Krooninen sairaus

tiivistelmä

onkogeeni FOXM1 on ollut mukana kaikissa päätyyppiä ihmisen syövän. Olemme äskettäin osoittaneet, että poikkeava FOXM1 ilmaisu aiheuttaa kantasolujen laajeneminen johtaa aloittamisen liikakasvun. Olemme aiemmin osoittaneet, että FOXM1 säätelee

HELLS

, eli SnF2 /helikaasi mukana DNA: n metylaatio, syytetään

FOXM1

in epigeneettiset sääntelyn. Tässä olemme osoittaneet käyttämällä ensisijaista normaalia ihmisen suun keratinosyyttejä (NOK) että säätelyä

FOXM1

tukahdutti tuumorisuppressorigeeniä

p16

INK4a

(

CDKN2A

) kautta promoottori hypermetylaation. Knockdovvn

HELLS

käyttämällä siRNA uudelleen aktivoitua mRNA ilmaus

p16

INK4a

ja samanaikainen downregulation kahden DNA metyylitransferaasien

DNMT1

ja

DNMT3B

. Annoksesta riippuvaa säätelyä endogeenisen

FOXM1

(isoformin B) ilmaisun aikana syövän etenemiseen poikki paneeli tavalliset ala- NOK kannat (n = 8), dysplasioita (n = 5) sekä pään ja kaulan okasolusyöpä ( HNSCC) solulinjat (n = 11) korreloi positiivisesti endogeenisen ilmauksia

HELLS

,

BMI1

,

DNMT1

ja

DNMT3B

ja negatiivisesti

p16

INK4a

ja involucrin. Bisulfiittimodifikaatio ja metylaatiospesifistä promoottori analyysi käyttäen absoluuttista kvantitatiivinen PCR (MS-qPCR) osoitti, että säätelyä

FOXM1

merkittävästi aiheuttama

p16

INK4a

promoottori hypermetylaation (10-kertainen, P 0,05) ensisijainen NOK soluissa. Muun kuin bias genominlaajuisten promoottori metylaatio microarray profiloinnin menetelmä, me paljasti, että poikkeava

FOXM1

ilmaisun ensisijainen NOK aiheuttama maailmanlaajuinen hypometylaatio kuvio samanlainen kuin käytettäessä HNSCC (SCC15) solulinjassa. Sen jälkeen validointi kokeita käyttäen absoluuttista qPCR olemme tunnistaneet joukon erilaisesti metyloitua geenien havaittiin korreloivan käänteisesti kanssa

in vivo

mRNA ekspressiotasot kliinisten HNSCC Tuumorinäytteiden näytteitä. Tämä tutkimus toimittanut ensimmäiset todisteet, käyttämällä ensisijaista normaalia ihmisen soluja ja kasvaimen kudokset, että poikkeava säätelyä

FOXM1

järjestettyjä DNA metylaatio allekirjoitus, joka jäljittelee syöpä methylome maisemaa, josta olemme tunnistaneet ainutlaatuisen

FOXM1

aiheuttama epigeneettisellä allekirjoitusta, joka voi olla kliinistä translaation mahdollisuuksia biomarkkereina varhaisen syövän seulontaa, diagnostisia ja /tai terapeuttisia interventioita.

Citation: Teh MT, Gemenetzidis E, Patel D, Tariq R, Nadir A, Bahta AW, et ai. (2012) FOXM1 indusoi Global Metylointi allekirjoitus, joka jäljittelee Cancer Epigenome pään ja kaulan Okasolusyöpä. PLoS ONE 7 (3): e34329. doi: 10,1371 /journal.pone.0034329

Toimittaja: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 marraskuu 2011; Hyväksytty: 26 helmikuu 2012; Julkaistu: 26 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Teh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli rahoittavat yhdessä Wellcome Trust (MTT, EG), kasvojen Surgery Research Foundation – Saving Faces (MTT, AW) ja hammaslääketieteen laitoksen (DP, RT, AN), Barts ja London School of Medicine ja hammaslääketieteen, Queen Mary University of London. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ymmärtäminen epigeneettiset mekanismi säätelevä kantasolujen kohtalon määrittämiseen tarjoaa tärkeimmät oivalluksia fysiologiaa kudosten uudistumista ja patogeneesi syöpiä. Parhaiten tutkittu epigeneettiset mekanismi levoton aikana syövän taudin alkamisen ja etenemisen on DNA: n metylaatio kemiallisesti lisää metyyli ryhmiä sytosiinit 5’tehtävissä, pääasiassa klo CpG dinukleotideissä nisäkkään genomista DNA [1]. DNA: n metylaatio liittyy kolme keskeistä DNA metyylitransferaaseja: DNMT1, DNMT3A ja DNMT3B. DNMT1 on klassisesti ollut mukana ylläpitoon nykyisten metyloitua DNA, kun taas, DNMT3A ja DNTM3B in

