Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

tiedetään vain vähän molekyylejä, jotka edistävät kasvua epiteelin munasarjojen karsinoomien (EOC), jotka ovat edelleen kaikkein vaarallisin gynekologinen syöpä naisilla. Kemokiiniryhmä fraktalkiini /CX

3CL1 on laajasti raportoitu pelata biologisesti relevantti osassa kasvaimen kasvua ja leviämistä. Raportoimme tässä ensimmäinen tutkimus ilmaisun ja roolia CX

3CL1 vuonna EOC.

Tulokset

epiteelisolut pinnalta munasarja ja munanjohtimien ja hyvänlaatuinen, rajatapaus ja pahanlaatuiset kasvaimet kaikki värjättyä positiivinen CX

3CL1. Kasvaimen näytteet 54 naisia, joille tehtiin kirurginen hoito EOC diagnosointiin, CX

3CL1 immunoreaktiivisuus epätasaisesti epiteelikasvainsolut, ja vaihtelivat vahva (33%) ja poissa (17%). Tämä epätasainen jakautuminen CX

3CL1 ei heijastanut morfologisia heterogeenisyys EOC. Se korreloi positiivisesti leviämisen indeksin Ki-67 ja GILZ (glukokortikoidien aiheuttamiin Leusiinivetoketju), aiemmin tunnistettu aktivaattorina leviämisen pahanlaatuisten EOC soluja. Hierarkkinen klusterointi analyysi, mukaan lukien ikä diagnoosin, kasvaimen, FIGO vaiheessa Ki-67-indeksi, CX

3CL1, SDF-1 /CXCL12 ja GILZ immunovärjäämällä tulokset, erottaa kaksi suurta klusterit vastaten matala ja korkea leviämisen ja erilaisten kannalta GILZ ja CX

3CL1 ilme.

GILZ

yli- ilmeneminen kohdunkaulan johdettujen BG1 solulinja aiheutti rinnakkaisia ​​muutoksia CX

3CL1 tuotteita. Kääntäen, CX

3CL1 edistetään sen sitoutumisen CX

3CR1 AKT aktivoitumista ja lisääntymistä BG1 soluissa. Vuonna hiiren ihonalaisen ksenograftimallia, yliekspressio

GILZ

liittyi korkeampi ilmentyminen CX

3CL1 ja nopeampaa kasvaimen kasvua.

Johtopäätös

havainnot korostavat sitä, aiemmin unappreciated konstitutiivinen ilmentyminen CX

3CL1 edellisen tuumorigeneesiä munasarjaepiteelisoluilla. Yhdessä GILZ, tämä kemokiini nousee säätelijänä solujen lisääntymistä, joka voi olla potentiaalista kliinistä merkitystä valinnassa sopivin hoito EOC potilaille.

Citation: Gaudin F, Nasreddine S, Donnadieu AC, emilie D, Combadiere C, PREVOT S, et ai. (2011) tunnistetiedot Kemokiini CX

3CL1 uutena Regulator pahanlaatuisia soluproliferaation epiteelikasvaimet munasarjasyöpä. PLoS ONE 6 (7): e21546. doi: 10,1371 /journal.pone.0021546

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 23, 2011; Hyväksytty: 1 kesäkuu 2011; Julkaistu: 07 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Gaudin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Ligue contre le syöpä (Comité Val d’Oise), Institut National de la Sante et de la Recherche médicale (INSERM), Université Paris-Sud, ja Euroopan unionin FP6 (INNOCHEM myöntää määrä LSHB-CT -2005-518167). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) muodostaa kuudenneksi yleisin syöpä ja viides johtava syy syövän liittyvät kuolemat naisten kehittyneissä maissa [1]. Koska hiljainen luonne varhaisvaiheen tauti, useimmat naisten EOC ovat laajalle levinneenä tautina (

eli

laajeneminen vatsakalvon ja etäpesäke omentum) aikaan diagnoosin ja läsnä edenneen taudin, jossa viisi- vuoden eloonjäämisaste alle 30% [2]. Huolimatta yleisyys ja kuolleisuus EOC, etiologinen tekijöitä munasarjan syövän synnyn edelleen huonosti määritelty, rajoittamalla tehoa hoitomenetelmistä.

epiteelituumori microenvironment koostuu monimutkainen kudos, joka sisältää useita solutyyppejä. Useimmat näistä solut tuottavat ja /tai reagoida kemokiinien, jotka voivat avainasemassa kehitettäessä ja etenemistä ensisijainen kasvaimia [3] – [5]. Olemme osoittaneet, esimerkiksi, että α-CXC-kemokiinin stroomasolulinja-Derived Factor-1 SDF-1 /CXCL12 edesauttaa immunosuppressiivisten verkon sisällä kasvain microenvironment, erityisesti orchestrating rekrytoimalla ennalta DC2s [6]. Olemme myös osoittaneet, että CXCL12 säätelee kasvaimen angiogeneesiä ja että tämä on kriittinen kasvaimen kasvu [7]. Sitä vastoin vain vähän jos jotain tiedetään roolista kemokiinin fraktalkiini /CX

