Krooninen sairaus

tiivistelmä

Esto androgeenireseptorin (AR) aktiivisuus on tärkein tavoite hoitojen edenneen eturauhassyövän (PCA). Kuitenkin uusiutumisen aggressiivisemman, hormoniresistentti PCa syntyy, joka satamat kunnostettu AR aktiivisuutta. Eräs mekanismi tällaisten uudelleenaktivointi tapahtuu ostamalla AR mutaatioita, jotka mahdollistavat sen aktivoinnin eri steroidiset ja ei-steroidiset rakenteita. Näin ollen, luonnon ja kemiallisia yhdisteitä, jotka edistävät sopimatonta (androgeeni-riippumattomia) aktivointi AR alueeksi intensiivisen tutkimuksen. Tässä osoitamme, että genistein, soija phytoestrogen sitoutuu sekä luontoon ja Thr877Ala (T877A) mutantti tyyppisiä AR kilpailukykyisesti kanssa androgen kuitenkin se kohdistaa pleiotrooppinen vaikutus PCa soluproliferaatioon ja AR toiminta riippuen mutaatiostatuksesta asemasta AR. Genistein estyy, annoksesta riippuvaa tavalla soluproliferaatiota ja AR ydinvoiman lokalisointi ja ilmaisun LAPC-4-soluja, jotka ovat villi AR. Kuitenkin, LNCaP-solut, jotka ilmentävät T877A mutantti AR, genisteiini indusoi kaksivaiheinen vaikutus, jossa fysiologiset annokset (0,5-5 umol /l) stimuloi solujen kasvua ja AR ilmaisun ja transkriptionaalisen aktiivisuuden, ja suuremmat annokset indusoivat estäviä vaikutuksia. Samanlaisia ​​kaksivaiheisesti tuloksia saavutettiin PC-3-solut transfektoitu AR mutanttien; T877A, W741C ja H874Y. Nämä havainnot viittaavat siihen, että genistein, fysiologisessa pitoisuuksina, mahdollisesti toimia agonistina ja aktivoi mutantti AR, joka voi olla läsnä pitkälle PCa jälkeen androgeeniablaatio hoidon.

Citation: Mahmoud AM, Zhu T, Parray A, Siddique HR, Yang W, Saleem M, et al. (2013) Differential Effects of Genistein eturauhassyöpäsoluilla Riippuu Mutaatiotutkimukset Asema androgeenireseptorin. PLoS ONE 8 (10): e78479. doi: 10,1371 /journal.pone.0078479

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 01 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 12 syyskuu 2013; Julkaistu 22 lokakuuta 2013

Copyright: © 2013 Mahmoud et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: 1. Grant No. GM 842 Egyptin opetusministeriön korkeakoulu. 2. NIH Grant No. CA 116195. Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin maligniteetti ja toiseksi yleisin syy syövän kuoleman miehillä Yhdysvalloissa [1]. Aasialaisilla, esiintyvyys PCa on pienempi verrattuna Yhdysvalloissa ja Euroopan maissa [2]. Useimmat epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet yhdistyksen välillä ravinnon kulutuksen soija ja pienempi riski PCA aasialaiset, joista monen soijaruokia ovat ensisijainen proteiinin lähde [3-5]. Meta-analyysit epidemiologiset tutkimukset tukevat suojaava vaikutus soija [5,6]. Ruokavalion soija on runsaasti isoflavoneja, mukaan luettuina pääoma isoflavone yhdisteet genisteiini ja daidzein sekä vähemmän runsaasti yhdisteitä kuten glysiteiinin [7,8]. Genisteiini on yleisin ja biologisesti aktiivisia isoflavone soijaa. Vakaan tilan genisteiiniä pitoisuudet plasmassa Japani kuluttaa soija-rikas ruokavaliot ovat peräti 2,4 umol /L, joka on moninkertaisesti suurempia että eurooppalaisista [9,10].

On yhä enemmän todisteita siitä, että genisteiinin on antikarsinogeenisia vaikutuksia PCa [3,11]. Se muuttaa kuvaamaan joitakin geenejä, jotka ohjaavat solujen eloonjäämistä, solusyklin ja apoptoosin [12], inhiboi tyrosiinikinaasiaktiivisuus [13], ja NF-KB [14], säätelee Akt ja MAPK signalointireitteihin [15], ja estää angiogeneesi ja metastaasi [16-21]. Genistein myös antioksidanttisia vaikutuksia [22] ja joissakin

in vitro

studies genistein pienentää ilmaisun ja transkriptionaalista aktiivisuutta androgeenireseptorin (AR) [23-29].

