Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant histoni asetylaatio olennainen rooli neoplastisen prosessin kautta epigeneettiset vaiennettaisi tuumorisuppressorigeeneille (APT); Näin ollen, esto histonideasetylaaseja (HDAC) on tullut lupaava kohde syövän hoito. Tutkia korrelaatio histonien asetylointi kliinis ja TSG ilmaisun, tutkimme ilmaus asetyloitu H3 (AcH3), RARβ2, E-kadheriinin ja β-kateniinin immunohistokemiallisesti 65 kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma potilaille. Tuloksista ilmeni, että puuttuminen AcH3 oli suoraan yhteydessä huonoon histologisia erilaistumista ja solmukohtien etäpesäkkeitä sekä vähennetään /negatiivinen ilmaus RARβ2, E-kadheriinin ja β-kateniinin kliinisissä kasvain näytteissä. Olemme lisäksi osoittaneet, että kliinisesti käytettävissä HDAC-inhibiittorit valproiinihappoa (VPA) ja suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA), yhdistelmänä all-trans-retinoiinihappo (ATRA), voi voittaa epigeneettinen esteet transkription RARβ2 ihmisen kohdunkaulan syövän soluihin. Kromatiinin immunosaostusanalyysille osoitti, että yhdistelmähoito lisäsi rikastumista asetyloitua histoni että RARβ2-HARVINAINEN promoottorialueen. Näiden havaintojen arvioimme antituumorivaikutukset aiheuttamien yhdistetyn VPA ja ATRA hoitoa ksenograftimallia istutettu huonosti eriytetty ihmisen okasolusyöpä. Erityisesti VPA palautettu RARβ2 ilmaisun kautta epigenetic modulaatio. Lisäaine antituumorivaikutus tuotettiin tuumoriksenografteja yhdistämällä VPA kanssa ATRA hoitoon. Mekanistisesti yhdistelmähoitoa uudelleen ilmaisua Aitojen perinteisten RARβ2, E-kadheriinin, P21

CIP1

, ja P53 ja vähentää taso p-Stat3. Peräkkäin, säätelyä involukriinin ja loricrin, jotka osoittavat pääte erilaistumista, voimakkaasti vaikuttanut kasvaimen kasvun estäminen sekä osittain apoptoosin. Lopuksi täsmähoitoihin HDAC-inhibiittorit ja RARβ2 agonistit voivat edustavat uutta terapeuttista lähestymistapaa potilailla, joilla on kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma.

Citation: Feng D, Wu J, Tian Y, Zhou H, Zhou Y, Hu W , et ai. (2013) kohdentaminen Histonideasetylaasit aktivoida Kasvain synnyssä ja sen terapeuttista potentiaalia Human Kohdunkaulan syövän ksenograftimallissa. PLoS ONE 8 (11): e80657. doi: 10,1371 /journal.pone.0080657

Editor: Joseph Najbauer, Pécsin yliopisto Medical School, Unkari

vastaanotettu: 25 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 06 lokakuu 2013; Julkaistu: 19 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Feng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (30901606, 81001168,81072127, 81372779 ja 81372777) ja Anhui maakunnan Natural Science Foundation (110406M176 ja 110406M178). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että muutoksen jälkeen kromatiinirakenteeseen johtuva histoni asetylaatio voi olla tärkeä neoplastisen prosessin [1] – [3]. Asetylointi tila histonien määräytyy histonideasetylaasi (HDAC) ja histoni asetyyli transferaasi (HAT). Syöpä kehitys johtuu geneettisiä ja epigeneettiset muutokset solutasolla, jotka aktivoivat ja inaktivoivat oncogenes ja tuumorisuppressorigeeneille (APT), vastaavasti [4]. Transkription hiljentäminen by histoni deasetylaation on yksi vakiintunut mekanismit TSG inaktivaation [1], [5] – [7]. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että deacetylated histones at promoottorialueita tukahduttaa ilmaisun Aitojen perinteisten, kuten

retinoblastoomaa

[8], retinoiinihappo-happo-reseptorin β (

RARβ

) [9],

p21

[10],

p53

[6],

p16

[11],

E-kadheriinin

[5], ja monet muut. Täten inhibition HDAC-entsyymien on laajalti hyväksytty, koska strategia muuntavan geenin ilmentymisen kautta histonien hyperasetylaation indusoitumisen ja uudelleen ilmentymisen vaiennettu APT.

