Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Huolimatta intensiivistä tutkimusta alussa syövän havaitsemiseen, on puute biomarkkereiden varten luotettavasti havaita pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) . DNA: n metylaatio muutokset ovat yleisiä ja suhteellisen vakaana eri syöpiä, ja voidaan käyttää diagnostisia tai prognostisia biomarkkereita.

Methods

Me tehdään DNA: n metylaatio profilointi näytteitä 48 potilailla, joilla on vaiheen I NSCLC ja 18 vastaavat syöpää free keuhkojen näytteitä käyttäen mikrosiruja, jotka kattavat promoottorialueet yli 14500 geenejä. Me korreloivat DNA metylaatiomuutokset kanssa geeniekspressiotasot ja suorittaa eloonjääminen analyysi.

Tulokset

Havaitsimme hypermetylaatiota 496 CpG: t 379 geenien ja hypometylaatio 373 CpG: t 335 geenejä NSCLC. Verrattuna adenokarsinooma näytteitä, okasolusyöpä näytteissä oli 263 CpG: t 223 hypermetyloitunut geenien ja 513 CpG: t 436 hypometyloidut geenejä. 378 869 (43,5%) CpG sivustoja erotteleva NSCLC ja ohjaus näytteet osoittivat käänteinen korrelaatio CpG metylaatio ja geenien ilmentymisen tasoa. Seurauksena selviytymisen analyysin löysimme 10 CpG: t 10 geenejä, jossa metylaation taso vaihtelee eri selviytymisen ryhmissä.

Johtopäätökset

Olemme tunnistaneet joukon geenejä, joilla on muuttuneita metyloinnin NSCLC ja totesi, että vähemmistö niistä osoittivat käänteinen korrelaatio geeniekspressiotasot. Olemme myös löytäneet joukon geenejä, jotka liittyvät selviytymisen potilaista. Nämä vasta-tunnistettu merkki ehdokkaita molekyyliseulontaa NSCLC tarvitsevat tarkempaa analysointia, jotta voidaan määrittää niiden kliinisen hyödyn.

Citation: Lokk K, Vooder T, Kolde R, Välk K, Võsa U, Roosipuu R, et ai. (2012) metylointi merkkiaineet alkuvaiheen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (6): e39813. doi: 10,1371 /journal.pone.0039813

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu 6 marraskuuta, 2011; Hyväksytty: 28 toukokuu 2012; Julkaistu: 29 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Lokk et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat Euroopan unionin kautta Euroopan aluekehitysrahasto, huippuyksikkö Genomics ja projisoida 245536 OpenGene. Lisätukea saatiin Viron opetus- ja tiedeministeriön ydin avustuksen SF0180142s08, Estonian Science Foundation apurahat 7473, 9293 ja Tarton yliopisto kehitysrahaston projekti Translational Genomics. LM on tukenut Euroopan unionin kautta Euroopan sosiaalirahaston, apurahan MJD71. NT on tukenut apurahan Alexander von Humboldt Foundation. KL, MK ja NT ovat saaneet matkustaa stipendejä maasta Kristjan-Jaak Foundation. Kotisivut OpenGene projektin: www.geenivaramu.ee/opengene/. Verkkosivu Viron Science Foundation: www.etf.ee. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvistä kuolemantapauksista maailmassa. Epigeneettiset tapahtumat ovat varhain ja usein karsinogeneesis- [1], [2], [3], mikä tekee DNA: n metylaatio houkuttelevan biomarkkereiden syöpään. Epigeneettiset voitaisiin myös tarjota taipuisa yhteys genomin ja ympäristön, jossa epigenome toimii biokemiallinen kirjaa asiaan elämän tapahtumia, esim. tupakointi [4].

Keuhkosyöpä on morfologisesti jaetaan ei-pienisoluinen ja pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC ja SCLC). NSCLC vastaa noin 80% keuhkosyövässä ja on heterogeeninen kliininen kokonaisuus suurten histologinen alatyyppejä kuten okasolusyöpä (SCC), adenokarsinooma (AC) ja suuri karsinooma [5]. Yhteistä eri alatyyppejä NSCLC on jonkin verran hitaampi kasvu ja leviäminen verrattuna SCLC, joka mahdollistaa kirurgisen hävittämistä sen alkuvaiheessa. Vain pieni osa NSCLC tapaukset ovat parhaillaan diagnosoidaan kliinisissä vaiheissa I II b, jossa kirurginen poisto on hoito valinta.