de novo

DNA: n metylaatio [1]. Periytyvä luonne DNA: n metylaatio mahdollistaa solujen määrittämiseksi solun tehon /kohtalon muuttamatta ensisijaista sekvenssin genominen DNA. Reversiibeliyttä DNA: n metylaatio ohjelmoinnin tekee solukohtalo- toiveiden erittäin muovia ja palautuvia. Epigeneettiset kyseeseen, joissa muutokset DNA: n metylaatio on osallisena kaikissa vaiheissa syövän kehittyminen [2], [3]. On myös osoitettu, että epigeneettisten uudelleenohjelmointi edeltää aloittamisesta syövän, kuten kantasolujen /esisolujen [4]. Nyt hyvin hyväksytty, että syöpäsolut hyödyntää palautuva ja periytyvien ominaisuuksien DNA: n metylaatio häiritsemiseksi tasapaino varsi /kantasolujen uusiminen ja erilaistumista siten edistetään syövän taudin alkamisen ja etenemisen [2], [3], [4].

FOXM1 (isoformin B) ensin havaittiin olevan alavirran kohde onkogeenisessä Sonic Hedgehog signalointireitin kautta gliooma perhe sinkkisormipolypeptidiin transkriptiotekijä 1 (Gli1) in tyvisolusyöpien [5]. Myöhemmät tutkimukset paljastivat, että FOXM1 on kaikkialle voimistunut useimmissa ihmisen syövissä [6], [7], joka sisältää aivoissa, maksassa, rinta-, keuhko-, vatsa-, haima-, paksusuolen, munuaisten, virtsarakon, eturauhasen, kives-, munasarja, kohtu, kohdunkaula , veri (akuutti myelooinen leukemia), ihon melanooma, pään ja kaulan okasolusyöpää [8], [9].

Etsittäessä ymmärtää kasvaimia synnyttävän mekanismin FOXM1, olemme hiljattain osoittaneet, että FOXM1 aiheuttaa syöpää aloittamista edistämällä aikuisen ihmisen epiteelisolujen kantasolujen /kantasolujen uusiminen ja vastavaikuttamalla erilaistuminen [10]. Toiset ovat osoittaneet, että FOXM1 avainasemassa säilyttämisessä varsi /kantasolujen uudistumista pluripotenttisuus geenejä, mukaan lukien

Oct4

,

Nanog

,

Sox2

ja

Bmi1

[11], [12]. Aikaisemmat työ tunnistanut FOXM1 alavirran kohde

HELLS

[8], ihmisen kantasolujen tekijä /lymfoidispesifiset SnF2 /helikaasi mukana chromatin remodeling ja DNA: n metylaatio [13], [14], syytetään FOXM1 vuonna epigeneettiset sääntelyn aikana varsi /kantasolujen uudistaminen [8], [10]. Se oli kuitenkin epäselvää FOXM1 on rooli epigeneettiset sääntelyn. Tässä tutkimuksessa käytetään ensisijaisena normaalia ihmisen suun keratinosyytit sekä pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) kasvainsolulinjoja ja Tuumorinäytteiden kudoksissa, tutkimme roolia FOXM1 säätelyssä geenin promoottorin metylaation sekä yhden geenin ja genomin laajuinen tasot . Tämä johti ensimmäiseen todisteita normaaleissa ensisijainen ihmisen suun epiteelisolujen että FOXM1 indusoi metylaation maisema muistuttava syöpä epigenome löytyy HNSCC tuumorikudoksissa.

Methods

Kliininen Kudokset

käyttö ihmiskudoksen tässä tutkimuksessa on hyväksynyt meidän isäntälaitosten (Barts Lontoon NHS Trust ja School of Medicine Dentistry, Queen Mary University of London) ja Yhdistyneessä kuningaskunnassa National Research eettinen komitea. Kaikki kliiniset näytteet, jotka olivat ylijäämä diagnoosin, kerättiin paikallisten eettisen komitean-hyväksyttyjen käytäntöjen ja kirjallinen ilmoitti potilaan suostumus saatiin kaikilta osapuolilta. Paria normaali marginaali ja HNSCC kasvaimen ytimen kudosbiopsioista oli histopatologisia ennalta vahvistanut meidän yhteistyökeskusten patologit ennen käyttöä tätä tutkimusta. Tuore biopsiakudoksesta näytteet säilytetty RNA

Myöhemmät

(Cat # AM7022, Ambion, Applied Biosystems, Warrington, Iso-Britannia) ja tallennetaan lyhyen aikavälin joko 4 ° C (1-2 päivää) tai -20 ° C (enintään 1 viikko) ennen kuljetusta ja sen jälkeen pitkäaikaisen varastoinnin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Soluviljely

Kaikki ensisijainen normaalin ihmisen suun keratinosyyttien (OK355, HOKG, OK113, NOK, NOK1, NOK3, NOK16 ja NOK376) uutettiin normaaleista suun limakalvon kudoksissa lahjoittama terve taudista vapaan yksilöiden käynnissä viisauden hampaan poistoon ja viljellään kuten aikaisemmin on kuvattu [8], [15]. Suun dysplastic precancer solulinjoissa (OKF6 /T [16], POE9n [17], DOK [18], D19 [19], D20 [19]) ja suun SCC solulinjoissa (SCC4 [20], SCC9 [20], SCC15 [20], SCC25 [20], SqCC /Y1 [21], UK1 [22], VB6 [22], CaLH2 [22], CaDec12 [22], 5pt [22], H357 [22]), SVpgC2a [23 ] ja SVFN1-8 [8] olivat kaikki vakiintuneet solulinjat viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [8], [10], [15].