Kaikista APT, RARβ2, ja E-kadheriinin on keskeinen rooli modulaatio solujen kasvua ja erilaistumista sekä terveillä ja pahanlaatuisten solujen [9]. Kyky retinoiinihapon toimia chemopreventive aine helpottaa ensisijaisesti sen vuorovaikutus RARβ2 [9], [12]. E-kadheriinin on solujen välinen adheesiomolekyyli epiteelisoluissa, joka sitoutuu P-kateniinin muodostaen kompleksin, jolla on tärkeä rooli ylläpitää morfologiset eheyden normaalin epiteelin [13], [14]. Tutkimukset kasvaimia ovat johdonmukaisesti osoittaneet, että downregulation RARβ2 on ratkaiseva tapahtuma maligniteetti ja että myöhemmät poikkeava ilmentyminen E-kadheriinin /β-kateniinin komplekseja korreloi muuntaminen varhaisvaiheen kasvaimet osaksi invasiivisia syöpäsairauksia [15], [ ,,,0],16]. Menetys RARβ2 ilmentymisen kasvainsoluissa syyksi on vaiennettaisi geenin promoottorialueen kautta histonien deasetylointi ja hypermetylaatiota. Siksi käyttöä HDAC-inhibiittorit, joko yksin tai yhdessä DNA-metyylitransferaasin (DNMT) estäjiä, on osoitettu palauttaa transkription ja kasvua sääteleviä vaikutuksia ja RARβ2 [9], [17], [18]. Meidän edellinen työ on paljastanut, että yhdistelmä valproaatti (VPA), kliinisesti saatavilla HDAC estäjä, ja all-trans retinoiinihappo (ATRA) edistää synergiavaikutuksia uudelleenaktivoinnissa lepotilassa RARβ2 ja voimakkaasti estämällä kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua

in vitro

ja

in vivo

edistämällä erilaistumisen kautta PI3K /Akt-reitin [19]. Kuitenkin tietojemme mukaan korrelaatio histonien asetylointi ja TSG ilmentymistä ihmisen kohdunkaulansyövän kudosnäytteet ja mahdollinen hyödyntäminen histoni asetylaatio kohdistetuissa syövän hoitona ei ole täysin selvitetty. Tässä tutkimuksessa selvitettiin histoni H3 asetylaatio ja TSG ilmaisun kohdunkaulan syövän ja sen yhdessä kliinis parametreja. Lisäksi arvioimme terapeuttista potentiaalia HDAC estäjä VPA yhdistettynä ATRA hoidettaessa -tuumoriksenografti malli on peräisin ihmisen kohdunkaulansyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tämä tutkimussuunnitelma hyväksyi eettisen komitean Anhui Medical University. Parafiini-sulautettujen potilaan kudosnäytteistä, joita käytetään tässä tutkimuksessa saatiin, kuten on kuvattu edellisessä raportissa [20]. Syöpä kudoksia istutettavien hiiret saatiin potilailla, joilla on kohdunkaulan syöpä. Kirjallinen tietoinen suostumus saatiin kunkin potilaan. Hyväksyntä

in vivo

kokeita, joissa käytetään eläimiä myönsi komitea käytön ja hoidon Animals Anhui Medical University.

Potilaat ja näytteet

Formaliinifiksoidusta parafiini- upotettu näytteet peräisin kohdunkaulan solumuutoksia 65 potilaalla diagnosoitiin kohdunkaulan levyepiteelisyövän vedettiin arkistoista patologian osaston Anhuin maakunnan sairaala sidoksissa Anhui Medical University aikana 2002 2008. kliinistä vaihetta määritettiin kaksi sertifioitu gynekologit mukaan muutetun International Federation of Naistenklinikka Obstetrics (FIGO järjestelmä) kohdunkaulan syövän julkaistiin 2000. kasvaimet luokiteltiin myös – kohtalaisesti tai huonosti eriytetty – vähintään kaksi patologit perusteiden mukaisesti ehdottamat Maailman terveysjärjestö. Yksityiskohtaiset kliinis tiedot on esitetty taulukossa 1. Kaikkia potilaita hoidettiin radikaali kohdunpoisto. Kukaan potilaista ei ollut saanut mitään kasvainspesifisiä hoito ennen kirurginen.

Soluviljely ja käsittely

Ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjoissa HeLa, SiHa-, CaSki-, ja C33A hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) ja niitä viljeltiin DMEM: ssä (Gibco, USA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Gibco). VPA (Sigma-Aldrich, USA) liuotettiin PBS: ään ja sitä käytettiin lopullisessa konsentraatiossa 3 mmol /l. SAHA ja ATRA ostettiin Sigma-Aldrich, liuotettu DMSO: hon, ja niitä käytettiin lopullisissa konsentraatioissa 10 umol /l ja 1 umol /l, vastaavasti. Soluja käsiteltiin joko VPA tai SAHA yksinään tai yhdessä ATRA 48 tuntia. Ohjaus-soluja käsiteltiin pelkästään vehikkelillä.

