Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämä on tutkia suhdetta ectonucleoside trifosfaatin diphosphohydrolase 5 (ENTPD5) ilmaisun ja keuhkosyöpä kliinispatologiset tekijöitä, ja vaikutus of ENTPD5 keuhkosyöpään solujen toimintaan. Keuhkosyöpä näytteet ja sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa saatiin potilailta ilman leikkausta edeltävän sädehoitoa tai kemoterapiaa. Knockdovvn ETNPD5 ilmaisun johti merkittävästi vähentynyt keuhkosyöpäsolua kasvu, huomattavasti lisääntynyt apoptoosi ja kyky korjata, ja merkittävästi vähentää hyökkäystä. Gene siru testit osoittivat, että knockdovvn ENTPD5 ilmaisun aiheuttanut enemmän Caspase ilmaisua. Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio osoitti, että kaspaasi 3: n ekspressio on merkittävästi lisääntynyt sen jälkeen, kun pudotus on ENTPD5. Lisäksi immunohistokemia osoitti, että kasvaimen kasvu merkki, proliferoivan solun tuma-antigeeni, oli merkitsevästi pienempi knockdown mallissa. Tuumorigeenisyyteen määritys ja terminaalin deoksinukleotidyylitransferaasin välittämää dUTP nick-end merkintöjä määritys osoitti, että apoptoosin keuhkosyövän solujen lisääntynyt knockdown mallissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että ENTPD5 vaikuttaa keuhkosyöpä apoptoosin kautta Caspase 3-reitin, ja voidaan mahdollisesti käyttää seuraamaan ennustetta tai ohjata asianmukainen hoito-.

Citation: Xue Y, Wu L, Liu Y, Ma Y, Zhang L, Ma X, et al. (2015) ENTPD5 indusoi apoptoosia Lung Cancer Cells kautta sääntely kaspaasi 3 Expression. PLoS ONE 10 (3): e0120046. doi: 10,1371 /journal.pone.0120046

Academic Editor: Yi-Hsien Hsieh, Institute of Biochemistry and Biotechnology, Taiwan

vastaanotettu: 23 lokakuu 2014; Hyväksytty: 03 helmikuu 2015; Julkaistu: 20 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Xue et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Beijing Science New Star Plan (nro Z11111005450000) ja National Natural Science Foundation of China (nro 81101598).

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, ettei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Keuhkosyöpä, yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia, on johtava syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) noin osuus 80% keuhkosyöpää [2]. Keuhkosyöpä on pitää eräänlaisena geneettinen sairaus, jossa poikkeava endogeenisen patogeenisten geenien ilmentymisen vaikuttaa genomin epästabiilisuuden, joka parantaa liikkuvuutta ja invasiivisuus syöpäsolujen, jotka johtavat ominaisuudet invasiivisuus. Huolimatta onnistunut hoito ensisijaisen maligniteetin, uusiutuminen ja myöhempi etäinen etäpesäke esiintyy edelleen yli neljännes postoperatiivisten potilaiden [3]. Siksi, leikkauksen jälkeinen jatkotoimia tulisi suorittaa rutiininomaisesti etsiä varhain etäpesäkkeitä vähentää kuolleisuutta. Tuoreen tutkimuksen mukaan, yliekspressio spesifisten geenien aikana karsinogeneesissä on todettu, että useissa keuhkosyövässä, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptoria [4-6], ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori-2 [7], p53 [8] ja B-solujen lymfooma-2 [9]. Apoptoosin inhibitio syöpäsolujen yleensä liittyy monia tärkeitä geenejä, jotka voidaan toiminnallisesti liittyvät rajoittamaton syöpä- solujen etenemistä kuten solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion. Lopulta syöpäsolujen voi etäpesäkkeitä kaukaisiin elimiin ja uhkaavat elinikä. Geenit ja jotka säätelevät kasvaimen aggressiivisuus voisi toimia ennustetekijöitä markkereita ja /tai terapeuttisten kohteiden keuhkosyöpään. Siksi on tarpeen kehittää erittäin herkkä ja spesifinen diagnostinen geenit /biomarkkerit edistää tarkkuutta varhaista diagnosointia etäpesäke. Nyt, useiden geenien on raportoitu osallistumaan erilaisia ​​patologisia prosesseja ja vaikuttaa merkittävästi aggressiivisuus syöpäsolujen, kuten ALK [10], kallikreiini liittyvät peptidaasi 8-geenin [11], ja RAS [12].