Immunoblottausmääritys

proteiinin uuttaminen ja erottaminen SDS sivun geelit ja immunoblottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu (5). Hiiren monoklonaalinen vasta-aine p16

INK4a (1:2000 laimennus; Cat # 551154, BD Biosciences) ja kaniinin polyklonaalista anti-GAPDH (1:20,000 laimennus; Cat # 9485, Abcam) käytettiin immunoblottauksella.

RNA-interferenssi

Pre-validoitu geenispesifisestä siHELLS (ON-TARGETplus SMARTpool HELLS, Cat # L-017444-09,10,11,12), ohjaus siCTRL (ON-TARGETplus Non-kohdistaminen Pool , Cat # D-001810-10-05) ja siRNA transfektioreagenssia (DharmaFECT 1, Cat # T-2001-02) ostettiin Dharmacon, Thermo Fisher Scientific. Ensimmäinen annos-vaste-koe suoritettiin valmistajan ohjeiden määrittää optimaalisen transfektion tehokkuutta. siRNA 10 nM (48 tunnin inkubaation) havaittiin olevan optimaalinen lopullinen pitoisuus, joka on näin ollen käytetään kaikissa myöhemmissä kokeissa. Vaikutus geenien validoitiin kvantifiointiin kohdegeenin mRNA: n ilmentymisen (

HELLS

) ehdottomalla käänteistranskriptio qPCR.

Retrovirusperäinen transduktio

retrovirussupernatanttia ja transduktio menettelyt olivat suoritetaan käyttämällä perustettu protokollia [8], [10], [15]. Yhtäläinen

EGFP

ja

FOXM1

(isoformin B) ilmentyminen saavutettiin sarja retrovirussupernatanttia titraus kokeilu ja sen jälkeen

EGFP

plasmidien kopioluvun varmistettiin qPCR käyttämällä genomista DNA: ta alkaen transdusoidut solut mukaan meidän aiemmin vakiintunut menetelmä [15]. Tasot Kohdunulkoisten

FOXM1

ilmaisun ensisijainen keratinosyyttien titrattiin jäljitellä tasoja löytyy syöpäsoluja raportoitu aikaisemmin [8], [10], [15] (katso kuva 1 C). Transdusoidut soluja viljeltiin 3-5 vuorokaudeksi, jotta ilmentymistä ennen kokeilla.

(A) FOXM1 merkittävästi tukahduttaa

p16

INK4a

mRNA ja proteiinin ilmentyminen (pieni kuva) perusterveydenhuollossa normaalin ihmisen keratinosyytit. GAPDH: ta käytettiin kontrollina proteiinimäärän. Ohjaus solut (mock transduktoitu- tyhjillä retroviruspartikkeleiksi tai EGFP transduktoitu-) eivät osoittaneet merkittäviä tukahduttamista p16

INK4a ilme. (B) knockdown on FOXM1-kohdegeenin

HELLS

, joka säätelee genominlaajuisten metylaatio [14], aiheuttama

p16

INK4a

ja samanaikaisesti vaimentaa

DNMT1

ja

DNMT3B

, mutta ei

DNMT3A

mRNA: n ilmentymisen on FOXM1-transformoitu pahanlaatuisten solulinja (SVFN5) ilmentävät konstitutiivisen endogeenisten

HELLS

[8]. Kukin pylväs edustaa keskiarvo ± SEM kolmena transfektion (48 h) joko siCTRL tai siHELLS. * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001 ilmaisevat tilastollisen merkitsevyyden verrattuna kontrolleihin. (C) Endogeeninen

FOXM1

(isoformin B) mRNA ekspressiotasot 8 kantojen ensisijainen ihmisen normaalia suun keratinosyyttien, 5 dysplastisia ja 11 HNSCC solulinjoissa. Yhteensä

FOXM1

mRNA: n ilmentymisen tasot mitattiin EGFP ja FOXM1-transdusoitujen NOK (NOKG ja NOKF), vastaavasti. (D-J) Kolmannen kertaluvun polynomiregression analyysit tehtiin saamiseksi R

2 determinaatiokerroin arvoja, jotka osoittavat merkityksen ilmentäminen rinnakkain keskenään geenin

FOXM1

poikki 24 solu kantaa /merkittyjen ratojen paneelissa C.

