Krooninen sairaus

tiivistelmä

Herkät ja erityinen biomarkkereita proteiinikinaasi esto voidaan hyödyntää nopeuttamaan lääkekehitystä tutkimuksia onkologian liittämällä aikaisin molekyyli vasteet tavoite esto. Tässä tutkimuksessa käytimme puolueeton haulikko fosfotyrosiiniseerumi (pY) proteomiikka löytää uusien biomarkkereiden vasteen dasatinibille, pienimolekyylinen Src-estäjä, prekliinisissä tutkimuksissa kolorektaalisyövän (CRC). Suoritimme puolueeton massaspektrometria haulikko pY proteomiikka paljastaa pY proteomiin viljeltyjen HCT-116 paksusuolen syöpä soluja, ja sen jälkeen ne laajennetaan tämän analyysin HCT-116 ksenograftikasvaimissa tunnistaa pY biomarkkerit dasatinibin-reagointikykyä in vivo. Major dasatinibia vastanneilla pY sivustoja ksenograftikasvaimissa mukana sivustoja delta-tyypin proteiinikinaasi C (PKCδ), CUB-domain sisältävä proteiini 1 (CDCP1), Type-II SH2-domeenin sisältävä inositoli 5-fosfataasi (SHIP2), ja reseptoriproteiinia-tyrosiinifosfataasin alfa (RPTPα). PY313 site PKCδ tuki lisäksi oleellisena biomerkkiaine dasatinibin välittämän Src eston in HCT-116-ksenografteja immunohistokemiallisesti ja immunoblottauksella kanssa fosfospesifiselle vasta-aineella. Vähentäminen PKCδ pY313 edelleen korreloi dasatinibille estoa Src ja vähentynyt kasvun pallosia paneelin ihmisen CRC solulinjoissa. Nämä tutkimukset paljastavat PKCδ pY313 lupaavana lukeman Src eston CRC ja mahdollisesti muita kiinteitä kasvaimia ja voi heijastaa vastata dasatinibin osajoukko peräsuolen syöpiä.

Citation: McKinley ET, Liu H, McDonald WH, Luo W, Zhao P, Coffey RJ, et ai. (2013) Global Fosfotyrosiini Proteomiikka Tunnistaa PKCδ kuin Marker vasteajan Src esto in peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (11): e80207. doi: 10,1371 /journal.pone.0080207

Editor: Laszlo Buday, Unkarin tiedeakatemian, Unkari

vastaanotettu: 19 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 30 syyskuu 2013; Julkaistu: 08 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 McKinley et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Näitä tutkimuksia tukivat avustusta National Cancer Institute: R25 CA136440, P50-951903; R01-CA140628; K25-CA127349; RC1-CA145138; R01-CA46413; ja Kleberg Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tyrosiinifosforylaatio on keskeinen signalointimekanismin säätelevä keskeinen osa nisäkässolun käyttäytyminen, mukaan lukien proliferaatiota, liikkuvuuteen, aineenvaihduntaa, ja erilaistuminen [1]. Proteiinityrosiinikinaasit ovat ensimmäinen tunnistettu tuotteina viruksen onkogeenien, kuten v-src ja v-abl, ja kasvutekijöiden reseptoreita, mukaan lukien EGF. Poikkeava signalointi monet yhdeksänkymmentä tavanomaisen tyrosiinikinaasit koodaa ihmisen genomi on liitetty tautiprosessit, kuten uusien ja syövän leviämisen [1,2].

Kohdennettu hoito tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) on alati laajeneva toimintatavat, mahdollistaa yksilöllisiä syöpähoidon [3,4]. Merkittävät esimerkkejä ovat pienmolekyylisalpaaja- imatinibi, että hoitaa tehokkaasti krooninen myelooinen leukemia, jota ohjaa BCR-ABL-onkoproteiinin [5,6] sekä hoitojen inhiboida mutantti BRAF syövissä, kuten melanooman [7,8]. Pienimolekyylisiä TKI ja neutraloivat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka kohdistuvat EGF-reseptorin (EGFR) ja /tai siihen läheisesti liittyvä erbB2 (HER2 /neu) ovat menestyneet hoidossa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja rintasyöpä [9,10].

kolorektaalisyöpää (CRC), suurin osa tapauksista näyttää kohonnut aktiivisuus Src-perheen nonreceptor tyrosiinikinaaseilla [11,12], joka vähitellen kasvaa aktiivisuutta kasvaimia edetä etäpesäkkeitä [13]. Poikkeava Src aktiivisuus voi edistää pahanlaatuisen vaikuttamalla useisiin reseptoreihin kohdistuva lukien kadheriinin välittämiä solun-soluliitos, integriini välittämiä solun-ECM kiinnikkeistä, ja aktivoituvan reseptorin kompleksit kuten EGFR [14-16]. Kohonnut Src-vaikutuksen CRC ennustaa huono kliininen ennuste [17]. Niinpä on ollut huomattavaa kiinnostusta Src terapeuttisena kohteena CRC ja muiden syöpien [18-21]. Dasatinibi, kaikkein kliinisesti tutkittu Src-estäjä, on tehokas sytostaatti tuumorikasvun estämiseksi, invaasio, ja etäpesäkkeiden [22]. Sen lisäksi Src-ryhmän kinaasien Dasatinibi estää voimakkaasti BCR-ABL ja äskettäin osoitettu olevan ylivoimainen imatinibi kuin kroonisen myelooisen leukemian [23].

