Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on yksi tappavimmista ihmisen maligniteettien, ja sen ennuste ei ole parantunut viimeisten 40 vuoden aikana. Hiiri malleja spontaanisti kehittävät haiman adenokarsinooma ja matkivat etenemistä ihmisten sairauksien ovat nousemassa uuden työkalun tutkia perusbiologian tämän taudin ja tunnistamaan mahdolliset terapeuttisten kohteiden. Tässä kuvaamme uuden mallin metastasoituneen haiman adenokarsinooma perustuu haiman-indusoituvat ja palautuvia ilmaus onkogeenisessä muodon Kras yhdessä haima-erityinen ilmaisu mutantin muodon tuumorisuppressorigeenin p53. Käyttämällä korkean resoluution magneettikuvaus seurata yksittäisiä eläimiä pitkittäistutkimuksissa, osoitamme, että sekä ensimmäisen että etäpesäkeleesioita riippuvaisia ​​jatkuvasta Kras toimintaa niiden ylläpitoon. Kuitenkin uudelleen aktivointi Kras * pitkäaikaisessa inaktivaatio johtaa nopeaan kasvaimen uusiutumisen, nostamalla huoli että Kras * -resistance voisivatkin hankittu. Siten meidän data identifioi Kras * keskeisenä onkogeenin haimasyövän ylläpitoon, mutta nostaa esiin mahdollisuuden hankittu resistenssi pitäisi Kras estäjät tulla käytettäväksi haimasyövän.

Citation: Collins MA, Brisset JC, Zhang Y , Bednar F, Pierre J, Heist KA, et al. (2012) metastasoituneen haimasyövän riippuu onkogeeninen Kras hiirissä. PLoS ONE 7 (12): e49707. doi: 10,1371 /journal.pone.0049707

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 30 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 12 lokakuu 2012; Julkaistu: 3. joulukuuta 2012

Copyright: © 2012 Collins et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat Michiganin yliopiston Bio- Scholar Program ja GI SPORE, P50CA13810 (Pilot Rahoitustuki MPdM) ja Yhdysvaltain National Institutes of Health tutkimuksen apurahan P50CA93990. MRI suoritti Center for Molecular Imaging tukee NIH P50 CA093990. MAC tukee University of Michigan Program Cellular and Molecular Biology koulutus avustus (NIH T32 GM07315) ja University of Michiganin Center for Organogenesis Training Grant (5-T32-HD007515). FB tukee American College of kirurgien Resident Research Scholarship ja NIH T32 HD007505. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

haiman adenokarsinooma (PDA), yleisin haimasyövän, liittyy usein mutaatioita Kras onkogeenin, yleisimmin KRAS

G12D [1], [2]. Mutaatiot kasvaimen p53 -Suosituimmat yleisesti R175H [3] – havaitaan usein ihmisen näytteissä [1]. Expression of KRAS

G12D (Kras *) ja mutantin p53

R172H -edellä hiiren ortologi R175H- hiiren haiman käytettiin tuottamaan KPC malli. KPC hiiret läheisesti matkivat etenemistä ihmisten sairauksien [4], [5] ja vastata hoito samalla tavalla kuin ihmisen potilailla. Sen sijaan kasvaimet istutetut immuunivajavaisissa hiirissä huonosti ennustaa hoitovasteen [6], [7]. KPC malli on siis ihanteellisesti tutkia haimasyöpä muodostumista. Kuitenkin tässä mallissa KRAS ilme on peruuttamaton. Siten KPC hiiret eivät sovellu tutkia roolia Kras * kasvaimen ylläpitoon. Koska huumeita kohdistaminen Kras * ovat tällä hetkellä saatavilla, geneettinen mallintaminen Kras esto on ainoa vaihtoehto, onko tämä -onkogeeni tarvitaan kasvaimen huoltoa.

, ja muut, ovat viime aikoina kuvattu indusoituva-Kras * p53

+/- (iKras * p53

+/-) hiirimallissa haimasyöpä, joka mahdollistaa kudosspesifisiä, indusoituva ja palautuvia ilmentymisen KRAS yhdessä lakkaa toimimasta alleelin kasvaimen p53 [8 ], [9]. iKras * p53

+/- hiiret kehittävät invasiivisia, mutta ei-metastasoituneen haimasyövän, joka on riippuvainen jatkuvan Kras * toimintaa sen kasvua ja ylläpitoa. Muissa hiirimalleissa haimasyövän, samoin kuin muissa kasvainmuodoissa, menetys p53 nopeutetun kasvaimen muodostumisen, mutta vain harvoin johti etäpesäkkeitä. Sitä vastoin ilmaus mutantin p53: n on osoitettu olevan erittäin pro-metastaattinen [10], [11], [12]. On tietty vaihtelua nämä havainnot: esimerkiksi metastaattisen potentiaali on kuvattu muiden ryhmien avulla KC tai iKras * hiiriä yhdistettynä lakkaa toimimasta alleelin p53 [9], [13], mikä saattaa olla lisävaikutuksia harkita , kuten geneettinen tausta hiirillä. Koska meidän hiiri pesäkkeitä p53 keskeytys- toiminto ei anneta metastaattinen potentiaali iKras * hiiriä, me syntyy iKras * hiiriä, että myös suorittaa mutantti p53-alleelin (p53