Nukleiinihapot valmistetuissa kudoksia ja soluja

Kaikki kudosbiopsioista pilkottiin proteinaasi K (Cat # 03115887001, Roche Diagnostics Oy, Englanti, Yhdistynyt kuningaskunta) ennen samanaikainen mRNA louhinta (Dynabeads mRNA Direct kit, Cat # 610,12, Invitrogen) ja genomi-DNA (gDNA) paineen (vakio phenol:chloroform menetelmällä mRNA-köyhdytettyä lystates). mRNA välittömästi käänteistranskriptio cDNA: ksi (Transcriptor cDNA Synthesis Kit, Cat # 04897030001, Roche Diagnostics). gDNA pilkottiin mukaan

MseI

pilkkomalla (37 ° C, 16 h) ennen rikastamiseen CpG-metyloitu DNA: ksi käyttäen MBD2b /MBD3L1-konjugoitua magneettinen helmi-järjestelmän mukaisesti valmistajan protokollan (MethylCollector Ultra kit, Cat # 55005, Active Motif Europe, Belgia).

genominlaajuiset Promoottori metylointi Profilointi

mukaan valmistajan protokollaa ja vaatimuksia, input

MseI

-digested gDNA ja metylointi rikastettu DNA jokaisesta solusta näytteestä (NOKG, NOKF ja SCC15) monistettiin tuottaa 6 ug DNA käyttäen WGA2 GenomePlex (Sigma) ennen microarray kokeita Roche NimbleGen mikrosirujen palveluun ihmisen DNA metylointi 3x720K CpG Island Plus RefSeq Promoottori Array (Cat # 05 924 600 001; NimbleGen System, Reykjavik, Islanti), joka perustuu genomin rakennettu HG18, jossa promoottori ylävirtaan /alavirtaan viljelemään -2,44 /+ 0,61 kb, jotka kattavat yhteensä 27728 CpG-saarekkeiden koko genomin (GEO Platform: GPL14361). Microarray tuotetut tiedot tässä tutkimuksessa on MIAME yhteensopiva ja se on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta at Gene Expression Omnibus arkistoon (GEO Sarjan hakunumero: GSE31767).

Reaaliaikainen absoluuttinen kvantitatiivinen PCR

standardikäyrä-pohjainen reaaliaikainen absoluuttinen kvantitatiivinen PCR tehtiin käyttämällä SYBR Green I Master (Cat # 04887352001, Roche Diagnostics Oy, Englanti, Yhdistynyt kuningaskunta) on 384-hyvin LightCyclerTM 480 qPCR järjestelmä (Roche) mukaan meidän laadittava pöytäkirja [8] [9], [15], jotka ovat MIQE yhteensopivia [24]. Metylaatiospesifinen PCR-olosuhteet suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25], [26]. Kaikki alukkeet käytettiin tässä tutkimuksessa on listattu kuviossa S1. Aiemmin validoitu isoformi B-erityisiä FOXM1 alukkeita käytettiin erikseen määrällisesti FOXM1 (isoformin B) mRNA: n ilmentymisen tässä tutkimuksessa [8]. Kaikki kohdegeenien normalisoituivat kaksi vakaa viite geenejä (YAP1 ja POLR2A) aiemmin validoitu olevan joukossa vakain viittaus geenien poikki monenlaisia ​​ensisijainen ihmisen suun soluja, dysplastisia ja HNSCC solulinjat [8].

tulokset ja keskustelu

Koska meidän aiempaan toteamukseen FOXM1 (isoformi B) edistetään varsi /kantasolujen uudistumista häiriintymistä eriyttäminen polku [10], me aluksi kyseenalaisti osallistuminen kasvainsuppressorigeenin

p16

INK4a

(

CDKN2A

), koska se on osoitettu säätelevän epiteelin kantasolujen /kantasolujen erilaistumista [27], ja se on yleisimmin inaktivoitu geenin syöpä [28]. Täällä, osoitimme, että kohdunulkoinen

FOXM1

ilmentyminen tukahdutetaan sekä mRNA ja proteiini ilmentymistä p16

INK4a primaarisissa ihmisen suun keratinosyyteissä (kuvio 1A). Valitettavasti, kuten on raportoitu aiemmin hiljentäminen endogeenisen

FOXM1

ilmaisu aiheuttaa solukierron pysähtymisen [29], joka sulkee pois lisäkokeita käyttäen RNAi on tunnetusti herkkä ensisijainen ihmisen suun keratinosyyteissä [8], [10]. Siitä huolimatta meidän

FOXM1

yliekspressio kokeet lopullisesti osoittivat, että

FOXM1

säätelyä tukahdutetaan

p16

INK4a

geeniekspression ensisijainen ihmisen suun keratinosyyteissä. Tämä on yhtäpitävä aikaisempien havaintojen että