3CL1 vuonna EOC, vaikka se on osoituksena välittävän vahva soluadheesiota [8] ja sen läsnäolo epiteelikudoksissa on laajalti dokumentoitu [9] – [10]. CX

3CL1 esiintyy kahdessa muodossa. Kalvo-ankkuroitu muoto välittää hyvä pysyvyys ilmentävien solujen oman reseptoria, CX

3CR1, endoteeliin fysiologisessa virtaus, oman luontainen tarttuvuus toiminta ja läpi integriinin aktivaation [11] – [12]. Liukoinen muoto vapautuu pilkkomalla paikassa, joka on lähellä kalvon [13]. Kuten muut tavanomaiset kemokiinien, se rekrytoi immuunijärjestelmän soluihin, joissa CX

3CR1, kuten T-lymfosyyttien ja sytotoksisten NK-solut, dendriittisolut tai suuri alapopulaatio CD14

+ monosyyttien [8]. Seurauksena sekä tartunta- ja kemoatrak- toiminta kemokiinin, CX

3CL1 /CX

3CR1 kompleksi voi välittää joko pro- tai anti-kasvain vaikutuksia [14]. Haiman adenokarsinooma soluissa laakeri CX

3CR1 tarttuvat spesifisesti CX

3CL1 ilmentävien solujen hermoston alkuperää ja siirtyä vastauksena CX

3CL1 tuottama neuronien ja hermo kuituja, edistää hermoa levittämistä haimasyövän [15 ]. Eturauhassyövän solut, jotka ilmentävät CX

3CR1 kiinni ihmisen luuytimen endoteelisolujen ja siirtyvät kohti keskipitkän conditioned osteoblastit, jotka erittävät liukoisen muodon kemokiinin edistää suuri todennäköisyys syöpäsolujen metastasizing luustoon [16] – [17]. Sitä vastoin liukeneva CX

3CL1 (SCX

3CL1) julkaistiin kasvaimen mikroympäristössä voi olla aktiivinen komponentti kasvaimen vastaisen vasteen [18] – [21], jolloin hiirten rokottaminen karsinoomasoluja muunnettu tuottaa CX

3CL1 voimakas kasvaimen vastainen vaste, koska kemoattraktiota NK-solujen [22], tai tehdä CX

3CL1 ilmentymistä koolonkarsinoomasoluissa tekijä, joka vähentää merkittävästi niiden metastaattista potentiaalia [23].

Tässä työssä olemme tutkineet ilmaus CX

3CL1 terveillä ja pahanlaatuisia munasarjojen kudoksiin ja sen rooli leviämisen pahanlaatuisia munasarjojen epiteelisolujen. Tämä kemokiini tuotti sekä terveillä että pahanlaatuisia munasarjojen epiteelin soluja, ja sen tuotanto EOC korreloi positiivisesti solun lisääntymistä indeksiin. Kiinnostavaa kyllä, se oli myös korreloi ilmentymisen glukokortikoidien aiheuttaman leusiinivetoketjun (GILZ), 17 kDa leusiinivetoketju- proteiini löydettiin kuin deksametasoni-indusoitu transkriptio hiiren tymosyyttien ja että olemme viime aikoina osoitettu lisäävän soluproliferaatiota EOC ja aktivoida AKT, ratkaiseva signalointi molekyyli kasvainten synnyssä [24], [25]. Meidän löydökset tukevat rinnakkaisten ja täydentäviä tietoja kertyneet kasvain potilas jolta näyte todettiin EOC, että BG-1 munasarjasyövän solulinja ja hiiren ihonalaisen ksenograftimallissa. Ne tarjoavat lisää tietoa roolista CX

3CL1 pahanlaatuisia solujen lisääntymisen ja kasvaimen kasvua, tiiviisti GILZ.

Tulokset

Detection of CX

3CL1 terveillä ja pahanlaatuiset munasarjojen kudoksiin

Matkapuhelinverkko ilmaus CX

3CL1 tutkittiin immunohistochemisty (IHC) kohdissa eristettiin kolme tervettä munasarjat, kahdeksan serous ja mucinous hyvänlaatuisia kasvaimia (jotkut vielä sisältävä normaali munasarjakudoksen), kahdeksan serous ja mucinous rajatapaus kasvaimet, kaksi munasarjan kasvaimet, ja 54 yksilöiden invasiivisia EOC. CX

3CL1 havaittiin selvästi munasarjoissa pintaepiteelissä (OSE) solujen ja epiteelin munanjohtimien (kuvio 1A). In vakavien ja mucinous hyvänlaatuisia ja raja kasvaimia, CX