PCa on androgeeniriippuvainen taudin ja erilaisten hoitomuotojen suuntautuvat androgeeniablaatio paikallisesti levinnyt tai metastaattinen PCa. Useimmat potilaat, jotka saavat androgeeniablaatio hoitojen aluksi kliinisiä ja biokemiallinen vaste (vähentynyt seerumin eturauhasen-antigeenin [PSA]). Kuitenkin lähes kaikki nämä potilaat relapsi aggressiivisemman, hormoniresistentti (kastraatio kestävä) muoto Eturauhassyövän joka ei vaadi verenkierrossa androgeenien, mutta silti riippuvainen funktionaalinen AR kasvuun ja etenemiseen. On ehdotettu useita mekanismeja molekyylitason kytkintä Eturauhassyövän peräisin androgeeniriippuvainen on androgeenista riippumaton tilan, mukaan lukien todisteet siitä, että kasvun räikeimpiä PCa ohjaavat sopimaton aktivoituminen AR [30-32]. AR aktiivisuus puuttuessa kivesten androgeenien voi tapahtua useita mekanismeja, kuten AR vahvistus, sääntelyn purkaminen kasvutekijöiden tai sytokiinien, muuttaminen koaktivaattoreiden, ja paikallinen tuotanto androgeenien sisällä eturauhanen [33-38]. Toinen mekanismi on hankkia AR aiheuttavat mutaatiot reseptori joko olla yliherkkiä pieninä pitoisuuksina androgeenien tai laajentaa ligandispesifisyys jos niitä esiintyy ligandia sitova alue (LBD) [39,40]. Jälkimmäinen tyyppisiä mutaatioita, jotta reseptori voidaan aktivoida monenlaisia ​​steroideja, kuten estrogeenit, progestiinit, lisämunuaisen steroideja, tai jopa antiandrogens [41,42]. Esimerkiksi treoniinin alaniinimutaatio AR kodonissa 877 (T877A) olemassa jopa 12,5% hormoni-tulenkestävien PCa ja mahdollistaa AR aktivoitumaan 17β-estradioli, progesteroni, ja jotkut antiandrogens [42]. Tämä sopimatonta sitoutumisen ei-androgeenireseptorin ligandien mahdollisesti vaikuttaa hoitoon vastus potilailla, joilla on edennyt PCa [43].

Genistein on 17β-estradioli-kaltainen rakenne ja on estrogeenista aktiivisuutta rintasyövän soluissa [44]. Vaikka useissa

in vitro

studies genisteiini- vaimentua AR transkription ja PSA-proteiinin ilmentymistä PCA soluissa ja esti niiden kasvun [24,26,27], stimuloivia vaikutuksia on myös raportoitu [45-47]. Kuitenkin suurin osa näistä tutkimuksista on joitakin metodologisia rajoituksia. Ensinnäkin, farmakologinen tai jopa solumyrkyllisyyspitoisuutta genisteiinin jotka eivät heijasta mitä voidaan saavuttaa nauttivien ihmisten soija on käytetty monissa näistä tutkimuksista. Toiseksi useimmissa tutkimuksissa vaikutusten tutkimisesta genisteiinin on PCA LNCaP on käytetty. Tämä solulinja on T877A mutaatio LBD AR, joka ulottuu sen sitoutumisen spesifisyyttä, jonka avulla aktivointi muiden steroidien tai steroidien kaltaiset molekyylit [48]. Oletamme, että genistein sen estradioli-rakenne voisi olla mahdollinen ligandi tälle mutantti AR, mikä mahdollisesti selittää stimuloivia vaikutuksia, jotka on saatu käyttämällä LNCaP joissakin tutkimuksissa. Kuitenkin, ei ole olemassa tutkimuksia differentiaalisen vaikutuksia genisteiinin fysiologisessa

versus

farmakologinen annoksina PCa solujen villityypin AR (WT-AR: t) ja soluja mutantti AR. Nykyisessä tutkimuksessa käytimme kaksi PCa solulinjoissa; LAPC-4-soluja, jotka on WT-AR: [49] ja LNCaP-solujen T877A mutantti AR: [48]. Soluja käsiteltiin solut monenlaisia ​​genisteiinin annoksina, mukaan lukien fysiologisesti saavutettavissa pitoisuudet, määrittämiseksi roolia T877A AR mutaatio ja genistein keskittyminen genisteiini- vaikutuksia soluproliferaatioon, apoptoosin, ja AR ja PSA ilme.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Genistein ja Casodex ostettiin Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Metyylitrienolonia (R1881) hankittiin Perkin Elmer (Downers Grove, IL).