FOXM1

estää vanhenemista reitin välittämä

p16

INK4a

syöpäsoluissa [30].

inaktivointi

p16

INK4a

geeniekspressio voisi olla seurausta useista mekanismeista kehitetyistä kannoista ja promoottori hypermetylaation. Koska FOXM1 tavoitteet

HELLS

joka säätelee DNA: n metylaatio [13], [14], me arveltu, että FOXM1 voidaan tukahduttaa

p16

INK4a

ilmaisun promoottori hypermetylaation kautta

HELLS

. Tämän testaamiseksi me knockeddown

HELLS

siRNA käytettäessä HNSCC solulinjassa SVFN5, joka on FOXM1 aiheuttama muuttaneet suun bukkaalisen keratinosyyttisolulinja SVpgC2a linjan [8], joka ilmentää suuria määriä endogeenista

HELLS

ja alhainen

p16

INK4a

. Tämä aiheuttaa aktivoitumisen mRNA ilmaus

p16

INK4a

(kuvio 1 B) ja samanaikainen downregulation kahden DNA metyylitransferaasien

DNMT1

ja

DNMT3B

mutta ei vaikutusta on

DNMT3A

ilme. Se, että

p16

INK4a

esto voidaan aktivoida puolla geenideleetio- mekanismina

p16

INK4a

inaktivoitumista. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen että

HELLS

vuorovaikutuksessa

DNMT1

ja

DNMT3B

[31] tukahduttaa

p16

INK4a

geeniekspression [32] kautta epigenetic muutoksia.

edelleen vahvistaa, että ilmaus

FOXM1

,

HELLS

ja

p16

INK4a

geenit korreloivat syövän etenemisessä ja onko olemassa mitään assosiaatioita osallistuvien geenien DNA: n metylaatio, mittasimme endogeenisen mRNA ekspressiotasot

FOXM1

,

p16

INK4a

,

HELLS

BMI1

, involucrin (

IVL

, eli differentiaatiomarkkeri on osoitettu olevan säätelee negatiivisesti

FOXM1

[10]) ja 3 avaimen DNA metyylitransferaaseja (

DNMT1

,

DNMT3A

,

DNMT3B

) paneelissa 24 solukantoja /linjojen koostuu 8 kantojen ensisijaisen normaalin ihmisen suun keratinosyyttejä (normaaleista suun limakalvon kudoksissa), 5 dysplasia ja 11 HNSCC solulinjoissa.

suostumuksella aiempia havaintoja [8], [10],

FOXM1

osoitti annoksesta riippuvaista säätelyä aikana kasvaimen etenemistä dysplasia ja HNSCC (kuvio 1 C). Across paneeli 24 solukantoja /linjat, olemme havainneet, että endogeeninen mRNA ilmaus

FOXM1

korreloi käänteisesti

p16

INK4a

mutta korrelaatio tehokkuus oli heikko (R

2 = 0,23, kuvio 1 D). Vaimennussäätely

p16

INK4a

ilmentyminen todettiin olevan voimakkaampia dysplastic verrattuna HNSCC solulinjoja. Tällaiset

p16

INK4a

ilme kuvio on täysin samaa mieltä

in vivo p16

INK4a

proteiinin ilmentymisen malli löytyy suullista dysplasia ja SCC kudoksissa [33]. Johdonmukaisesti,

BMI1

, Polycomb ryhmä onkogeeni, joka on ylävirtaan säätelijä

p16

INK4a

geeni [34] ja myös alavirran tavoitteeksi FOXM1 [12], [30], myönteisesti koeskspressio

FOXM1

(R

2 = 0,64, kuvio 1 E), mutta heikko käänteinen korrelaatio

p16

INK4a

(R

2 = 0,42, tietoja ei esitetä) tukee näyttöä siitä, että

p16

INK4a

ilmentymistä itsenäisesti säädellään

BMI1

aikana suun syövän synnyn [35]. Ristiriitainen ekspressiotasot välillä

FOXM1

ja

p16

INK4a

syöpäsoluissa voi johtua siitä, että

p16

INK4a

voidaan vapautettu kautta monia eri mekanismeja, kuten inaktivoivat mutaatio (voi johtaa ylösajon ansiosta palautemekanismi), geeni poistetaan, geenien monistuminen (toiminnallisten geenin mutta viallisen loppupään signalointi), promoottori hypermetylaation jne Tämä voi johtaa vaihtelevissa

p16

INK4a

ilmentyminen riippumattomaksi

FOXM1

tasoilla ”syöpä” solulinjoja. Näin ollen samalla kun

FOXM1

voi aiheuttaa promoottorin hypermetylaatiota

p16

INK4a

”normaaleissa” solut, tällainen vaikutus voidaan levoton in ”syöpä” soluja.