R172H, täten p53 *). Tavoitteenamme oli luoda metastaattista mallia, jossa voisimme käsitellä roolia Kras * ylläpito metastasoituneen haimasyövän seuraamalla hiiret pitkittäistutkimuksissa käyttäen

in vivo

kuvantamiseen.

(A ) geneettiseen koostumukseen iKras * p53 * hiirillä. (B) Koejärjestely: DOXY annettiin jatkuvasti, alkaen vieroituksen. Akuutti haimatulehdus aiheutettiin 72 h, minkä jälkeen eläimet olivat iältään kunnes he kehittivät kasvaimia. Kaplan-Meier selviytymisen käyrä. iKras * p53 *, n = 25; iKras * p53

+/-, n = 9. Log-rank tilastollinen analyysi tuotti P-arvo on 0,001. (C) Gross morfologia kuvia primaarikasvain ja maksametastaaseja. T: kasvain, S: vatsa, Sp: perna, Int: suoli, L: maksa (D). Histologiaa kohtalaisen eriytetty (ylärivi) ja un-eriytetty (alin rivi) haiman kasvain; maksan ja keuhkojen etäpesäkkeet. T: kasvain. Mittakaava 100 um.

Tulokset

iKras * p53 * hiiriä, haiman-erityinen p48-Cre (Ptf1a-Cre) [14] recombines floxed seis kasettia Rosa26-lokuksen, aktivoiden näin ilmentymisen transkription aktivaattorin rtTa [15]. Cre rekombinaatiota myös indusoi p53

R172H (p53 *) [16] sen endogeeniseen lokukseen kun rekombinaatiota floxed lopettaa kasetti. RtTa on transkriptionaalisesti aktiivinen läsnäollessa doksisykliiniä (DOXY), ja aktiivinen sen puuttuessa. Siten TetO-Kras

G12D (Kras *) [17] alleeli voidaan transkriboida indusoitavissa, kudosspesifisiä ja palautuvia tavalla antamalla doksisykliiniä ja eläinten vettä (Fig. 1A). Jotta aiheuttaa Karsinogeneesin iKras * p53 * hiiret pantiin DOXY vieroituksen, jota seuraa lyhyt sarja haimatulehduksen edistää Panin muodostumista kuten aikaisemmin on kuvattu [18], [19]. Sitten eläimiä ylläpidettiin DOXY kunnes he kehittivät PDA ja jouduttiin lopetettiin tai sortunut, välillä 2 ja 45 viikkoa DOXY annon (Fig. 1 B ja taulukko 1). Mielenkiintoista, selviytyminen iKras * p53 * eläimet oli pidempi kuin iKras * p53

+/- hiiret (ks Kaplan Meier käyrä kuvassa. 1 B); kuitenkin, syy tähän eroon jää epäselväksi. Ruumiinavauksessa iKras * p53 * eläimet esitetään kasvain massa usein pään haima, yhdessä näkyvä etäpesäkeleesioita (Fig. 1 C). Osajoukko eläinten myös esittelyyn hemorraginen askites (n = 5). Histologia primaarikasvaimen paljasti kohtalaisen un-eriytettävä haiman adenokarsinooma runsasta desmoplastic stroman (Fig. 1D, Fig. 2A ja taulukko 1) samanlainen kuin mitä on havaittu iKras * p53

+/- eläimet [8] . Etäpesäkeleesioita olivat erittäin yleisiä maksassa (Kuva. 1 C upotus, 1D, Fig. 2A ja taulukko 1), ja harvemmin keuhkoihin; pohjukaissuolen invaasio toisinaan myös havaittu (Fig. 1 D, Fig. 2A, taulukko 1 ja dataa ei näytetty). Sekä ensisijainen kasvaimia ja etäpesäkkeitä ilmaisi fosfo-ERK1 /2, alavirtavaikuttajainhibiittorit of Kras (Fig. 2B). Lisäksi luonnehdinta kasvaimia ja etäpesäkkeitä paljasti ilmentymisen PDA markkereita, kuten CK19 (Fig. 2C), korkea proliferatiivinen indeksi mitattuna Ki67-värjäys (Fig. 2D), kertyminen mutantti p53-proteiinin (kuvio. 2E), genomista epävakautta havaitaan γ-H2AX ilmentymisen (Fig. 2F), ja kertyminen desmoplastic strooman kuten sileän lihaksen aktiini-ilmentävien fibroblastien (Fig. 2G). Siten iKras * p53 * hiirimallissa yhteenveto siitä histologian ja biologista käyttäytymistä ihmisen haimasyövän ja edellinen hiiri mallien kanssa ylimääräinen kyky hallita Kras * ilmentymistä ajan ja elin-selektiivisellä tavalla.

