Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kasvun pysähtymisen erityisiä transkripti 5 geeni

(

GAS5

) koodaa pitkä ei-koodaava RNA (lncRNA) ja isännöi useita pieniä nucleolar RNA: iden (snoRNAs), joka on äskettäin ollut mukana useiden solun prosessien ja syöpä. Täällä me tutkimme suhdetta DNA-vaurioita, p53, ja

GAS5

snoRNAs päästääkseen paremmin osaksi mahdollista roolia tässä lokuksessa solujen eloonjäämisen ja oncogenesis molemmat

in vivo

ja

in vitro

.

Methods

käyttää määrällisiä menetelmiä analysoida vaikutusta DNA vahinkoa

GAS5

snoRNA ilmaisun ja arvioida suhdetta p53 ja

GAS5

snoRNAs syöpäsolulinjoissa ja normaalissa, premaligneja, ja pahanlaatuisen paksu- ja kudosten ja käytetään biologisten menetelmien ehdottamaan mahdollisia roolia näissä snoRNAs että DNA-vaurioita vastaus.

tulokset

GAS5

-johdannainen snoRNA indusoitiin DNA-vaurioita p53-riippuvainen tavalla peräsuolen syövän solulinjoissa ja niiden tasot ei vaikuttanut Dicer. Lisäksi p53 tasot korreloivat voimakkaasti

GAS5

-johdannainen snoRNA ilmentymistä peräsuolen kudokseen.

Johtopäätökset

Kokonaisuudessaan nämä tiedot viittaavat siihen, että

GAS5

-johdannainen snoRNAs ovat hallinnassa p53 ja että niillä on tärkeä rooli välittämisessä p53 vastaus DNA-vaurioita, jotka eivät voi koskea niiden tehtävä ribosomin. Ehdotamme, että nämä snoRNAs ei käsitellä Dicer muodostaa pienempiä snoRNA johdettuja RNA: iden kanssa microRNA (miRNA) kaltaisia ​​toimintoja, mutta niiden tarkkaa roolia edellyttää lisäarviointia. Lisäksi koska GAS5 isäntä snoRNAs käytetään usein endogeenisten valvonta qPCR kvantitatiivinen osoitamme, että niiden käyttö taloudenhoito geenien DNA-vaurioita kokeet voivat johtaa epätarkkoihin tuloksiin.

Citation: Krellin J, Frampton AE, Mirnezami R, Harding V, De Giorgio A Roca Alonso L, et al. (2014)

Kasvu pidätys-Specific Transcript 5

Associated snoRNA Tasot liittyvät p53 Expression ja DNA-vaurioita peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (6): e98561. doi: 10,1371 /journal.pone.0098561

Editor: Raffaele A. Calogero, University of Torino, Italia

vastaanotettu: 28 helmikuu 2014; Hyväksytty: 05 toukokuu 2014; Julkaistu: 13 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Krell et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiittää Searlen Memorial (2005) hyväntekeväisyysjärjestönä Michael ja Lottie Hunter, Peter ja Marilyn Cooper, Steve Mobbs ja Pauline Thomas, ja Denise ja Edward Pincheson näiden anteliaasta tuesta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

snoRNAs ovat hyvin tunnettu luokka, ilmentyy kaikkialla, ei-koodaavat RNA: t (ncRNAs), jotka ovat 60-300 nukleotidin pituisia [1]. Pääosin sijaitsee nucleolus ne klassisesti toimivat opas-RNA: t että transkription jälkeisen kypsymisen ja muuttaminen ribosomaalisen RNA: iden (rRNA) ja snRNAs mukana silmukointiyksikkövälitteiseen. snoRNA opas sekvenssit hybridisoituvat spesifisesti niiden rRNA-sekvenssin, ja kautta yhdistyksille proteiineja, muodostavat pieniä nucleolar ribonukleoproteiini- komplekseja (snoRNPs) ja suorittavat tietyt rRNA muutokset [1]. Siksi snoRNAs ovat ratkaisevia ribosomin toiminnan ja tehokkaan sääntelyn kääntämisen ja siten yllättävää, ovat erittäin konservoituneita läpi evoluution [2]. On olemassa kaksi pääluokkaa snoRNAs, kutsutaan C /D laatikko snoRNAs ja H /ACA laatikko snoRNAs, vastaavasti. Ne eroavat toisistaan ​​niiden järjestys ja rakenne, niiden sitoutumispartnereihin ja luonne transkription jälkeisen muutoksia, että ne indusoivat [2], [3].