Expression on

DNMT1

(R

2 = 0,84; kuvio 1 H) ja

DNMT3B

(R

2 = 0,89; kuvio 1J), mutta ei

DNMT3A

(R

2 = 0,13; kuva 1I), osoitti merkittäviä myönteisiä koeskspressio

FOXM1

jotka ovat yhtä mieltä havaintomme edellä (kuvio 1 B), joka hiljentää

FOXM1

– alavirran kohde

HELLS

johti samanaikainen downregulation

DNMT1

ja

DNMT3B

mutta vaikutusta

DNMT3A

ilme. On epäselvää, miksi

DNMT3A

ei vaikuttanut. Julkaistu kirjallisuus osoittaa, että vaikka sekä

DNMT3A

ja

DNMT3B

osallistuvat

de novo

metyylitransferaasiaktiivisuus, ne palvelevat ei-päällekkäistä roolit [1]. Kuitenkin osallistuminen molempien

DNMT1

ja

DNMT3B

syytöksiä rooli

FOXM1

ja

HELLS

puhkeamisessa Sekä huolto- ja

de novo

DNA: n metylaatio toimintaa [1]. Odotetusti,

HELLS

olivat positiivisesti (R

2 = 0,76, kuvio 1 F) ja

IVL

negatiivisesti (R

2 = 0,52, kuva 1G) korreloi

FOXM1

kuten on esitetty aiemmin [8], [9], [10]. Yhdessä nämä tulokset antavat ensimmäistä näyttöä ihmisen soluissa, että

FOXM1

voidaan välityksellä toimivien

HELLS

,

DNMT1

ja

DNMT3B

tukahduttaa

p16

INK4a

geeniekspressiota. Ottaen huomioon, että

HELLS

,

DNMT1

ja

DNMT3B

on aiemmin osoitettu moduloivan

p16

INK4a

promoottorin metylaation [31], [32 ], me arveltu, että

FOXM1

voidaan laukaista

p16

INK4a

geenien kautta promoottori hypermetylaation.

tutkimiseksi promoottori CpG DNA: n metylaatio, me määrällisesti taso

p16

INK4a

promoottori metylaatio käyttämällä bisulfiittimodifikaatio ja metylaatiospesifistä kvantitatiivinen PCR (MS-qPCR Kuvio 2A ja kuvio S1). Yliekspressio

FOXM1

, mutta ei

EGFP

, havaittiin indusoivan

p16

INK4a

promoottorin hypermetylaatio (P 0,05), joka oli merkittävästi käänteinen (P 0,001 ) DNA-demetyloivan agentti 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5Aza) primaarisissa ihmisen suun keratinosyyteissä (kuvio 2B). Nämä tulokset vahvistivat roolin

FOXM1

tukahduttamaan

p16

INK4a

ilmaisun promoottori hypermetylaation. Tuki

FOXM1

aloittaessaan oncogenesis kautta estämällä

p16

INK4a

, on osoitettu, että epigeneettisellä vaiennettu

p16

INK4a

indusoi solujen kuolemattomuus hiiren alkion fibroblasteissa [36]. Lisäksi meidän aiempaan toteamukseen

FOXM1

ilmaisu koekspressoitiin epiteelin kantasolujen merkki ΔNp63α että lisääntyvissä varsi /kantaisä suun keratinosyyttien subpopulaatio [10], ja että ΔNp63α on osoitettu kohdistaa

HELLS

aiheuttavan okasolusyöpä muodostumista hiirillä [37], yhdessä ehdottavat mahdollista roolia

FOXM1

(via

HELLS

) puhkeamisessa oncogenesis kautta hiljentäminen

p16

INK4a

. Tarkka onkogeeniset mekanismia ei kuulu tämän tutkimuksen. Siitä huolimatta meidän nykyinen data tarjoaa ensimmäiset todisteet että

FOXM1

pystyy aiheuttamaan promoottori hypermetylaation yhdellä geeni taso tarjoaa välähdyksen mahdollisuus, että poikkeava säätelyä

FOXM1

voi hämmentää epigeneettiset sääntelyn DNA: n metylaatio genomitason laajuisesti.

(A) bisulfiittimodifikaatio ja metylaatiospesifisen ehdoton qPCR kvantifiointiin

p16

INK4a

promoottori metylaatiostatuksen. Genomi-DNA: ta käsiteltiin ensin natriumbisulfiitilla ennen PCR pre-monistamisen promoottorialueen

p16

INK4a

(PCR

BS, 273 bp). Metylaatiospesifisen (p16M-R /F) ja metylointi riippumaton (p16U-F /R) alukkeita käytettiin sitten määrittämään suhteelliset tasot metyloitujen ja metyloimattomien tuotteiden PCR