3CL1 immunoreaktiivisuus havaittiin lisääntyvissä kasvainsoluissa, jotka ovat peräisin epiteelin (kuvio 1, B ja C). CX

3CL1 ekspressiota havaittiin EOC yksilöihin, mukaan lukien vakavien, kirkas-solu, endomet- ja mucinous histologisia alatyyppejä (kuvio 1 D). Näissä kasvaimissa, se on havaittu lähinnä pahanlaatuisten solujen, mikä kasvainsolut merkittävin lähde CX

3CL1 in EOC. Tämän mukaisesti havainnon, CX

3CL1 havaittiin epiteelisoluissa pahanlaatuisia askites, korkeasti ilmaisun CD326

+ murto (kuva 1 E). CX

3CL1 rajoittui sytoplasmaan pahanlaatuisten epiteelisolujen ja ei havaittu ytimeksi. CX

3CL1 puuttui ei-epiteelin munasarjan kasvaimet (kuvio 1 F).

(A) terve munasarja, CX

3CL1 immunoreaktiivisuuden OSE (i) ja munanjohdin (ii) . (B) seroosit (i) ja mucinous (ii) hyvänlaatuiset munasarjojen kasvaimia. (C) seroosit (i) ja mucinous (ii) rajatapaus munasarjojen epiteelin kasvaimissa. (D) pahanlaatuiset epiteelin munasarjakasvaimia: mucinous (i), endomet- (ii), kirkas-solu (iii) ja vakavien (iv), CX

3CL1 immunoreaktiivisuus epiteelisoluissa rajoittuu sytoplasmaan, mitään värjäytymistä tumissa kasvainsolujen. (E) Cytocentrifuged CD326

– ei epiteelin (i) ja CD326

+ epiteelin (ii) solut eristetään maligni askites kerättiin potilaalta on diagnosoitu invasiivisia EOC. CX

3CL1 havaitaan CD326

+ soluja ja myös joissakin CD326

– soluja. (F) Ei-epiteelin munasarjojen follikkeliepiteelisolujen kasvain, puuttuminen CX

3CL1 immunovärjäyksen. (A-F) Suurennuskerroin 40.

Lähetti-RNA CX

3CL1 tehtiin näkyväksi RT-PCR, joka tuotti tuotteen odotetun koon (387 emäsparia) kolmelta terve munasarja näytettä kuudessa yksilöitä hyvänlaatuisia munasarjakasvainten, kolme rajatapaus yksilöitä ja yhdeksän EOC yksilöitä. Se havaittiin myös, että BG1, SKOV3 ja OVCAR3 munasarjasyövän solulinjoissa. Edustavat tiedot on esitetty kuviossa 2A. MRNA: n määrä kvantifioitiin reaaliaikaista PCR viidellä EOC yksilöitä. Se korreloi positiivisesti intensiteetti IHC värjäytymisen seitsemän pisteen asteikolla (Spearmanin testi,

P

0,05, r = 0,88) (kuvio 2B). 90-kDa: n proteiini, joka vastaa odotettua kokoa täyspitkän CX

3CL1, havaittiin EOC biopsianäytteissä, ja CD326

+ epiteelisolujen maligni askites ja SKOV3, BG1 ja OVCAR3 soluja (kuvio 2C). CX

3CL1 on kalvoon sitoutunut molekyylin kanssa kemokiinin verkkotunnus musiinialue kaltainen varsi. Pilkkominen juuressa tämän varren metalloproteinaaseilla synnyttää liukoista kemokiini, joka toimii klassisen kemoattraktantti [13]. Sitten tutkittiin, SCX

3CL1 vapautui munasarjasyöpäsoluja. Se havaittiin maligni askites (vaihtelee 1,3-1,5 ng /ml). Teimme myös ELISA määritykset viljelmäsupernatanteista. Suurimmat määrät SCX

3CL1 otettiin talteen viljelmän supernatantista OVCAR3 soluja, jotka antoivat vahvimman signaalin western blotissa (Kuva 2D). Meidän havainnot korostavat sitä aiemmin unappreciated ilmentämällä CX

3CL1 terveellisistä epiteeliin munasarja pinnan ja munanjohtimet, mikä osoittaa, että EOC voivat olla peräisin joko näiden epiteelin. Olemme lisäksi paljastaa, että CX

3CL1 tuotanto pahanlaatuisia epiteelisolujen edeltää kasvaimien syntyyn.