Eukaryoottijärjestelmissä genomeja, snoRNAs ovat pääasiassa koodattu intronit proteiini-koodaus isäntägeenejä mutta jotkut ovat valvonnassa itsenäisen promoottorien [4]. Ihmisillä, useimmat snoRNAs ovat introni ja yhteistyötä transkriptoidaan vastaanottavan geenitranskriptien ja käsiteltiin sitten pois leikatun intronit [5]. Kuitenkin transkription vähemmistön tapahtuu riippumattoman RNA-polymeraasi II tai III toimintaa samalla tavalla kuin monet miRNA [5], [6]. Läheistä sukua snoRNA perheenjäsenet ovat yleensä koodattu eri intronit saman isännän geenistä, mutta jotkut isäntä geenit koodaavat lukuisia etuyhteydettömille snoRNAs. Vaikka jotkut snoRNA isäntägeenejä näyttävät olevan ei-proteiini-koodausta, monet ovat mukana nucleolar toimintaa ja proteiinisynteesiä, ja siten on usein elementti yhteistyössä toimivan [5], [7]. Se seikka, että ihmisellä, useimmat snoRNAs on koodattu intronit proteiineja koodaavia ja ei-proteiinia koodaavan geenien johti olettamukseen, että nämä isäntägeenejä toimivat yksinomaan solujen Taloudenhoitajien kautta snoRNA-koodaavia sekvenssejä [8], [9 ]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat haastaneet tämän käsitteen ja ovat sekaantuneet snoRNAs ja niiden isäntägeenejä valvonnassa syövän synnyn ja solun kohtalon [10], [11]. Olemassaolo useiden ”orpo” snoRNAs ilman tunnettua rRNA tavoitteita, ja osoitus niiden läsnäolo subsellulaarisia muualle kuin nucleolus [12], tukee ajatusta, että tämä joukko pieniä ei-koodaavat RNA: t voivat säädellä muiden molekyylien ja on ylimääräisiä solutoiminnoille [13]. Lisäksi useat tutkimukset viittaavat kehittyvä suhde miRNA ja snoRNAs [14] ja muut raportoivat, että kypsät snoRNAs voidaan käsitellä edelleen soluprosessoinnissa muodostaa pienempiä snoRNA johdettuja RNA: t (sdRNAs) kanssa miRNA kaltaisia ​​toimintoja [3], [14] – [17]. Lisäksi snoRNA ilmentyminen on osoitettu olevan yhtä vaihteleva kuin miRNA ilmentymistä ihmisen kasvainnäytteestä ja normalisoida miRNA polymeraasiketjureaktio (PCR) ekspressiotietojen näihin snoRNAs vinoutuivat yhdistysten välillä miRNA ja tuloksista [18].

kasvun pysähtymisen-spesifinen transkripti 5

geenin (

GAS5

), joka sijaitsee 1q25, on ei-proteiinia koodaavan useita snoRNA vastaanottavan geeni, joka käsittää 12 eksonia [19], [20] perin havaitut seulonta potentiaalisten tuumorisuppressorigeeneille ekspressoidaan korkeilla tasoilla kasvun aikana pidätyksen. Ihmisillä se koodaa kymmenen introni C /D laatikko snoRNAs ja kaksi kypsän kauan kuin koodaavat RNA: t (lncRNAs) isoformit, jotka ovat peräisin vaihtoehtoisista 5′- silmukointidonori sivustoja eksonissa 7 [20]. Avoin lukukehys koodattu

