Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kirurginen näytteitä pitkään käytetty tärkeitä kohteita syöpätutkimukseen . Mukaisesti kasvua neoadjuvant hoidon biopsianäytteissä on viime aikoina tullut välttämätöntä syövän transcriptome. Toisaalta, sekä koepala ja kirurgiset näytteet ovat käytettävissä ilmaisun profilointi ennustamiseen kliininen tulos mukaan adjuvanttihoito; se on kuitenkin vielä epäselvää, onko kirurgisen näytteen ilmaisu profiilit ovat hyödyllisiä ennusteen kautta biopsianäytteissä, koska vähän on tehty vertailevaa geeniekspressioprofilointi välillä kahdenlaisia ​​näytettä.

Menetelmät ja havainnot

yhteensä 166 näytettä (77 koepala ja 89 kirurgisen) normaalien ja pahanlaatuisten vaurioiden ruokatorven analysoitiin mikrosiruja. Geeniekspressioprofiilit vertailtiin biopsia ja kirurgiset näytteet. Keinotekoisesti epiteelin-mesenkymaalitransitioon (aiEMT) havaittiin kirurgisen näytteissä, ja tapahtui myös hiiren ruokatorven epiteelisolukerroksissa alle iskeemisen kunnossa. Tunnistaminen kliinisesti merkittäviä alaryhmien luultiin häiriintyä häiriö ilmaisun profiilin kautta aiEMT.

Johtopäätös ja merkitys

Tämä tutkimus herättää perustavanlaatuisia virheellistä tulkintaa myös aliarviointiin ennustetekijöiden arvioinnin teho merkkiaineiden mukaan yliarvioinnista EMT viime syöpätutkimukseen ja toimittavat joitakin neuvoja lähitulevaisuudessa seuraavasti: 1) ymmärtäminen, kuinka kauan kudokset oli alle iskeemisen kunnossa. 2) yleisyys koepalojen varten

in vivo

ilmaisun profilointi alhainen harhojen perustutkimukseen ja kliiniseen tutkimukseen. 3) tarkistaminen syöpäsolun sisältö ja normaali- tai nekroottisen-kudoksen saastuminen biopsianäytteissä varten esiintyvyys.

Citation: Aoyagi K, Minashi K, Igaki H, Tachimori Y, Nishimura T, Hokamura N, et al. (2011) keinotekoisesti epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon in Surgical Oppiaineet: sen yhteyksistä Clinical and Basic Cancer Research. PLoS ONE 6 (4): e18196. doi: 10,1371 /journal.pone.0018196

Editor: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 24 joulukuu 2010; Hyväksytty: 22 helmikuu 2011; Julkaistu: 21 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Aoyagi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Program edistämisen Fundamental Studies in Health Sciences of National Institute of Biomedical innovaatio; Grant-in-tuki kolmannen Kattava 10-Year strategia Cancer Control terveysministeriön, Labour and Welfare of Japan; Prinsessa Takamatsu Cancer Research Fund, ja säätiö edistäminen Cancer Research (RR: T. N.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on merkittävä syy ihmisen kuolemista monet maat. Geeniekspressioprofiilien DNA mikrosiruja ovat yksilöllisiä ja käyttökelpoisia diagnoosissa ja ennusteen tauteja [1]. Vaikka jotkut keinotekoinen tekijät, kuten iskemia, hypoksia, hyponutrition, ja kylmä stressi mahdollisesti esiintyä kirurgisen resektion ja näytteen kuljetus (kuva S1), kirurgiset näytteet pitkään käytetty tärkeänä aiheita kliinisen ja perustutkimuksen syöpätutkimukseen. Mukaisesti kasvua neoadjuvant terapian (pään ja kaulan, ruokatorven, keuhko-, haima-, eturauhas-, ja rintasyöpiä), koepalojen on viime aikoina tullut välttämätöntä syövän transcriptome. Toisaalta, sekä biopsialla ja kirurgiset näytteet ovat saatavilla ilmentymisen profilointi ennustamiseksi kliininen tulos, jonka liitännäishoitona (vatsassa, paksusuoli, maksa, virtsarakko, haiman, aivojen, munuaisten, munasarjojen, kohdunkaulan, ja rintasyöpiä). Koskevat tavoitteet mikrosiruanalyysi olivat, että viimeisten kymmenen vuoden aikana, lähinnä kirurginen samplesfrom kehittämistä ja yleisyydestä kahdenlaisia ​​microarray: oligonukleotidi [2], [3] ja cDNA [4], [5]. Kuitenkin myös valtava määrä kertynyt kirurgisen näytteen ilmaisu profiilit ovat hyödyllisiä ennusteen käyttämällä otetuissa aiemmin hoidetut potilaat on vielä epäselvä, koska vähän on tehty vertailevaa geeniekspressioprofilointi välillä kahdenlaisia ​​näytettä.