(a) histologia ensisijaisen haiman adenokarsinooma ja etäpesäkkeitä maksaan ja keuhkoihin. (B-G) immunohistokemia primaarituumorin ja etäpesäkkeitä varten: (B) fosfori-ERK1 /2; (C) CK19; (D) Ki67; (E) p53; (F) γH2AX; (G) αSMA. M: etäpesäke. Mittakaava 20 um.

Sen määrittämiseksi vaikutuksen Kras * inaktivaation primaarikasvaimen ja etäpesäkkeitä, arvioimme erilaisia ​​vaihtoehtoja

in vivo

kuvantamisen, mikä antaisi meille seurata yksittäisiä eläimiä ajan mittaan pitkittäistutkimuksissa. Fluorodeoksiglukoosi positroniemissiotomografia (FDG-PET) ja magneettikuvaus (MRI) on laajalti käytetty kuva potilaalle tehdä malleja PDA [20], [21], ja joissakin tapauksissa spontaania kasvaimia [22], [23] . Toiset ovat käyttäneet korkean resoluution ultraäänen ensisijainen geneettisesti hiiri malleja PDA [6]. Olemme tutkineet käyttö MRI, kliinisesti merkittävää kuvantamisen tekniikkaa, joka antaisi meille mahdollisuuden saada korkean resoluution kuvia kasvaimia ja etäpesäkkeitä ja mitata tilavuuden muuttuu ajan mittaan. Me kuvantaa KPC hiiriä (p48Cre; LSL-Kras; p53

R172H) [4], rinnalla iKras * p53 * hiiriä vertailla kasvainten muodostumista kaksi mallia. Aluksi hiiret kuvattavan valittiin perustuvat kliiniset oireet taudin (huono turkin kunto, laajentunut vatsa), tai joissakin tapauksissa, kun tunnustelu vatsan massa (Fig. 3A). Verrokkihiiret kuvattiin havainnollistaa normaalin haiman, sisäkkäin välillä mahalaukku, pohjukaissuoli, perna, ja vieressä oikea munuainen (Fig. 3B). Sekä yksittäiset KPC ja iKras * p53 * hiiriä (Kuva. 3C ja 3D), MRI selkeästi haiman kasvain massa. Lisäksi, iKras * p53 * hiiriä, MRI myös visualisoida useita etäpesäkeleesioita maksaan, suurista hyvin pieniä vaurioita (0,11 mm

3) (Fig. 3d, pohja-paneelit). Seuraavina kuvantaminen kokeissa eläimet kuvattiin kuukausittain alkaen 1 kuukauden ajan aktivaation Kras * ilmaisun ja induktio haimatulehduksen, riippumatta mistä tahansa sairauden oireita. Tässä toisessa kohortin eläimiä, pienempiä kasvaimia ajoittain merkittävä siten, että kasvaimen kasvu voitiin seurata ajan mittaan (kuvio. 3E ja Fig. 4B). Kasvain ja koko etäpesäkkeitä tilavuudet mitattiin kunkin eläimen osalta (Fig. 3F, kasvainten, top, ja yhdistetyt etäpesäkkeitä tilavuus, pohja, sillä KPC ja iKras * p53 * # 1, # 2, # 3) klo ilmoitettuina ajankohtina. Näin ollen, tämä tekniikka on tehokas, ei-invasiivinen menetelmä läsnäolon määrittämiseksi kasvainten ja metastaasien yksittäisissä eläimissä.

(A) Koejärjestely. (B) MK kontrollina hiiren haiman ja maksan. P: haima, S: vatsa, Sp: perna, K: munuainen, L: maksa, G: sappirakon. (C) Large haiman massa (T), mutta ei etäpesäkeleesioita on KPC hiiri. (D) Kaksi iKras * p53 * hiiriä DOXY 15 viikkoa (vasemmalla) ja 42 viikon ajan (oikea) osoittavat suurta haiman massa ja maksametastaaseja. (E) tunnistaminen pienempiä kasvaimia (iKras * p53 * # 3, vasen paneeli, 38 viikkoa) voidaan seurata, koska ne kehittyä suurempi kasvaimia (iKras * p53 * # 3, oikea paneeli, 40 viikkoa). (F) määrä mittauksia sekä primaareja kasvaimia ja yhdistetyt etäpesäkkeiden yksittäisten KPC ja iKras * p53 * eläinten ilmoitettuina ajankohtina.