Arvioidessaan suunnattu TKI kliinisissä onkologian, on tarve tunnistaa asiaan biomarkkereita, joita voidaan käyttää ohjaamaan annosvalinnan prekliinisen kehityksen ja seuraamaan antituumorivaikutuksen kliinisissä kokeissa. Biomarkkerit voi myös olla hyötyä ennustettaessa onko potilaalla todennäköisesti hyötyä erityistä hoitoa. Useissa tutkimuksissa on käytetty erilaisia ​​lähestymistapoja yritettäessä tunnistaa tällaiset markkereita [24-26]. Rationaalisesti, kuten biomarkkerit voisi myös olla erityinen tyrosiinin sivustoja, jotka fosforyloituu kinaasin (t) kasvun estoon. Näin ollen on kiinnostava luonnehtia tyrosiinikinaasin signalointireittejä, jotka toimivat kasvainsolujen. Tyrosiinifosforylaatio kasvainsoluissa voidaan systemaattisesti ja kattavasti profiloitu käyttämällä massaspektrometriaa analysoida peptidien rikastettu fosfotyrosiinille (pY) immuuniaffiniteettikromatografialla [27]. Olemme aiemmin soveltanut tätä puolueetonta haulikko proteomiikka lähestymistapa saada perusteellisen analyysin tyrosiinifosforylaation normaaleissa verrattuna Src-transformoidun hiiren fibroblasteissa, mikä kuvaavat maailmanlaajuisia vaikutuksia onkogeenisten Src [28]. Toisessa Tämän lähestymistavan soveltamista, pY signalointi suuressa näytteenotto ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat ja kiinteitä kasvaimia paljasti aktivoitu tyrosiinikinaaseiksi [29].

tavoitteet Tämän tutkimuksen käyttäisi haulikko pY proteomiikka saada yleiskuva tyrosiinifosforylaatioon tunnettu HCT-116 ihmisen paksusuolen adenokarsinoomasolulinjasta ja laajentaa analyysiä HCT-116 ksenograftikasvaimissa käsitelty dasatinibille tunnistaa dasatinib reagoiva pY biomarkkerit. Havaitsimme pY sivustoja viestintäproteiinit lukien PKCδ CDCP1, ja RPTPα merkittävinä dasatinibi vastanneilla sivustoja HCT-116 ksenograftikasvaimissa, jotka voivat olla käyttökelpoisia ennakoivaa biomarkkerit SRC eston. Lopuksi, käyttäen sferoidiviljelmiä perustettu useista ihmisen CRC solulinjojen, havaitsimme korrelaatio datatinib-välitteisen proliferaation esto ja vähentää PKCδ pY313. Tuloksemme osoittavat PKCδ pY313 ehdokkaaksi biomarkkeri ennustamiseksi vastauksena dasatinibin CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja lääkehoito

HCT-116 (ATCC CCL- 247), Caco-2 (ATCC HTB37), Colo205 (ATCC CCL-222), DKO-1, DLD-1 (ATCC CCL-221) saatiin ATCC: stä ja Lim1215 soluihin [30] saatiin Robert Whitehead, Ludwig Institute for Cancer Research. Ihmisen CRC solulinjoja ylläpidettiin kuin yksikerrosviljelmään klo subkonfluenteista tiheys 5% CO

2, 37 ° C ilmakehässä. Kasvualusta koostui Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM, Mediatech) kaikkien solulinjojen paitsi Colo205, jotka kasvatettiin RPMI (Cellgro). Kasvualustaa täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals), 1% antimykoottista antibiootit (Mediatech), ja 100 uM ei-välttämättömiä aminohappoja (Gibco-Invitrogen). Kaikki solut siirrostettiin käyttäen 0,25% EDTA-trypsiinillä (Gibco).

Dasatinibia (BMS-354825) luovutti ystävällisesti Richard Smykla Bristol-Myers Squibb Oncology (Princeton, NJ). Dasatinibia liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) kanssa 10 mM kantaliuos. HCT-116, Caco-2, Colo205, DKO-1, ja DLD-1-soluja käsiteltiin Kasvavat dasatinib pitoisuuksilla (0, 10, 100, 1000, 5000 nM) 24 tuntia. Lopussa hoidon, viljelyalusta poistettiin ja solut kerättiin analyysiä varten.