Ectonucleoside trifosfaatin diphosphohydrolase 5 (ENTPD5) on eräänlainen entsyymin endoplasmakalvostossa, joka hydrolysoi UDP UMP edistää proteiinin N-glykosylaatiota ja taitto endoplasmakalvostossa. ENTPD5 proteiini on erottuva muista NTPDases, koska se on ainoa jäsen, joka on kuvattu proto-onkopsykologista proteiini [13]. ENTPD5 raportoidaan edistää soluproliferaatiota ja Warburg vaikutus [13]. Olemassa olevat todisteet vahvistavat, että ENTPD5 osallistuu useisiin solujen toiminnallisia prosesseja ja edistää hyökkäys kyky syöpäsolujen avulla proteiinikinaasi Cδ [14]. Lisäksi on tunnistettu, että lääkeaine-resistanssi eturauhassyövän aikana platinaa kemoterapian liittyy proteiinikinaasi Cδ-välitteisen vakaan tilan B-solulymfooman-2 [15]. Aikaisemmat tutkimukset myös korostavat ENTPD5, joka liittyy tuumorin muodostumiseen ja syöpään etenemisen eturauhassyövän solulinjoissa. Nämä havainnot osoittavat, että alas-säätely ENTPD5 ilmaisun vaikuttaa negatiivisesti kapasiteetin kasvainsolujen selviytyä epäsuotuisissa olosuhteissa.

On olemassa paljon raportteja suhdetta ENTPD5 ja pahanlaatuisen kasvaimen kasvua, mutta ei ole juuri mitään raportoivat korrelaatio ENTPD5 ja keuhkosyövän. Äskettäin Curry et al. kertoi, että tukahduttaminen ENTPD5 PTEN null eläinmallissa riittää vähentää insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 -reseptorin tasoja ja herkistää bronkiolaarinen tuumorisoluja seerumistarvaatio

in vitro

ja dieettiä

in vivo

[16]. Tämä tutkimus osoittaa, että ENTPD5 saattavat liittyä esiintyminen keuhkosyövän eläinkokeissa.

Kun otetaan huomioon puutos ENTPD5 tutkimuksen keuhkosyöpää ja tärkeä rooli ENTPD 5 prosessissa kasvaimen kehitystä, olemme suunnitelleet tämän tutkimuksessa ymmärtää yksityiskohtaisia ​​roolin ENTPD5 keuhkojen syöpäsolujen kasvua ja invaasiota prosessi. Lisäksi haluaisimme onko ENTPD5 on lupaava kohde terapiassa keuhkosyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

Kaikki keuhkosyövän solulinjat, mukaan lukien A549, PC9, H1650, H1975, H1299 Skmes-1, ja GLC82, hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) ja niitä viljeltiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, USA ), 100 U /ml penisilliiniä, ja lg /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ja 37 ° C: ssa.

sekvenssit ENTPD5 siRNA ja ei-hiljentäminen ohjaus siRNA oli 5’CCUGGGAUUUGGAUUGAAATT -3 ’ja 5’UUUCAAUCCAAAUCCCAGGTT -3’, vastaavasti. SiRNA: t kertyi Genepharma (Shanghai, Kiina). SiRNA: t transfektoitiin A549-soluihin ja PC9-soluihin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) noudattaen valmistajan protokollaa.

Potilaat

Keuhkosyöpä yksilöiden (n = 131) ja sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa saatiin potilailta ilman leikkausta edeltävän sädehoitoa tai kemoterapiaa Beijing Cancer sairaalan 1999 2011. Ennen ja tietoinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja tai heidän perheensä. Tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean Pekingin yliopisto. Kliinis ominaisuudet kasvainten määriteltiin mukaan kasvaimen etäpesäke lavastus järjestelmä Unionin International Cancer valvonta. Kliinis tekijät on esitetty taulukossa 1.