immunohistokemiallinen värjäys ja arviointi immunoreaktiivisuus

Parafiini lohkojen kasvaimet leikattiin 5

μ

m viipaleiksi ja käsitellään sitten käyttäen vakiintuneita deparaffinisation ja nesteytys tekniikoita. Endogeeniset peroksidaasit blokattiin käyttäen 3% vetyperoksidia. Antigeenin haku, levyt käsiteltiin mikroaaltokuumennuksella 0,01 M natriumsitraatti (pH 6,0). Levyjä esi-inkuboitiin 5% vuohen seerumia TBS: ssä (pH 7,6), ennen kuin ensisijaisen vasta-aineita lisättiin. Seuraavat ensisijainen vasta-laimennoksia käytettiin: 1:100 varten asetyloitua histoni H3 (Santa Cruz, USA), 1:100 varten RARβ2 (Santa Cruz), 1:50 E-kadheriinin (Abcam, UK), 1:100 varten β kateniinin (Abcam), 1:100 varten involucrin (Santa Cruz), 1:500 varten loricrin (Abcam), ja 1:200 varten Ki67 (Boster, Kiina). Sitovat Primaaristen vasta-aineiden visualisoitiin käyttäen ChemMate Detection Kit (Boster). Objektilasit kevyesti vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä 30 sekunnin ajan.

Immunoreaktiivisuus semikvantitatiivisesti arvioitiin pohjalta värjäystä intensiteetin ja levitys immunoreaktiivisuus pisteet seuraavasti: intensiteetti pisteet × osuus pisteet [16], [21]. Intensiteetti pisteet määriteltiin 0, negatiivinen; 1, heikko; 2, kohtalainen; tai 3, vahva, ja osuus pisteet määriteltiin 0, negatiivinen; 1, 10%; 2, 11-50%; 3, 51-80%; tai 4, 80% positiivisia soluja. Kokonaispistemäärä vaihteli 0 12. Immunoreaktiivisuus jaettu kolmeen tasoon perusteella lopullinen pistemäärä: negatiivinen immunoreaktiivisuus määriteltiin-pisteet 0; alhainen immunoreaktiivisuus määriteltiin yhteensä pisteet 1-4; ja korkea immunoreaktiivisuus määritettiin kokonaispistemäärä yli 4. värjätään tuumorikudokset tekee kaksi tutkijaa, jotka olivat sokaissut kliinisten tietojen.

RNA: n eristys ja reaaliaikaisen PCR kvantifiointiin

yksi mikrogramma kokonais-RNA, joka uutettiin kudoksista, muutettiin cDNA: ksi käyttäen Superscript III käänteistranskriptaasia (TaKaRa, Japani). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR) määritykset suoritettiin käyttäen 50 ng cDNA: ta, spesifisiä alukkeita (taulukko 2) SYBR®

Esiseos Ex Taq

™ Kit (TaKaRa), ja Opticon® 2 real- PCR instrumentti (MJ Research, USA). Geeniekspression tasot määritettiin käyttämällä standardikäyrää menetelmä ja ilmaistu suhteessa GAPDH ilmentymisen.

Vasta-aineet ja immunoblottaus

Asetyloitu histoni H3 (AcH3, 1:500), RARβ2 (1 :500), ja involucrin (1:500) vasta-aineet hankittiin valmistajalta Santa Cruz Biotechnology. Stat3 (1:1000), p-Stat3 (1:2000), P21 (1:1000), ja GAPDH (1:2000) vasta-aineet saatiin Cell Signaling Technology. E-kadheriinin (1:500), β-kateniinin (1:5000), ja loricrin (1:2000) vasta-aineet ostettiin Abcam. P53 (1:500), kaspaasi-3 (1:1000), ja Bcl-2 (1:200) vasta-aineet on saatu Boster Technology. Proteiini valmistettiin kudoksista kit (# 89900, Thermo, USA) käsin, paitsi lisäämällä happouuttovaiheen varten histonien [19]. Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF), ja tutkittiin, jossa on esitetty ensisijaisen vasta-aineita. Inkubointi lajikohtaisia ​​sekundaarisia vasta-aineita (Cell Signaling) suoritettiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Blotit kehitettiin kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo), ja autoradiografia suoritettiin X-OMAT kalvon (Kodak, Rochester, NY).