kemosädehoito (CRT) ja sen jälkeen leikkaus on tavallinen hoito ruokatorven syöpä länsimaissa. Japanissa neoadjuvanttikemoterapian seuraa leikkauksen ja lopulliset CRT ovat standardin hoitojen [6], sekä paikallisesti edennyt ruokatorven syöpiä (vaihe II tai III), leikkaus oli tavallinen hoito on noin 5 vuotta sitten [7]. Tämä antaa meille mahdollisuuden saada sekä biopsialla ja kirurgiset näytteet ruokatorven syöpä potilaiden ja verrata geeniekspressioprofiilit näiden kahden tyyppisiä näytteitä. Kirjoittajat raportoivat, että keinotekoisesti epiteelin-mesenkymaalitransitioon (aiEMT) esiintyy kirurgisten näytteiden. Sen läsnäolo siellä ei ehkä puuttua paitsi microarray- tai immunohistochemistory-pohjainen kliinisen tutkimuksen lisäksi myös perustutkimukseen.

Tulokset

vertailu Expression Profiles välillä Biopsia ja Kirurgisesti resektoitiin Ruokatorven kasvainnäytteestä Saadaan eri asiat

ensimmäinen verrattuna geeniekspressioprofiilien välillä 35 tuoretta biopsianäytteissä jotka eivät sisällä nekroottisen vaurion ja 66 kirurgiset ruokatorven kasvain näytteet, jotka on saatu marginaali kasvain altistuksen jälkeen 4-7 tunnin ajan iskeemisen edellytyksen , jonka ilman valvontaa klustereiden kanssa 3126 käsitellyt geenien (materiaalit ja menetelmät). Ei ollut merkitsevää eroa kliinisiä tai patologisia vaiheessa jakautuminen näiden kahden ruokatorven syöpien koska paikallisesti edennyt kasvaimia (vaihe II tai III) ovat keskeiset tavoitteet sekä sädehoitoa ja kirurgian [8] – [10]. Kuusikymmentä on 66 kirurgisen näytettä (90,9%) ja 29 35 biopsianäyttei- (82,9%) esiintyi (vasemmalla) ja b (oikealla) näyte klusteri, vastaavasti (kuvio 1A). Tutkimaan useita eri tavalla ilmentyvien geenien näiden kahden eri näytteiden toistettavuus, vertasimme ekspressioprofiilit joukossa kolme itsenäistä näytteen sarjaa (A, B, ja C): toinen 20 biopsianäytteestä asettaa versus kolme kirurgisen näytteen sarjaa (A, B, ja C), joka sisältää 20 satunnaisesti valittua tapausta 66 tapausta (kuvio 1 B, ylempi). Määrä eri tavalla ilmaistuna geenien valitaan u-testi (p 0,01) olivat 2, 295, 2328, ja 2, 245 sarjoissa A, B, ja C, vastaavasti. Näistä 3 sarjaa, 1495 geenit (65,1% A, 64,2% B, ja 66,6% C) on yleisesti tunnistettu (kuvio 1 B, ylempi). Siksi enemmän kuin 20% (1495/6000, 24,9%), ja geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä biopsia ja kirurgiset näytteet, koska keskimäärin havaittavissa geenejä kussakin tapauksessa oli noin 6000. Nämä tulokset viittaavat siihen, että suuri ero välillä biopsia ja kirurginen näytteitä.

(A) valvomaton yritysverkostojen 3126 käsitelty geenejä. Kirurginen (a) ja biopsianäytteestä klusterit (b) on esitetty. (B) Vertailu ilmentymisen profiilien joukossa kolme itsenäistä sarjaa (A, B, ja C): valitaan satunnaisesti 20-biopsianäytteestä asettaa versus kolme kirurgisen näytteen sarjaa (A, B, ja C), joka sisälsi 20 itsenäistä tapauksissa. Määrä eri tavalla ilmaistuna geenien valitaan u-testi (p 0,01): 2, 295 joukko A, 2328 B-sarjan, ja 2, 245 set C (ylempi). Määrä differentiaalisesti ilmentyvien geenien kanssa 3-kertainen muutos kahden keskimääräisen signaalin intensiteettiä: 297, 273, ja 300. klusterointi tuloksia näillä geenin sarjaa (Ala). (C) Up-geenien in kirurgiseen tai biopsianäytteissä. Käyttämällä kaikkien profiilien tiukoissa selektio-olosuhteissa (katso materiaalit ja menetelmät), 38 ja 219 geenit tunnistettiin up-geenien in biopsia ja kirurginen näytteitä, vastaavasti.