immunohistokemia

Ensisijainen keuhkosyöpä näytteet kiinnitettiin ja parafinoidut. Osaa (5 um) on rutiininomaisesti käsitelty, ja värjättiin kanin monoklonaalista anti-ENTPD5-vasta-aineen (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK), jonka pitoisuus on 2 ug /ml, jota seurasi inkubaatio piparjuuriperoksidaasilla konjugoitua kanin anti- -rabbit sekundaarinen vasta-aine (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK). Positiivinen värjäytyminen alueet koko kudoksen osassa oli luokiteltava prosenttiosuus positiivisesti värjättyä solut: 0, sillä 25%; 1, sillä 25-49%; 2, sillä 50-74%; ja 3, on 75-100%. Tässä tutkimuksessa 0 pidettiin negatiivinen tai kohtalainen värjäytyminen, kun taas 1, 2 ja 3 pidettiin positiivista värjäytymistä.

Quantitative reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) noudattaen valmistajan protokollaa. Kypsä miRNA määrän, polyA-häntä lisättiin kokonais-RNA (100 ng), jota polyA-polymeraasia (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), minkä jälkeen käänteistranskriptio oligo-dT-sovitin alukkeita ja Moloney-hiiren leukemiaviruksen (Invitrogen, USA). cDNA syntetisoitiin käyttäen 2 ug kokonais-RNA: sta käyttäen iScript cDNA-synteesin kit (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK). Alukkeet ENTPD5 ja GAPDH on lueteltu taulukossa 2. GAPDH käytettiin lastaus ohjaus. qRT-PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green PCR Master Mix (Toyobo, Osaka, Japani) on Light-PCR-laite 480 Real-Time PCR System (Roche, USA). Suhteellinen määrä miRNA tai geenejä normalisoitiin GAPDH. Tiedot laskettiin perustuen 2

-ΔCt jossa ACt = Ct (Target) -Ct (viite). Kertainen muutos laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmällä.

Western blotting

Proteiinit uutettiin soluista käyttäen RIPA-puskuria, joka sisälsi täydellisen proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche, Mannheim, Saksa ). Proteiinit erotettiin käyttäen natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja. Sitten membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa TBST (15 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9% NaCl ja 0,05% Tween-20, pH 7,4), minkä jälkeen blot-analyysillä käyttäen vasta-aineista: kanin monoklonaalista anti-ihmis- ENTPD5 vasta-ainetta (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK), ja kanin anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (1: 1000). Immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin käyttäen SuperSignal West Femto kemiluminesenssisubstraatilla. Kokeet suoritettiin ainakin kahdesti yhdenmukaiset tulokset.

Soluproliferaatiomääritys

Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen solulaskennalla kit-8-määrityksessä. -Soluja (2 x 10

3) viljeltiin 96-kuoppaisilla viljelylevyillä. Solut suspendoitiin uudelleen RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää, ja jaettu ryhmiin ennen kuin viljeltiin 0, 24 tai 48 h. Useita elävien solujen määritettiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä käyttämällä Fluostar Optima (BMG LAB-TECH, Offenburg, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Virtaussytometria

Solut kerättiin ja analysoitiin apoptoosin käyttämällä anneksiini V-FITC PI apoptoosin havaitseminen pakki (IMGENEX, USA) valmistajan ohjeiden. Solut analysoitiin FACSCalibur Analyzer (Becton-Dickinson, USA) käyttäen CellQuest Pro -ohjelmistoa.

TranswellTM invaasiomääritys

TranswellTM invaasiomääritys suoritettiin seuraten valmistajan ohjeita. Lyhyesti, 5 x 10

4-soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 0,1% FBS maljattiin 24-kuoppaisille levyille, jotka sisältävät RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, kuten kemoattraktantti. 24 tunnin kuluttua solut, jotka vaelsivat läpi ja kiinnitetty toisella puolella insertin kiinnitettiin ja värjättiin 0,5%: lla (w /v) kristalliviolettia. Tunkeutuvat solut pohjaan suodattimet kuvattiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa. Viisi suuritehoiset kentät laskettiin per suodatin pääsi hyökkäystä. Solujen lukumäärä kvantifioitiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa.