GAS5

eksonit on lyhyt ja ei oleteta koodaa funktionaalista proteiinia. Kartoitus sen 5 * pää osoittaa, että sillä on jokin oligopyrimidine suolikanavan ominaisuus 5 * terminaalisia oligopyrimidine (5 * TOP) geeniluokassa aikana kertyviä solukierron pysähtymisen mutta nopeasti hajottaa nonsense välittämä hajoamisen aikana solujen kasvua. Luokittelu

GAS5

kuin 5 * TOP geeni tarjoaa selitystä siitä, miksi se on kasvun pysähtymisen tietyn transkriptin kun saumattu

GAS5

RNA liittyy normaalisti ribosomien ja nopeasti hajoavan, aikana pidätettiin solukasvun se kertyy mRNP hiukkasia. Mielenkiintoista on, että vain alueet säilyttämistä hiiren ja ihmisen välillä

GAS5

geenit ovat niiden snoRNAs ja 5 * end-sekvenssit [20] viittaa siihen, että nämä ovat tärkeimmät toiminnalliset osat. Vaikka

GAS5

on rooli transkription jälkeinen muutos ribosomaalisen RNA kautta snoRNAs, useat viimeaikaiset tutkimukset ovat sekaantuneet tämän geenin muita tärkeitä solun prosesseja [10], [18], [21], [ ,,,0],22]. GAS5 lncRNA on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa DNA-sitovan domeenin glukokortikoidireseptorin, jossa se toimii riborepressor, vaikutetaan solujen eloonjäämistä ja metabolisen toiminnan aikana nälkään moduloimalla transkriptionaalista aktiivisuutta tämän reseptorin [10]. Lisäksi sama ryhmä osoitti eturauhasen solulinjoissa, että GAS5 mRNA sequesters androgeenireseptorin /androgeenireseptorin monimutkainen ja estää sen sitoutumaan kohde-DNA-sekvenssit [10], joka on todennäköisesti tärkeä rooli moduloivan vaikutuksia androgeenien eturauhasen . GAS5 selostukset on myös osoitettu olevan tärkeitä säätelijöitä solun eloonjäämistä ja apoptoosia ihmisen T-soluissa ja rinta- ja eturauhassyövän solulinjoissa [21] – [23], ja niiden yli-ilmentyminen on herkistetty nisäkkään syövän solulinjat indusoijia apoptoosin [21] . Lisäksi, vähentynyt ilmentyminen GAS5 ja /tai sen snoRNAs on osoitettu pään ja kaulan okasolusyöpä [18], rintasyöpä [18], [21] ja glioblastoma multiforme [24], kun taas yli-ilmentyminen U44, U76 ja U78 on esitetty NSCLC [25]. Poikkeava

GAS5

ilmaisun osoitettu rintasyövän ja pään ja kaulan alueen syöpä oli yhteydessä huonoon ennusteeseen [18].

Huolimatta näistä tiedot, tiedetään hyvin vähän siitä, täsmällistä asemaa tiettyjen GAS5 snoRNAs vuonna reitit, jossa ne ovat sekaantuneet, ja vielä vähemmän hyväksytään noin mekanismeista niitä. Koska edellä kuvattu merkitys

GAS5

sääntelyssä apoptoosin ja hyvin dokumentoitu rooli p53 samassa prosessissa, pyrimme tutkia tarkemmin suhdetta p53 ja GAS5 snoRNAs saada tarkempi käsitys niiden mahdollinen rooli solujen eloonjäämisen ja oncogenesis kolorektaalisyövässä sekä

in vivo

ja

in vitro

. Lisäksi osoitimme, että molemmat U44 ja U47 GAS5 johdettu snoRNAs, jotka ovat joukossa yleisin snoRNAs käytetään taloudenhoito geeneistä normalisoinnin yhteydessä taqman miRNA ilmentymisanalyysiä ja olisi vältettävä DNA-vaurioita kokeita.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

eettinen hyväksyntä saatiin Imperial College eettiset Review board. Tutkimus suoritettiin mukaisesti Helsingin julistuksen ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ennen saamista kudosnäytteitä varten tutkimuksen.