biomarkkereiden perustuvaa lähestymistapaa preinvasive vaiheissa voisi tukea diagnosoinnissa tai sulkea pois keuhkosyöpä. Nykyinen markkereita, mukaan lukien okasolusyöpä antigeeni karsinoembryonaaliselle antigeeni, sytokeratiinista 19 fragmentti antigeenin 21-1 ja neuroni enolaasin osoitettiin puuttuvan tyydyttävä diagnostinen teho. Tuoreessa tutkimuksessa, vain 37,3% alkuvaiheen keuhkosyövässä voidaan diagnosoida käyttämällä yhdistelmää määrityksiä edellä mainittujen kasvainmerkkiaineet [6].

Tutkimuksemme tavoitteena oli genomin laajuinen tunnistaminen DNA metylaatio-pohjainen biomarkkereiden ehdokkaita alkuvaiheen NSCLC. DNA: n metylaatio tapahtuu huomattavasti yhteydessä sytosiini-guaniinin dinukleotidien (CpG: t) [7]. CpG-rikas lyhyet osuuksilla (CpG saaret) sijaitsevat yleensä promoottorialueen geenien ja yleensä pidetään demetyloituneen tilassa [8]. Syövän, CpG saaret sijaitsevat promoottori alueella kasvainten synnyssä ja ”talon pitäminen” geenit tulevat hypermetyloitunut, mikä voi johtaa vähentynyt näiden geenien ilmentymistä. Samaan aikaan uskotaan, että genomi on maailmanlaajuisesti demetyloidaan, mikä puolestaan ​​voi johtaa siihen, että aktivointi onkogeenien [9], [10]. Metylaation CpG-saarekkeen rantojen – alueille, joilla CpG tiheys on noin 2 kb CpG-saarekkeiden – on myös tiiviisti mukana transkription inaktivointi [11].

Äskettäin, huomattavaa edistystä on tapahtunut genominlaajuisten DNA: n metylaatio analyysi. Menetelmät ovat bisulfiittikonversion DNA, immunosaostuksella tai affiniteettipuhdistuksessa metyloitua DNA, jota seuraa mikrosiruanalyysillä tai high-throughput sekvensointi [12]. On osoitettu, että tarkkuutta, bisulfiitti perustuvat menetelmät suorittaa hieman parempi kuin rikastukseen perustuvat menetelmät eivätkä vaadi tilastollinen korjaus CpG bias [13].

Olemme suorittaneet genominlaajuisten DNA metylaatio tutkimus vaiheen I NSCLC saada käsityksen alkuvaiheen epigeneettiset muutokset keuhkosyöpää ja tunnistaa mahdolliset diagnostisia tai prognostisia biomarkkereita. Tutkimuksessamme käytimme HumanMethylation27 BeadChips (Illumina, Inc), jotka mahdollistavat kustannustehokkaan kvantitatiivinen vertailuihin monia näytteitä.

Tulokset

CpG metylointianalyysi

Kaiken kaikkiaan olemme havainneet 496 CpG: t 379 geenien hypermetyloitunut ja 373 CpG: t 336 geenien hypometyloidut in NSCLC (kuva S1, taulukko S1). Lämpökarttana 100 eniten eri metyloituneiden geenien NSCLC verrattuna kontrolliin näytteitä on esitetty kuvassa 1.

DNA metylaatiotasoilla on esitetty top 100 CpG sivustoja, joilla on korkein delta Beta-arvot (FDR korjattu) DNA metylaatio välillä syövän kudoksen ja normaalin keuhkokudoksen. Metylointi Beta-arvot edustettuina rivi Z-score. Lämpökarttana luotiin käyttäen valvomaton 2D hierarkkista klusterin analyysi. Punainen osoittaa korkea metylaatio ja sininen ilmaisee alhainen metylaatio suhteessa rivi tarkoittaa.

Verrattuna AC näytteitä, SCC näytteet oli 263 CpG: t 223 hypermetyloitunut geenien ja 513 CpG: t 436 hypometyloidut geeneistä (kuvio S2, taulukko S2).