Haavan paranemista määrityksessä

Soluja viljeltiin konfluenssiin 6-kuopan astioihin ennen raaputtamalla 200 ul pipetin kärjen. Jäte poistettiin laaja pesemällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja soluja inkuboitiin edelleen vielä 24 h tai 48 h vamman jälkeen.

cDNA microarray-analyysi

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzolia menetelmä (Invitrogen, Carlsbad, CA), puhdistettiin RNeasy mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), käsitellään käyttäen GeneChip- Expression 3′-monistusreagenssit Kit (Affymetrix, USA), ja kuulusteltiin jossa Affymetrix Primeview Human Gene Expression Array. RNA puhdistettiin edelleen käyttäen RNeasy mini (Qiagen, Valencia, CA, USA) mukaisesti Affymetrix esittelyt. Ilmentämiseen erilaisia ​​analyysi, kokonais-RNA (250 ng) käytettiin tuottamaan biotiinilla leimatun cRNA käyttäen GeneChip Expression 3′-Amplification Reagenssit Kit (Affymetrix, USA) valmistajan protokollan. CRNA hybridisoitiin Affymetrix Primeview Human Gene Expression Array skannattavaksi käyttäen Affymetrix GeneChip- array Scanner 3000 7G.

tuumorigeenisyystesti määritys

Kuusi viikkoa vanhoja Balb /c atyymisissä nude-hiiriin (Vitalriver Laboratory Animals, Peking, Kiina) injektoidaan subkutaani- oikeaan kylkeen 2,0 × 10

6 solua 0,1 ml: ssa PBS: ssä. Kun kasvaimet ovat muodostuneet, paksuus Mittaukset tehtiin päivittäin ja kasvaimen tilavuus (V) laskettiin käyttäen kaavaa V = (L x W

2) /2, jossa L on pituus, ja W on leveys kasvain. Kun kasvaimet saavuttivat keskimäärin tilavuuteen 30-69 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään (n = 6) päivittäiseen kasvaimensisäistä injektion ENTPD5-siRNA ja negatiivinen kontrolli 16 päivää. Jokaisen injektion 15 ug miRNA sekoitettiin 15 ui

in vivo

transfektioreagenssi (Entranster-in vivo, Engreen, Kiina). Kasvukäyrät piirrettiin käyttämällä keskimääräistä kasvaimen sisällä kunkin koeryhmän useissa aikapisteissä. Kasvaimen tilavuutta hiiriä kirjattiin 16 päivää, minkä jälkeen hiiret lopetettiin. Dissekoiduissa kasvaimet kerättiin ja valmistettiin myöhempää analyysejä. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin eläimen keskelle Pekingin Cancer sairaalan.

Terminal deoksinukleotidyylitransferaasilla välittämää dUTP nick-end merkinnät (TUNEL) määritys

Terminal deoksinukleotidyylitransferaasilla välittämää dUTP nick-end merkinnät (TUNEL) iinianalyysikitissä (in situ Cell Death Detection Kit, Beyotime Biotekniikan instituutti, Kiina) käytettiin arvioimaan apoptoottisten solujen määrässä. Jäädytetyt leikkeet kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä pH 7,4 PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja läpäiseviksi PBS: ssä, jossa 1,0% Triton X-100: ssa 2 minuutin ajan. Rikki DNA päät kuolleet solut leimattiin käyttäen TUNEL kit noudattamalla valmistajan protokollan.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS versio 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA ). Mann-Whitney testiä käytettiin analysoitaessa jatkuvia muuttujia. Chi-square testi, Fisherin testiä tai yksisuuntaista ANOVA testiä käytettiin analysoitaessa kategorisen muuttujia. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ENTPD5 tulokset korreloivat sukupuolia, savun historiaa ja kasvaimen vaiheita, jossa negatiivinen ilmaus ENTPD5 johtaa pidempiin elinaika