Valitse 1495-geenit, olemme edelleen valittu differentiaalisesti ilmentyvien geenien joukossa 3 sarjaa, joka oli 3-kertainen muutos kahden keskimääräisen signaalin voimakkuudet kunkin geenin välissä biopsia ja kirurgiset näytteet. Joukoista A, B, ja C, 297, 273, ja 300 geeniä tunnistettiin, vastaavasti (kuvio 1 B, alempi). Yli 80% näistä geeneistä oli yli-ilmentyy kirurgisen näytteissä, mikä viittaa etuoikeutettu läsnäolo keinotekoisten tekijöiden tai saastumisen normaali annoksia.

Vastatakseen perustelut ero, lopulta valitaan geenit ilmaistaan edullisesti kaikissa 35 koepalan tai 66 kirurgiset näytteitä tiukoissa olosuhteissa u-testi (p 0,01), permutaatio testi, ja 2-kertainen muutos, jne. (materiaalit ja menetelmät). Tällä menettelyllä, 38 ja 219 geenit tunnistettiin up-geenien in biopsia ja kirurginen näytteet, vastaavasti (taulukko S1 ja kuvio 1 C). Mielenkiintoista on, että kirurgisen näytteissä, monet EMT markkereita havaittiin ilmentyvän ensisijaisesti ja usein. Microarray tulokset 13 edustajan EMT markkereita kuten fibronektiini (FN), vimentiinistä (VIM) ja kollageenien (työtoverit) esitetään kuviossa 2A. Lisäksi kalvo signaalimuuntajia kuten sytokiinien, kemokiinin, ja reseptorit todettiin myös olevan säädellään ylöspäin kirurgisen näytteissä. Edustavia microarray ja RT-PCR tulokset

IL8

,

CXCR4

,

CXCL9

,

PDGFRB

,

CCL5-

, ja

TLR2

vastaavasti on esitetty kuvioissa 2B ja 2C. Vastaten EMT, E-kadheriinin (

CDH1

) todettiin alassäädetty kirurgisessa näytteissä (kuvio 2A, oikea alin).

(A) Expression malleja epiteelin solumarkkerigeenien E-kadheriinin (

CDH1

) ja tyypillinen EMT markkereita kuten fibronektiiniä (

FN

), vimentiinistä (

VIM

), ja kollageenien (

Cols

). (B) Expression kuvioita 6 kalvo signaalimuuntajia: sytokiini (

IL8

), kaksi kemokiinien (

CXCL9

ja

CCL5-

), ja kolme kalvotyyppi reseptoreihin (

CXCR4

,

PDGFRB

, ja

TLR2

). (C) Semi-kvantitatiivinen RT-PCR tulokset 6 kalvon antureiden edustavissa näytteissä.

vertailu Expression Profiles välillä biopsianäytteissä ja kirurgiset resektoitiin Ruokatorven kasvainnäytteestä Saatiin samanlaisia ​​laatikoita

samalla edellä esitetyllä tavalla, vertasimme geeniekspressioprofiilit välillä 18 biopsia ja 18 kirurgisesti resektoitiin ruokatorven kasvain näytteitä, ja on valittu 41 ja 716 geeniä, jotka havaittiin jopa geenien kahden eri näytteiden, vastaavasti (taulukko S2 ja kuvio 3). Mukaisesti edellä esitetyt tulokset eri tapauksissa monet EMT markkereita ja kalvo signaalimuuntajia todettiin myös olevan säädelty usein kirurgisen näytteissä (kuvio 4A). Vielä tärkeämpää on, kaksi EMT sääntelyviranomaisten,

ZEB1

ja

ZEB2

, ja jotkut EMT liittyviä myogenic transkriptiotekijöiden kuten

MEOX2

ja

MEF2C

pystyivät valitaan niin ylös geenien kirurgisessa näytteistä (kuviot 4A). Kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR vahvisti yli-ilmentyminen

ZEB1

,

ZEB2, FN, ja VIM

on 18 kirurgiset näytteet samanlaisia ​​laatikoita (kuvio 4B). Yli-ilmentyminen

ZEB1

ja

ZEB2

todettiin myös, että 66 kirurgisen näytteitä eri tapausten (Kuva S2), vaikka nämä kaksi EMT sääntelyviranomaisten ei voida uuttaa ekspressioprofiileja alla edellä tiukat ehdot. SNAI1 /Snail, SNAI2 /Slug, ZEB1 /ZFHX1A, ZEB2 /SIP1 /ZFHX1B, TWIST1 /TWIST, ja TWIST2 edustavat EMT sääntelyviranomaiset [11], [12]. Joukossa,

TWIST1

sekä kaksi

ZEBs

oli yli-ilmentyy kaksi ruokatorven kasvainten (kuva S3). Sen tutkimiseksi, aiEMT mRNA tasoilla vaikuttaa immunohistokemia (IHC), teimme IHC tyypillinen mesenkymaalisten merkki vimentiinista biopsiassa ja kirurgisissa näytteitä samanlaisia ​​laatikoita. Ensin määritellään edellytykset, joilla normaali epiteelisolujen kerrokset ei värjätä, mutta kasvainsolujen EMT voisi olla (kuviot 5A, 5B), koska eriytymättömiä kerrokset (pohjapinta ja parabasal) on raportoitu ilmaista EMT liittyviä geenejä, mukaan lukien