Culture Eturauhassyövän solulinjojen

LAPC-4-solut saatiin tri R. Reiter kautta tohtori Karen Knudsen (UCLA), joka on alun perin kehitetty Dr. Charles Sawyersilta [49]. LNCaP-ja PC-3-solulinjojen saatiin ATCC: ltä (Rockville, MD). Soluja ylläpidettiin fenolipunaista RPMI-elatusaineeseen, jossa L-glutamiinia, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 IU /ml penisilliini ja 100 pg /ml streptomysiiniä. Media korvattiin RPMI, joka sisälsi 10% puuhiilellä puhdistettua naudan sikiön seerumia 24 tuntia ennen käsittelemällä soluja 1 ul /ml: aan DMSO ajoneuvo, jossa genisteiinin liuotettiin pitoisuuksina 0,5, 1, 5, 10, 25, ja 50 umol /l, ja tai ilman 100nmol /L Casodex (Sigma, St. Louis, MO), ja /tai 1 nmol /l metyylitrienolonia (R1881) (Perkin Elmer, Downers Grove, IL).

proliferaatiomääritystä

Solujen eloonjääminen määritettiin käyttämällä Cell Titer 96 AQ

ueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega, Madison, WI). Solut ympättiin 96-kuoppalevyille (3000 solua /kuoppa). Kaksikymmentä ui MTS-reagenssia /100 ui väliainetta lisättiin ja jätettiin sitten 4 tuntia kosteassa inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Absorbanssi rekisteröitiin aallonpituudella 570 nm käyttäen mikrolevyjen lukijaa (Synergy 2, Biotek, Highland Park, VT). Solujen lisääntyminen ja solujen elinkelpoisuus mitattiin myös hemosytometrin laskenta; Solut maljattiin 24-kuoppaisille soluviljelylevyille 5000 solua /kuoppa 1 ml: ssa viljelyalustaa, jossa FBS: ää. 24, 48, ja 72 h käsittelyn jälkeen, solut kerättiin trypsiini ratkaisu. Solulaskenta suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttäen hemosytometriä trypaanisinisellä (0,2%) sulkeminen tunnistamiseksi elävien solujen. Kokonaismäärät elinkelpoisia ja väriaine-värjäytyneiden solujen kussakin kokeessa verrattiin vastaavan käsittelemätön kontrolli solumäärien suoritetaan samanaikaisesti kolmen erillisen kokeen.

Cell sytotoksisuusanalyysin

Cell Sytotoksisuus määritettiin käyttämällä Vybrant sytotoksisuusmääritys Kit (G6PD release määritys) (Invitrogen, Grand Island, NY). Solut ympättiin 96-kuoppalevyille (5.000 solua /kuoppa) 50 ui media. 48 tunnin kuluttua hoidon, 50 ui esi-valmistettiin 2X resatsuriini /Reaktioseokseen lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Fluoresenssi rekisteröitiin käyttämällä fluoresenssi mikrolevyn lukija, joka perustettiin heräte ja emissiosuodattimia sopivia resorufiini (viritys 530-560 nm, emissio 580-600 nm).

transfektio PC-3 Cells

PC-3-solut, 5000 solua /kuoppa, transfektoitiin lyhytaikaisesti 24-kuoppalevyille 0,5 ug WT-AR, T877A-AR, W741C-AR, H874Y-AR, tai pSG5 tyhjän vektorin käyttäen Lipofectamine

TM LTX (Invitrogen Grand Island, NY). Plasmidit jalomielinen lahjoitus tohtori Karen Knudsen (Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA). Kahdeksan tunnin kuluttua transfektiosta solut käsiteltiin vehikkelillä (etanoli ja /tai DMSO) tai genisteiiniä.

Virtaussytometrinen analyysi

Solut ympättiin T-25-pulloihin pitoisuutena 5 x 10

5-10

6 solua ja käsiteltiin genisteiini 48 tuntia. Käsitellyt solut otettiin talteen, pestiin kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja värjättiin anneksiini V arvioida apoptoosin käyttämällä Alexa Fluor 488 anneksiini V /Dead solukuoleman Kit (Invitrogen). Solusyklin analyysi, solut kiinnitettiin 70% etyylialkoholi vähintään 15 minuuttia ja värjättiin propidiumjodidilla (50 ug /ml propidiumjodidia, 0,1 mg /ml RNaasi A: n ja 0,05% Triton X-100). Soluja inkuboitiin 40 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja analysoitiin sitten käyttäen syaani ADP kolmen kanavan virtaussytometrillä ja Summit3 ohjelmisto (Beckman Coulter, Brea, CA).