kerääminen, käsittely ja RNA uuttamalla laser jää mikro-leikellään (LCM) kasvainnäytteestä

suostumuksella meidän Institutional Review board, kudosnäytteet vastaa tavanomaista koolonkudoksessa ja koolonadenokarsinoomasolulinjalla saatiin heti leikkauksen jälkeen, leikataan kappaleiksi, ja sitten formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Kirjallinen suostumus saatiin. Ennen mikrodissektion kahdeksan 8 um serial leikattiin (-25 ° C) samasta kudoksesta lohko ja asetettiin dioja (1 mm), jotka sitten parafiini värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Sitten ne microdissected käyttämällä PALM Laser Microbeam järjestelmän (P.A.L.M. Microlaser Technologies GmbH, Bernried, Saksa). Kokonaispinta-ala on 200000 um

2 oli mikro-leikeltiin kunkin dian. Kuvio 1 näyttää kuvia eri vaiheissa mikrodissektion prosessin. RNA uutettiin sitten mikro-leikeltiin näytteet RNeasy MinElute RNA: n eristäminen Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Ranska).

N = normaali paksusuoli, T = kasvain, A = adenooma. 1: hematoksyliinillä ja eosiini värjäystä; 2: alueet voidaan microdissected on merkitty; 3: dia seuraava mikrodissektion merkittyjen alueiden; 4: mikropaloitelluista kudoksen seuraava catapulting päälle sisäpuolelle eppedORF korkit.

kerääminen, käsittely ja RNA makrotaloudellista leikellään peräsuolen kudos

halusi tutkia onko suhde välillä vallitsi p53 aktiivisuuden ja ilmentymisen

GAS5

-snoRNAs ihmisen peräsuolen kudosten ja erityisesti peräsuolen kasvain näytteissä. Keräsimme pariksi näytteitä tuore peräsuolen kasvainkudoksessa ja vastaava normaali peräsuolen kudos 20 yksittäisille potilaille ja mitataan miR-34a ja snoRNA tasoilla ja p53 ilmentymistä näistä näytteistä. Yksilöitä normaali, adenomatoottisten ja pahanlaatuiset peräsuolen kudos saatiin yksilöiltä, ​​joille tehdään peräsuolen leikkauksen tai kolonoskopia vuosien 2011 ja 2013 St Maryn sairaalassa, London, UK. Kirjallinen tietoinen suostumus saatiin kunkin potilaan. Näytteet otettiin heti macrodissected aikaan leikkauksen, sijoitettu suoraan RNA

Myöhemmät

stabilointi liuosta (Qiagen, Hilden, Saksa), varastoidaan huoneen lämpötilassa 2-3 tunnin ajan, ja sitten pakastettiin -80 ° C: ssa. H 0,01) ja U47 (P 0,01) verrattuna käsittelemällä ohjaus ajoneuvoa, mutta ei ollut merkittävää muutosta tasoilla kuin

GAS5

-associated snoRNA U19 (kuva 2) tai snRNA U6, jotka eivät johtuvat GAS5 lokuksesta verrattuna GAPDH ilme (data ei esitetty). Doksorubisiini hoito ei merkittävästi lisää

GAS5

-johdannainen snoRNA ilmentymisen HCT116 p53

KO-soluja (kuvio 2), mikä viittaa siihen, että DNA-vaurion indusoima ilmentyminen

GAS5

-johdannainen snoRNAs vuonna p53-riippuvaisella tavalla. Doksorubisiini hoito HCT116 p53