(A)

CX

3CL1

mRNA havaita tavanomaisilla PCR odotettuun koko (387 emäsparia ) edustavia yksilöitä 2 tervettä munasarjat, 5 cystadenomas (hyvänlaatuisia kasvaimia), 2 rajatapaus kasvaimet, 5 adenokarsinoomat (pahanlaatuiset kasvaimet) ja EOC solulinjat, SKOV3, OVCAR3 ja BG1. Valkoiset pystyviiva erottaa kaistojen ei toimi samalla geelillä. (B)

CX

3CL1

mRNA kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR: llä ja ilmaistaan ​​

CX

3CL1

sisältöä normalisoitu kuin

ß-aktiini

. Kuvassa näkyy jakautumista immunovärjäyty- tulokset verrattuna määrä

CX

3CL1

mRNA: t normalisoidaan kuin

ß-aktiini

5 EOC näytteitä. Kukin symboli edustaa yksittäisen näytteen run kolmena kappaleena (keskiarvo); Spearmanin testi,

P

0,05, r = 0,88. (C) CX

3CL1 immunobloteista kokonaisproteiinia teissa EOC yksilöitä, mistä CD326

+ epiteelisolujen rikastettu maligni askites näytteitä, ja SKOV3, BG1 ja OVCAR3 solulinjoissa. CX

3CL1 proteiini, jota käytetään joko ~90 kDa. ß-aktiini tasot näkyvät normalisointia. (D) havaitseminen ELISAlla SCX

3CL1 on 24 h kasvatusalustaa BG1, OVCAR3 ja SKOV3- soluja (tiedot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta); huomaamaton SCX

3CL1 kasvualustaan ​​HEK-293T-solut (HEK), käytettiin negatiivisena kontrollina.

CX

3CL1 korreloi Ki-67 ja GILZ in EOC

CX

3CL1 immuunivärjäystä oli heterogeeninen EOC yksilöitä, ulottuen puuttuminen havaittavissa olevaa värjäytymistä (pisteet 0, 9/54) voimakkaalle immunoreaktiivisuus (pisteet 5-7, 18/54). Siksi tutkittiin, erot CX

3CL1 ilmentymistasot ilmentymiseen liittyvien kahden merkkiaineiden leviämisen: Ki-67, joka käytetään rutiininomaisesti diagnoosin [26] ja GILZ, joka äskettäin tunnistettu tekijä, joka säätelee leviämisen pahanlaatuisten EOC-solujen [25]. Immunoreaktiivisuus CX

3CL1, GILZ ja Ki-67 pisteytettiin seitsemän pisteen asteikolla perusteella värjäyksen intensiteetti ja aste värjäytyminen leikesarjojen palasia EOC 54 potilasta. Oli erittäin merkittävä positiivinen korrelaatio pistemäärät Ki-67 ja ne, GILZ, odotetusti (taulukko 1). Mielenkiintoista, merkittäviä positiivisia korrelaatioita välillä ei havaittu CX

3CL1 ja Ki-67 ja välillä CX

3CL1 ja GILZ, koko kohortin 54 potilaalla (kuvio 3, A ja B). Immunovärjäyksen pistemäärät Näiden proteiinien korreloivat myös serous syöpä ja ei vakavien karsinooma (taulukko 1).

(A ja B) CX

3CL1 ja Ki-67 lopullinen tulokset (A, Spearman testi,

P

0,01, r = 0,38) ja CX

3CL1 ja GILZ lopullinen tulokset (B, Spearman testi,

P

0,0001, r = 0,59) korreloivat positiivisesti 54 EOC yksilöt lukien vakavien (mustat neliöt) ja muiden vakavien (valkoiset neliöt) näytteet. (C) dendrogrammissa tuottama hierarkkinen agglomerative klusterianalyysillä varten 54 EOC näytteet tutkitaan, vastaan ​​ikä diagnoosin, FIGO vaiheessa grade, Ki-67, GILZ, CX

3CL1 ja CXCL12 immunoreaktiivisuus tasolla. Kaksi klustereita tunnistetaan, joilla on alhainen (ylhäällä) ja korkea (alhaalla) proliferaatiotasoja. Asiaankuuluvat näytteet on merkitty numeroin.

CXCL12, kemokiini tuotetaan munasarjasyöpäsoluja [6], on ollut mukana valvonnassa leviämisen näissä soluissa [27]. Kuten olemme aiemmin esitetty kohortin 183 potilailla [28], CXCL12 immunoreaktiivisuus syöpäsoluissa oli heterogeenistä, pistein 0 (huomaamaton tuotanto) saatu 16 potilasta ja 5.-7 (voimakas immunoreaktiivisuus) saatua kahdeksan potilasta meidän kohortti 54 potilaalla. Ei ollut mitään merkittävää korrelaatiota lopullinen pistemäärä CXCL12 ja CX

3CL1 tai lopullisia pisteitä CXCL12, GILZ ja Ki-67. Analyysi seitsemän aineistoja, kuten ikä diagnoosin, FIGO vaiheessa luokittelua, GILZ, Ki-67, CX