Western Blot analyysi

Yhteensä proteiini eristettiin käsitellyistä soluista ja semikvantitatiivinen analyysi ydinvoiman AR, ydin- ja sytoplasman uutteet eristettiin käyttäen Nuclear Extract Kit (Active motiivi, Carlsbad, CA). Proteiinipitoisuus mitattiin 595 nm: ssä mikrolevylukijalla käyttäen Bio-Rad Protein Assay -kittiä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Kaksikymmentäviisi ug proteiinia /kaista erotettiin NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Immunoblottaustietojen inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla laimennoksina 1: 500-laimennettu kanin polyklonaalista vasta-ainetta AR (N-20), 1: 500 vuohen polyklonaalinen vasta-ainetta PSA (C-19) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) tai 1: 1000 hiiren monoklonaalinen vasta-aine fosfotyrosiinille (4G10) (Invitrogen) yön yli 4 ° C: ssa. Toissijainen vasta-aineita konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin käytettiin (Promega). ECL Western blotting tunnistus reagenssit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) käytettiin tunnistamaan vasta-aine sitoutunut proteiini bändejä. p-Tubulin ja Tata sitova proteiini (TBP) (Cell Signaling, Danvers, MA) käytettiin lastaus säätimet kokonaisproteiinin ja ydin- proteiiniin, vastaavasti. Image J ohjelmisto käytettiin laskea intensiteetti AR ja PSA bändejä suhteessa taloudenhoito geeni kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Real-Time PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen RNeasy mini kit (Qiagen, Germantown, MD). RNA määrät ja laadut määritettiin mittaamalla absorbanssi 260 ja 280 nm spektrofotometrillä. Viisi ug kokonais-RNA: ta käänteisesti cDNA: ksi käyttäen SuperScript RT III (Invitrogen). AR ja PSA-mRNA: n ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR käyttämällä SYBR Green Pitoisuus vakioprotokolla, ja askel yksi plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) käytettiin. Spesifisiä alukkeita kunkin geenin oli suunniteltu. AR, eteenpäin aluke oli 5′-TTGTGTCAAAAGCGAAATGG- 3′, ja reverse-aluke oli 5′-CAATGGGCAAAACATGGTC-3′. PSA, eteenpäin oli 5’CTTGTAGCCTCTCGTGGCAG-3′, ja käänteinen aluke oli 5′-GACCTTCATAGCATCCGTGAG- 3′. Glyseraldehydi-3- fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin sisäisen valvonnan normalisoida ilmaisun tietoja. GAPDH eteenpäin-aluke oli 5′-GCCTCAAGATCATCAGCAATGCCT-3′, ja reverse-aluke oli 5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCACGAT- 3′. Kynnyssyklistä numerot (Ct) tuottama reaaliaikainen RT-PCR: llä käytettiin laskettaessa normalisoitua ilmentymisen suhde kohdegeenien käyttäen 2

-ΔΔCt (Livak) menetelmällä. Reaktiot suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja tulokset osoittavat kolmen erillisen kokeen.

Luciferase Assay

Solut ympättiin 24 kuoppalevyillä tiheydellä 5000 solua /kuoppa standardia väliaineessa ilman antibiootteja . Soluja lyhytaikaisesti ko-transfektoitiin PSA-promoottori-tulikärpäsen lusiferaasi-plasmidi ja

Renilla

lusiferaasin ekspressiovektori kontrollina transfektiotehokkuuden käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Molemmat plasmidit jalomielinen lahjoitus tohtori Larisa Nonn (UIC, Chicago, IL). Kahdeksan tunnin kuluttua transfektiosta solut käsiteltiin vehikkelillä (etanoli ja /tai DMSO) tai genisteiiniä. 24 tunnin kuluttua solut kerättiin talteen, ja toimittaja sekä

Renilla

Lusiferaasiaktiivisuudet määritettiin käyttäen Dual-lusiferaasimäärityssysteamiä (Promega).

Nuclear lokalisointi Studies

Cells maljattiin 16-kuoppaisille kammio dioja (Lab-Tek kammio dia järjestelmä, Nalge Nunc, Naperville, IL). Kolmekymmentä minuuttia – 4 tuntia käsittelyn jälkeen, solut huuhdeltiin 1 x PBS: llä, kiinnitettiin 4% formaldehydiä /1x PBS: ssa 20 minuuttia ja tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton X-100/1 x PBS: ssa 10 minuutin ajan. Soluja inkuboitiin ensin 5% seerumia free proteiinia lohko 60 minuuttia ja sitten AR primaarisen vasta-aineen (N-20, Santa Cruz Biotechnology) 1: 200 laimennos yön yli 4 ° C: ssa kostutetussa kammiossa. Seuraavana päivänä solut pestiin ja inkuboitiin FITC-konjugoidun anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology) 1 tunti ja sitten inkuboitiin 1: 500 Hoechst counterstaining 20 minuuttia pimeässä. Objektilasit tutkittiin ylösalaisin fluoresenssimikroskoopissa (Eclipse TE 2000, Nikon, Japani) on varustettu jäähdytetyllä CCD-kameralla (Fotometrinen Cascade II, Tucson, AZ) kontrollin alla MetaMorph kuvankäsittelyohjelma (Molecular Devices, täysin Vale, CA).