WT-solut myös merkitsevästi lisääntynyt ilmentyminen miR-34a (P≤0.006), käytettiin positiivisena kontrollina, vaikka koko kertainen muutos vaihdella riippuen jossa pienet RNA valittiin normalisoida ekspressiotasot ja (Kuva 2 3). Sen jälkeen 24 tuntia doksorubisiinin hoidon miR-34a ilmaisun kasvoi merkittävästi 2,8-kertaiseksi ja 2,6-kertainen (P≤0.006 molemmille) kun tasot normalisoituivat U6 ja U19 vastaavasti. Vaikka silti tilastollisesti merkitsevä, kansi-muutokset miR-34a ekspressiotasot olivat huomattavasti pienempiä (1,9-kertainen; P 0,01), kun

GAS5

-peräisen snoRNAs U44 ja U47 käytettiin normalisointi (kuva 3). Samanlaisia ​​eroja ei havaittu, kun p21 käytettiin positiivisena kontrollina (tuloksia ei ole esitetty). Analyysi p53 kromatiinin immunosaos- sekvensointi (ChIP-kohdat) suoritetuissa kokeissa HCT116-soluissa [29] osoittaa, että läsnä on merkittävä huipun p53 vuorovaikutuksen kahdessa riippumattomassa kokeessa, joissa p53: n aktivaatio indusoi Nutlin3 tai 5’fluorouracil (5FU)), on samassa asennossa, noin 800 bp päässä GAS5 transkription aloituskohdan (TSS), mikä osoittaa, että p53 ohjaa suoraan GAS5 transkriptiota.

suhteelliset tasot (A) miR-34a, (B) U19 snoRNA, (C) U44 snoRNA ja (D) U47 snoRNA mitattiin RT-qPCR p53

WT HCT116 solulinjojen ja p53

KO HCT116 solulinjoja käsiteltiin joko doksorubisiinia (lopullisessa konsentraatiossa 0,2 ug /ml) tai ajoneuvon 24 tuntia. Tasot normalisoitiin U6 snRNA tasoa ja tiedot esitetään ajoneuvon suhteen käsiteltyjen solujen ± sem (kukin niistä suoritettiin kolmena rinnakkaisena, Studentin t-testi: * P 0,01, ** P≤0.006).

suhteelliset tasot miR-34a normalisoitu (A) U6 snRNA, (B) U47 snoRNA, (C) U44 snoRNA ja (D) U19 snoRNA mitattiin RT-qPCR p53

WT HCT116 solulinjojen ja p53

KO HCT116 solulinjoja käsiteltiin joko doksorubisiinia (lopullisessa konsentraatiossa 0,2 ug /ml) tai vehikkelillä 24 tuntia. Tiedot esitetään ajoneuvon suhteen käsiteltyjen solujen ± sem (kukin niistä suoritettiin kolmena rinnakkaisena, Studentin t-testi: * P 0,01, ** P≤0.006).

GAS5

-peräisen snoRNA ilme vaihtelee normaalin ja pahanlaatuisen peräsuolen raikas kuin mikropaloitelluista kudoksen p53-riippuvainen tavalla

Löysimme merkittäviä eroja ekspressiotasot

GAS5

-johdannainen snoRNAs välillä pariksi näytteitä tuore normaalin kolorektaalisen kudoksen ja paksusuolen ja peräsuolen kasvaimen samasta potilaasta (P 0,01; Kuvio 4). snoRNA tasot olivat merkitsevästi korkeammat kasvaimissa verrattuna vastaavaan normaaliin peräsuolen kudokseen 85% potilaan näytteistä, mutta olivat huomattavasti alhaisempi 15%. Ei ollut merkittävää eroa snRNA U6 tasojen välillä pariksi normaalin ja kasvaimen näytteitä. Mielenkiintoista, miR-34a-tasot olivat myös merkittävästi korkeampia potilaan tuumorinäytteissä verrattuna niiden vastaavassa normaalissa paksusuolen ja peräsuolen kudosnäytteiden (P≤0.0006; kuvio 4). Sitten mitattiin p53-ilmentymisen tasot pariksi normaalin kolorektaalisen kudoksen ja paksusuolen ja peräsuolen kasvaimen näytteitä käyttäen Western-blottauksella (kuvio 5A-C). p53-tasot olivat merkitsevästi korkeammat Kolorektaalituumorien verrattuna niiden vastaavassa normaalissa peräsuolen kudosnäytteistä (P 0,01, kuvio 5D).

rasiakuvaajan suhteellista ekspressiotasot miR-34a, U44 snoRNA ja U47 snoRNA välillä pariksi peräsuolen kasvain (T) ja normaalin peräsuolen (N) tuore kudosnäytteistä. (Studentin t-testiä * P 0,01, *** P≤0.0006).