Eläinmallijärjestelmiä

Kaikki tutkimukset hyväksynyt Vanderbilt University Institutional Animal Care ja käyttää komitean ja yritettiin minimoida eläinten kärsimyksiä. HCT-116 -ksenografteja tuotettiin atyymisissä nude-hiirissä (Harlan Sprague-Dawley) ihonalaisen injektion 2-4 x 10

6 solua. Palpoitavissa kasvaimia havaitaan 2-4 viikkoa. Dasatinibia muodostettiin uudelleen DMSO. Välittömästi ennen käsittelyä, yhdeksän osaa steriiliä suolaliuosta lisättiin lääkeliuosta. Kasvaimen kantavien hiirten (0,5-1 cm pisin ulottuvuus) annettiin 100 ui dasatinibia (60 mg /kg) tai DMSO /suolaliuoksessa ajoneuvon letkulla suun kautta. Eläimet saivat joko kerta-annoksena tai käsiteltiin päivittäin 5 peräkkäisen päivän ajan. Kunkin hoito-ohjelma, kohorttien eläimet uhrattiin ja tuumorit leikattiin 4 h ja 24 h kuluttua viimeisestä lääkkeen annon.

valmistaminen fosfotyrosiinin rikastetun peptidin näytteet

trypsiinipeptidit rikastunut fosfotyrosiinivasta- olivat valmistettu HCT-116 yksikerrosviljelyissä (eksponentiaalisesti kasvavat noin 70% konfluenssilla) ja HCT-116 ksenograftikasvaimissa. Solulyysiksen, proteiinia ruoansulatusta, ja immunoaffi- rikastumisen pY sisältävien trypsiinipeptidit saavutettiin käyttämällä PhosphoScan Kit (P-Tyr-100; Cell Signaling Technology) mukaan valmistajan protokollaa. Viljeltyjä soluja, kunkin kierroksen analyysi suoritettiin käyttäen 60 mg solun kokonaisproteiinia (saatu kahdeksan 150 mm astiat). Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA (Thermo Scientific), naudan seerumin albumiini (BSA; Sigma) standardina. Kasvaimen lysaatit valmistettiin homogenisoimalla jäällä dispergoimiseksi jäätynyt kudos (noin 400 mg kasvaimen märkäpainon 9 ml PhosphoScan Lysis Buffer), jonka jälkeen sonikoimalla ja sentrifugoimalla (20000 x

g

15 min) selkeää liukenematonta materiaalia. Selvitetty kasvaimen lysaatit, jotka sisälsivät noin 40 mg proteiinia (määritettynä BCA-määrityksellä) käytettiin analyysiin. Trypsiinipeptidit muodostettiin käsittelemällä lysaatit yli yön 25 ° C: ssa trypsiini-TPCK (60: 1 solun: trypsiini).

Massaspektrometria

LC-MS /MS-analyysi peptidien suoritettiin käyttäen hybridi lineaarista ioniloukku /orbitrap väline (LTQ-Orbitrap, Thermo Fisher) varustettu Eksigent NanoLC-AS1 Automaattinen näytteenottaja, Eksigent NanoLC-1D ja korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) pumpun (Eksigent), nano-sähkösumutus lähde, ja Xcalibur väyläohjainten ohjelmisto. Peptidit erotettiin kvartsilasikapillaarikolonnissa (100 pm x 18 cm) pakattuna käänteisfaasihartsin kanssa (Jupiter C18, 3 um, 300 Ä; Phenomenex), ja yhdistettynä in-line, sulatettua (generoidaan nestemäinen silikaatti Kasil) trapping sarake (100 pm x 4 cm) on myös pakattu C18-hartsia (Jupiter C18, 5 um, 300 Ä, Phenomenex) [31]. Bifaasinen kaltevuus kromatografinen eluointi käytettiin jolloin liikkuva faasi A koostui 0,1% muurahaishappoa ja liikkuva faasi B koostui 0,1% muurahaishappoa asetonitriilissä. Virtausnopeus lastaamisen ja suolanpoisto vaiheessa gradientti oli 1,5 ul /min ja erotuksen aikana faasi oli 500 nl /min. 184 min gradientti suoritettiin 10 minuutin pesun aikana siirretään tuhlata jälkeen pre-column (100% liuotinta A 10 ensimmäisen minuutin ajan, sen jälkeen gradientilla 98% liuotinta A, v /v, 15 min) mahdollistavat poistetaan kaikki jäljellä suoloja. Sen jälkeen pesun aikana, kaltevuus nostettiin 35%: iin B 125 min, minkä jälkeen se kasvoi 90% B 140 min ja pidettiin 9 min ennen palaamista alkuehdot. Tandem-spektrit saatiin käyttäen data-riippuvainen skannaus tila, jossa yksi täysi MS scan (m /z 300-2000) oli hankittu Orbitrap resoluutiolla 60000. Suurin injektio oli 1 s. Data riippuvainen MS /MS skannaa hankittiin viiden voimakkain ionien täysi tarkistus käyttämällä eristämistä leveys 2 m /z, aktivointi aika 30 ms, 30% normalisoitu törmäys energiaa, ja enintään injektio aika 150 ms .