Sen määrittämiseksi, onko primaarikasvaimen ja etäpesäkkeitä ovat riippuvaisia ​​Kras * me vetäytyi DOXY in iKras * p53 * hiirillä, mikä inaktivoi Kras * siirtogeenin, ja suoritetaan sarja kuvantaminen saman eläimen ajan (järjestelmän kuvassa. 4A ja Fig. 5A). Sen jälkeen Kras * inaktivaation, primaarikasvaimen massa (Fig. 4B ja Fig. 5B) taantui tuskin havaittavissa tai havaita 3 viikon kuluessa (Fig. 4C ja Fig. 5C). 6 viikkoa Kras * inaktivaation, vain harvoissa etäpesäkeleesioita jatkui, vaikkakin pienemmällä koon (Fig. 5C). Kunakin ajankohtana, pystyimme saamaan tilavuudeltaan mittaa sekä primaarikasvaimen ja etäpesäkkeitä (Fig. 4D ja Fig. 5F). Kun hiiret leikeltiin pitkäaikaisessa Kras * inaktivaation, niiden haima ilmestyi pieniä ja läpikuultavia, ja puuttui näennäinen näkyvissä kasvain massa (Fig. 4E). Histologinen analyysi (kuvio. 4E, keskimmäinen paneeli) paljasti fibroottisia parenchyma (

vihreä nuolenkärki

), jossa acini (

punainen nuolenkärki

) välissä sisällä laajentuneet kanavissa (

keltainen nuolenkärki

) , ja jota ympäröi rasvakudos (

sininen nuolenkärki

). Osa laajentuneet kanavat säilyvät solunsisäisen mukiinia kertyminen tunnistetaan positiivinen PAS värjäys (Kuva. 4E, oikea paneeli). Havaitsimme myös kystat vuorattu CK19-positiivisten solujen, jotka voisivat merkitä edellisessä kasvainpaikkaa (Fig. 4F vasen paneeli). Fibroottiseen alueet säilytetään kollageenin kuituja, kuten korostettu Trichrome värjäystä, mutta solut heidän puuttui Smooth Muscle Actin ilmaisun ja ei proliferatiivista, mikä osoittaa arpikudosta sijaan aktiivinen strooman. Sekä koko jäljellä haima ja sisällä kystat, fosfo-ERK1 /2: n ilmentyminen oli harvinaista, pelkästään yksittäisten solujen Ki67-värjäys oli läsnä osajoukko epiteelisolujen, mutta mitoottisia olivat harvinaisia ​​(Fig. 4F). Niinpä päätellään, että tässä spontaani mallissa haimasyövän Kras * tarvittiin ylläpitoon sekä primaarikasvaimen ja etäpesäkkeitä, vaikka läsnä ylimääräisen onkogeenin, mutantti p53. Riippuvuus yhdestä onkogeenin pitkälle kasvaimia on havaittu ennen [24], [25], [26], [27], [28], [29]; kuitenkin tietojemme mukaan vaikutus onkogeenin inaktivaatiomenetelmät etäpesäkkeiden kiinteitä kasvaimia on harvoin käsitelty.

(A) Koejärjestely. (B) MRI otettu 38 viikon kuluttua Kras * aktivoinnin on normaali haima morfologia. P: haima, S: vatsa, Sp: perna. Kuitenkin samassa eläimessä, on näyttöä pieni haiman tuumori (T) 40 viikkoa, 2 päivää, joka kasvaa koko seuraavan neljän viikon ajan. (C) Kasvaimen regressio esiintyy seuraavat Kras * inaktivoitumista. Kolmella viikolla, ei ole enää tunnistettavissa tuumorimassan. (D) Kasvaimen tilavuus on ilmoitettuina ajankohtina. (E) Gross morfologia haiman seuraavista Kras * inaktivaatio – huomaa pieni haima ilman selvää kasvain massa (vasen paneeli). Histologia taantunut kudoksen (HE, keskimmäinen paneeli, Mittakaava 100 um) paljastaa acini (punainen nuolenkärki) ympäröi fibroosia (vihreä nuolenkärki) ja rasvakudoksessa (sininen nuolenkärki) ja laajentuneet kanaviin (keltainen nuolenkärki), joka sisältää joitakin soluja, jotka osoittavat musiinituoton kerääntyminen tunnistetaan nuolin (PAS värjäys, oikea paneeli, Mittakaava 20 um). (F) histologia fibroottisten kystat, viittaa mahdolliseen edellisen kasvainpaikkaa (HE, vasen paneeli), reunustavat solut, jotka ovat CK19 positiivinen (upotus). Mittakaava 100 um. Gomori Trichrome (Mittakaava 100 um), SMA värjäys (upotus), p-ERK1 /2, ja Ki67-värjäys osoittaa, että jäljellä olevat fibroosin ei ole enää reaktiivinen. Mittaviivat 20 um.