3 [H] -R1881Competitive sitoutumismääritys

Tämä analyysi tehtiin käyttäen menetelmää, jonka Siddique et al. [50]. Lyhyesti, LAPC4 ja LNCaP-solut ympättiin 12-kuoppalevyille fenolipunaista väliaineessa, joka sisälsi 5% hiilellä käsiteltyä FBS: aa varten 3 päivää, minkä jälkeen, väliaine korvattiin seerumittomalla väliaineessa, joka sisälsi 1 nM

3 [H] -R1881 kanssa tai ilman 0.1-1,000-kertainen molaarinen ylimäärä leimaamatonta kilpailijaa ligandien (R1881, Casodex tai genistein) 90 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut pestiin fosfaattipuskurilla, ja sitoo

3 [H] -R1881 uutettiin etanolissa 30 min ajan huoneenlämpötilassa ja havaitaan tuikelaskennalla.

Genistein Sitoutuminen AR in silico

X-ray kiderakenne villityypin androgeenireseptorin (ATE koodi 1I37) ja T877A mutantti (ATE koodi 1I38) yhdistettynä dihydrotestosteroni (DHT) valmistettiin kautta Protein valmistelu Wizard on Schrödingerin Suite 2011 Genistein rakentaminen valmistettiin käyttäen LigPrep [51]. OPLS2005 voimakenttä käytettiin geometrisen optimoinnin, ja mahdolliset ionisaatio ja tautomeeriset muodot luotiin genisteiini- pH 7,5 ± 0,5 käyttäen EPIK [52]. Molecular telakointi suoritettiin GOLD v5.0.1 [53]. Sitoutumiskohta pallo oli määritetty 10 Å säteellä ligandia läsnä kiderakenne, ja 100 telakointi ajoja tehtiin kunkin ligandin. Oletusarvoja käytettiin muita geneettisiä algoritmin parametrit. Kaikki laskelmat suoritettiin Amber 11 sarja ohjelmia [https://ambermd.org/], mukaan lukien ff99SB voimakentän AR proteiinin GAFF voimakentän ligandille, ja MM /PBSA laskea sitovat ilmaiseksi energiat [ ,,,0],54]. Kukin proteiini-ligandi-kompleksin solvatoitiin oktahedraaliseen laatikko TIP3P vesimolekyylien ulottuu 10 A ° ulkopuolella proteiinin puolelta. Sähköstatiikan käsiteltiin hiukkasia mesh Ewald menetelmällä [55]. Simulaatiot käytetään jäännöksen-pohjainen sulku 8 Å, aika vaihe 2 fs ja rajoite sidospituudet joissa vetyatomit avulla SHAKE algoritmia. Solvatoidut kompleksit minimoida 10000 vaiheet konjugaattigradienttimenetelmä minimointia, tasapainotettiin MD 300 K kanssa 50ps lämmityksen ja 50 ps tiheys tasapainotettiin 2 kcal mol

-1 Å

-2 rajoituksia monimutkainen ja seurasi by 500ps vakiopaineessa tasapainottumisen 0,5 kcal mol

-1 Å

-2 rajoituksiin kompleksin 300K. Tasapainon saavuttamisen jälkeen 20 ns tuotantoajolla arvioimiseksi suoritettiin vapaan energian lähentymistä ja koordinaatit poimittiin joka 2 ps. Tehollisarvoinen poikkeama (RMSD) analyysit suoritettiin käyttäen ptraj moduuli Amber 11. MM /PBSA on vakiintunut tapa laskea sitovat vapaa energiat [56]. Sitova vapaa energia laskettiin käyttäen yksinkertaista termodynaamisen energia ero monimutkainen ja sitoutumattoman muotoja. Arvot vapaan energian sitoutumisen Kunkin yhdisteen laskettiin yhtälöstä Δ

G

bind =

G

monimutkainen –

G

reseptori –

G

ligandia. Vapaan energian jokainen näistä arvioitiin summana neljästä ehdoista

G

=

E

MM +

G

psolv +

G

npsolv –

TS

lnmode, missä E

MM on molekyylimekaniikka energiaa molekyylin ilmaistu summa sisäisen energian molekyylin plus sähköstatiikan ja van der Waalsin vuorovaikutusten, Gpsolv on polaarinen osuus solvaatioenergia molekyylin, Gnpsolv on ei-polaarinen solvaatioenergia, T on absoluuttinen lämpötila, ja S on entropia molekyylin arvioitiin normaalissa tilassa analyysi. Tilannekuvia MM /PBSA otettiin joka 20 ps viimeisen 2 ns MD sarjoja, jolloin kaikkiaan sata tilannekuvia ajoa kohti. Normal-tilassa analyysi käytettiin laskea värähtelyjen, rotaatio, ja translaation entropia. Koska korkea laskennallisen kustannukset ja poikkeaman entropian, joka on suhteellisen pieni eri konformaatioita [57], me vain valitut 12 säännöllisesti erillään valokuviin pitkin viime 2 ns tuotanto kehityspolun entropia laskelmia.