parantamiseksi havaitsemisen fosfopeptidejä, ylimääräinen data-riippuvainen algoritmin Xcalibur ohjelmisto oli käytössä, jossa läsnä on vallitseva fosfaatin neutraali menetys (97,97, 48,99 ja 32,66 m /z yksikköä) synnyttäisi hankinta MS /MS /MS [32]. Sallia kokoelma MS /MS-spektrit alemmista runsaasti peptidejä, entinen tavoite valittujen ionien MS /MS oli dynaamisesti jätetty listan pituus on 150 ionien ja aika 60 s. ”Monoisotooppinen esiaste valinta” oli käytössä ja lataus valtioiden 1+ ja 4+ jätettiin huomiotta MS /MS. Instrumentti toimi esikatselutilassa mahdollistaa samanaikaisen kokoelma MS /MS-spektri aikana Orbitrap skannauksen. Yleiset massaspektrometrisia olivat seuraavat: spray jännite, 2,2 kV; no tuppi ja ylimääräisiä kaasun virtaus; ion siirtoputken lämpötilassa, 200 ° C; ja putki linssi jännite 80 V.

Tietokanta etsimistä, suodatus, ja väärien löytö nopeudenmääritystiedot

menetelmät olivat samanlaisia ​​tietokantaan hakuja strategioita aiemmin kuvattu [28], vähäisin muutoksin. Thermo RAW muuttuivat DTA Tiedostojen ScanSifter algoritmia (Vanderbilt University), sitten etsitään TurboSEQUEST V.27 (rev. 12) algoritmia (Thermo Electron) vasten hiiren /ihmisen alaryhmä UniRef100 tietokannan, joka purettiin laskemiseen väärien löytö korko. Haut tehtiin mahdollistaa seuraavat ero muutoksin: +57 kysteiini- (for carboxyimidomethylation maasta jodiasetamidi), +16 metioniinin (hapetus), ja +80 on Ser, Thr tai Tyr (fosforylaatio). MS /MS /MS-spektrit myös etsinyt -18 massa työvuoron Ser, Thr tai Tyr tilille nestehukka, joka johtuu neutraalin menetyksen fosforihappoa. Peptidi ja ioniosan toleranssit asetettiin 2,5 Da ja 1,0 Da, vastaavasti.

False-löytö oli arvioitiin sitten peptidi ottelut käännetyn sekvenssit kerrottuna kahdella ja jaettuna kokonaismäärä peptidin osumia. Peptidit haetaan tietokannasta hakualgoritmit 5% vääriä-löytö korko oli edelleen suodatetaan kolme uutta vaihetta. Ensinnäkin pisteet kynnys asetettiin riippuen peptidi luokka. Käyttömaksuluokkaan 1-peptidejä, peptidejä valittu xcorr suurempi tai yhtä suuri kuin 1, RSP on alle tai yhtä suuri kuin 5, ja Sp on suurempi tai yhtä suuri kuin 350; käyttömaksuluokkaan 2 peptidejä, oli vahvistettu xcorr 1,8, RSP 5, ja Sp 350; käyttömaksuluokkaan 3 peptidejä, oli vahvistettu xcorr 2,5, RSP 5, ja Sp 350. Toiseksi vain peptidit, joilla on vähintään tyrosiinin ja fosforylaatio oli säilytetty. Lopuksi jäljellä peptidin osumia, vain pTyr sisältävät peptidit, joissa on ainakin yksi kolmesta lisäkriteereitä säilyttivät (1) ainakin kahta samanlaista spektri oli xcorr arvojen yläpuolella korkea kynnys (3.3 vastaa 3, 2.2 vastaa 2 , ja 1,5 vastaa 1), (2) pTyr sivusto on itsenäisesti tunnistettiin kaksi tai useampia erillisiä peptidejä, tai (3) pTyr sivusto oli itsenäisesti tunnistettu muualla sisältyvät PhosphoSite online-resurssi on

in vivo

fosforylaatiopaikat, versio 1.5 (https://www.phosphosite.org) ylläpitämä Cell Signaling Technology, Inc.

Kaikki alkuperäiset massaspektrometria dataa xenograph kasvain kokeiluja on tehty julkisesti saatavilla Chorus verkossa massaspektrometrialla data resurssi (https://chorusproject.org/). Kanssa Chorus käyttäjätilin tahansa osan näistä raakadatan voi ladata tai katsella verkossa. Vaihtoehtoisesti nämä tiedot voidaan ladata suoraan 2,8 Gt tiedosto rekisteröitymättä at: https://chorusproject.org/anonymous/download/experiment/-2997969850554343767).