VIM

[4]. 3 out of 5 paria tutkitut näytteet, tuumorileesioissa kirurgisen näytteen todettiin värjätään korkeammin kuin koepala näyte (kuviot 5C-H); kuitenkin se, että 2 paria ei osoittanut tällaista eroa (tuloksia ei ole esitetty). Siksi aiEMT joka tapahtui kirurginen näytteiden mRNA tasolla uskottiin vaikuttavan vain osan kirurgisen näytteiden tasoa EMT-sukuiset proteiinit.

tiukkoja valinta (katso materiaalit ja menetelmät), 41 ja 716 geenit tunnistettiin up-geenien in biopsia ja kirurginen näytteitä, vastaavasti.

(A) Expression kuvioita 2 edustajan EMT sääntelyviranomaisten (

ZEB1

ja

ZEB2

), 8 tyypillinen EMT markkereita kuten fibronektiiniä (

FN

), vimentiinistä (

VIM

), 3 kollageenien (

COL1A2

,

COL3A1

, ja

COL14A1

),

fbn1

,

MYH11

, ja

ACTC1

, ja 2 EMT liittyvät myogenic transkriptiotekijöiden (

MEOX2

ja

MEF2C

). (B) Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR-tulokset

ZEB1, ZEB2, FN, ja VIM

. Suljettu box: kirurginen näyte; Avaa-ruutuun: koepala näyte.

IHC of vimentiinista ylimääräiseen kirurginen näyte, joka sisälsi normaali annoksia, osoittivat, että normaali ruokatorven epiteelisolujen ei värjätä, mutta invasiivisia kasvainsolut olivat (A, B). 3 out of 5 paria koepala ja kirurgisten näytteiden yli-ilmentyminen vimentiinista havaittiin kirurgisen näytteistä (koepala: C, E, G, kirurgiset: D, F, H).

yli-ilmentyminen

ZEB1

,

ZEB2

, ja

TWIST1

kirurgisesti resektoitiin Normaali kudokset

Saimme 4 biopsianäytteissä ja 5 kirurgisia näytteitä ei -cancerous kudoksia, ja verrattiin niiden ilmaisun profiileja. Samalla tavalla edellä ilmentymisen profiilit kasvaimen kudokset (kuviot 2, 4, S2 ja S3), kolme EMT säätölaitteet (

ZEB1

,

ZEB2

, ja

TWIST1

) ja kaksi tyypillistä EMT markkereita (

VIM

ja

FN

) havaittiin yli-ilmentyy 5 kirurgisen näytteistä (kuvio 6A). Meidän edellinen raportti osoittaa osallistumista ZEB2 ja TWIST1 että EMT normaalien ja pahanlaatuisten ruokatorven epiteelisoluissa [9] tukee läsnäoloa keinotekoisesti aiheuttama EMT.

(A) yli-ilmentyminen EMT-sääntelyviranomaisten (

ZEB1

,

ZEB2

, ja

TWIST1

) ja EMT-markkereita (

VIM

ja

FN

) kirurgisesti resektoitiin normaali ruokatorvi limakalvolle. (B) induktio hiiren

Zeb1

,

Zeb2

,

Vim

, ja

Fn

alle iskeemisen kunnossa. Resektion jälkeen hiiren ruokatorven, otimme sen PBS 0 tai 4 tunnin ajan huoneen lämpötilassa (alle iskeemisen edellytyksen), heti teki jääleikkeet, jää epiteelisolukerroksen (ylempi) laserilla mikrodissektion, monistettiin mRNA TALPAT [24] – [28], ja saatu ilmentyminen profiileja Mouse Expression Array 430 2,0 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Kokeet suoritettiin 3 hiirtä.

Zeb1

,

Zeb2

,

Vim

, ja

Fn

geenit indusoidaan 4 tunnin kuluttua resektio (Ala). *

P

0,05. (C) Quantitative reaaliaikainen RT-PCR

Zeb1

,

Zeb2

,

Vim

, ja

Fn

. Yli-ilmentyminen

Zeb1

,

Zeb2

,

Vim

, ja

Fn

, osoittama mikrosiru, vahvistettiin.