Kromatiini immuunisaostustesti

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) suoritettiin käyttämällä EZ-chip Assay kit (Millipore, USA) ja siru-luokan vasta-asetyloitua histoni H3 (H3K9ac, Abcam). Lyhyesti, kohdunkaulan syövän soluja viljeltiin 150 mm: n viljelymaljoilla. Solut käsiteltiin sitten joko VPA (3 mmol /l) tai SAHA (10 umol /l) yksinään tai yhdessä ATRA (1 umol /l) 48 tuntia. Sitten solut silloitettu 1% formaldehydiä 10 min huoneen lämpötilassa, ja reaktio pysäytettiin 0,125 M glysiiniä. Solut kaavittiin, suspendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin (1% SDS, 10 mM EDTA, ja 50 mM Tris-HCl, pH 8,1) täydennettynä proteaasinestäjä cocktail jäällä, ja sonikoitiin, jolloin saatiin DNA-fragmentteja 200-1000 bp pitkä , mikä vahvistetaan elektroforeesilla 1% agaroosigeeleillä. Leikatut DNA sentrifugoitiin 12000 x

g

4 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja supernatantti otettiin talteen. Kymmenen prosenttia supernatanttia varattu käytettäväksi tulon DNA ja käsitellään edelleen käytettäväksi positiivisena kontrollina. Liukoinen chromatin immunosaostettiin yli yön anti-H3K9ac vasta-aine. Immunosaostetun kromatiinin kompleksi otettiin talteen käyttäen proteiini-G-agaroosin helmiä, ja ristisidoksia kääntyi lisäämällä NaCl lopulliseen konsentraatioon 200 mM 65 ° C: ssa 5 h. DNA puhdistettiin käyttämällä spin sarakkeet mukana Kit. DNA-näytteet, sekä käsiteltävien materiaalien ja mock immunosaostus näytteitä, käytettiin templaatteina semikvantitatiivinen ja reaaliaikainen PCR määrittää suhteellinen rikastuminen RARβ2-RARE promoottori. Alukkeet RARβ2-RARE promoottori on esitetty taulukossa 2.

implantaatio alkuperäinen ihmisen tuumorin hiirissä ja lääkehoidon

neljä viikkoa vanhoja naaraspuolisia BALB /c-nude-hiiriä hankittiin laboratoriosta animal Center of Kiinan Academy of Science (Shanghai, Kiina) ja ylläpidetään patogeenittomassa eläin järjestely 1 viikko ennen käyttöä. Kohdunkaulan syöpä mallin huonosti eriytetty okasolusyöpä, joka vahvistettiin histologia, saatiin tietoon perustuvan suostumuksen peräisin potilaasta leikkaus 1 tunnin kuluttua kohdunpoisto. Näyte pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,4), joka sisälsi 10000 U /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä, ja sitten leikattiin pieniksi paloiksi noin 2-4 mm

3 istutusta. Nämä pienet kudosblokeista istutettiin ihonalaiseen kudokseen kolme nude-hiiriin dorsum avulla troakaarin.

jälkeen 6-8 viikkoa, osa kasvaimen kyhmyjä, jotka on kehitetty leikattiin steriileissä olosuhteissa. Tämä yksilö oli heti jaettu pieniksi paloiksi ja ruiskutettiin muihin paljaisiin hiiriin. Kun kouraantuntuva kasvaimia perustettiin, 20 hiiret sijoitetaan satunnaisesti neljään ryhmään: kontrolli, VPA, ATRA, ja yhdistelmä. VPA laimennettiin 0,9% natriumkloridia, vaikka ATRA liuotettiin puhdistettuun seesamiöljy. Hiirille annettiin VPA (300 mg /kg /d) ja /tai ATRA (15 mg /kg /d) päivittäin intraperitoneaalisesti (i.p.) ja (i.g.) letkuruokintaneulan, vastaavasti. Kontrolliryhmä sai pelkkää vehikkeliä noudattaen samaa aikataulua. Kasvaimen tilavuus mitattiin mikrometrillä kahdesti viikossa, ja se lasketaan seuraavan kaavan mukaisesti: (pituus x leveys

2) /2. Eläimiä hoidettiin 4 viikkoa ja lopetettiin sitten. Kasvaimet kerättiin ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä patologista arviointia tai pakastetaan nestetyppeen PCR, siru, ja immunoblottauksella analyysi yhtä kasvainten massa kirjattiin. Kasvaimen kasvun estäminen (TGI) laskettiin vähentämällä 100% keskiarvosta kasvaimen massa /tarkoita ohjaus syöpäkasvain x 100%.