Vasta-aineet ja immunoblottaus

Cell näytteet kerättiin 24 h dasatinibialtistusta. Ksenografti kasvain kerättiin 4 h tai 24 h jälkeen viimeisen antamisen dasatinibia. Kasvaimet jäädytettiin nestetypessä, sitten homogenoitiin ja laimennettiin 1 ug /ul lyysipuskuria. Välillä 20 ja 40 ug kokonais-proteiinia kustakin näytteestä ladattiin 7,5-12% SDS-PAGE-geeleissä ja erotettiin elektroforeesilla ennen siirtämistä PVDF-kalvoille (PerkinElmer). Membraanit blokattiin yön yli 4 ° C: ssa tris-puskuroidussa suolaliuoksessa 0,1% Tween-20 (TBST), joka sisälsi 5% w /v rasvaton kuiva maitojauhetta. Sen jälkeen, kalvot immunoblotattiin vasta-aineita p-Src Y416 (Cell Signaling # 6943S), yhteensä Src (Cell Signaling # 2107), p-PKCδ Y313 (Cell Signaling # 2055S), yhteensä PKC (Cell Signaling # 2058), p- RPTP Y789 (Cell Signaling # 4481S), yhteensä RPTP (Upstate # 07-472), β-aktiini (Cell Signaling # 4967), ja β-tubuliinia (Cell Signaling # 2128). Kosketustoiminto tapahtui 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa vasta-aineiden kanssa laimennetun ehdottivat toimittajien TBST: ssä, jossa 3% naudan seerumin albumiinia (BSA), minkä jälkeen inkuboitiin 1 h huoneenlämpötilassa lajien sopivia piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Jackson ImmunoReserach) laimennettu 1: 5000 TBST, joka sisälsi 3% BSA. Western Lightning

TM Plus-ECL (PerkinElmer) substraattia käytettiin havaitsemiseen on Xenogen IVIS 200. Densitometria suoritettiin käyttäen Living Image 3.2 ohjelmisto (Etu).

Sferoidiviljelmiä kasvun analyysi

Serial mikroskooppikuvia solujen pallosia 0, 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua dasatinibihoidon hoitoon tuotiin ImageJ ohjelmistopaketti (NIH). Kuvat otettiin muunnetaan automaattisesti binary ja reikiä binaarikuvassa suljettiin käyttämällä Täytä Holes toimintoa ImageJ. Sauva valintatyökalulla käytettiin segmenttiin kaikkiin liitettyihin pikseleitä sferoidi, ja pikselien määrä tällä alueella kirjattiin. Ala kutakin sferoidiviljelmiä normalisoitiin 24 tunnin aikapisteessä.

immunohistokemia

Heti uhri, kasvain näytteitä poistetun kasvaimen kiinnitettiin 10% formaliinilla 24 h ja siirrettiin 70% etanolia. Sitten näytteet käsitellä parafiiniupotusta ja leikattiin ennen immunovärjäyksen. Seuraavat leikkuu, kudosnäytteet parafiini, vedettömät, ja antigeeni haku vaihe suoritettiin käyttäen sitraatti- puskuria (pH 6,0) levitetty liuos 20 minuutin ajan 105 ° C: ssa ja sen jälkeen 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten näytteet käsiteltiin 3% H

20

2 poistamiseksi endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus. Leikkeet tämän jälkeen tukittiin seerumittomalla proteiinin esto-reagenssia 20 minuuttia. Serial leikkeitä inkuboitiin yön yli 1: 100 laimennos p-PKCδ pY313 (Cell Signaling # 2055S) vasta-aine tai p-SHIP2 Y986 /987 (Cell Signaling # 2008). Havaitseminen primaaristen vasta-aineiden käytössä Envision + Systems (Dako) piparjuuriperoksidaasi leimattu polymeeri (30 min inkubaation), minkä jälkeen lisättiin DAB-substraatti (5 min inkubaatio). Stained näytteet kuvattiin at 40x suurennos ja analysoitiin ilmentymisen histologista markkereita.

Tulokset

Fosfotyrosiinipitoisuus proteomiin viljeltyjen ihmisen HCT-116 peräsuolen solujen

aiemmin teki laajan analyysin fosfotyrosiinivasta- proteomiin Src- transformoitujen hiiren fibroblastien

vuonna vitro

[28]. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli suorittaa samanlainen analyysi luonnehtia pY proteomiin ihmisen CRC solulinjaa ja sitten laajentaa lähestymistapa etsimään mahdollisia pY biomarkkerit dasatinibin reagoimattomuus HCT-116 ksenograftikasvaimissa.