Lopuksi tutkia näitä 5 geenit indusoidaan epiteelisoluihin kirurginen resektio liittyvä iskemia, me resektoitiin hiiri ruokatorvi, ja asetti sen PBS 0 tai 4 tuntia, ja heti teki jääleikkeille seurasi laser-kaapattu mikrodissektion epiteelisolujen kerrokset (kuvio 6B, ylempi). Expression profiilit hiiren epiteelisolujen kerrokset 0 tai 4 tuntia sen jälkeen resektion paljasti, että hiiren

Zeb1

,

Zeb2

,

Vim

, ja

Fn

indusoitiin 4 tunnin kuluttua resektio (kuvio 6B, laske). Kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR vahvisti yli-ilmentyminen

Zeb1

,

Zeb2

,

Vim

, ja

Fn

resektion jälkeen (kuvio 6C) . Koska yleinen herkkyys hiiren Affymetrix paneelit tiedetään olevan alhaisempi kuin ihmisillä, ja käyttää pieni määrä RNA: ta, kuten laser-jää aineet tunnetaan myös vähentää microarray herkkyyttä,

Twist1

mRNA itse voinut havaitaan hiiri kokeessa (tuloksia ei ole esitetty).

Sen tutkimiseksi, aiEMT, että mRNA-tasot vaikuttaa IHC, teimme IHC tyypillinen mesenkymaaliset markkeri vimentiinista 8 tunnin kuluessa leikkauksen jälkeen. Täällä määritetään olosuhteet, joissa normaalin epiteelisolujen kerrokset värjätään. Kaikissa 3 riippumatonta tutkitut näytteet, normaali epiteelisolujen kerrokset ei todettu värjätään erittäin 8 tuntia sen jälkeen, kun resektion (kuviot 7A-C). Ristiriita mRNA-tasolla ja proteiinin taso voidaan selittää seuraavista kahdesta syystä: 1) vaikka erilaistumaton kerrokset (pohjapinta ja parabasal) on raportoitu ilmaista EMT liittyviä geenejä, mukaan lukien

VIM

[4], niiden ekspressiotasot olivat paljon pienempiä kuin kasvain (kuvio 5B). 2) se voi myös olla vaikeaa osoittaa suunnilleen 2-kertainen muutos mRNA tasolla (kuviot 6B, C) proteiinin tasolla IHC, koska IHC on huonompi RT-PCR sekä herkkyyttä ja kvantifiointiin.

Kun resektio hiiren ruokatorven, otimme sen PBS: 0, 4, 8 tuntia huoneenlämmössä (alle iskeeminen ehto), heti teki jääleikkeille, ja IHC on vimentiinista suoritettiin alle herkempi olosuhteissa verrattuna kuvion 5 . Kokeet suoritettiin 3 hiirtä (A-C). Yli-ilmentyminen vimentiinista hiiren ruokatorven epiteeli ei havaittu, vaikka 8 tuntia altistuksen alle iskeemisen kunnossa. Arrow: vimentiinista-positiivinen sileän lihaksen, nuoli pään: hiiri kerrostunut ruokatorven epiteelisolujen kerrokset.

Kaikki tulokset viittaavat siihen, että EMT, erityisesti mRNA tasolla, indusoidaan keinotekoisesti sekä normaali ja pahanlaatuiset epiteelin solut kirurginen resektio liittyviä tapahtumia (iskemia aiheuttama hypoksia ja hyponutrition, ja hypoksian aiheuttama tulehdus, jne.).

keinotekoisesti EMT (aiEMT) by Surgical Kaarileikkaus Estää Microarray-pohjainen alakonserni Identification

tunnistaminen kliinisesti merkittäviä alaryhmien on erittäin tärkeää henkilökohtaisen lääketieteen ja lääkekehityksen vastaan ​​hankala tapauksissa. Kun käytimme ilmaisua profiilit 35 biopsianäytteissä saatu hoidetulla potilaalla kemosädehoito [8], valvomattoman klustereiden kanssa 5570 käsitellyt geenien (materiaalit ja menetelmät) tunnistaa hyvän vasteen, joka koostuu 9 potilasta (7/9, 78% osoittaa täydellistä vastauksena kemosädehoito) päässä 35 (kuvio 8A, vasemmalla). Kuitenkin, kun profiilit 66 kirurgisen näytteitä käytettiin, valvomattoman klustereiden kanssa 2016 käsitelty geenien ei ole havainnut mitään alaryhmä (kuvio 8A, oikealla). Siten biopsianäytteestä ekspressioprofiileja näytti olevan tehokkaampi alaryhmä tunnistamisen kuin kirurgisen näytteitä. Itse asiassa me aikaisemmin raportoitu, että biopsianäytteestä ekspressioprofiileja voisi erottaa pitkäaikainen tai lyhytaikainen eloonjääneiden lopullisten kemosädehoito [8]; kuitenkin, kirurginen näyte ekspressioprofiileja koskaan tunnistettu huono ennustetekijöiden osaryhmään laaja imusolmuke etäpesäke [10]. Lisäksi kirurgisen näytteissä, EMT nopeutettiin 36 (85,7%) 42: sta ruokatorven syöpiä [9]. Tämä suuri osuus näyttäisi johtuvan aiEMT.