3CL1 ja CXCL12 immuunivaikutukset, joka perustuu agglomerative hierarkkinen klusterointi lähestymistapa paljasti kaksi suurta klustereita, mikä näkyy dendrogrammia tuotetaan tilastollisen analyysin (kuvio 3C). Tärkeimmät ominaisuudet erottaa kaksi suurta klustereita, jotka vastaavat matala ja korkea leviämisen, on esitetty taulukossa 2. Kuten odotettua, CXCL12 tuotantoa ei eronnut merkittävästi näiden kahden ryhmän välillä. Sen sijaan CX

3CL1 ja GILZ immuunivaikutukset kasvainsoluissa olivat korkeampia ryhmässä korkeampi leviämisen. Huolimatta suhteellisen pieni määrä potilaita, määrä syöpien at FIGO vaiheissa III ja IV oli merkitsevästi korkeampi korkean leviämisen ryhmä. Sen sijaan ikä diagnoosin ja laatu eivät eronneet näiden kahden ryhmän välillä. Täten korkeampia leviämisen liittyivät säätelyä GILZ ja CX

3CL1 ilme.

GILZ ylössäätelee CX

3CL1 ilmaisu

immunohistokemiallinen tiedot osoittivat selvästi, että GILZ tasot pahanlaatuisia soluja korreloi positiivisesti CX

3CL1 tasolla, mikä viittaa mahdollisen tehtävän GILZ säätelyssä CX

3CL1 tuotantoa. Testasimme tätä olettamusta määrittämällä määrä CX

3CL1 mRNA ja proteiini pGILZ (yli-ilmentävät GILZ) ja CTRL (matalapaineista määrän GILZ) BG1 soluja. Kuten odotettua, GILZ sisältöä (mRNA ja proteiini) oli merkitsevästi korkeampi pGILZ kuin CTRL klooneja. Parallel kasvaa CX

3CL1 mRNA ja proteiini kuvattiin RT-PCR, IHC ja Western blot (kuvio 4, A, B ja C). Lisäksi pGILZ solut vapautetaan suurempia määriä SCX

3CL1 kuin kontrollisolut (kuvio 4D). Käyttämällä Ab kohdistaminen solunulkoisen domeenin CX

3CL1, Western blot lysaatit BG1 soluja käsiteltiin forboli-12-myristaatti-13-asetaatti (PMA), proteiinikinaasi C: n (PKC) aktivaattori, osoitti puuttuessa 90-kDa: n vyöhyke, joka vastaa koko pituudeltaan CX

3CL1. Käänteisesti tämä käsittely lisäsi vapautumista SCX

3CL1 supernatanttiin. (Kuvio 4, C ja D). Yhdessä tuloksemme osoittavat, että CX

3CL1 tuotantoa munasarjojen epiteelin pahanlaatuisia soluja on voimistuvan GILZ.

(A)

CX

3CL1

PCR-signaalin intensiteettiä CTRL ja pGILZ BG-1-soluissa kvantitoitiin densitometrialla normalisoituivat vastaan ​​signaalin

ß-aktiini

; Tulokset ilmaistaan ​​

CX

3CL1 /SS-aktiini

suhteet. Eräässä kokeessa edustaja kolmesta. (B) immuunivärjäytyminen CX

3CL1 päälle CTRL ja pGILZ BG1 cytocentrifuged soluja. Suurennus x 40 (C) kokonaismäärä solun uutteiden CTRL ja pGILZ BG1 soluja viljeltiin kanssa tai ilman 100 ng /ml PMA: lla 24 tuntia analysoitiin western-blottauksella tietyn Ab tunnustetaan solunulkoisen domeenin CX

3CL1. CX

3CL1 kvantitoitiin densitometrillä ja palauttamalla vastaan ​​signaalin ß-aktiini; Tulokset ilmaistaan ​​CX

3CL1 /SS-aktiini-suhteet. Eräässä kokeessa edustavat kolmea. (D) histogrammit esittävät julkaisun SCX

3CL1 supernatanttiin käsiteltyjen solujen tai PMA, mitattuna ELISA. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

P 0,05

puuttuminen vs. läsnäolo PMA ja

#

P 0,05

, CTRL versus pGILZ BG1 soluja (pariton

t

testi).

CX

3CL1 lisääntyy pahanlaatuisten solujen lisääntymistä

Osoitimme, että SCX

3CL1 vapautuu munasarjasyövän soluja vuodattamalla membraaniin sitoutuneen kemokiinin viittaa siihen, että SCX

3CL1 voi olla aktiivinen komponentti kasvainten microenvironment. Täällä, kysyimme, onko tämä kemokiinin vaikuttaa kasvainsoluproliferaation, ehdottivat korrelaatio CX

3CL1 ja Ki-67 immunovärjäyksin in EOC yksilöitä. Tämä proliferatiivinen toiminta voi johtua autokriini vaikutuksesta CX