havaitsemiseksi ENTPD5 ilmentyminen keuhkosyöpä kudoksissa, keuhkosyövän solut värjättiin immunohistokemiallista analyysia varten. Syövän solut osoittivat voimakasta ja diffuusi sytoplasman värjäytyminen ENTPD5 (Fig. 1A-D). Huippupisteet of ENTPD5 (1-3) NSCLC havaittiin 32 tapauksessa (24,4%). Kaikista käytettävissä olevat parametrit, sukupuoli, savun historia ja kasvaimen vaiheessa osoitti merkittävää korrelaatiota ENTPD5 tulokset (P 0,05) (taulukko 1). Univariate analyysi vaikutuksista ENTPD5 ilmentymistilanne ennusteeseen osoittivat, että pidempi elinaika korreloi merkitsevästi negatiivinen ilmaus ENTPD5 (keskimääräinen elinaika, 81 kuukautta vs 45,6 kuukautta, P 0,001). Kaplan-Meier selviytymisen käyrä, joka perustuu ENTPD5 ilmaisun pisteet, osoitti, että kumulatiivinen elinaika potilailla, joilla on ENTPD5 negatiivinen ilmaus (pistemäärä = 0, n = 96) oli merkitsevästi pidempi kuin potilailla, joilla on korkea ENTPD5 (pisteet = 1- 3, n = 31) (Fig. 1 E). Nämä tiedot viittaavat siihen, että ENTPD5 tulokset korreloivat sukupuolia, savun historiaa ja kasvaimen vaiheita, jossa negatiivinen ilmaus ENTPD5 johtaa pidempiin elinaika.

ENTPD5 värjäystä keuhkosyöpään kudosten kanssa (A) pisteet 0, (B ) pisteet 1+, (C) pisteet 2+, ja (D) pisteet 3+. (E) Kaplan-Meier-analyysi korrelaatio eloonjäämisaste keuhkosyöpäpotilaita ja ilmaisu asema ENTPD5 proteiinin (P 0,001).

inhibitio ENTPD5 ilmaisun vähentää keuhkosyövän solujen kasvua ja lisää niiden apoptoosin nopeudella

in vitro

testaamiseksi vaikutuksen ENTPD5 keuhkosyöpään solujen kasvuun ja apoptoosin

in vitro

, onnistuneesti rakennettu lyhytaikaista transfektiota solumalleja. Arviointi ENTPD5 ekspressiotasoja eri keuhkosyöpä linjat, mukaan lukien H1975, H1650, H1299, A549, GLC82, PC9 ja SKMES1, osoitti, että SKMES-1 oli korkein suhteellinen ENTPD5 ilmentymistä (Fig. 2A). Lisäksi, knockdovvn ENTPD5 indusoi merkittävästi vähentynyt ENTPD5 ekspressiotasot PC9 ja A549-solut (Fig. 2B ja C). Lisäksi solukasvumäärityksessä päälle PC9 ja A549-soluja, joilla on kohtalainen ilmaus ENTPD5 osoitti, että knockdovvn ENTPD5 vähensi kasvua keuhkosyövän soluja (Fig. 2D ja E) (P 0,001). Apoptosis analyysi PC9 ja A549-solut osoittivat, että knockdovvn ENTPD5 nousi apoptoosin nopeuden verrattuna kontrolliryhmiin (P 0,05) (kuvio. 2F). Nämä tulokset osoittavat, että estäminen ENTPD5 ilmaisun vähentää keuhkosyövän solujen kasvua ja kasvattivat apoptoosin nopeudella

in vitro

.

(A) ilmentyminen ENTPD5 eri keuhkosyövän solulinjat. Suhteellinen ENTPD5 ilmentymistä (B) PC9 ja (C) A549-soluja määritettiin qRT-PCR ja Western blottauksella. Kasvun kyky (D) PC9 ja (E) A549-soluja sen jälkeen, kun pudotus on ENTPD5 geenin määritettiin kasvun määrityksessä. (F) apoptoosi PC9 ja A549-soluja sen jälkeen pudotus on ENTPD5 geenin määritettiin virtaussytometrialla. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD. Double tähdellä osoittavat arvot eroavat merkittävästi toisistaan.

Down-regulation of ENTPD5 ilmaisun vähentää hyökkäyksen kykyä ja liikkuvuus keuhkosyöpään solujen

in vitro

tutkimiseksi vaikutuksen ENTPD5 keuhkosyöpään solujen invaasiota ja liikkuvuus

in vitro

, siirtokuoppaan invaasiomääritys ja haavojen paranemista määritys tehtiin. TranswellTM invaasiomääritys osoittivat, että alas-säätely ENTPD5 ilmentymisen merkittävästi esti hyökkäyksen kykyä PC9 ja A549-solut (P = 0,000142 ja P = 0,00158, vastaavasti) (Fig. 3A). Haavan paranemista määrityksessä osoitti, että alaspäin säädelty ilmentyminen ENTPD5 laski jyrkästi motiliteettia PC9 ja A549-soluja 24 h loppuun kokeissa verrattuna kontrollisoluihin (Fig. 3B ja C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että alas-säätely ENTPD5 ilmaisun vähentää hyökkäyksen kykyä ja liikkuvuus keuhkosyöpään solujen

in vitro

.