Kaksi DNA-näytteet (tunnukset 33 ja 107) käsiteltiin kahtena sisäisenä kontrollina määrityksen n toistettavuus. Pearsonin korrelaatiokerroin sekä kaksoiskappaleet oli 0,998. Metylaatiotasoilla määräytyy Infinium määritys validoitiin käyttäen Sangerin sekvensointia bisulfiitin-muunnetaan DNA 11 CpG: t (kuusi CpG: t alkaen NSCLC versus kontrollinäytteistä analyysiä ja viisi CpG: t säilymisen analyysi). Keskimääräinen korrelaatio kahden menetelmän oli 83% (vaihteluväli 48,9%; 97,4%) (kuvio S3).

CpG sivustoja analysoidaan HumanMethylation27 määrityksessä sijaitsevat 1,5 kb ylävirtaan 1 kb alavirtaan TSS heidän vastaavat geenit. Löysimme merkittävä ero sijainnin hypermetyloitunut vs. hypometyloidut CpG: t suhteessa lähimpään TSS (p = 0,0001, Welch Kaksi otoksen t-testi). Hypermetyloitunut CpG: t olivat valikoivasti sijaitsevat TSSs, 3 ’alavirtaan TSS tai CpG saarilla. Sen sijaan hypometyloidut CpG: t todettiin usein 5 ’ylävirtaan vastaavien TSSs tai CpG-saarekkeen rannoille [11] (taulukko 1, kuva 2).

mitattuna CpG: t ”etäisyys transkription aloituskohdasta (TSS) . a) Etäisyys TSS kaikkien CpG: t on metylointi array. b) Etäisyys TSS of hypermetyloitunut CpG: t (pisteviiva) ja etäisyyden TSS of hypometyloidut CpG: t (jatkuva viiva). X-akselilla, etäisyys TSS mitataan bp-s, ja y-akselilla N edustaa useita CpG: t.

Eri CpG: t on

HSPA12B

,

PABPC5

ja

TP73

olivat joko hyper- tai hypometyloidut in NSCLC.

TP73

geeni, hypermetyloitunut CpG kasvaimen näyte, joka sijaitsee ylävirtaan TSS ja täyspitkän mRNA: n isoformi. Hypometyloidut

TP73

CpG: t sijaitsivat lähellä TSSs lyhyemmän isoformeja. Hypermetyloitunut CpG: t on

HSPA12B

ja

PABPC5

sijaitsivat niiden 5 ’CpG-saarekkeiden, kun taas hypometyloidut CpG: t sijaitsivat ylävirtaan, ulkopuolella CpG-saarekkeiden.

Gene Expression Microarray Validation by qRT-PCR

Geenien ilmentyminen array setup ja tulokset raportoidaan viime paperi [14]. 10 geenit ja kahdeksan näytteen paria käytettiin vahvistamaan microarray tuloksia käyttäen qRT-PCR-tekniikkaa. Kaikki geenit osoittivat samaan suuntaan yli- tai ali-että keuhkosyövän näytteitä, käyttäen sekä tekniikoita (kuvio 3). Seitsemän geenit osoittivat merkittävää korrelaatiota ilmentymisen taitettava muutoksista määritetään qRT-PCR ja mikrosirujen (p 0,05, T 0,7) (kuva S4).

Y-akselilla on esitetty keskiarvo log2fold- muuttaa määräytyy Illumina array ja qRT-PCR (8 näytettä paria). Virhe palkit esittävät keskivirhettä keskiarvon (SEM).

Metylointi liittyvät Gene Expression Muutokset

Käyttämällä Pearsonin korrelaatio analyysi, pystyimme määrittämään odotettavissa käänteinen korrelaatio ero metylaatiotasoilla ja geenien ilmentyminen arvot 378 (43,5%) ja 869 differentiaalisesti metyloitu CpG: t välillä NSCLC ja kontrollinäytteiden. Eri histologisia ryhmissä pystyimme löytämään 337 780 CpG: t (43,2%), metylaatiotasot joista korreloi käänteisesti geenin ilmentymisen tasoa.

Teimme qPCR analyysi eri

TP73

isoformit testata, onko ero metylaatio vieressä TSSs eri isoformeja vaikuttaa niiden ekspressiotaso. QPCR analyysi ei havaittu tilastollisesti merkitsevää eroa (p-arvo 0,36, pariksi t-testi) välillä ekspressiotasot kahden isoformia meidän kasvain näytteissä.