vieressä eteni onko tuumorisolujen oli täysin eliminoitu, vai osan niistä oli selvinnyt inaktivaation Kras *. Tätä tarkoitusta varten olemme uudelleen aiheuttama Kras * ilmentyminen kasvaimen regression. Kun DOXY hallinto, havaitsimme nopea uusiutuminen primaarikasvaimen massa (Fig. 5D ja 5F), mikä viittaa siihen, että jotkut kasvainsolut oli selvinnyt siirtogeenin inaktivoitumista ja pystyivät jatkamaan nopeaa kasvua. Lisäksi lisäanalyysi paljasti fosfo-ERK1 /2 kohoamiseen kaikkialla primaarikasvaimen sekä maksassa ja keuhkometastaaseista (Fig. 5E). Tämä havainto sai meidät tutkimaan, onko syöpäsoluissa voi lopulta resistenteiksi Kras * inaktivaatioon.

(A) Koejärjestely. (B) Tuotteen suuri haiman kasvain massa 22 viikkoa kuluttua Kras * aktivoinnin. T: kasvain, S: vatsa, Sp: perna, L: maksa, G: sappirakon. (C) otettuja kuvia 1, 3 ja 6 viikkoa Kras * inaktivoitumista. Huomaa vähentää huomattavasti primaarikasvaimen massa ja metastaasilastista. (D) Uudelleenaktivointimaksu Kras * johtaa nopeaan kasvaimen uusiutumisen. (E) histologia primaarikasvaimen sekä etäpesäkkeitä tavataan maksassa ja keuhkoissa kasvaimen uusiutumisen osoittavat runsasta fosfo-ERK1 /2 lauseke (sisäkkeet). Mittakaava 100 um (F) Kasvaimen ja kokonaismäärä etäpesäkkeitä tilavuus tällä ilmoitettuina ajankohtina.

Vastatakseen tähän mahdollisuuden, ja pystyä saamaan histologisen tiedon saman kasvaimen ajan, me syntyy ensisijainen solulinjoja iKras * p53 * kasvaimia. Ensisijainen kasvainlinjojen kulttuuri oli ominaista joko epiteeli- tai mesenkymaaliset kaltainen morfologia (Fig. 6A ja 6C). Ilmaisu mutantin Kras * RNA säännelty DOXY kulttuurissa, odotetusti (Fig. 6A ja 6C). Lisäksi päätimme Ras aktiivisuus iKras * p53 * ensisijainen solulinjoissa oli verrattavissa tasot aktiivisen Ras soluissa uutettu KPC kasvaimia (Fig. 6G). Fosfo-ERK1 /2 tasossa alun perin säännelty DOXY keskipitkällä; mutta tämä asetus oli heikentynyt ajan kuluessa viljelmässä, jossa fosfori-ERK1 /2 tasossa tulossa konstitutiivisesti koholla, vaikka Kras * ilme oli vielä DOXY riippuva (Fig. 6B ja 6D). Mielenkiintoista, leviämisen, mitattuna lisääntyvien solun tuma-antigeenin (PCNA), ei näytä olevan DOXY riippuvaista viljelmässä. Kuitenkin yksi solulinjojen (iKras * p53 * -2) oli lisääntynyt ilmentyminen apoptoosin merkki lohkaistaan ​​kaspaasi-3 vastauksena poistaminen DOXY median (kuva. 6E ja 6F). Aineisto on yhdenmukainen aiempien havaintojen osajoukko ihmisen haimasyövän soluja riippuu kasvaimia synnyttävän Kras hengissä [35], [36].

(A) Ensisijainen solulinja iKras * p53 * -1 näyttelyitä epiteelin morfologia ja osoittaa doksisykliini riippuvainen Kras * lauseke (* p 0,05), ja pERK1 /2 tasolle passage 5. (B) sama solulinjaa klo passage 12; Kras * ilme on yhä riippuvainen DOXY (*** p 0,001), mutta pERK1 /2 tasot eivät riipu Kras * ilme. (C) Toinen ensisijainen solulinja, iKras * p53 * -2, on mesenkymaaliset morfologia. Klo passage 6, Kras * ilme riippuu DOXY (** p 0,01), ja pERK1 /2 tasossa riippuu Kras * ilme. (D) Analysis at passage 11: Kras * on edelleen säätelee DOXY (* p 0,05, ** p 0,01), mutta pERK1 /2 tasoa pysyy koholla. (E) Western blot-analyysi apoptoosin, merkitty pilkottu kaspaasi-3 (CC3), ja leviämisen mitattuna lisääntyvien solun tuma-antigeenin (PCNA), molemmissa iKras * p53 * -1 ja iKras * p53 * -2 solulinjoissa. (F) Immunofluoresenssi apoptoosin, joka on merkitty pilkottu kaspaasi-3 (CC3), ja iKras * p53 * -2-soluja joko läsnä (+48 h) tai ilman sitä (-48 h), ja DOXY mediassa. DAPI värjäys merkitsee ytimet. Mittakaava 100 um. (G) Ras alasvetovastukset määritys osoittaa, että Ras aktiivisuuden tasot ovat vertailukelpoisia iKras * p53 * solulinjat ja solujen KPC kasvaimia.