BS näytteestä käyttäen standardoitua-käyrää perustuva ehdoton qPCR menetelmä kunkin tuotteen, tässä järjestyksessä. Sulamisanalyysi suoritettiin validoimiseksi qPCR spesifisyys havaitsemisessa kaksi M ja U tuotteita. (B) Bisulfiittikonversio ja metylaatiospesifisen qPCR suoritettiin mitata suhteelliset tasot metyloimatonta (U, joka sulaa lämpötilassa 85,8 ° C) ja denaturoidulla (M, 91,2 ° C) joko EGFP- tai FOXM1-transdusoituja ensisijainen NOK käsiteltiin joko ajoneuvo (DMSO) tai 5Aza (1 uM, 3 päivän inkubaation tuoretta lääkettä täydennystä päivittäin). Kaikkiaan n = 11 toistojen vähintään 4 itsenäistä koetta suoritettiin. Tilastollinen t-testiä merkitys merkinnät * P 0,05 ja *** P 0,001.

ja muut ovat aiemmin perustaneet keskeinen rooli

FOXM1

ylläpitoon genomin vakautta jolloin poikkeava

FOXM1

ilmaisu aiheuttaa maapallon perimän epävakaisuuden [8], [15], [38]. Lisäksi tulokset, että

FOXM1

tavoitteena epigeneettisestä /kantasolujen modulaattori

HELLS

aikana syöpä aloittamisen [8], [14] ja

FOXM1

suoraan saa

p16

INK4a

promoottorin hypermetylaatio (kuvio 2) sai meidät oletuksia, että poikkeava säätelyä

FOXM1

häiritsee methylome. Tämän hypoteesin testaamiseksi teimme ei-bias genominlaajuisten promoottori metylaatio mikrosirujen profiloinnin ensisijaisesti normaalin suun ihmisen keratinosyyttejä (NOK) joko yli-ilmentävät kontrollina geeni

EGFP

(NOKG) tai

FOXM1

(NOKF) (kuviossa 1 C

FOXM1

geenin ilmentymisen tasoa NOKG ja NOKF solut) sekä koskevasta HNSCC solulinja (SCC15). SCC15 valittiin tässä tutkimuksessa positiivisena kontrollina, koska promoottori

p16

INK4a

geeni (CDKN2A) on aiemmin osoitettu olevan hypermetyloitunut ja voitaisiin aktivoida uudelleen 5Aza [39], joten jotta voimme validoida metylointi array data.

FOXM1

havaittiin indusoivan maailmanlaajuinen hypometylaatio kuvio samanlainen kuin löytyy HNSCC solulinjassa verrattuna ohjata NOK soluihin, jotka ekspressoivat

EGFP

(kuvio 3A). Verrataan metylaation regressioanalyysin korrelaatio analysoidaan yksi kolmesta solutyyppejä (NOKG, NOKF ja SCC15), vain NOKF vs SCC15 saatiin positiivinen korrelaatio malli, kun taas NOKF tai SCC15 jokainen tuotettu käänteinen korrelaatio ohjaus- NOKG (kuvio 3B). Tämä osoittaa, että yli-ilmentyminen

FOXM1

, mutta ei

EGFP

, indusoi metylointi maisema samanlainen kuin löytyy SCC15. Sekä globaali hypometylaatio ja polttoväli hypermetylaation (vaikuttava yksittäisiä geenejä) ovat tyypillisiä metylaatiovyöhykkeiden löytyy syöpä [2], [3]. Se, että säätelyä FOXM1 indusoi näitä metylaatiovyöhykkeiden ”normaali” solut osoittaa, että poikkeava ilmentyminen FOXM1 muuttuu Metylointilaitteistoon maiseman kohti kuin syöpä. Seurauksena maailmanlaajuisen hypometylaatio on osoitettu aiheuttavan perimän epävakaisuuden [2], [3], tämä saattaa tarjota mekanismi meidän aikaisempia havaintoja, poikkeavaan FOXM1 ilmaisu aiheuttaa perimän epävakaisuuden primaarisissa normaalin ihmisen keratinosyyttien [8], [15]. Vaikka globaali hypometylaatio näytti olevan hallitseva vaikutus, on osoitettu, että polttoväli hypermetylaation hiljentäminen avain tuumorisuppressorigeeneille (esim.

p16

INK4a

) soittaa myös tärkeä rooli syövän synnyssä [2], [3] .

(A) Genome laajuinen promoottori mikrosiruanalyysi ensiarvoisen normaalin suun ihmisen keratinosyyttien, joka joko