Tilastollinen analyysi

Aineisto analysoitiin käyttämällä Studentin t-testiä, tai yksisuuntainen ANOVA seurasi post-hoc testi tarvittaessa ja p arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

fysiologiset pitoisuudet Genistein Inhibioitu LAPC-4 Cell Growth, mutta stimuloidun kasvu LNCaP

onko T877A mutaatio AR vaikuttaa vaikutuksia genisteiinin on PCa solujen proliferaatiota, me soveltaa kaksi lähestymistapaa, (a) käyttäen solulinjat, jotka luonnollisesti WT AR (LAPC-4-soluja) tai T877A mutantti AR (LNCaP-solut) ja (b) käyttämällä AR-null-solulinja (PC-3 ) transfektoitu ohimenevästi eksogeenisellä WT tai T877A mutantti AR voittamiseksi biologista poikkeamia kahdella eri solulinjoja. Lisäksi, jotta vältetään Vaihtelut AR ilmentymisen välillä PC-3-solut transfektoitiin eri AR rakentaa ja LNCaP-soluja, erilaisia ​​DNA-pitoisuudet (0.5-5μg) testattiin, ja optimaalinen annos, joka johti lopulliseen AR ekspressiotason lähellä että LNCaP käytettiin (0,5 ng).

PCa-soluja käsiteltiin eri genisteiinin pitoisuudet (0,5-50 umol /l) ja 24-72 tuntia, jonka jälkeen solujen kasvua ja elinkelpoisuus arvioitiin sekä MTS-soluproliferaation määritys ja hemosytometriä solujen laskenta trypaanisinieksluusiolla. Genistein esti LAPC-4 solujen lisääntymistä merkittävästi kaikilla testatuilla pitoisuuksilla annoksesta liittyvä muoti (kuvio 1A). Sen sijaan, fysiologiset pitoisuudet 0,5, 1,0, ja 5,0 umol /l genistein stimuloi LNCaP-solujen lisääntymisen 13%, 35%, ja 27% kontrolleihin verrattuna, vastaavasti, kun taas suurempia pitoisuuksia genisteiinin (25 ja 50 umol /l) aiheutti eston leviämisen 38% ja 50% (kuvio 1 B). LAPC-4-soluja, käsittely 1nmol /L R1881 poistettiin inhiboivia vaikutuksia genisteiinin, paitsi korkea konsentraatio (50μmol /L) (kuvio 1C). Vaikka LNCaP yhdistettynä hoito pieniannoksisen genisteiini- (1 umol /l) ja synteettiset androgeenien (1 nmol /l R1881) additiivisesti lisääntyi solujen lisääntymistä 134%, mikä oli enemmän kuin aiheuttama joko genisteiiniä tai androgeenien yksinään (35% ja 90% kontrolliin verrattuna, vastaavasti) (kuvio 1 D). Hemosytometriä laskenta trypaanisini- syrjäytymisen vertailukelpoinen kuvion, joka saadaan MTS-proliferaatiomääritys ja puute sytotoksisuuden (tuloksia ei ole esitetty).

Tiedot edustavat keskiarvoa ± SD (keskihajonta) on kolmen kokeen kunkin kolmena kappaleena. A ja B: graafinen esitys vaikutuksista eri pitoisuuksia genisteiinin on LAPC-4 (A) ja LNCaP (B) solujen kasvua. C ja D: vaikutus yhdistettynä hoidon genistein ja R1881 on LAPC-4 (C) ja LNCaP (D) solujen lisääntymistä. E: vaikutus genisteiinin hoitoa 24 tuntia kasvuun ei transfektoitujen PC-3-solujen tai PC-3-solut transfektoitiin joko WT-AR tai T877A mutantti AR. OD; optinen tiheys. * P 0,05, ** p 0,01 vertailut kontrolliryhmiin.

10 umol /l tai enemmän, genisteiini hoito 48 tunnin indusoi merkittävän proliferaation inhibitiota PC-3 soluja, joista puuttuu AR ilmaisu (kuvio 1 E). Mielenkiintoista, sama pitoisuudet genisteiinin indusoi merkittävän proliferaation PC-3-solut ilmentävät T877A-mutantti AR (kuvio 1 E), vastaa meidän havaintojen LNCaP että ilmentävät endogeenisesti samaa mutantti AR. Leviämisen PC-3-soluja, jotka on transfektoitu WT-AR inhiboitui merkittävästi pitoisuuksina 10 pmol /l tai enemmän (kuvio 1E).

Yhteenvetona (katso taulukko 1), PCa solut, jotka ilmentävät WT-AR joko endogeenisesti (LAPC-4-soluja) tai eksogeenisesti (WT-AR transfektoitujen PC-3-solut) eivät osoittaneet mitään kasvua stimuloiva vaste genisteiiniksi . Kuitenkin PCa solut, jotka ilmentävät mutantti AR, joko endogeenisesti (LNCaP-solut) tai eksogeenisesti (transfektoitu PC-3-soluja), oli merkittävä parannus solujen jakautumista vasteena alentaa mikromolaarisia konsentraatioita genisteiinin.