(A) valvomaton klusterointi 35 koepala ja 66 kirurgisesti resektoitiin ruokatorven kasvain näytteitä 5570 ja 2016 jalostettuja geenejä, tässä järjestyksessä. Näyte klusterin 2971 geenejä esiintyy vain biopsianäytteissä. (B) vertailu määrä käsiteltyjen geenejä valvomatta klusterointi välillä koepala ja kirurgiset näytteitä. Määrä käsiteltyjen geenien ja yleisesti valittu geenien on osoitettu. (C) Frekvenssijakauma varten prosenttiosuus näytteiden lopulta jalostettu-geenin sarjaa. Jokainen jakelu 5, 570 geenit biopsianäytteissä (vasen) ja 2016 geenien kirurgisissa näytteissä (oikea) on merkitty.

Vastatakseen syystä subgrouping on vaikeaa kirurginen näytteissä, vertasimme numero ja jakelu kunkin käsitellyn geenit, joita käytettiin ilman valvontaa klusterointi. Ensin valitun geenin kanssa, signaalin voimakkuus on yli 1000 yli 10% näytteistä. 35 biopsia ja 66 kirurgiset näytteet, 6551 ja 4797-geenien, vastaavasti, on valittu. Näiden geenien lopulta valitaan enemmän kuin 3-kertainen muuttaa geenien vertaamalla keskimääräinen signaalin voimakkuus kunkin geenin yli 10% näytteistä. Vuonna 35 biopsianäytteissä, 85% (5570) ja 6551 käsitellään ensin geenit säilyi, kun taas määrä lopullisen jalostettujen geenien laski 4797 ensimmäisen käsitelty geenejä 2016 (42%) (kuvio 8B, ylempi). Ja 2016 lopulta käsitellään geenien kirurgiset näytteet, 1724 (86%) oli mukana 5570 lopulta käsitellään geenien koepalojen; kuitenkin, 3846 (69%) 5570 geenejä ainutlaatuinen koepalojen (kuvio 8B, alempi). Lisäksi toistojaon (varten prosenttiosuus näytettä) näiden kahden lopulta jalostettu-geenin sarjaa osoittaa, että noin 60% 2016 jalostettujen geenien kirurginen näytteet ilmaista vain harvoissa tapauksissa (0-10%) (kuvio 8C) . Niinpä aiEMT kirurgiset näytteet voivat vähentää lukumäärää käsiteltyjen geenien käyttökelpoisia alaryhmä tunnistamiseen.

Keskustelu

Olemme hiljattain raportoitu läsnäolon ylikuulumisen välillä Hedgehog (Hh) ja EMT signalointia normaalia ja pahanlaatuista epiteelisolut ruokatorven [9]. Tässä raportissa

ZEB2

osoitettiin olevan alavirran geenin sekä ensisijainen transkriptionaalista anturin GLI1 Hh signalointi ja toisen EMT säädin, TWIST1, ja että ZEB2 ylempänä säädelty 5 kemokiinin tai kasvutekijän reseptoreita,

PDGFRA

,

EDNRA

,

CXCR4

,

VEGFR2

, ja

trkB

(kuva S4). Hh-signaali lohkon esti ruokatorven keratinosyyttien erilaistumista ja syöpäsoluinvaasiota ja kasvuun. Niinpä yli-ilmentyminen

ZEB2

ja

TWIST1

kirurgisissa näytteissä sekä normaalin ja kasvaimen kudokset voivat aiheuttaa EMT, jolloin yli-ilmentyminen edustajan EMT merkkiaineiden

VIM

FN

, ja

työtoverit

(kuviot 2, 4, 6, S2 ja S3) ja kalvo signaalimuuntajia

IL8

,

CXCL4

,

CCL5-

,

CXCR4

,

PDGFRB

, ja

TLR2

(kuva 2). Yli-ilmentyminen kalvon signaalimuuntajia voi aktivoida edelleen alavirtaan porrastetusti. Tämä on merkittävä syy suurta eroa ilmaisun profiilien välillä koepala ja kirurgiset näytteet (kuviot 1 ja 3).

Laaja saastuminen normaalin mesenkymaalisten osien kirurgisesti resektoitiin tuumorikudoksissa voi myös selittää yli-ilmentyminen näiden EMT sääntelyviranomaisten ja EMT liittyviä geenejä, vaikka koulutetut patologeja huolellisesti leikattiin irtotavarana kudosnäytteitä tärkein kasvain, jolloin jäljelle jäi kirkas marginaali ympäröivästä normaalista kudoksesta (materiaalit ja menetelmät). Kuitenkin, yli-ilmentyminen havaittiin myös kirurgisesti resektoitiin normaalin kudoksen ja hiiren epiteelisolujen kerrokset 4 tuntia sen jälkeen, kun resektion (kuvio 6). Sen vuoksi päättelimme, että keinotekoisesti EMT, kutsutaan aiEMT, tapahtui sekä normaalissa että pahanlaatuisten epiteelisoluihin kirurginen resektio liittyviä tapahtumia (iskemia-indusoidun hypoksia, iskemia-indusoidun hyponutrition, ja hypoksian aiheuttama tulehdus, jne.) (Kuvio S1 ).