Ingenuity Pathway Analysis

suoritetaan

in silico

toiminnalliset ja vuorovaikutuksen analyysit erilaisesti metyloitua geenien avulla Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ohjelmisto (Ingenuity Systems, Redwood City, CA), ja löysi 78 verkko oikeutettu geenejä ja 451 toiminnot /Pathways oikeutettuja geenejä. Sisällyttämällä tunnetut suorat ja epäsuorat vuorovaikutukset, kaikkein näkyvästi edustettuina geeni verkkoon liittyi tuumorinekroositekijän (TNF, kuva S5). Suurin osa geeneistä (n = 22) verkossa olivat hypometyloidut, mutta jotkut geenit (n = 7) on myös hypermetyloitunut.

DNA Metylointi liittyvät tupakointikäyttäytymiseen

Perustuu tupakointi pack -vuotias data, kysyimme, onko tupakointi vaikuttaa DNA metylaatiovyöhykkeiden kasvain. Yksi potilas, joka puuttui tupakointi Aineisto ulkopuolelle. Lineaarinen regressioanalyysi suoritettiin käyttämällä Bioconductor Limma paketti. Analyysi sisällä kasvain näytteet eivät osoittaneet mitään differentiaalisesti metyloidut liittyvien geenien laajuus tupakoinnin. Vertaamalla rajoitettu määrä tupakoimattomien (n = 3, 6,4%) ja tupakoitsijat (n = 44, 93,6%) löydettiin neljä erilaisesti metyloitua CpG-sivustoja kolme geeniä (p 0,05, FDR oikaistu), jotka ovat kaikki hypometyloidut tupakoitsijoilla ryhmä:

CXorf38

,

MTHFD2

ja

TLL2

.

Altered metylointi ja pitkäaikainen Survival

Suoritimme kaksi tyyppisiä selviytymisen analyysien löytää mahdollisia ennustetekijöitä metylaatio markkereita. Potilaat, joilla ainoastaan ​​enintään kuukauden selviytymisen leikkauksen jälkeen (n = 2), ei oteta välttää mahdolliset sekoittavien vaikutusta leikkauksen jälkeisiä komplikaatioita.

Ensinnäkin, teimme Kaplan-Meier eloonjääminen analyysi kustakin CpG sivustoja jakamalla Beta arvot alhaisen, keskisuuren ja korkean metylointi ryhmiä. Olemme vain raportoivat tuloksista jossa kaikki ryhmät olivat suurempia kuin viisi potilasta. Tuloksena löydettiin 10 CpG: t 10 geenejä, joissa metylaation tasoeroja eri eloonjäämisen ryhmissä (kuva 4). Potilaat, joilla keskipitkän metyloinnin taso

UGT1A7, GPR171, P2RY12, FLJ35784

ja

C20orf185

oli parempi eloonjäämisen kuin potilailla, joilla on korkean tason metylaatio. Potilaat, joilla keskipitkän metyloinnin taso

CLEC11A

ja

GRIK3

oli parempi eloonjäämisen verrattuna matalan tason metylaatio. Potilaat, joilla on alhainen metyloinnin taso

CYP1A1

ja

INGX

oli parempi eloonjäämisen kuin ne, joilla on keski- tason metylaatio. Potilaat, joilla on korkea metylaation tasolla

PIK3R5

oli parempi eloonjäämisen kuin ne, joilla on keskitason metylaatio.

Teimme selviytymistesti kustakin CpG sivustoja. Metylointi arvot on jaettu 3 ryhmään: matala (0-0,25), keskipitkän (,25-+0,75) ja korkea (0.75-1). Tämän seurauksena löydettiin 10 CpG kohteissa, joiden metylaatio taso vaihtelee eri selviytymisen ryhmissä. X-akseli esittää selviytymistä vuosia ja y-akseli esittää eloonjäämiseen.