(A B) Western blot: n osoittaa p53 tasot 10 ensimmäisen normaalin peräsuolen (A) ja peräsuolen kasvain ( B) kudosnäytteistä. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (C) Pystypylväskuvioissa osoittaa kertaiseksi muutoksia p53 ekspressiotasot esitetty Western-blotit (A B) normalisoitiin GAPDH ja lasketaan ImageJ ohjelmistoa. (D) rasiakuvaaja suhteellista ekspressiotasot p53 kaikkien 25 pariksi peräsuolen kasvain (T) ja normaalin peräsuolen (N) kudosnäytteistä (Studentin t-testillä * P 0,01).

käyttäminen samoista näytteistä, laskimme Pearsonin korrelaatiokertoimet, verrataan p53 ekspressiotasoja kanssa snoRNA U44 ja U47 tasolla, onko mitään suhdetta välillä oli

GAS5

-peräisen snoRNA tasoilla ja p53

in vivo

vuonna ihmisillä. Löysimme voimakas positiivinen korrelaatio p53 ekspressiotasot ja tasot molempien snoRNA U44 (Pearson korrelaatio = 0,64; R

2 lineaarisen = 0,41; p = 0,02) ja snoRNA U47 (Pearson korrelaatio = 0,69; R

2 lineaarinen = 0,49; P = 0,01) ja peräsuolen kasvaimen näytteissä (kuvio 6A). Olemme myös laskettu Pearsonin korrelaatiokertoimet verrata miR-34a ilmentymisen tasoja snoRNA U44 ja U47 tasolla, onko mitään suhdetta olemassa välisiä

GAS5

-johdannainen snoRNAs ja p53-säännelty miRNA ihmisillä. Tämä suoritettiin myös todistamaan tukemiseksi käytön miR-34a korvikemarkkerina p53 tässä yhteydessä ylimääräisiä kokeita käyttäen RNA peräisin mikropaloitelluista FFPE kudosnäytteistä, joissa p53 tasot eivät olleet mitattavissa Western-blottauksella. Mielenkiintoista, löysimme voimakas positiivinen korrelaatio miR-34a ekspressiotasot ja tasot molempien snoRNA U44 (Pearson korrelaatio = 0,73; R

2 lineaarisen = 0,53; p = 0,001) ja snoRNA U47 (Pearson korrelaatio = 0,66; R

2 lineaarisen = 0,43; p = 0,02) ja peräsuolen kasvain näytteissä (kuvio 6B).

Kaaviot, joissa Pearsonin korrelaatio analyysit suhde (A) p53 tasoja tai (B) miR-34a tasoa ja snoRNAs U44 ja U47 peräsuolen kasvain kudosnäytteistä (A B).

GAS5

-johdannainen snoRNA ilme vaihtelee normaalin, premaligneja ja pahanlaatuiset mikropaloitelluista FFPE peräsuolen kudos ja tasot korreloivat miR-34a ilmaisu

on herättänyt paljon keskustelua siitä tarkkuudesta RNA ja geeniekspressiotutkimuksissa jotka käyttävät ei-mikropaloitelluista kasvain näytteissä, koska mahdolliset vaikutukset että solukomponenttien ympäröivän strooman voi olla tasot mitataan molekyylin. Siksi tavoitteena oli suorittaa edelleen kokeita mikropaloitelluista kudosnäytteitä tukemaan tulosten yläpuolella. Keräsimme 60 parittomia FFPE peräsuolen kudosnäytteitä koostuu 20 normaalin limakalvon, 20 adenooma ja 20 kasvaimen yksilöitä. Me microdissected tarvittava osuudet jälkeen H 0,05, ** P≤0.006, *** P≤0.0005) . B, A Pearsonin korrelaatio analyysi suoritettiin määrittämään suhdetta miR-34a tasoa ja snoRNAs U44 ja U47 on mikropaloitelluista peräsuolen FFPE kasvain kudosnäytteitä.

