53 tuotantoa ei ole poissuljettu.

RPS9 hiljentäminen heikentää tuotanto 18S rRNA ja indusoi p53 glioomasoluihin

toistaiseksi useimmat tutkimukset ribosomaalinen proteiini-p53 signalointi on toteutettu U2OS soluissa ja se jää epäselväksi, jos, tai mitä määrin tämä säätelymekanismi toimii muissa solutyypeissä. Olemme havainneet, että endogeeninen RPS9 voitaisiin tehokkaasti vaiennettu in U343MG ja U87MG gliooma soluissa, kun taas mitään muutosta RPS9 ilmentyminen havaittiin U1242MG soluissa, kun siRPS9 transfektiota (kuvio 4A). Huomattavaa on, että on jo alhainen RPS9 käsittelemättömissä U1242MG soluissa. Selvä väheneminen solujen määrä käsitellyissä viljelmissä siRPS9 suhteessa siCtrl käsitellyissä viljelmissä nähtiin U87MG, U343MG, ja U343MGa Cl2: 6-soluissa, mutta ei U1242MG (kuvio 4B). Edelleen spesifisyys ohjaus, me vahvisti, että RPS9 siRNA oligonukleotidi ei ollut vaikutusta hiiren NIH3T3-solujen lisääntymisen, kun taas hiiren rps9 siRNA oligo tehokkaasti esti näiden solujen (kuvio S1C). Arvioida vaikutuksen RPS9 Knockdown synteesiin kypsän 28S ja 18S rRNA me merkitty Knockdown ja hallita U343MGa Cl2: 6 soluja [

3H] -uridine 2 tuntia ja tutki merkitty ja eristetty rRNA seuraavat geelielektroforeesi ja blottaus nailonmembraanille. Huomasimme, että RPS9 Knockdown kulttuureissa hyvin vähän kypsä 18S rRNA aikana tuotettiin merkintöjä aikana (kuvio 4C), mutta kaiken kaikkiaan RNA-synteesin edelleen (kuvio 4D). Aktinomysiini D (5 nM) salpasi tehokkaasti synteesiä ja merkintöjä rRNA (kuvio 4C ja D). Eräässä kokeessa käyttämällä [

3H] -L-metyyli metioniinin tilalla näytetään juuri syntetisoidun rRNA huomasimme, että tuotanto 18S rRNA oli selvästi heikentynyt (kuvio 4E). Oli hienoinen väheneminen uudessa synteesissä 28S rRNA. Lisäksi ehtyminen RPS9 in U343MGa 2CI: 6 solua laski yleistä sisällyttäminen [

35S] metioniinilla osaksi orastava proteiinia 30-50% (kuvio 4F). Mekanismi säilyttää rRNA synteesi korkealla tasolla huolimatta aktivointi p53 on vielä määrittämättä. Ehdottivat ohessa tämä saattaa olla yleinen kompensoivana vastauksena puute ribosomien [50].

(A) RPS9 Knockdown tehokkuutta glioomasolulinjoja U87MG, U343MG ja U1242MG määritettynä immunoblottauksella varten RPS9 suhteessa aktiini. (B) solulinjoja koe suoritetaan (A), ja U343MGa Cl2: 6 solua, jotka transfektoitiin siCtrl tai siRPS9-1 ja sen jälkeen 72 tunnin elävien solujen lukumäärä suhteessa siCtrl käsiteltyjen solujen asetettu 100%: iin määritettiin kustakin solulinjasta. Tässä määrityksessä yhtä monta solua maljattiin kolmena kappaleena päivänä 0, ja viljelmiä transfektoitiin päivänä 1, ja sitten ne trypsinoitiin ja laskettiin 72 tuntia myöhemmin. (C) Kokonais-RNA koetta (C) erotettiin 1%: isessa formaldehydi-geelillä, siirrettiin nailonkalvoille ja sille suoritettiin autoradiografia. Vasta syntetisoitu 18S rRNA ilmoitetaan, kun koko taso 18S rRNA siirretään kalvoon tehtiin näkyväksi metyleenisineä värjäystä. Aktinomysiini D lopullinen pitoisuus 5 nM, lisättiin 3 tuntia ennen merkitsemistä ja toimi kontrollina inhibition rRNA transkription. (D) U343MGa 2CI: 6-solut transfektoitiin siRNA: illa kuten on osoitettu, ja 72 tunnin jälkeen solut leimattiin [

3H] -uridine vielä 2 tunnin ajan. Radioaktiivinen inkorporaatio mitattiin käyttäen nestetuikelaskentaa ja ilmaistiin cpm /ug kokonais-RNA: ta ja sitten normalisoidaan tasoa siCtrl transfektoiduissa soluissa asetettu 100%. Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja ja SEM edustavat kolmea eri kokeessa. (E) U343MGa 2CI: 6, jotka on transfektoitu siRPS9-1 tai siCtrl 72 tuntia inkuboitiin [metyyli-

3H] -L-metioniini 2 tuntia merkitä juuri syntetisoidun rRNA esiasteiden seuraa eristäminen kokonais-RNA: ta. Yhtä suuret määrät koko RNA: ta seuraavan erotettiin 1% agaroosi- formaldehydigeelissä, siirrettiin nailonkalvoille, ja sille suoritettiin autoradiografia. Vasta syntetisoitu 18S rRNA näytetään (vasen paneeli) ja koko 28S ja 18S rRNA siirrettiin kalvolle tehtiin näkyväksi metyleenisineä värjäyksen (oikea paneeli). Tähdellä merkitsee ilmeistä kertyminen välissä rRNA esiaste. (F) U343MGa Cl2: 6 transfektoitujen solujen siRNA 72 tuntia kuten leimattiin [

35S] metioniinilla. Solut nälkään metioniinin ja kysteiinin 30 minuuttia ennen kuin lisättiin [

35S] metioniinilla. Sen jälkeen merkinnät 2 tuntia proteiiniuutoksia olivat valmiit. Radioaktiivinen inkorporaatio mitattiin käyttämällä nestetuikelaskennalla ja ilmaistiin cpm /ug kokonaisproteiinia ja normalisoidaan sitten ohjata solujen asetettu 100%. Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja ja SEM edustavat kolmea eri kokeessa.