Genisteiini (umol /L ) B Cell Growth

apoptoosi

AR tumaanohjaussignaali

AR proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen

PSA-proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen

PSA lusiferaasia activity

LAPC-40.5↓↑↓↓↓↓1↓↑↓↓↓↓↓↓↓↓5↓↓N/AN/A↓↓↓↓↓↓↓↓10↓↓↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓25↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓50↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓LNCaP0.5↑↔↑↑↑↑1↑↑↔↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑5↑↑N/AN/A↑↑↑10↔↔↔↔↓↓↓25↓↓↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓50↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓Table 1. Yhteenveto kokonaisvaikutukset genisteiinin on LAPC-4 ja LNCaP-solut.

Lyhenteet ovat seuraavat: ↑ hieman lisääntynyt; ↑ ↑ kohtalaisesti lisääntynyt; ↑ ↑ ↑ huomattavasti lisääntynyt; ↔ ei muutosta, ↓ hieman estyy; ↓ ↓ kohtalaisen estyy; ↓ ↓ ↓ inhiboitui merkittävästi. CSV Lataa CSV

pieniä annoksia Genistein aiheuttaman apoptoosin ja solukierron pysähtymisen LAPC-4 Cells, mutta ei LNCaP

Vertasimme LAPC-4 ja LNCaP solujen kasvun vaikutukset pitoisuuksien genisteiiniä hoidon 48 tuntia apoptoosiin ja solusyklin etenemisen, sekä arvioida virtaussytometrialla. Apoptoosi vahvistunut pitoisuudesta riippuvalla tavalla LAPC-4-soluja, alkaen niinkin pienellä annoksella kuin 0,5 umol /l (kuviot 2A). Sitä vastoin genisteiini pitoisuuksia välillä 0,5 ja 10 umol /l ei aiheuttanut merkittävää muutosta apoptoosin LNCaP; apoptoosin nostettiin vain genisteiini- pitoisuuksina 25 mikromol /l tai suurempi (kuviot 2B). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, genisteiini aiheutti kasvua LAPC-4-solut Saharan G1 pitoisuuksissa yhtä suuri tai suurempi kuin 10 mikromol /l, kun taas tämä havaittiin LNCaP vain tai yli 25 mikromol /l (taulukko 2).

soluja käsiteltiin genisteiiniä (0.5- 50 umol /l) 48 tunnin ajan, sitten apoptoosia tutkittiin LAPC-4 (A) ja LNCaP-soluja (B) virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen anneksiini-V apoptoosin havaitseminen pakki. Solut käsiteltiin genisteiini- 72 tunnin testattiin merkkejä sytotoksisuuden käyttämällä laktaattidehydrogenaasin vapautumisen määrityksellä. Tulokset kaaviossa edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01, vertailuja kontrolliryhmiin.

LAPC-4-solut

LNCaP

Genistein annos

Sub G

G0 /G1

S

G2 /M

Sub G

G0 /G1

S

G2 /M

Control9.46 (3,8) 71,98 (5,1) 6,38 (3,3) 12,25 (2,8) 7,06 (1,5) 73.85 (2,5) 8,04 (2,1) 11,05 ( 2.8) 0,5 mikromol /l 13,63 (1.5) 62,69 (9.4) 6,12 (4,9) 17.66 (2,6) 7,00 (1,5) 74,96 (5,4) 8,02 (2,9) 10,02 (4.6) 1,0 mikromol /L18.37 (6,2) 59,58 * ( 4.1) 4,18 (0,8) 17,78 (5.6) 4,44 * (0.9) 82,12 * (4.3) 9,09 (2,4) 4,42 * (2.4) 10 umol /L25.1 ** (2,6) 52,3 ** (2,9) 3,30 (0,9) 19.31 * (2,8) 7,08 (1,5) 72,81 (4.8) 7,80 (1,8) 12,31 (2.6) 25 umol /L34.2 ** (4,2) 40,8 ** (4,3) 3,84 (4,1) 21,19 * (3,5) 13,0 ** (2,5) 61,78 ** (3,2) 5,84 (2,1) 19,4 * (3,6) 50 umol /L40.4 ** (0,8) 31,2 ** (3,0) 2,30 (0,9) 26,1 ** (2,0) 9,37 ** (1,6 ) 43,03 ** (3,4) 3,30 * (1,1) 34,3 ** (3,9) Taulukko 2. vaikutukset genisteiinin solusyklin jakautumista LAPC-4 ja LNCaP-solut.