Aluksi pyrimme luonnehtia pY proteomiin viljeltyjen HCT-116-solujen puuttuessa dasatinibia hoitoa. 15 riippumaton LC-MS /MS kulkee (5 biologinen rinnakkaisnäytteiden kukin tukee 3 tekninen toistoa), 249 erillistä pY peptidejä tunnistettiin. Nämä peptidit ovat 162 erillistä pY sivustoja 116 eri proteiineja. Kriteerit peptidi säilyttäminen myös korkean kynnyksen xcorr arvon ja tunnistaminen 1. biologinen jäljitellä. Taulukossa S1 esittää säilytti peptidit ryhmitelty toiminnallinen luokitus, pY sivusto aminohappoasemassa, määrä riippumattomia tunnistusten (spektrin määrä), ja korkein xcorr arvoja. Luettelon hyväksytyistä pY peptidien ja spektrin count data tarjoaa kokonaiskuvan pY signalointi toiminnan HCT-116 soluja olosuhteissa yksikerroksisen soluviljelmässä. Noin puolet pY sivustoja listattu edustavat proteiinikinaasien (44/162) ja muut viestintäproteiinit (38/162), kun taas toinen 25% sivustot ovat proteiineja, jotka liittyvät soluadheesiota ja aktiinisytoskeletonin (40/162) (Kuva 1A).

viljelty HCT-116-solut, 162 pY sivustoja tunnistettiin jotka edustavat 116 erillisiä proteiineja (A). Proteiinit luokitellaan suuren luokan Adhesion ja Cytoskeleton, Proteiinikinaasit, ja muut signalointi noin kolmea neljäsosaa koko. Niistä pY sivustoja proteiinikinaasien, valtaosa ovat tavanomaisia ​​tyrosiinikinaaseja ja ”CMGC Group” proteiinikinaasien joka sisältää CDK, ERK /MAPK, GSK-3, ja muut dual-spesifisyys kinaasien. Katso taulukko 1 ja taulukko 2 on luettelo yleisimmin sijoituspaikat spektrin count in HCT-116-soluissa. Kaikki 162 sivustot on esitetty taulukossa S1 yhdessä keskeiset tiedot mukaan lukien UniProt tietuenumero, fosfopeptidit havaittu LC-MS /MS-analyysia ja koko spektrin tunnukset. HCT-116 ksenograftikasvaimissa, 71 pY sivustoja tunnistettiin jotka edustavat 58 erillisiä proteiineja (B). Säilyttäminen kriteerit sivustot olivat 7 tai enemmän spektrinen tunnukset kasvaimissa ja havaitsemiseen myös HCT-116 soluviljelmässä. 71 pY sivustot edustavat 58 erillisiä proteiineja. Kasvaimen täyttävien säilyttämistä kriteerit on toiminnallinen hajautus, hyvin samanlainen kuin määritetyillä alueilla viljellyissä soluissa. Katso taulukko 3 ja taulukko 4 on luettelo Top Sites spektrin count in HCT-116 -ksenografteja. Kaikki 71 sivustot on esitetty taulukossa S2 sekä keskeiset tiedot mukaan lukien UniProt henkilötunnus, fosfopeptidit havaittu LC-MS /MS-analyysia ja määrä spektrin tunnuksia käsittelemättömästä

versus

dasatinibia saaneista kasvaimia.

Niistä proteiinikinaasi pY sivustoja, tunnistimme 24 sivustoja 14 eri tyrosiinikinaaseja ja 15 sivustoja 14 eri CMGC kinaasien. CMGC kinaasit (laaja luokitus ryhmään kuuluu CDK, ERK /MAPK, GSK-3, ja perheet dual-spesifisyys kinaasien) olivat näkyvästi yleisimmin tunnistettu HCT-116 sivustoja (taulukko 1). CDK1 pY15 oli kaikkein havaittu sivuston 146 spektrin laskee. Kinaasidomeeni aktivointi silmukan päällä (pY1234) markkinatalouskohtelusta, hepatosyyttikasvutekijän reseptori tyrosiinikinaasin, oli toiseksi useimmin tunnistettu sivuston HCT-116 viljelty solu profiilin 74 spektrin laskee. Muita kärkipään sivustoja CMGC kinaasien (mukaan lukien PRP4, ERK2, DYRK1 ja GSK-3) on myös asuu kinaasidomeenissa aktivointi silmukoita missä fosforylaation ilmaisee aktivoituun tilaan. Olemme tunnistaneet useita sivustoja HCT-116-solut, joita ei havaittu edellisessä laaja analyysi MEF [28], Taulukko 2.

Protein

toiminnallinen luokka Sivuston

tunnukset

CDK1Protein Kinase: CMGCY15146METProtein Kinase: tyrosiini * Y123474PRP4Protein kinaasin: CMGC * Y84969CDCP1Adhesion: Cell /ECM Y70747PaxillinAdhesion: Cell /ECMY11841ERK2Protein kinaasin: CMGC * Y18736SHBOther SignalingY24632Annexin A2Other SignalingY2429DYRK1AProtein kinaasin: CMGCY32126SHBOther SignalingY26824LAP2 /ErbinOther SignalingY110424Catenin δ-1Adhesion: Cell /CellY22824GSK-3Protein Kinase: CMGC * Y27922Table 1. Kaikki fosfotyrosiinivasta- sivustot useimmin havaittu HCT-116 soluviljelmässä.