TUNEL määritys

Kun vastaanottamisen kunkin tuumorinäytesylinterin, eli pieni osa kasvain kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja upotettiin parafiiniin. Jälkeen deparaffinization, leikkeitä pestiin ja läpäiseviksi 5 min jäillä 0,1% Triton X-100, ja sitten niitä inkuboitiin proteinaasi K: n (Sigma-Aldrich) 10 min ajan huoneen lämpötilassa. TUNEL värjäys suoritettiin käyttäen

in situ

apoptoosin-havaitseminen kit (Keygene Technology, Kiina), mukaan valmistajan suuntiin. Kohdat peitettiin TUNEL merkintöjä reaktioseos (tasapainotuspuskurilla, biotiini-11-dUTP, TdT entsyymi) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h kosteuskammiossa. Leikkeet vielä leimattu streptavidiini-FITC pimeässä 30 min. Sen jälkeen counterstaining DAPI (2 ug /ml), Tunel-positiiviset solut laskettiin fluoresenssitulosten kuvaa otettu 10 satunnaisesti kenttien 200 x suurennus.

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS ohjelmistopaketti (versio 13, SPSS Inc., USA). Korrelaatio kliinis parametrien ja immunohistokemiallista dataa arvioitiin käyttäen chi-neliö testi tai Fisherin testiä. Välisen assosiaation ilmentymisen AcH3, RARβ2, E-kadheriinin ja β-kateniinin analysoitiin käyttäen chi-neliön testi lineaarisen trendin. Välinen tarkkailija yhteneväinen immunoreaktiivisuus pisteet kahden tutkijaa arvioitiin κ-tilastoihin. Mukaan Fleskens [22], κ-arvot 0,20 osoittaa huonoa sopimusta; +0,21-+0,40 Oikeudenmukaisen sopimuksen; 0,41-0,60 maltillinen sopimus; 0,61-0,80 hyvä sopimus; ja ,81-+1,00 erinomainen sopimus. ANOVA käytettiin analysoida tilastollisesti merkitsevä suhteellinen rikastuminen RARβ2 promoottorin siru määrityksessä ja

in vivo

ksenograftimalleissa.

P

-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

kliinis ominaisuudet

yhteensä 65 tapausta ensisijaisen kohdunkaulan levyepiteelisyöpä syöpä analysoitiin. Heidän kliinis ominaisuuksia, kuten kasvain eriyttäminen, lavastus tiedot ja solmukohtien etäpesäkkeitä, tarkistettiin ja on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

Association of kliinis muuttujiin ekspressiotasot AcH3, RARβ2, E-kadheriinin ja β- kateniinin

edustavat tulokset meidän immunohistokemiaa analyysi AcH3, RARβ2, E-kadheriinin ja β-kateniinin on esitetty kuviossa 1. normaalin kohdunkaulan epiteelin, kaikki neljä parametreja, jotka värjäytyivät positiivisesti soluissa suprabasaalisissa tyvikerrokseen, jossa erillinen ilmentyminen AcH3 ytimet, RARβ2 sytoplasmassa ja ytimet, ja E-kadheriinin ja β-kateniinin pääasiassa kalvon (kuvio 1). Vuonna syöpäkudoksen, immunoreaktiivisuus intensiteetti näiden neljän parametrin oli vahvaa hyvin eriytetty kasvaimia ja vähennetään kohtuullisesti erilaistunut karsinooma, heikot tai negatiivinen merkintöjä huonosti eriytetty karsinoomia (kuvio 1A).

(EN) vasen paneelit osoittavat kohdat normaalista kohdunkaulan kudoksesta. AcH3 värjäytyminen oli vahvaa kasvainsolujen hyvin eriytetty karsinoomia. AcH3 ilmentyminen väheni tai poissa kohtalaisen ja huonosti eriytetty karsinoomat, vastaavasti. Samanlaisia ​​ekspressiokuvioiden havaittiin värjäytymisen RARβ2, E-kadheriinin ja β-kateniinin. (B) oli huomattavia eroja immunoreaktiivisuus pisteet AcH3, RARβ2, E-kadheriinin ja β-kateniinin keskuudessa hyvin, kohtalaisesti, ja huonosti eriytetty levyepiteelikarsinoomia.

immunohistokemiallinen värjäys pisteytettiin kaksi tutkijaa. Taulukossa 3 esitetään välistä yhdenmukaisuutta kaksi tutkijaa varten kolme tasoa immunoreaktiivisuus AcH3, RARβ2, E-kadheriinin ja β-kateniinin. Vertailtaessa tuloksia käyttämällä κ-tilastot osoittivat erinomaista sopimuksen RARβ2 ja E-kadheriinin pisteytys (κ = 0,840, 0,876) ja hyvä sopimus AcH3 ja β-kateniinin pisteytys (κ = 0,710, 0,657). Yleinen κ-arvo oli 0,778 (hyvä sopimus), mikä osoittaa, välistä yhdenmukaisuutta immunoreaktiivisuus tulokset antamat kaksi tutkijaa.