vaikutuksen määrittämiseksi Kras * inaktivaation

in vivo

injektoimme soluja ihon alle NOD /SCID-hiiriin. Vaikka ihonalainen injektio ei sovellu prekliinisissä tutkimuksissa haimasyövän, koska se ei vastaa monimutkaisuus kasvain microenvironment, sen avulla voidaan silti lukeman kyky syöpäsolujen kasvua

in vivo

. Kaikki linjat testataan (n = 3) muodostuu nopeasti kasvaimia, kun istutetaan NOD /SCID-hiirissä säilytetään DOXY-vettä. Kun DOXY peruuttamista, kasvaimet ensimmäinen lakannut kasvaa ja myöhemmin taantui nopeasti; mielenkiintoisesti, täydellinen regressio havaittiin ainoastaan ​​solulinjassa, joka oli riippuvainen kasvaimia synnyttävän Kras hengissä soluviljelmässä (iKras * p53 * -2). Viiveen jälkeen kuitenkin kasvaimet kasvoivat takaisin puuttuessa DOXY (Fig. 7A ja kuvassa. 7C). Histologinen analyysi osoitti, että siirrettyjen kasvainten sekä uusiutunut kasvaimia muistutti primäärisen tuumorin ne olivat peräisin (Fig. 7B ja kuvio. 7D, vertaa Fig. 1D, katto ja pohja vastaavasti). Sekä fosfo-ERK1 /2 ja Ki67 ekspressiotasoja alunperin alassäädetty upon Kras * inaktivaation (Fig. 7D, upotus), mutta ilmaistuna uusiutunut kasvaimet (Fig. 7B ja kuvio. 7D). Havaitsimme myös alas-säätely SMA vuonna fibroblasteissa ympäröivä kasvainsolujen, vaikka odotetusti SMA ilmentyminen säilyy verisuonistossa liittyvien fibroblasteissa (kuvio. 7D), joka indikoi muutoksen epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä vuorovaikutukset upon Kras * inaktivaatiota epiteelin. Kun analysoimme ilmaisun onkogeenisten Kras * kasvaimissa, huomasimme, että uusiutuneen kasvaimia oli konstitutiivisesti kohonnut ilmentyminen Kras *, mikä osoittaa tappiota doksisykliinin riippuvuutta siirtogeeniä (Fig. 7E). Siten on todennäköistä, että kasvain toistuminen johtuu selektiivinen paine Kras * ilmaisun, eikä hankittu riippumattomuutta Kras *. Olemme myös selvittäneet muita kasvaimia synnyttävän väyliä saattaa edistää uusiutumisen. Emme havainneet mitään muutoksia EGR signalointireitillä, mutta meillä ei havaita kasvua myc ilmaisun uusiutunut kasvaimissa (kuvio. 7E, tuloksia ei ole esitetty).

(A) Kasvaimen tilavuus mitattiin ajan funktiona iKras * p53 * -1 solut subkutaanisesti NOD /SCID-hiiriin. Keltainen viiva ilmaisee läsnäolon DOXY, mustat viivat osoittavat puuttuessa DOXY, nuolet osoittavat sadonkorjuun aika-pistettä. N = 5. (B) histologia ja fosfo-ERK1 /2 lauseke (upotus) on iKras * p53 * -1 kasvaimia korjatuista kasvun alkuvaiheen ja uusiutunut kasvaimia. Mittakaava 100 um. (C) kasvaimen muodostumisen, regressio, ja uusiutumisen NOD /SCID-hiiriin injektoitiin subkutaanisesti ensisijainen solulinja iKras * p53 * -2. N = 5. Toinen kohortti NOD /SCID-hiiriin injektoitiin iKras * p53 * -2-solut, mutta säilyttää ilman DOXY jotka eivät kehittää kasvaimia. N = 10. Keltainen viiva ilmaisee läsnäolon DOXY, mustat viivat osoittavat puuttuessa DOXY, nuolet osoittavat sadonkorjuun aika-pistettä. (D) histologia ja pERK1 /2 (upotus), Ki67 ja SMA ilmaus iKras * p53 * -2 kasvainten kasvun aikana, regressio, ja uusiutumisen vaiheita. Mittakaava 100 um. (E) Kvantitatiivinen PCR onkogeeniselle Kras * ja myc ilmaisun iKras * p53 * -2 kasvaimia.