ENTPD5-KD tai KD ilmaisee Knockdown keuhkosyöpä solulinjat. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD. Double tähdellä osoittavat arvoja, jotka eroavat merkittävästi toisistaan ​​(P 0,05). (B) Haavan paranemista PC9 ja A549-soluja sen jälkeen pudotus on ENTPD5 geenin verrattuna villityypin (WT) ja normaali kontrolli (NC) malleja 0, 24 tai 48 tuntia. Aikana hyökkäys ja haavoja kokeita, kaspaasi 3 lisättiin estävät solujen apoptoosin.

kaspaasi 3 saattaisi olla tärkeä rooli apoptoosin keuhkosyövän solujen jälkeen knockdovvn ENTPD5

ymmärtää vaikutusmekanismit proteiinien liittyvän keuhkosyövän apoptoosin jälkeen knockdovvn ENTPD5, suoritimme geenilastuun analyysi PC9 ja A549-soluja, jotka oli lähinnä testeistä solun apoptoosireitin. Sillä PC9 soluja, knockdovvn ENTPD5 lisäsi kuvaamaan joitakin geenejä yli 1,5-kertainen verrattuna ohjaus, mukaan lukien CASP4, APAF1, BCL2L11, CASP7, ja BCL2A1. A549-solut, knockdovvn ENTPD5 lisäsi kuvaamaan joitakin geenejä vähintään 2 kertainen verrattuna ohjaus, mukaan lukien CASP7, MDM2, ja BIRC3 (Fig. 4A). Huomattavaa on, että kaspaasi 7 (CASP7), jäsen kaspaasi 3 alaryhmä, osoitti huomattavasti ilmaisun jälkeen ENTPD5 Knockdown sekä PC9 ja A549 solulinjoissa (Fig. 4A). Nämä tiedot viittaavat siihen, että kaspaasi 3 saattaisi olla tärkeä rooli apoptoosin keuhkosyövän solujen jälkeen knockdovvn ENTPD5.

(A) Gene siru testi osoittaa polku analyysi, joka liittyi apoptoosin. Caspase geeni yli-ilmentyminen havaittiin PC9 ja A549-soluja jälkeen knockdovvn ENTPD5. (B) qRT-PCR-testi osoittaa kaspaasi 3 ilmentyminen PC9 ja A549-soluja jälkeen knockdovvn ENTPD5. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD. Tähdet osoittavat arvot, jotka ovat merkittävästi erilaisia ​​kuin NC (p 0,05). (C) apoptoosi PC9 ja A549-soluja sen jälkeen pudotus on ENTPD5 läsnä ollessa kaspaasi 3-estäjällä.

kaspaasi 3-estäjällä estää kasvua apoptoosin määrä keuhkosyöpään solujen aiheuttama pudotus on ENTPD5

vahvista tärkeyden kaspaasi 3 keuhkosyöpäsolua apoptoosin jälkeen knockdovvn ENTPD5, qRT-PCR ja virtaussytometria tehtiin. Tulokset qRT-PCR osoitti, että suhteellinen ekspressio kaspaasi 3-mRNA oli merkittävästi lisääntynyt, että pudotus on ENTPD5 sekä PC9 ja A549-solut (Fig. 4B). Lisäksi, virtaussytometria osoitti, että ENTPD5 pudotus ei onnistunut indusoimaan merkittävää kasvua apoptoosin korko PC9 ja A549-soluja, kun läsnä on Casepase 3-estäjällä (Fig. 4C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että kaspaasi 3-estäjällä estää kasvua apoptoosin määrä keuhkosyöpään solujen aiheuttama pudotus on ENTPD5.