Käyttäen samaa näytettä, meidän lasketaan sitten Pearsonin korrelaatiota kertoimet verrata miR-34a ekspressiotasot ja snoRNA U44 ja U47 tasolla määrittää, jos suhde osoitettu ei-mikropaloitelluista näytteiden välillä

GAS5

-peräisen snoRNA tasoja ja p53 (miR-34a käytetään tässä korvikemarkkerina p53) nähtiin myös mikropaloitelluista Kolorektaalituumorien. Löysimme voimakas positiivinen korrelaatio miR-34a ekspressiotasot ja tasot molempien snoRNA U44 (Pearson korrelaatio = 0,69; R

2 lineaarinen = 0,47) ja snoRNA U47 (Pearson korrelaatio = 0,67; R

2 lineaarinen = 0,45) ja peräsuolen kasvain näytteissä (kuvio 7B).

ilmentyminen

GAS5

-peräisen snoRNAs ei vaikuta kolorektaalisyövässä solulinjoissa, joissa Dicer on tippuu alas ja siksi eivät näyttävät käsiteltäväksi Dicer

ottaen huomioon kuvattujen havaintojen aikaisemmissa tutkimuksissa, jotka osoittivat, että snoRNAs voidaan muuntaa Dicer ja sdRNAs kanssa miRNA kaltaisia ​​toimintoja on mahdollista, että miRNA kaltaiset molekyylit tuotetaan GAS5 johdettu snoRNAs osallistuvat DNA-vaurioita vastaus [3]. Tutkimaan mahdollista osallistumista Dicer tähän prosessiin arvioimme vaikutusta Dicer knock alaspäin ilmaus

GAS5

-johdannainen snoRNAs seuraavat DNA-vaurioita. Tämän saavuttamiseksi käytimme RT-qPCR vertailla muutoksia ilmaus snoRNAs U44 ja U47 doksorubisiinin kohtelun peräsuolen syövän solulinjoissa DLD1 ja RKO niiden villityypin (WT) muodossa ja sellaisessa muodossa, jossa Dicer oli vakaasti pudotti (KD). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että vaikka Dicer knock-down johti tilastollisesti merkittävä väheneminen miR-34a tasoa (P≤0.006) sekä DLD1 ja RKO solulinjoissa, odotetusti, ei ollut vaikutusta tasoilla snoRNA U44 tai snoRNA U47 (kuvio 8), mikä viittaa siihen, että toiminta

GAS5

-johdannainen snoRNAs p53-säädellään vasteena DNA-vauriolle ei liittynyt niiden muuntaminen sdRNAs kanssa miRNA kaltainen toiminto.

Suhteellinen tasot U44 snoRNA (punainen), U47 snoRNA (sininen) ja miR-34a (violetti) mitattiin RT-qPCR in DLD1 Dicer

WT solulinjoissa, DLD1 Dicer

KD solulinjoissa, RKO Dicer

WT-solulinjat, RKO Dicer

KD solulinjoja käsiteltiin joko doksorubisiinia (lopullisessa konsentraatiossa 0,2 ug /ml) tai vehikkelillä 24 tuntia. Tiedot esitetään ajoneuvon suhteen käsiteltiin vastaavan solulinjoja (pisteviiva) ± sem (kukin niistä suoritettiin kolmena rinnakkaisena, Studentin t-testi: * P 0,01, ** P≤0.006).

keskustelu

Meidän tulokset osoittivat suhdetta p53 aktiivisuuden ja ilmentymisen

GAS5

-johdannainen snoRNAs kolorektaalisyövässä solulinjoissa ja ihmisen peräsuolen kudos. Lisäksi ne ehdottivat, että transkriptio

GAS5

geeni suoraan säätelee p53, vaikka kromatiinin immunosaostus tutkimuksia vaadittaisiin vahvistaa tämän. Vaikka ole toiminnallista ole tehty, nämä havainnot ehdotti tärkeä rooli

GAS5

-johdannainen snoRNAs p53-säänneltyjen soluvastetta DNA-vaurioita ja p53-liittyvä signalointireittien ihmisen peräsuolen kudosten ja peräsuolen syöpä .