välisiä suhteita kliinis ja immunoreaktiivisuus pisteet AcH3, RARβ2, E- kadheriinin, ja β-kateniinin esitetään taulukossa 1. mitään tilastollisesti merkittäviä eroja suhteessa ikään tai kliiniseen vaiheeseen näiden neljän parametrit. Ilmaisulla näistä neljästä parametrien osoitti merkittävää korrelaatiota histologisia erilaistumista (

P

0,01) ja solmukohtien etäpesäkkeitä (

P

0,01) (taulukko 1). Jakaumat positiivisesti värjättyä kasvainsolujen funktiona immunoreaktiivisuutensa tulokset potilaan näytteissä esitetään kuviossa 1B. AcH3, RARβ2, E-kadheriinin ja β-kateniinin ilmaisu korreloi positiivisesti histologinen eroavuus (r = 0,737, 0,531, 0,574, ja 0,549, vastaavasti,

P

0,01) (taulukko 1). H3 asetylointi, 94,4% (17/18) ja hyvin erilaistunut tapaukset osoittavat korkeat ekspressiotasot, kun taas 37% (10/27) ja kohtuullisesti erilaistunut tapaukset osoittivat korkeaa ekspressiotasot. Voimakas ilmentyminen ei havaittu huonosti eriytetty tapauksissa (0/20). Osuus kasvainten korkea immunoreaktiivisuus E-kadheriinin ja β-kateniinin ilmentyminen oli yli 72% potilailla, joilla on hyvin erilaistunut kasvaimia. Kuitenkin RARβ2 ilme, vain 39% (7/18) potilaista oli kokonaispistemäärä 4, kun taas 61% (11/18) potilaista oli lieviä immunoreaktiivisuus. Samoin, oli tilastollisesti merkitsevä korrelaatio H3 asetylointi ja ilmentymistä RARβ2, E-kadheriinin ja β-kateniinin (r = 0,560, r = 0,731, ja r = 0,733, vastaavasti,

P

0,01) (kuvio 1 B).

HDAC-inhibiittorit yhdessä ATRA palauttaa RARβ2 ilmaisun RARβ2-RARE

Kuten kuviossa 2A, HDAC estäjä SAHA (yhdenmukaisia ​​aiempien työtä VPA [19]), yksin tai yhdessä ATRA indusoituu voimakkaasti hyperasetylaation histoni H3 ja palauttaa RARβ2 ilmentymistä kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Edelleen ymmärtää mekanismi histoni asetylaatio aiheuttama uudelleen ilmentymisen RARβ2, teimme ChIP määritys käyttäen anti-H3K9ac-vasta-aineen sitoutumisen määrittämiseksi asetyloitua histoni H3 on RARβ2 promoottorialue (-168 /+ 22), joka sisältää ydinalueen harvinainen (-55 /-35) ja TATA (kuvio 2B). Hyperasetylaation lysiiniä 9 histoni H3 (H3K9ac) liittyy yleensä aktiivisesti puhtaaksi geenejä [23]. Verrattuna kontrolliryhmään, SiHa solut käsiteltiin HDAC-estäjien (10 mikromol /l SAHA tai 3 mmol /l VPA) yksin 48 tuntia osoitti merkittävää kasvua rikastamista RARβ2-RARE perustuu puolikvantitatiivinen (kuvio 2C) ja reaaliaikainen PCR (kuvio 2D). Vaikutus oli suurimmillaan silloin kun soluja käsiteltiin sekä HDAC-inhibiittorit ja ATRA (1 umol /l). Tämä yhdistetty hoito oli tehokkaampi indusoimaan histoni asetylaatio klo RARβ2-RARE alue kuin mikään yksittäinen lääke. Nämä tulokset osoittavat, että harvinaisia ​​RARβ2 promoottori on toiminnallinen ja että histoni asetylaatio klo RARβ2-RARE alue läheisesti korreloi RARβ2 uudelleen ilmentymisen kohdunkaulan syöpäsoluja.

(A) SAHA (10 mikromol /l ) hoito 48 tuntia, joko yksin tai yhdessä ATRA (1 umol /l), voimakkaasti indusoi hyperasetylaation histoni H3 ja palauttaa RARβ2 ilmaisun HeLa, SiHa-, CaSki-, ja C33A soluja. (B) Kaaviokuva RARβ2-promoottorialueen. Eksoneissa RARβ2 edustavat mustat laatikot. Nuoli osoittaa, että transkription aloituskohdasta. PCR alue (-168-+22) sirulle määrityksessä mukana ydinalueen harvinainen, TATA, ja 22 bp eksonista 1. (C) edustaja chip PCR data. PCR-tuotteet visualisoitiin kautta 1% agaroosigeelillä värjättiin etidiumbromidilla. (D) DNA-näytteet anti-H3K9ac IP sekä käsiteltävien materiaalien ja mock immunosaostus näytteet kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Hoito joko 10 mikromol /l SAHA tai 3 mmol /l VPA johti merkittävään kasvuun RARβ2-RARE rikastamiseen. Suurin kasvu RARβ2-RARE rikastaminen havaittiin yhdistelmähoitoa. *

P

0,05, **

P

0,01.