* Site proteiinikinaasidomeenin aktivointi silmukka lyhenteet: CDCP1, CUB domain sisältävä proteiini 1; CDK1, Solunjakautumisen ohjaus proteiini 2 homologi; DYRK1A, Dual spesifisyys tyrosiini-fosforylaation-säädellään kinaasi 1A; ERK2,-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin 1; GSK-3, Glykogeenisyntaasikinaasi-3 (alfa ja beeta); MET, Hepatosyyttikasvutekijä reseptori; PRP4, seriini /treoniini-proteiinikinaasi PRP4 homologi; SHB, SH2 domain sisältävä sovitin proteiini B. CSV Lataa CSV Protein

toiminnallinen luokka Sivuston

tunnukset

CDCP1Adhesion: Cell /ECMY70747DCBLD2MiscellaneousY75019PKCδProtein Kinase: AGCY31318FAT1Adhesion: Cell /CellY424416MST1R /RONProtein Kinase: tyrosiini * Y123815Annexin A2Other SignalingY3014DCBLD2MiscellaneousY73214TYK2Protein Kinase: TyrosineY29213FYNProtein Kinase: tyrosiini ** Y21311LYNProtein Kinase: tyrosiini ** Y19311Table 2. Fosfotyrosiini sivustoja ei löydy edellisessä laaja analyysi viljeltyjen MEF

(28) B * Site proteiinikinaasidomeenin aktivointi silmukan ** Site in Src-ryhmän kinaasien SH2 domainAbbreviations: CDCP1, CUB domain sisältävä proteiini 1; DCBLD2, Discoidin, CUB ja LCCL domain sisältävä proteiini 2; -rasva1, Protocadherin Fat 1; FYN, tyrosiini-proteiinikinaasin Fyn; LYN, tyrosiini-proteiinikinaasin Lyn; MST1R /RON; Makrofagin stimuloiva proteiini-reseptori; PKCδ, proteiinikinaasi C delta tyyppi; Tyk2, Non-reseptori tyrosiini-proteiinikinaasi Tyk2. CSV Lataa CSV

Fosfotyrosiinipitoisuus proteomiin HCT-116 ksenograftikasvaimissa

saatuaan pY profiilia HCT-116-soluille, PY proteomiikan strategiaa käytettiin sitten tunnistamaan HCT-116 pY sivustoja, jotka ovat näkyvä ksenograftikasvaimissa ja joilla on mahdollisuuksia toimia biomarkkereita dasatinibilla reagointikykyä. Ihon alle HCT-116 ksenograftikasvaimissa perustettiin kateenkorvattomissa nude-hiirissä ja pY-rikastettu trypsiinipeptidit valmistettiin kustakin 3 kasvainten sekä ajoneuvon-käsitellyistä hiiristä ja hiiristä, jotka oli käsitelty 4 tuntia aikaisemmin 60 mg /kg dasatinibia. Kukin peptidi valmiste analysoitiin läpi kolmeen rinnakkaiseen LC-MS /MS kulkee saada kasvain pY profiileja. Tämän analyysin 71 pY sivustoja, jotka edustavat 58 eri proteiineja, oli tunnustettu näkyvämpi ksenograftikasvaimissa samoin kuin on havaittu viljellyissä soluissa (taulukko S2). Samanlainen viljelty solu profiilia, useimmat näistä alueista olivat signalointi proteiineja (mukaan lukien monet proteiinikinaasien) ja tarttuvuus /solun tukirangan liittyvien proteiinien (kuvio 1 B). Tyrosiinikinaasit ja CMGC proteiinikinaasien olivat jälleen näkyvästi kasvain profiilin. Sivustot CMGC kinaasien hallinnut listan useimmin tunnistettu tuumorikohdat kuten CDK1 Tyr15, ja aktivointi silmukka sivustoja p38 MAPK, PRP4, ERK1, ERK2 ja GSK-3 (taulukko 3).

Proteiini

toiminnallinen luokka Sivuston

tunnukset (käsittelemätön, 4hr Das) B CDCP1Adhesion: Cell /ECM Y70790, 14CDK1Protein Kinase: CMGCY1585, 80PKCδProtein Kinase: AGCY31372, 10p38α MAPKProtein Kinase: CMGC * Y18259 , 35PRP4Protein Kinase: CMGC * Y84949, 45ERK2Protein Kinase: CMGC * Y18735, 31ERK1Protein Kinase: CMGC * Y20430, 27RPTPαOther SignalingY79827, 1β-actinCytoskeletonY5522, 24GSK-3Protein Kinase: CMGC * Y27919, 22Annexin A2Other SignalingY3019, 5Histone H4MiscellaneousY8919, 17Table 3. Fosfotyrosiini sivustoja useimmin havaittu hoitamattomilla HCT-116 ksenograftikasvaimissa: vertailu dasatinibille hoidetuista eläimistä.