3CL1, joka riippuu ilmaus ainutlaatuisen reseptorin, CX

3CR1 [8]. Havaitsimme

CX

3CR1

mRNA tavanomaisella RT-PCR on odotetun kokoinen (340 emäsparia) kaikissa EOC näytteet testattiin (N = 14) ja kolmessa EOC solulinjat, BG1, SKOV3 ja OVCAR3. Flow-rianalyysit kertoo vielä kalvo CX

3CR1 ilmentymistä sekä CD45

+ ja CD45

– soluja pahanlaatuinen kasvain yksilöitä. Kun CD45

– osa, joka on hyvin rikastettu pahanlaatuisten munasarjan epiteelin solujen prosenttiosuus CX

3CR1

+ solut vaihtelivat 20%: sta 95% (kuvio 5A). Vuonna BG1 soluissa, vakaan tilan tason kalvon CX

3CR1 ilme oli heikko ( 10% kaikista soluista) perusolosuhteissa (kuvio 5B). Mielenkiintoista on, että osa CX

3CR1

+ solujen lisääntyi merkittävästi happokäsittely, prosessi, joka tunnetaan erottaa ligandin sen reseptorin. Toisella puolella, pitoisuuden vähentämistä FBS 10%: sta 1% viljelyalustassa lisännyt kalvo ilmentymistä CX

3CR1 vuonna BG1 soluissa (kuvio 5C). Sen sijaan, tason pinnan CX

3CR1 oli pienempi pGILZ soluja, jotka tuottavat suurempia määriä SCX

3CL1 kuin CTRL-soluja. Näiden tulosten perusteella, käytimme CTRL BG1 viljeltyjen solujen täydennetty 1% FBS mitata proliferatiivista vaikutusta rekombinantti ihmisen (rh) CX

3CL1 mukaan [

3H] -tymidiinin. Tulokset yhdeksästä itsenäisestä kokeesta osoittivat, että rhCX

3CL1 suunnilleen kaksinkertaistui korko soluproliferaation 24 tunnin kuluttua hoidon (kuvio 6A). Tämä vastaus kumottiin lisäämällä CX

3CL1 analogi, jossa on muunnettu N-pää, joka sitoutuu CX

3CR1 ja toimii antagonistina (kuvio 6B) [29]. Nämä tulokset osoittavat proliferatiivista toimintaa eksogeenista CX

3CL1 sen sitoutumisen kautta CX

3CR1. Me tutkimme seuraavaksi endogeeninen CX

3CL1 stimuloi kasvainsoluproliferaation. Tätä tarkoitusta varten pGILZ BG1 soluja, jotka tuottavat suuria määriä endogeenista CX

3CL1, käsiteltiin CX

3CL1 analoginen uusitaan 24 tunnin välein 72 tuntia. Näissä olosuhteissa, nopeus soluproliferaation oli merkittävästi vähentynyt, taustalla rooli endogeenisen CX

3CL1 säätelyssä kasvainsoluproliferaation (kuvio 6C).

(A) tasot CX

3CR1 ja pan-hematopoieettista markkeri CD45 määritettiin virtaussytometrialla 2 vastaeroteltujen näytteitä EOC yksilöitä. Numerot osoittavat taajuudet CX

3CR1

+ CD45

– soluja. (B) edustaja FACS profiilit CX

3CR1 tasoja BG1 soluissa. Vasen, pinta ilmentyminen CX

3CR1 perusolosuhteissa; keski, pinta ilmentyminen CX

3CR1 soluissa jälkeen happamassa hoidon; oikea, ilmaus CX

3CR1 in läpäiseviksi soluissa. Numerot osoittavat prosenttiosuus CX

3CR1

+ soluja (keskiarvo ± SEM) 3 itsenäisestä kokeesta. (C) histogrammit esittävät fluoresenssin voimakkuus CX

3CR1 värjäystä pinnalla CTRL BG1 soluja viljellään, kun läsnä on 1% tai 10% FBS: ää, ja CTRL ja pGILZ BG1 soluja viljeltiin 1% FBS: ää. -luvut CX

3CR1

+ soluja yhdessä edustavassa kokeessa kolmesta.

(A-C) Lisääntyminen mitattiin [

3H] -tymidiinin (A) CTRL soluja inkuboitiin kanssa tai ilman 10 ng /ml rhCX

3CL1 24 tuntia, 9 itsenäisestä kokeesta. Histogrammit esittävät keskiarvoja ± SEM, pariksi t-testi,

**

P

0,001; (B) CTRL soluja inkuboitiin kanssa tai ilman 10 ng /ml rhCX

3CL1 24 tuntia, kun läsnä on tai ei ole 10 ng /ml CX

3CR1 antagonisti; kukin symboli edustaa yksittäisen näytteen ajaa kolmena kappaleena, viivat edustavat keskiarvoja, *

P

0,05,

t

testi, yksi edustava koe 3; (C) pGILZ solujen ja ilman hoitoa 10 ug /ml CX

3CR1 antagonisti vaihdettava 24 tunnin välein 72 tuntia, kukin symboli edustaa yksittäisen näytteen ajaa kolmena kappaleena, viivat edustavat keskiarvoja, *

P

0,05,

t

testi, yksi edustava koe 3 (D) totaalisoluproteiinia uutteiden CTRL soluja viljeltiin ja poissa ollessa 10 ng /ml rhCX

3CL1 analysoitiin western blotting erityisiä Abs. Pakt kvantitoitiin densitometrillä ja palauttamalla vastaan ​​signaalin koko AKT: tä. Tulokset ilmaistaan ​​Pakt /AKT-suhteet. Yksi blot, edustavat kolmea suorittaa, on esitetty.