Yhdistetty hoito VPA ja ATRA estää etenemisen tuumoriksenograftien peräisin ihmisen luovuttajien

Neljä viikkoa ensimmäisen implantaation kohdunkaulan karsinooman peräisin ihmisen luovuttajalta, kasvaimen tuli tunnistettavissa paikalla siirroista ja edelleen hitaasti. Nopea kasvu havaittiin toisen sukupolven; se vain kesti 2 viikkoa havaittavaa ksenograftin muodostamiseksi. Histologinen tutkimus osoitti, ominaisuuksia, jotka olivat hyvin samanlaisia ​​kuin alkuperäisen potilaan kohdunkaulan karsinooman (kuvio 3D).

Kun kasvaimet olivat palpoitavissa, hiiret jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään: kontrolli (vehikkeli), VPA (300 mg /kg VPA), ATRA (ATRA 15 mg /kg), ja yhdistelmä. Eri hoidot annettiin päivittäin 28 päivää. Tuumoritilavuudet ja hiiri painot laskettiin joka toinen päivä. Yhdistelmä VPA ja ATRA huomattavasti inhiboivat tuumoriksenograftien verrattuna joko yhden lääkkeen tai ajoneuvon käsittely (

P

0,05) (A). Päivänä 28 hiiret lopetettiin ja tuumoriksenografteja kerättiin (B). Syöpäkasvain tiedot olivat yhdenmukaisia ​​kasvainten. Suurempi regressio kasvaimen kasvua havaittiin kombinaatio kuin yhden lääkkeen hallintojen (

P

0,05) (C). VPA ja yhdistelmähoito huomattavasti parempi aste histologisten erilaistumista. Yksittäiset syöpäsolut oli runsas eosinofiilinen keratinized soluliman (nuoli päätä), ja mitoosi luvut olivat poissa. Kasvain ksenografteissa käsitelty ajoneuvon tai ATRA pysynyt huonosti eriytetty, vastaa alkuperäistä ihmisen kasvaimista. Mitoottisia (nuolet) ovat yleisiä näitä näytteitä ja sytoplasmaan on eosinofiilinen sen amfofiilisen, minimaalisella tai poissa keratinization (D). *

P

0,05, verrattuna yksittäisen lääkkeen hoidetussa ryhmässä.

vaikutuksen määrittämiseksi VPA ja ATRA on -tuumoriksenografti kasvuun, eläimet saivat ajoneuvon kontrollina, VPA (300 mg /kg /d ip), ATRA (15 mg /kg /d ig), tai yhdistelmä hoito 28 päivää, kun kasvaimet olivat vahvistettu. Hoito ei ollut ilmeistä myrkyllisyyttä hiirissä. 28 päivän jälkeen, keskimääräinen kasvaimen tilavuus yhdistelmälle hoitoryhmän oli 66,84 ± 19,10 mm

3, kun taas kasvainten tilavuudet hiiriä hoidettiin ajoneuvo, VPA, ja ATRA oli 316,65 ± 94,58 mm

3, 119,83 ± 7,74 mm

3, ja 208,64 ± 76,61 mm

3, vastaavasti (kuvio 3A ja B). Yhdenmukainen kasvaimen tilavuuden tiedot, keskimääräinen kasvaimen paino kontrolliryhmässä oli 0,99 ± 0,09 g, kun taas kasvain painot VPA, ATRA, ja yhdistelmä hoitoryhmissä oli 0,402 ± 0,02 g, 0,618 ± 0,16 g ja 0,264 ± 0,09 g, vastaavasti (kuvio 3C). Nämä tiedot osoittavat, että -ksenografteja tukahdutti 59.39%, 37.58% ja 73.33% (prosenttiosuus kasvaimen kasvun estäminen,% TGI) varten VPA, ATRA, ja yhdistetyt hoidot, vastaavasti (kuvio 3A). Tiedot osoittavat, että yhdistelmähoito johti suurempaan kasvun estymistä tuumoriksenograftien kuin joko yhden lääkehoitoa.