Ennen Chang

et al.

(2002) [30] ensimmäinen kuvattu mahdollinen rooli snoRNAs kasvainten synnyssä, oli vain vähän perusteita järjestelmällisen arvioinnin roolin snoRNAs tässä tai mikä tahansa muu patologinen tila. Kuitenkin tiedot eduista, jotka viittaavat häiriöstä ilmaus eri snoRNAs kehittämiseen useita maligniteettien [11], [25], [31], [32]. Koska

GAS5

geeni isännöi kymmenen introni- snoRNAs ja lncRNA ja on liitetty onkogeneesiin ja säätelyyn solujen eloonjäämistä ja apoptoosin [21] – [23], ja koska hyvin dokumentoitu rooli p53 samassa prosessit, pyrimme tutkia tarkemmin suhdetta p53 ja GAS5 snoRNAs päästääkseen paremmin heidän mahdollinen rooli kasvainten synnyssä. Huomasimme, että peräsuolen syöpä solulinjoissa,

GAS5

-johdannainen snoRNAs indusoitiin p53-riippuvainen tavalla seuraavat DOX kannustanut DNA-vaurioita, mutta että tämä vaikuttaa ei jäänyt kun Dicer oli toiminnallisesti pudotettiin. Tämä viittaa siihen, että nämä snoRNAs ei jalostettu sdRNAs kanssa miRNA kaltainen toiminto, ja että niiden rooli DNA-vaurioita vastaus ei edellytä niitä käsitellä edelleen tällä tavalla. Tämä osoittaa, että nämä snoRNAs saattavat olla mukana koordinoinnissa p53-välitteisen vasteen kautta rooli säätelyssä ribosomin. snoRNAs ovat ratkaisevia ribosomaalista toiminnon ja tehokkaan sääntelyn käännös [2] ja p53 on keskeinen välittäjäaine ribosomin biogeneesin erityisesti vastauksena niin sanottua nucleolar stressi [33]. Lisäksi p53: n on osoitettu välittävän signalointi yhteyden ribosomin biogeneesiä ja solusyklin [34]. On loogista siksi, että

GAS5

-johdannainen snoRNAs saattaa suoraan indusoida p53-välitteisen transkription seuraavat DNA-vaurioita, jotta ”virtaviivaistaa” transkription jälkeisellä kypsymisen ja muuttaminen rRNA ja varmistaa tehokkaampi käännös geenien koordinoitava vastaus tällaiseen stressiä. Tämä teoria edellyttää selvästi vielä kokeellista arviointia ei vähiten osoittamalla, että kasvu lokalisoinnin näiden snoRNAs ribosomin kuin vaihtoehdon soluosastoon seuraavat DNA-vaurioita. On mahdollista, että nämä snoRNAs eivät toimi muussa paikassa kuin ribosomin ja että he voivat olla sdRNA tyyppinen toiminto, mutta eivät vaadi Dicer käsittelyä, jotta tätä. Olipa nämä DNA aiheuttaman vaurion

GAS5

-johdannainen snoRNAs yksinkertaisesti toimivat hoitamaan lisääntynyt geeni muuntamisessa ribosomin tai ovatko ne todellakin prosessoidaan sdRNAs ja on muita, itsenäinen toiminta, niiden vaikutus geenien ilmentymisen voitaisiin arvioida läpi yli-ilmentyminen kokeiluja seuraa geeni profilointi kokeita.