AKT hyperactivation havaitaan usein munasarjojen syöpien ja liittyy valvontaan soluproliferaation EOC [30], [31] [32] – [33]. Tasot Pakt, joka on aktiivinen AKT muodossa, oli suurempi rhCX

3CL1 käsiteltyjen BG1 soluissa (kuvio 6D). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että proliferatiivinen vaikutus CX

3CL1 /CX

3CR1 pari liittyy AKT aktivointi. GILZ on aikaisemmin tunnistettu proliferatiivinen tekijä aktivoivan AKT vuonna EOC [25]. Sen vahvistamiseksi, että CX

3CL1 toimiin liittyy AKT aktivointi

in situ

mittasimme Ki-67 ja Pakt pistemäärän EOC yksilöt teki 0 GILZ ja joko tuottavat tai eivät CX

3CL1. Kuten taulukosta 3, leviämisen ja AKT fosforylaatio olivat suuremmat yksilöt tuottavat CX

3CL1. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen, että proliferatiivista vaikutusta CX

3CL1 on munasarjojen epiteelin pahanlaatuisten solujen peräkkäistä CX

3CR1 sitova, joka aktivoi AKT.

In vivo

vaikutus GILZ yli-ilmentymisen

Lopuksi tutkimme vaikutus GILZ ja CX

3CL1 kasvaimen kasvuun

in vivo

hiirellä ihonalaisen ksenograftimallissa. BG1 solut joko yli-ilmentäviä GILZ (pGILZ) vai ei (CTRL) injektoitiin subkutaanisesti kateenkorvattomiin nude-hiiriin, ja kasvainten kasvua seurattiin 35 päivää. Keskimääräiset kasvain tilavuudet esitetään graafisesti kuviossa 7A. Kasvaimet kehittyy pGILZ solut oli merkittävästi suurempia kuin ne, jotka kehittyvät CTRL, milloin tahansa tiettynä ajankohtana. Western blotit ksenograftin tiivisteet ja immunovärjäys osoitti rinnakkain nousu GILZ ja CX

3CL1 proteiinin tasot (kuva 7, B ja C). Siten

GILZ

yliekspressio liittyy selvästi korkeampi CX

3CL1 tuotanto kasvaimissa, mikä johtaa korkeampiin lisääntymistä ja kasvaimen kasvua.

(A) pGILZ tai CTRL BG1 soluja (40 x 10

6 solua /ml) ihon alle oikeaan paljaiden hiirien kylkiin. Tuumorin koko mitattiin joka 5 päivää, ja 35 päivää (n = 3 hiirtä ryhmää kohti). Kasvaimen tilavuuden [mm

3] laskettiin seuraavasti: (pituus [mm]) x (leveys [mm])

2 x 0,5. **

P

0,001 (pariton

t

testi). (B) Solun totaali-proteiinin uutteet Ksenosiirretyn kasvainten analysoitiin western-blottauksella erityisiä Abs. CX

3CL1 ja GILZ kvantitoitiin densitometrillä ja palauttamalla vastaan ​​signaalin ß-aktiini; Tulokset ilmaistaan ​​CX

3CL1 tai GILZ /SS-aktiini-suhteet. Yksi blot edustaja kolmesta suorittaa näytetään. (C) Serial osia pGILZ ja CTRL ksenosiirrettyjä kasvaimia värjättiin CX

3CL1, GILZ ja Ki-67. Negatiivinen kontrolli: ei merkintää ei havaittu, kun kukin ensisijainen Ab pois. Suurennuskerroin 40.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme paljastettiin että CX

3CL1 oli konstitutiivisesti tuotettu EOC ja tutkittiin miten tämä kemokiinin kasvaimen kasvua. Tuotanto tämän kemokiinin edeltää syöpään OSE, ja todettiin myös munanjohtimien terveiden naisten ja hyvänlaatuisia. Immunohistologinen analyysi paljasti, että CX

3CL1 tuotanto EOC näytteissä korreloi tasojen Ki-67 ja GILZ, kaksi markkereita leviämisen pahanlaatuisten munasarjaepiteelisoluilla. Hierarkkinen klusterointi analyysi tunnisti kaksi tärkeää klusterit, joilla on korkea ja alhainen leviämisen, jotka eroavat toisistaan ​​GILZ ja CX

3CL1 tasoilla.