eri joukko kokeita, me pistetään kasvainsolujen NOD /SCID-hiiriin puuttuessa DOXY, onko DOXY riippumaton soluja jo läsnä tuumorilinjoja. Tässä tapauksessa kasvainsolut ei aiheuta kasvainten aikana 13 viikkoa (kuvio. 7C); Näin, häiriöstä Kras * siirtogeeni ei todennäköisesti läsnä alkuperäisessä solupopulaation, mutta tapahtui solut kasvavat NOD /SCID-hiiriin. Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että

in vivo

, kasvainsolut riippuu kasvaimia synnyttävän Kras * muodostaa ja ylläpitää kasvaimia. Huomattavaa on, että emme noudata uusiutumisen iKras * p53 * hiiriä, mutta vain kerran viljeltiin soluja ja uudelleen käyttöön NOD /SCID hiirillä; näin ollen on mahdollista, että eri ympäristössä, mahdollisesti koska puuttuminen toimiva immuunijärjestelmä, tai siitä, että manipulointi solujen, saattaa olla salliva kasvaimen kasvua.

Keskustelu

Kiitos tutkimukset hiiri malleja, jotka läheisesti matkivat etenemistä ihmisen sairauden, sekä genomista tietoa ja tutkimusten ensisijainen ihmisen kasvaimista, olemme kehittäneet hienostunut ymmärrystä biologian haimasyövän [1], [30], [31]. Koska kyseessä on monimutkainen mutaatiostatuksesta profiilia haimasyövän ja mahdottomuus kohdistaa jokaisen muutos, se on erittäin tärkeää ymmärtää geenien /polkuja, joita tarvitaan kasvaimen huoltoa. Mutaatiot Kras geeni esiintyy aikaisessa taudin etenemiseen [32]. Hiirimallissa tutkimukset ovat osoittaneet avainasemassa mutantti Kras aloittamisen tämän taudin [33], [34]. Lisäksi alaryhmä ihmisen haimasyövän solulinjoissa vaativat Kras * kasvua ja selviytymistä sekä

in vitro

ja immuunivajavaisissa hiirten [35], [36]. Lisäksi muut ihmisen kasvaimissa, kuten keuhko- adenokarsinooma ja rintasyövän osoittavat samanlaista riippuvuutta kasvaimia synnyttävän Kras [17], [24]. Olemme äskettäin osoittaneet, että haimasyövän hiirillä on riippuvainen Kras * [8]. Kuitenkin ensimmäinen tutkimus ei ulotu analysointi roolin Kras * läsnäollessa toisen onkogeenisten tapahtuma, eikä se tutkia etäpesäkkeitä. Koska haimasyöpä on erittäin metastaattinen ihmisillä, mielestämme oli välttämätöntä laajentaa lähestymistapamme sisällyttää tämän ominaisuuden yhdistämällä Kras * ilmaisutapoja mutantti p53 *. Vaikka läsnä p53 *, osoitamme, että Kras * tarvitaan ylläpitoa primaarikasvaimen ja etäpesäkkeitä. Kuitenkin kasvainsolut selviytyi Kras * inaktivoitumistehon, kun Kras * reaktivaatio, johti uudistetun kasvaimen kasvua. Lisäksi, kun kasvainsolut eristettiin ja istutettiin immuunivajavaisissa isännät, he nopeasti kehittynyt vastustuskyky. Muissa malleissa käsitellään onkogeeni riippuvuuteen, lopulta hankinta vastus on havaittu yleisesti [24], [37]. Meidän järjestelmässä, on vielä tutkittava, onko läsnäolo mutantin p53 edistää vastustuskykyä Kras * esto, vai heikentynyt immuniteetti tilan isäntä on salliva kasvaimen uusiutumisen, kuten aiemmin ehdottanut [38]. Yhdessä havaintomme vahvistaa käsite estävä Kras haimasyövän potilaille; mutta ne tarjoavat myös varoituksen koskevat mahdollisuudet kasvainsolujen lopulta ohittaa niiden onkogeeni riippuvuus. Jatkotutkimuksissa olisi pyrittävä ymmärtämään mekanismeja, jotka mahdollistavat osajoukko kasvainsolujen hengissä Kras * inaktivoitumista tarjota strategioita täydellistä kasvaimen hävittämiseksi.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiret

Hiiriä pidettiin erityinen patogeenittomassa tilat Michiganin yliopiston Kattava Cancer Center. Tutkimus hyväksyi University of Michigan University komitean käytön ja hoidon Animals (UCUCA) ohjeet. p48Cre (Ptf1a-Cre) hiirissä [14] ovat intercrossed kanssa TetO-Kras

G12D [17], Rosa26

rtTa /rtTa [15] ja p53

R172H /+ [16] hiirillä tuottaa p48Cre; TetO-Kras

G12D; Rosa26

rtTa /+; p53

R172H /+ (iKras * p53 *). Poikueesta puuttuu Cre tai mutantti Kras ja p53-alleelit käytettiin kontrolleina. KPC hiirillä [4] ja iKras * p53

+/- hiirissä [8] kuvattu aikaisemmin.