Tärkeää on, että histologinen ulkonäkö osoitti, että VPA ja yhdistelmä hoito paransi laajuus histologista eriyttämisen tuumoriksenograftien . Kuten kuviossa 3D, syöpäsolujen ksenografteissa käsitelty VPA yksinään tai yhdessä ATRA on runsaasti eosinofiilinen keratinized solulimassa, kun taas mitoosi luvut ovat poissa tai huomattava vain satunnaisesti. Kuitenkin syöpäsolut kudoksiin sekä ohjaus- ja ATRA hoidetuissa ryhmissä olivat huonosti eriytetty. Mitoosi luvut olivat yleisiä (2-4 per suuritehoisia kenttä kontrolliryhmässä, mutta ≤2 per suuritehoisia kentän ATRA hoidetussa ryhmässä) ja sytoplasmassa oli eosinofiilinen ja amfofiilisen, kun keratinization oli minimaaliset tai puuttuvat, samanlainen alkuperäisen karsinooma. Nämä havainnot ovat edelleen todentaa immunohistokemiallisella värjäyksellä involukriiniä ja loricrin (merkkiaineita päätelaitteen epiteelin erilaistuminen) kudoksissa tuumoriksenografteja (kuva 4). Ilmaisu involukriinin ja loricrin aiheutettiin merkittävästi kasvaimia käsiteltyjen hiirien VPA yksin, verrattuna kasvainten verrokkihiiristä ja ATRA-käsitellyillä hiirillä. Suurin involukriiniä ja loricrin ekspressiotasoja havaittiin kasvainten käsitellyillä hiirillä lääkeaineiden yhdistelmä. Soluproliferaatiota arvioitiin Ki67-värjäys. Hoito VPA yhdistettynä ATRA johtanut merkittävään väheneminen Ki67-positiivisten solujen verrattuna VPA, ATRA, tai ajoneuvon käsittelyä (13,0%

vs.

39,4, 71,2, ja 78,6, vastaavasti;

P

0,05) (kuvio 5B). Lisäksi indusoimaan, VPA edistää myös apoptoosin [24]. Tutustua vaikutuksen, suoritimme TUNEL värjäys arvioimiseksi apoptoosin tuumoriksenografteja (kuvio 5A). Kasvaimissa kontrollista hiirissä apoptoottisten solujen määrässä oli minimaalinen (3,6 ± 1,14). Määrä apoptoottisten solujen kasvaimia ATRA-käsitellyissä hiirissä ei ollut merkittävästi erilainen kuin hiirissä, joita käsiteltiin VPA: lla yksin tai ajoneuvon. Oli kasvoi merkittävästi apoptoottisten solujen (20.60 ± 4,16) in yhdistelmä saaneista kasvaimia.

hoito VPA yksinään lisäsi merkittävästi tasoa histoni H3 asetylointi, kunnostettu RARβ2 ilme, ja indusoi ilmaus päätelaitteen differentiaatiomarkkerien involukriini ja loricrin, kun taas käsittely yhdistelmällä VPA ja ATRA lisännyt vaikutus reaktivoiville näiden geenien ilmentyminen verrattuna joko yhden lääkehoitoa. Vähän positiivisia soluja havaittiin kudokset ATRA-käsitellyssä ryhmässä.

(A) Cell apoptoosi arvioitiin käyttämällä TUNEL-määritystä. Apoptoottisia soluja (vihreä) laskettiin fluoresenssitulosten kuvaa otettu 10 satunnaisesti kenttien 200 x suurennus. Hoito yhdistelmällä VPA ja ATRA huomattavasti apoptoosin verrattuna ajoneuvon tai yhden lääkehoitoa. (B) Solulisääntyminen arvioitiin käyttäen Ki67 värjäystä. Jakauma Ki67-positiivisten solujen teki kaksi tutkijaa. Merkittävä väheneminen ja Ki67-positiivisia soluja havaittiin kasvaimia, käsiteltiin lääkeaineiden yhdistelmä verrattuna VPA hoito yksinään. Siellä oli vain hieman laskevan määrän Ki67-positiivisten solujen ATRA hoidetussa ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään. *

P

0,05, **

P

0,01, kontrolliryhmään verrattuna.

VPA ja ATRA palauttaa RARβ2 ilmaisun kautta epigeneettisellä muutos ja peräkkäin estää kasvaimen kasvua aktivoimalla APT ilmaisu

histoni H3 asetylointi tilan tuumoriksenograftien määritettiin käyttäen immunohistokemiallisesti ja Western blot-analyysi. Kuten kuvioissa 4 ja 6, VPA hoito lisäsi merkittävästi taso asetyloitu H3 kontrolliin verrattuna ja ATRA ryhmä. Yhdistettynä ATRA, VPA näytteillä ilmeinen additiivinen vaikutus histoni epigeneettiset muutos. Vaikutuksen tutkimiseksi näiden reagenssien tasolla histonien asetylointi on RARβ2-promoottorialueen, siru-määritys suoritettiin.