Äskettäin hypoksian indusoima tekijä (HIF-1A tai HIF-2A) on raportoitu suoraan säädellä TWIST1 [13], [14] ja LOXL2, jotka tiettävästi stabiloitu EMT säädin, SNAI1 /SNAIL, fyysisen vuorovaikutuksen SLUG toimialueen ja etanan lysiinitähteet K98 ja K137 [15]. SNAI1 sitoutumiskohta havaittiin myös 5 ’promoottorialueen

ZEB2

[16]. Yli-ilmentyminen sekä

HF1A

ja

LOXL2

havaittiin vain kirurgisesti resektoitiin kasvain kudosten eri tapausten (Kuva S5). Lisäksi muut

HIF1

perheisiin (

HIF1B

ja

HIF2A

) ei koskaan yli-ilmentynyt missään kirurgisten näytteiden. Siksi selvittäminen molekyylitason mekanismeja aiEMT kirurgisissa näytteissä jää tuleville tutkimuksille. Kuitenkin olemme huomanneet, että iskemia aiheuttama hypoksia ja /tai tulehdus on raportoitu vapauttaa tukahduttamisen NFKB [17], joka säätelee

ZEB1

,

ZEB2

, ja

TWIST1

[18], [19] ja että TGF-β signalointi voi olla mukana aiEMT, koska yli-ilmentyminen

NFKB1

ja

TGFBR2

havaittiin kirurgisen näytteissä (kuvio S6).

kuten johdannossa, kirurginen näytteitä on käytetty tärkeänä aiheita kliinisen ja perustutkimuksen syöpätutkimuksen vuosia. Siksi aiEMT kirurgiset näytteissä ehkä mahdollisesti puuttua tai estyy paitsi microarray- tai immunohistokemia-pohjainen kliinisen tutkimuksen (diagnostisen markkerin tunnistamiseen, subgrouping, mikä ennustavia, ja ennusteen arviointi jne), vaan myös perustutkimus (tekemällä signaalireitin kartalla , terapeuttisen kohteen tunnistamista, jne.). Tämä tutkimus todennäköisesti herättää perustavanlaatuisia virheellistä tulkintaa myös aliarviointiin prognostisen arvioinnin voima markkereiden yliarvioinnista EMT viime syöpätutkimukseen ja antaa joitakin neuvoja lähitulevaisuudessa seuraavasti: 1) ymmärtäminen, kuinka kauan kudokset oli alle iskeemisen edellytyksen ( alkaen alusta resektio varastoon tai RNA: n valmistaminen). Kokonaismäärä aika ei saa ylittää 4 tuntia. 2) yleisyys koepalojen varten

in vivo

ilmaisun profilointi alhainen harhojen perustutkimukseen ja kliiniseen tutkimukseen; esimerkiksi kliinisten tulosten ennustamisessa paitsi neoadjuvant vaan myös adjuvanttia kemoterapia, sädehoito, ja sädehoitoa kuten aiemmissa raporteissa [8], [20] – [23]. 3) tarkistaminen syöpäsolun sisältö ja normaali- tai nekroottisen-kudoksen saastuminen biopsianäytteissä varten esiintyvyyden. Vuonna näytteenottoa neula koepala, kasvain osuudet (2mm X 2mm) olisi saatu marginaali (reuna) kasvaimen syrjäytymistä Keski- nekroottisia muutoksia alla tähystykseen. Jos nekroottisia muutoksia pahoin saastunut näytteissä, nämä näytteet on suljettava pois määrällisesti ja täyttäviä RNA. Jos näytteet sisälsivät laajan normaali vaurioita, tällaisia ​​näytteitä voidaan sulkea pois ilmaisua profiilin perustuvan pisteytyksen menetelmällä käyttämällä normaaleja ja /tai kasvaimen geenit.