Propidiumjodidia-värjätyt solut analysoitiin käyttäen virtausta sytometrin. Tulokset taulukossa edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01, verrattuna vehikkelikontrolliryhmään. Numerot sulkeissa ovat standardipoikkeamat. CSV Lataa CSV

Mitä solusyklin etenemistä, 1 umol /l genisteiinin merkittävästi vähentää LNCaP-solujen osa-G1 ja G2 /M ja lisääntynyt solujen G0 /G1 vaiheen solusyklin (taulukko 2). Sen sijaan, LAPC-4-soluja, pienet annokset genisteiinin indusoi kasvun pysähtymisen ilmeistä pelkistämällä solujen määrä G0 /G1 ja kerääntyminen solujen G2 /M, joka on ominaista S-vaihe lohkossa tai S /G

2-faasimuutoksen lohko (taulukko 2). Kuitenkin supraphysiological pitoisuuksina (25μmol /l ja korkeampi), genisteiini aiheuttaa G2 /M-pysähtymisen ja apoptoosia sekä solulinjoissa, LAPC-4-soluja on herkempi kuin LNCaP-soluja. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​sen kanssa, mitä me raportoitu edellä MTS soluproleferaatiomäärityksessä. Eliminoimiseksi suoran sytotoksisuuden genisteiinin, me sitten suoritetaan laktaattidehydrogenaasi vapautumisen määrityksellä sekä LAPC-4 ja LNCaP-solujen koko alueella genisteiinin annoksilla, joita on käytetty. Ei ollut havaittavissa sytotoksisuus tahansa annoksen genisteiinin enintään 50 umol /l 72 tunnin ajan joko solulinjoissa (kuvio 2C).

stimuloivan vaikutuksen genisteiinin LNCaP-soluissa oli Tukena Mutant AR

tutki mutantti AR-T877A vaaditaan genistein parantaa LNCaP-solujen lisääntymisen puuttuessa androgeenin (kuvio 3A). LNCaP-soluja inkuboitiin joko 1 umol genisteiiniä tai 1 nmol /l R1881 puuttuessa tai läsnä 100 nM AR-antagonisti, Casodex. Kuten kuviossa 3A, Casodex yksinään ei vaikuttanut LNCaP solujen kasvuun, mutta se poisti stimuloiva vaikutus 1 nmol /l R1881 soluproliferaatioon, yhdenmukaista käsitteen että AR aktivaatio välittää PCa solujen lisääntymistä (36,38). Lisäämällä 1 umol /l genisteiinin medialle tehostetun LNCaP soluproliferaation 49% ja tämä vaikutus oli myös eliminoitu 100 nmol Casodex. Nämä havainnot osoittavat, että stimuloiva vaikutus genisteiinin LNCaP soluproliferaatioon välittyy ensisijaisesti T877A mutantti AR.

V: graafinen esitys vaikutuksesta yhdistettynä hoidon R1881 (1nmol /l) ja Casodex (100nmol /l) tai genisteiiniä (1 umol /l) ja Casodex (100nmol /L) LNCaP solujen kasvuun mitattiin MTS-määritys. Tulokset kaaviossa edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta kokeesta kukin kolmena rinnakkaisena. * P 0,05, ** p 0,01, sillä vertailut potilailla, joita hoidettiin R1881 tai genistein, vain. B: Evaluation genisteiinin-AR sitova

silico

. Edustava osoittavat konformaatiomuutoksia WT-AR ja T877A mutantti AR jälkeen molekyyli telakointi genisteiini-

silico

käyttämällä GOLD v5.0.1 mallinnusohjelma. Eri aloilla AR esitetään eri värejä. Inset, genisteiini sitoutunut ligandia sitovan domeenin (LBD) ja AR-reseptoriin. Nuolet osoittavat eri konformaatiomuutoksiin ja silmukka liikkeet WT-AR ja T877A mutantti AR vastauksena genisteiiniksi telakointi. C: geometrinen optimointi, ja tautomeeriset muodot genisteiinin luodaan pH 7,5 ± 0,5 käyttäen EPIK. Keltainen on WT-AR, ja vihreä on, että T877A mutantti AR. D ja E: Evaluation genisteiinin-AR sitova käyttämällä

3 [R1881] kompetitiivinen sitoutumismääritys. Histogrammi esittää sitoutumisen genisteiinin kanssa AR LAPC4 (WT-AR) ja LNCaP (mutantti AR) soluissa määritettiin radioleimatun solupohjainen kompetitiivinen sitoutumismääritys, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset kaaviossa edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01, verrattuna kontrolli.

kyky genisteiinin parantaa proliferaatiota LNCaP-soluissa, mutta ei LAPC-4-soluja, voi johtua eri affiniteetilla, joka genisteiini sitoutuu mutantti AR ja WT-AR. Tutkia tätä oletusta, kaksi lähestymistapoja käyttäen,

in silico

molekyylimallinnuksen ja

3 [H] -R1881 kompetitiivinen sitoutumismääritys.

In silico

mallinnus osoitti, että genistein sitoutuu AR sitova tasku ilman päällekkäisyyksiä kanssa DHT sidoskohdan (kuviot 3B ja 3C).