knockdovvn ENTPD5 estää kasvua ja edistää apoptoosia keuhkosyövän soluja

in vivo

vahvistaa vaikutuksen ENTPD5 eläinmalleissa, tuumorigeenisyyteen määritys, Western blotting-määritys, immunohistokemia ja TUNEL määritys tehtiin. Kasvaimen kasvua tila hiirillä ruiskutetaan A549-solut osoittivat, että ENTP5-KD hiirten ryhmässä oli pienempiin kasvain, hitaammin kasvaimen volyymikasvun, ja alempi lopullinen kasvaimen painoa kuin WT ja NC ryhmät (Kuva. 5A-C). Western blotting-analyysi kasvaimen kudosten osoitti, että proteiini ilmentymistä lisääntyvien solujen tuma-antigeenin ja ENTPD5 oli väheni, mutta kaspaasi 3 suureni ENTPD5-KD hiirten ryhmässä verrattuna kontrolliryhmiin (Fig. 5D).

(B) Kasvaimen tilavuuden muutos eri ryhmissä A549 injektioita. (C) Kasvaimen paino muutos eri ryhmissä. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD. Double tähdellä osoittavat arvot, jotka ovat merkittävästi erilaisia ​​kuin NC (p 0,05). (D) Lisääntyvät solun tuma-antigeenin, kaspaasi 3 ja ENTPD5 ilmentymistilanne eri eläinmallissa ryhmät määritettiin Western blotting. (E) immunohistokemia testit osoittavat ENTPD5, kaspaasi 3 ja lisääntyvissä solun tuma-antigeenin ilmentymistilanne eri eläinmallissa ryhmiä. (F) Apoptosis kasvainkudoksen solujen eläinmalleissa jälkeen pudotus on ENTPD5 määritettiin in situ käyttämällä TUNEL-määritystä.

immunohistokemiallinen analyysi ekspression proliferoivan solun tuma-antigeeni, ENTPD5 ja Casepase 3 yhtyi saatuja tietoja Western blottauksella (kuvio. 5E). Lisäksi TUNEL-määritys kasvain kudosten osoitti, että apoptoosin tasot kasvainsolujen ENTP5-KD hiirten ryhmässä olivat korkeammat kuin kontrolliryhmän (kuvio. 5F). Nämä tiedot viittaavat siihen, että knockdovvn ENTPD5 estää niiden kasvun ja edistää apoptoosin keuhkosyövän solujen

in vivo

.

Keskustelu

Keuhkosyöpä ennusteeseen liittyviä markkereita tärkeitä rooleja monissa prosesseissa, kuten kasvainsolujen kasvua, apoptoosin, kasvaimen angiogeneesiä ja kasvaimen solujen invaasiota. Vuonna keuhkosyöpä, toteutettaessa kohdennettuja tekijöille potilailla, jotka on geneettinen poikkeavuuksia on johtanut parempia kliinisiä tuloksia parempaa elämänlaatua. Genomin epästabiilisuuden tai valinta johtaa poikkeamia, jotka voidaan ryhmitellä kuuteen olennaista reittejä: i) hankinta omavarainen tai yksipuolisten kasvun signaaleja; ii) ali kasvua estävää signaalit; iii) resistenssin signaaleja apoptoosin; iv) rajoittamaton leviämisen mahdollisia; v) jatkuva angiogeneesi; ja vi) invaasio ja etäpesäkkeiden [17]. Syöpäsolut ilmeisen monimutkaisia ​​geneettisiä poikkeavuuksia, jotka tapahtuvat aikana monivaiheisen syövän synnyn. Jotkut molekyyli poikkeavuudet ovat todennäköisemmin kuin toiset vaikuttamaan kliinistä käyttäytymistä syöpä, mukaan lukien etäpesäkkeiden riski. Tällaiset poikkeamia, kun tunnistettu, saattaa olla prognostisia markkereita, jotka ovat kasvaimen ominaisuudet, jotka voivat vaikuttaa sekä ennustaa kliininen tulos syöpäpotilailla.

yli-ilmentymisen joitakin markkereita, kuten verisuonten endoteelin kasvutekijä [18] , epidermaalisen kasvutekijän reseptori [4-6], ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori-2 [7], p53 [8] ja B-solulymfooma-2 [9] ovat osoittaneet, korrelaatio on huono ennuste. Tässä tutkimuksessa, immunohistokemia-analyysi vahvisti erityisiä yli-ilmentyminen ENTPD5 proteiinin keuhkosyöpä kudoksissa. Lisätutkimukset kokonaiselinaikaan viittaavat siihen, että tehostettu ilmentyminen ENTPD5 liittyy huonompi ennuste. Nämä havainnot osoittavat potentiaalia ENTPD5 ennustetyövälineenä indikaattorina.