Doksi annettiin juomaveden kautta, jonka pitoisuus on 0,2 g /l liuoksessa, jossa on 5 % sakkaroosia, ja korvattiin joka 3-4 päivä.

haimatulehdus indusoitiin kahden sarjaan kahdeksan tunnin vatsaontelonsisäisiä seruleiini (Sigma), jonka pitoisuus on 75 ug /kg, yli 48 tunnin aikana, kuten aiemmin on kuvattu [18].

Magnetic Resonance Imaging

Hiiret nukutettiin 1-2% isofluraani /ilmaa, ja kehon lämpötila pidettiin puhaltamalla lämmintä ilmaa reiän läpi magneetin käyttäen Air-Therm (World Precision Instruments, Sarasota, FL). MRI suoritettiin käyttäen 7 T Agilent (Palo Alto, CA)

Direct Drive

järjestelmän Quadrature rotan pää volumic kela (M2M Imaging, Cleveland, OH). Hiiret pantiin selälleen kelassa, teipattu alapuolella rintaonteloon sängyllä vähentää hengityksen liikkeen. T2-painotettu kuvat hankittiin käyttämällä nopea spin kaiun multi-slice sekvenssi TR /TE: 4000/30 ms, 8 kaikua junat, 4 keskiarvoja, 2 tyhjää ajoa, näkökentän (FOV) = 25 x 25 mm

2, matriisin koko = 128 x 128, leikkeen paksuus = 1 mm, viipaleiden määrä = 25 peräkkäistä. Käyttämällä in-house-ohjelmisto on kehitetty MATLAB (MathWorks, Inc., Natick, MA) kasvain rajan manuaalisesti määritettävä jokaiseen siivu ja sitten integroidaan poikki viipaleet tarjota volyymiarvio.

Immunohistokemia

Histologia ja immunohistokemia suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [8]. Luettelo vasta on esitetty taulukossa 2. Kuvat otettiin Olympus BX-51 mikroskooppia, ja Olympus DP71 digitaalikamera, ja DP Controller-ohjelmiston.

perustaminen Ensisijainen Cell Cultures

Tissue kerättiin primaarikasvaimen, jauhettu, ja hajotettiin 1 mg /ml kollagenaasia V (Sigma) 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Digestio lopetettiin lisäämällä täydellistä alustaa: RPMI-1640 (Gibco) + 10% naudan sikiön seerumia + 1% penisilliiniä /streptomysiiniä. Solut eristettiin suodattamalla 100 um solusiivilän ja maljattiin täydelliseen kasvualustaan, joka sisälsi doksisykliiniä (Sigma) 1 ug /ml.

ihonalainen kasvain Transplantation

1 x 10

6 iKras * p53 * solua injektoitiin ihon alle kylkeen NOD /SCID-hiirille 01:01 suhteessa Matrigel (BD Biosciences) ja täydellistä alustaa. Doksi annettiin juomaveden kautta pitoisuutena 0,2 g /l liuoksessa, jossa on 5% sakkaroosia ja 3 päivää, ja Chow (BioServ). Tuumorin koko mitattiin paksuus.

Kvantitatiivinen RT-PCR

RNA: n uutto, cDNA valmistelu ja kvantitatiivista PCR: ää varten Kras * ja normalisoinnin GAPDH suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [8]. Tilastollinen analyysi tehtiin parittomalla t-testillä.

Western blot -analyysi

Solut lyysattiin RIPA-puskuriin (Sigma Aldrich, R0278) ja proteaasi-inhibiittorin (Sigma-Aldrich, P8340). Yhtä suuret määrät proteiinia ajettiin elektroforeesilla 12%: n tai 4-15% gradientti SDS-PAGE-geeleillä, siirrettiin PVDF-kalvolle (Bio-Rad). Membraanit blokattiin 5% maito, ja primäärisen vasta-aineen inkuboinnit suoritettiin yön yli 4 ° C: ssa. Primaarisilla vasta-aineilla ja laimennokset on esitetty taulukossa 2. Toissijainen vasta-aine, HRP-konjugoitua anti-kani (1:5,000) käytettiin, ja havaittiin Western Salama Plus-ECL (Perkin Elmer). Proteiinivyöhykkeet näkyviksi Kodak Biomax- XAR elokuva.

Aktiivinen Ras Pull-down-määritys

Pull-down ja immunoblottauksella aktiivisen Ras suoritettiin käyttämällä Active Ras pull-down (Pierce) seuraavat valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Kiitokset

Kiitämme Esha Mathew kriittistä käsittelyyn käsikirjoituksen ja Marsha Thomas laboratorio- tukea. CK19 vasta-aine (Troma III) saatiin Iowan Developmental Hybridomaviljelmät Bank.