In vitro

, GILZ ylituotanto johtaa kasvuun CX

3CL1 tuotantoa BG1 soluissa. CX

3CL1 kasvattaa BG1 solujen lisääntymisen kautta reseptorin, CX

3CR1, ja samanaikaisen kasvun havaitaan Pakt tasoilla. Vuonna ksenosiirrettyjä hiirillä, yliekspressio sekä GILZ ja CX

3CL1 liittyy nopeammin kasvaimen kasvua. Nämä tulokset korostavat suhde GILZ ja CX3CL1 on keskeinen säätelijä pahanlaatuisten solujen lisääntymistä ja kasvaimen kasvua.

Uusimpien hypoteeseja alkuperästä ja histogeneettisesti ja EOC, tyypin I kasvaimia, joiden uskotaan sisältävän kaikki tärkeimmät histotypes, peräisin OSE, joka on perinteisesti pidetty lähde neoplastisen transformaation. Sitä vastoin tyypin II kasvaimia, joiden uskotaan käsittää lähes yksinomaan korkealaatuista vakavien karsinoomien, uskotaan syntyvän kärkialueella munanjohtimien [34] – [36]. Sekä OSE ja munanjohtimien tällä hetkellä ajatellaan olevan mahdollisia lähteitä neoplastisten EOC ja molemmat ovat peräisin alkion mullerian kanavan [37]. CX

3CL1 on havaittu ihmisen kohdun limakalvon [38] ja munanjohtimien [39]. Olemme myös havainneet CX

3CL1 että OSE, lisäksi osoittaa, että tuotanto CX

3CL1 by munasarjan epiteelin soluja edeltää kasvaimien syntyyn. CX

3CL1 havaittiin myös hyvän- ja rajatapaus kasvainsoluja, mikä viittaa siihen, että sen tuotanto ei liity maligniteetti.

Munasarjojen kasvaimia ovat morfologisesti heterogeenisiä ja jaotellaan patologia osaksi vakavien, kirkas solu, endomet- ja mucinous alatyyppejä perusteella histopatologinen tutkimus. Kukin alatyyppi on tunnusomaista ominaispinta-mRNA profiili, geneettisiä riskitekijöitä ja molekyyli- ominaisuudet [34] [40] – [41], mikä viittaa siihen, että munasarjasyövän on heterogeeninen sairaus, [42]. Tästä heterogeenisuudesta huolimatta, emme havainneet merkittävää yhdistyksen välillä CX

3CL1 ja histologista tyyppiä meidän sarjassa, johon kuului edustaja yksilöitä kaikkien neljän pääasiallisen histologisia tyyppejä EOC. Kuten GILZ ja CXCL12, CX

3CL1 ilmentyy laajalti EOCs ja sen läsnäolo ei heijasta morfologisia heterogeenisyys EOC [25] [28].

kemokiinit, kuten CXCL12, tuotetaan paikallisesti munasarjan kasvaimet ja edistää kasvaimen mikroympäristössä [5] – [6]. Täällä, tunnistamme CX

3CL1 toisena komponenttina EOC microenvironment. Epiteelisolut pahanlaatuinen askites, kasvain näytteet ja kolmesta munasarjasyövän solulinjoissa, nimittäin BG1, OVCAR3 ja SKOV3, näytetään värjäys CX

3CL1. CX

3CL1 rajoittui sytoplasmaan ja oli poissa ytimeksi. Solut sisälsivät CX

3CL1, jonka molekyylipaino on 90 kDa, joka vastaa kalvon muodossa CX

3CL1, josta liukoinen muoto on johdettu irtoaminen [8]. Tuotanto SCX

3CL1 viljelysupernatanteista samansuuntainen kuin kalvoon sitoutunut muoto, mikä viittaa siihen, että tuotanto SCX

3CL1 vuonna EOC mikroympäristössä tehostettiin kasvaimissa vahva CX

3CL1 immunoreaktiivisuus. Mielenkiintoista on, että paikallisen vapauttamisen CX

3CL1 voi riippua myös CXCL12, tuotetaan munasarjan epiteelin pahanlaatuisia soluja EOC ja tiedetään säätelevän pilkkominen CX

3CL1 hermosoluista [43]. Emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että CXCL12 stimuloi metalloproteinaasien mukana CX

3CL1 lohkaisu EOCs, kuten se hermosolujen kulttuureissa. Todellakin, lisätutkimuksia tämän näkökohdan käytöstä tarvitse tehdä.

voimakkuus CX

3CL1 värjäystä ja osa kasvainsolujen värjätään CX

3CL1 vaihtelivat meidän kohortin 54 joilla on pitkälle edennyt ensisijainen EOC. Tämä heterogeenisuus tuotanto CX

3CL1 korreloi positiivisesti GILZ tasoilla.