ENTPD5 tunnistetaan keskeinen osa Akt /fosfatidyyli 3-kinaasi /fosfataasi ja tensin homologi sääntelyyn silmukka, joka pystyy synergizing aerobinen Glykolyysivaiheen [19,20 ]. Jotkut tutkijat osoittavat, että yli-ilmentyminen ENTPD5 kasvu vaikuttaa monien kasvainten, kuten gliomablastoma [20], rintasyövän [21], kohdunkaulan syöpä [22], kivesten itusolutuumoritapauksia [23], ja kurkunpään kasvainten [24]. Kasvaimien syntyyn on monivaiheinen prosessi, johon solujen kasvua, invaasio, etäpesäke, ja angiogeneesiä. Tutkimuksen vaikutus ENTPD5 solujen etenemisen prosessi osoittaa, että alas-ilmentyminen ENTPD5 A549 ja PC9 solulinjat merkittävästi vähentää astetta solujen lisääntymisen, apoptoosin ja muuttoliike. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ENTPD5 voisi toimia onkogeenin tärkeä rooli säätelyssä solujen eri prosesseja, jotka edistävät neoplastisia eteneminen eri tasoilla. Kuitenkin mekanismit, joilla ENTPD5 kykenee sen vaikutukset tietyillä signaalireitteihin tarvitsevat lisätutkimuksia.

NSCLC-solut ovat apoptoosin kestäviä. Strategiat de-tukahduttaa endogeenisen kaspaasi-inhibiittorit NSCLC viittaavat lupaava aktiivisuus mallijärjestelmiin ja esittää järkevä ja aivan uudenlainen strategia parantamiseksi Keuhkosyövän hoidossa. Apoptoosi on johtamasta peräkkäisen kaspaasien aktivaatio, perheen kysteiiniproteaasien, jotka ovat spesifisiä asparagiinihappotähteitä. Kaksi polut voivat välittää apoptoosin: i) kuolema reseptoreiden polku (tuumorinekroositekijä, Fas-ligandi tai TRAIL-reseptorit), joka aktivoi kaspaasi 8 ja 10, ja ii) mitokondriaalisen polku, joka aktivoi kaspaasi 9. Molemmat polut johtavat efektori caspases 3, 6 ja 7 [25]. Tutkimuksemme on vahvistanut suhdetta ENTPD5 ja kaspaasi 3 solutasolla ja eläinkokeista. Ymmärtäminen molekyylitason tämän fenotyypin on kriittinen, jos hoito on siirtyä terapeuttiseen tasanne, joka on saavutettu tavanomaisilla kemoterapiaa. Kaspaasi 3: n ekspressio voi liittyä herkkä prosessi, kemoterapiaa tai sädehoitoa [26]. MacCarthy et ai. raportoitu, että epänormaali ilmentyminen ENTPD5 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen karsinooman solut voivat vaikuttaa ATP-tasot ja kestävyys oksaliplatiini, peräsuolen syöpää asiaan kemoterapeuttista ainetta [27]. Villar et ai. totesi myös suhdetta ENTPD 5 ja kemoterapia vaste eturauhasen syöpä 15]. Näyttää siltä, ​​että ENTPD5 ekspressio voi olla vain tehokas toimittaja metabolisen muutoksen tuumorisoluissa, mutta myös mahdollista ennustaja kasvainten kemoterapiaan vastauksia. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että ENTPD5 esti apoptoosin keuhkosyövän soluihin kaspaasi 3. Kuitenkin, välinen suhde kemoterapian vaikutuksia ja ENTPD5 tarvitsee lisätutkimuksia tulevaisuudessa. Lopuksi ENTPD5 geeni on ratkaisevan tärkeää NSCLC. Sitä voitaisiin mahdollisesti käyttää seuraamaan ennustetta tai ohjaamaan asianmukainen hoito-.

Kiitokset

Tätä työtä tukivat Beijing Science New Star Plan (nro Z11111005450000) ja National Natural Science Foundation of China (nro 81101598).