* sivusto aktivointi silmukan proteiinikinaasidomeenin lyhenteet: CDCP1; CUB domain sisältävä proteiini 1; CDK1, Solunjakautumisen ohjaus proteiini 2 homologi; ERK1,-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin 3; ERK2,-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin 1; GSK-3, Glykogeenisyntaasikinaasi-3 (alfa ja beeta); p38a MAPK,-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin 14; PKCδ, proteiinikinaasi C delta mukaan, joten PRP4, seriini /treoniini-proteiinikinaasi PRP4 homologi; RPTPα, Receptor-tyypin tyrosiini-proteiinifosfataasi alfa. CSV Lataa CSV

CDCP1 pY707 (90 spektrin määrä), PKCδ pY313 (72 spektrin määrä), ja PKCδ pY334 (14 spektrin määrä) olivat useimmin sijoituspaikat käsittelemättömästä ksenograftikasvaimissa. Dasatinibi hoito vähentää huomattavasti tunnistamista taajuuden kaikki kolme paikkaa (taulukko 3, taulukko 4), sopusoinnussa niiden ollessa tavoitteita Src-perheen kinaasien. Sen sijaan sivustoja CMGC kinaasien (ei katsota fosforyloituu dasatinibia herkkien kinaasien) havaittiin yhtä usein sekä käsittelemättömiä ja dasatinibia saaneista kasvaimia. Muut näennäinen dasatinibia vastanneilla sivustoja yleisimmin tunnistettu ajoneuvon hoidetuilla kasvaimia mukana pY798 päälle RPTPα ja pY30 päälle anneksiini A2 (taulukko 3). RPTPαpY798 tunnistettiin 27 spektriä käsittelemättömästä kasvaimia, mutta vain kerran dasatinibia-käsiteltyjen näytteiden.

Proteiini

toiminnallinen luokka Sivuston

tunnukset (käsittelemätön, 4hr Das) B RAIG-1Muut SignalingY34715, 1PKCδProtein Kinase: AGCY33414, 0SHC1Other SignalingY42713, 0α-enolaseMetabolic EnzymeY4413, 3SHIP2Other SignalingY98611, 0Table 4. muita merkittäviä dasatinibia vastanneilla fosfotyrosiini- määritetyillä alueilla hoitamattomilla HCT-116 ksenograftikasvaimissa: vertailu dasatinibille hoidetuista eläimistä.

lyhenteet: PKCδ, proteiinikinaasi C delta tyyppi; PRP4, seriini /treoniini-proteiinikinaasi PRP4 homologi; RAIG-1, Retinoiinihappoa aiheuttama proteiinin 3; SHC1, SHC-muuttamalla proteiini 1; SHIP2, Fosfatidyyli-3,4,5-trisfosfaatti 5-fosfataasi 2. CSV Lataa CSV

Immunoblottausmääritys vahvistaa dasatinibille reagointikykyä PKCδ pY313 ja RPTPα pY798 sivustoja HCT-116 ksenograftikasvaimissa

Niistä näkyvin dasatinibin -responsive pY sivustoja identifioitiin phosphoproteomic analyysi HCT-116 ksenograftikasvaimissa (taulukko 3, taulukko 4), fosfori-spesifisiä vasta-aineita on kaupallisesti saatavilla PKCδ pY313, SHIP2 pY986 /987 ja RPTPα pY798. Näitä vasta-aineita käytettiin vahvistamaan dasatinibille reagointikykyä näistä alueista suhteessa Src esto (määritetty käyttäen fosfospesifiselle vasta-ainetta vastaan ​​Src pY416 autofosforylaatiokohta). Sekä PKCδ pY313 ja RPTPα pY798 sivustoja, immunoblottauksella fosfo-spesifisten vasta-aineiden osoitti vähentyneen merkittävästi fosforylaation 4 h dasatinibiryhmän-käsitellyt tuumorit samanaikaisesti Src inhibition (kuvio 2A). Fosforylointireaktio asema näiden jäämien palasivat lähelle lähtötasolle 24 tunnin kuluttua altistuksesta, mikä viittaa kestävyyttä Src eston tässä mallissa oli ohimenevä yhdellä hallinnon.

Immonoblot analyysi PKCδ pY313 ja RPTPα pY798 ksenograftikasvaimissa suhteessa Src pY416 kerta farmakologisen annoksen (A) tai 5 päivittäistä annosta dasatinib (B). Ksenograftikudoksista arvioitiin 4 h ja 24 h seuraava dasatinibialtistusta. Sekä PKCδ pY313 ja RPTPα pY798 korreloivat Src esto in HCT-116 -ksenografteja. Lisäksi yhden annoksen, vakaan tilan hoito-ohjelmaan (B) johti pitkäaikaiseen Src esto mitattuna 24 tuntia sen jälkeen dasatinibialtistusta ja korreloivat alentuneesta PKCδ pY313 ja RPTPα pY798.

arvioimiseksi vaikutusta dasatinibin hoidon kesto kestävyydestä Src esto, HCT-116 kasvaimia käsiteltiin 5 päivittäisiä annoksia dasatinibin arvioitiin western blot analyysi määrittää vasteen tunnistettujen tähteiden vakaissa lääkkeen antamisen.