Materiaalit ja menetelmät

Tissue Näytteitä

Kaikki ruokatorven syöpä (okasolusyöpää) ja ei-syöpä kudoksia toimittivat keskussairaalan tai Itä sairaala National Cancer Center saatuaan kirjallinen lupa kunkin potilaan ja hyväksyntä Centerin eettinen komitea.

kaikki kirurgiset näytteet saatiin potilailta, joilla neoadjuvant hoitoa, ja kaikki biopsia näytteet saatiin ennen hoitoa. Sillä kirurginen näytteet, koulutettu patologit huolellisesti leikattiin irtotavarana kudosnäytteitä tärkein kasvain, jolloin jäljelle jäi kirkas marginaali ympäröivästä normaalista kudoksesta. Niinpä saimme kirurginen näytteitä marginaali (reuna) kasvain. Sillä neulabiopsiaan näytteet, kasvain osat (2 mm x 2 mm) saatiin alla tähystys peräisin marginaali kasvaimeen miltään Keski nekroottisia muutoksia. Jos näytteet pahasti saastuttamaa nekroottisia muutoksia, ne näytteet jätettiin mittaamalla ja täyttäviä RNA. Jos näytteet sisälsivät laajan normaali vaurioita, me ulkopuolelle tällaisia ​​näytteitä ilmaisu profiilin perustuvan pisteytyksen menetelmällä käyttämällä normaaleja ja /tai kasvaimen erityisiä geenejä (valmisteilla).

Yleinen prosessi ruokatorven syöpä toiminta vaatii paljon aikaa . Näin ollen, kirurgiset näytteet leikattiin marginaali kasvaimen koulutettu patologit altistuksen jälkeen 4-7 tunnin ajan iskeemisen edellytyksen, ja ne pakastettiin välittömästi -80 ° C: ssa käyttöön asti. Päinvastoin, neula koepalojen resektoitiin alle tähystys jäädytettiin välittömästi -80 ° C: ssa käyttöön asti. Kliinis tietoja annetaan taulukoissa S3, S4, S5.

Laser Mikrodissektiomenetelmiä seuraa RNA ja Amplification

Kryostaattipreparaatit (8 um) jäädytettyjä hiiren ruokatorven näytteet laser-microdissected kanssa MMI CellCut järjestelmä (MMI Inc., Rockledge, FL). Kokonais-RNA eristettiin suspendoimalla soluista ISOGEN lyysipuskuria (Nippon Gene, Toyama, Japani) ja sen jälkeen saostamalla isopropanolilla. RNA monistettiin tehokas menetelmä hifi-mRNA vahvistus, nimeltään TALPAT (T7 RNA-polymeraasin promoottorin sitoutumattomat, sovitin ligaation välittämää ja PCR-monistamisen seurasi

in vitro

T7-transkriptio) [24-28 ].

Microarray Analysis

geeniekspressioprofiilien saatiin 166 näytteistä: kasvain sarjaa (eri tapausta) riippumattomien 35 ja 20 biopsianäytteissä ja 66 kirurgiset näytteet, toinen kasvain asetettu (identtiset tapaus) 18 biopsianäytteissä ja 18 kirurgiset näytteet, normaali sarja 4 biopsianäytteissä ja 5 kirurgiset näytteitä. Yhteensä RNA: t uutetaan suurin kudosnäytteet biotiinileimatuilla ja hybridisoitiin tiheäksi oligonukleotidigeenisirumenetelmää (Human Genome U95Av2 tai U133PLUS2.0 Array, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) mukaisesti valmistajan ohjeita. Laser-vangiksi hiiren ruokatorven epiteelisolujen kerrokset, Mouse Genome 430 2,0 Array käytettiin. Skannatut data paneelit käsiteltiin Affymetrixin Microarray Suite 4.0 tai 5.0, joka skaalataan keskimääräinen voimakkuus kaikkien geenien kuhunkin array kohdesignaalin 1000 luotettavasti verrata muuttujan useita paneelit. Kaikki microarray tiedot on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta, GEO; hakunumerolla SuperSeries GSE22954.

Gene Valinta Microarray Data ja hierarkinen klusterointi

Hierarkkinen klusterointi käytetään laajalti yhtenä valvomattoman oppimisen menetelmiä. Hierarkkinen klusterointi microarray tietojen suoritettiin käyttämällä GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., CA, USA), Microsoft Excel, ja Cluster TreeView ohjelmisto [29] .For valvomatta klusterointi (kuviot 1A ja 8A), ensin valitun geenin kanssa, signaalin voimakkuus on yli 1000 yli 10% näytteistä, ja nämä geenit, lopulta valitaan enemmän kuin 3-kertainen muuttuneiden geenien vertaamalla keskimääräinen signaalin voimakkuus kunkin geenin yli 10% näytteistä. Sillä yli-ilmennetään geenejä kirurgiseen tai biopsianäytteissä, ensin valitaan geenien u-testi (p 0,01), permutaatio testi, ja 2- tai 3-kertainen muutos välillä keskimääräisen signaalin voimakkuudet kaksi näytesarjaa, ja siitä ensimmäinen valittu geenit lopulta valitun geenin yli 1000 keskimäärin signaalin intensiteettiä.

Semikvantitatiivisilla ja kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä-RNA eristettiin suspendoimalla solut Isogen lyysipuskuria (Nippon Gene, Toyama, Japani) ja sen jälkeen saostamalla isopropanolilla.