EGFP

(NOKG, mustia pisteitä) tai

FOXM1

(NOKF, keltaiset pisteet ) ja vakiintunut okasolusyöpä solulinja (SCC15, punaiset pisteet). Jokainen piste edustaa yhtä geeniä. (B) Epälineaarinen 2

nd järjestyksessä polynomiregression analyysit tehtiin suhteellisesta metylaation välinen NOKG vs NOKF (käänteinen korrelaatio), NOKG vs SCC15 (käänteinen korrelaatio) ja NOKF vs SCC15 (positiivinen korrelaatio). (C) Gene valintakriteerit erilaisesti metyloitua geenien välillä ohjaus (NOKG) ja testien ryhmät (NOKF ja SCC15). 100-useimmat hypermetyloitunut ja 100-useimmat hypometyloidut geenejä käänteisesti sovitettu erilaisesti metyloituja geenien NOKF ja SCC15. Viereisen geenin luettelot esittävät jatkoon FOXM1-indusoidun (esiintyy myös SCC15) differentiaalisesti hypermetyloitunut (punainen) ja hypometyloidut (vihreä) geenit verrattuna kontrolliin NOKG soluihin. CDKN2A (koodaa

p16

INK4a

) geenin, sen promoottorin tiedetään hypermetyloitunut HNSCC, sisällytettiin positiivisena kontrollina promoottori hypermetylaation. (D) Kliininen kasvaimen kudosnäyte korrelaatio suhteellisten tasojen metylaation ja geeni-ilmentymisen kunkin jatkoon geenin kohortin 10 potilailla, joilla on yhdistetty normaali marginaali ja HNSCC kasvain kudosnäytteitä. Jokainen piste edustaa keskiarvo ± SEM kunkin geenin. Vertical virhepalkkeja olivat peräisin suhteellisesta geenin ilmentymistä 10 margin-kasvainkudoksen pareja ja vaaka virhepalkkeja olivat peräisin suhteellisesta promoottori metyloinnin 3 riippumatonta ensisijaisen NOK (NOKG /NOKF) kokeissa. Korrelaatiokerroin (R

2) on epälineaarinen 2

nd järjestyksessä polynomiregression analyysit suoritettiin kaikki 30 kandidaattigeenit (vasen paneeli), 16 hypermetyloitunut geenit (keskimmäinen paneeli) tai 14 hypometyloidut geenejä (oikea paneeli) vastaavasti.

validoida meidän hypoteesia, että

FOXM1

-orchestrated metylointi allekirjoituksen, joka jäljittelee syöpä methylome, erilaisesti metyloituja geenit (100 eniten hypometyloidut ja 100 eniten hypermetyloitunut) alun perin valittu käänteisen vertailuja NOKG ja NOKF /SCC15, ja osajoukko 30 konsensus geenien, jaettu NOKF ja SCC15 solujen vastakkaisilla metylointi asema NOKG ohjaus soluja, myöhemmin ehdolla jatkotutkimuksiin (kuvio 3C). Jos nämä ehdokas

FOXM1

aiheuttama erilaisesti metyloituja geenit olivat todellakin epigeneettisestä allekirjoitus syövän, me arveltu, että HNSCC tuumorikudoksista olisi säilytettävä käänteinen

in vivo

mRNA ilmaisun allekirjoitus näistä kandidaattigeenejä. Tämän varmistamiseksi suoritimme absoluuttinen qPCR määrittää kunkin 30 kandidaattigeenien: i, suhteelliset tasot promoottori-DNA: n metylaation kunkin geenin NOKG vs NOKF soluja, ja ii suhteellinen mRNA: n ekspressio tasoille pariksi normaalissa marginaali vs HNSCC kasvain kudosnäytteitä. Korrelaatio regressioanalyysisarjoissa 30 kandidaattigeeneihin osoitti käänteinen suhde (R

2 = 0,62, kuvio 3D, vasen paneeli) välillä geenin ilmentyminen HNSCC kasvain kudosten ja DNA: n metylaatio on NOKF soluja.

Mielenkiintoista, hypometyloidut geenit osoittivat merkittävästi korkeampi käänteinen korrelaatio malli (R

2 = 0,92, kuvio 3D, oikea paneeli) kuin hypermetyloitunut geenit (R

2 = 0,27, kuvio 3D, keskimmäinen paneeli). Tämä viittaa siihen, että promoottori hypometylaatio näytteillä voimakkaampi vaikutus transkription aktivaatio verrattuna promoottori hypermetylaation on transkription tukahduttaminen. Yksi selitys voisi olla, että se voi olla helpompi havaita transkriptionaalisen aktivaation seuraavat promoottori hypometylaatio vastakohtana havaitsemiseksi transkription tukahduttaminen joka riippuu siitä, onko geenit aktivoitiin ennen hypermetylaation. Tuloksemme osoittavat, että hypo /hypermetylaation voi olla yksinkertainen symmetrinen on /off kytkin geenin transkription. Lisätutkimuksia tarvitaan rajata transkription mekanismeja säädellä promoottori DNA: n metylaatio /demetylaation.

luettelo 15 uusia

FOXM1

aiheuttama hypermetyloitunut geeneistä (kuvio 3D, keskimmäinen paneeli), 4 geenit (

C6orf136

,

MGAT1

,

NDUFA10

ja

PAFAH1B3

) oli merkittävästi vaimentua mRNA ekspressiotasot HNSCC kasvaimissa, sekä positiivisen kontrollin

p16

INK4a

(

CDKN2A

). Vähän julkaistua geeni oli saatavilla

C6orf136

.