Toiseksi suoritti ero metylointianalyysi yhdistämällä Coxin suhteellinen vaara-analyysi ja Wilcoxonin-sum test. Löysimme 18 CpG: t 15 geenien potilailla, joilla on 1-24 kuukautta eloonjäämisen (n = 12) vs. potilaalla 60 kuukauden ajan ja elinajan pitenemiseen (n = 15), p 0,05 ja metylointi ero cut-off sovellettu. Vuodesta differentiaalisesti metyloitu geenit,

DXS9879E

(

LAGE3

),

RTEL1

ja

MTM1

olivat hypermetyloitunut, ja

SCUBE3

,

SYT2

,

KCNC3

,

KCNC4

,

GRIK3

,

CRB1

,

SOCS2

,

ACTA1

,

ZNF660

,

MDFI

,

ALDH1A3

ja

SRD5A2

oli hypometyloidut ryhmässä on huono selviytyminen (kuva S6).

keskustelu

Olemme suorittaneet genominlaajuisten DNA metylaatio tutkimuksessa 48 vaiheessa I pienisoluista keuhkosyöpää ja 18 makroskooppisesti syöpää vapaa kontrollinäytteitä käyttäen klusterianalyysillä etsiä geenejä, jotka erottaa toisistaan ​​syöpä ja normaali keuhkokudoksen ja verrattiin näiden geenien metylaatiotasoilla niiden ekspressiotasot. Lisäksi teimme

in silico

toiminnalliset ja vuorovaikutuksen analysointi eri metyloituneiden geenien avulla IPA ohjelmistoa. Lineaarinen regressio käytettiin löytää geenejä, jotka liittyvät tupakoinnin, ja Kaplan-Meierin eloonjääminen analyysi suoritettiin tunnistaa ero metylaatio liittyvien geenien potilaan selviytymisen.

Tämän seurauksena olemme havainneet 496 CpG: t 379 hypermetyloitunut geenejä ja 373 CpG: t 336 geeniä, jotka olivat hypometyloidut NSCLC. Täydellinen erottaminen valvonnan keuhkojen kudosnäytteitä NSCLC näytteistä ei saavutettu, koska yksi normaali keuhko näyte ryhmittyneet yhdessä syövän näytteitä ja kuusi syöpänäytteissä (yksi kaksoiskokeina) osoitti metylaation hieman muistuttava kasvaimettomina keuhkokudoksessa. Koska käytimme ei-dissektoiduista kasvainnäytteet, tämä havainto saattaa olla ainakin osittain aiheuttamien hämmentävä vaikutus ei-neoplastisen kudoksen läsnä näissä näytteissä. Patologinen tutkimus NSCLC näytteiden DNA: n metylaatio ominaisuudet kuin normaalin keuhkojen näytteistä löytyi joko pieni kasvain pitoisuus (10-30%) tai hyvin heterogeeninen koostumus kasvainsolujen näytteissä. Nämä co-klusterointia syöpänäytteissä ja syöpää vapaa keuhko näytteet siis kuulu muihin analyyseihin.

Ensimmäinen tavoitteemme oli tunnistaa geenien alussa tapahtumia kasvainspesifisiä metylaatio. Tämän seurauksena meidän seulonta paljasti joitakin tunnettuja metylaatio markkereita, joista osa on kasvaimen suppressoriaktiivisuutta:

CDKN2A

,

MGMT

,

GATA4

,

HOXA7

,

HOXA9

,

RUNX3

,

SFRP1

. Useimmat tunnistetuista geeneistä ovat uusia metylaatio merkkiaineita NSCLC, vaikka jotkut näistä on kuvattu metyloitu muissa syövissä.

LGALS12

on ehdokas tuumorisuppressori, joka pystyy pidättämään solusyklin ja inhiboimaan useita syöpäsolulinjoissa [15]. Rintasyövässä

LGALS12

on todettu vaimentua siinä pahanlaatuinen kudos [16].

Toinen päämäärä oli selvittää korreloida metylaatio taso muuttuu geeniekspression data. Käyttämällä Pearson analyysin pystyimme löytämään odotettavissa käänteinen korrelaatio metylaatiotasot ja geenien ilmentyminen arvot 378 869 CpG sivustoja (43,5%). Korkeimmat käänteinen korrelaatio arvojen hypermetyloitunut CpG: t ja ilmaisun arvot löytynyt

AGER

(-0,78),

EPOR

(-0,65) ja

AQP1

(-0,63) geenejä. Keskimääräinen etäisyys TSS of korreloi käänteisesti geenien oli -65 bp (alue -1498; 917 emäsparia) verrattuna -158 emäsparin (alue -1474; 818 bp) korreloi positiivisesti CpG: t (p-arvo 0,02, opiskelijat t-testi). Valikoima CpG: t on luultavasti vaikuttaa se, että Illumina n Infinium HumanMethylation27 mikrosirujen kattaa CpG: t, jotka sijaitsevat pääasiassa läheisyydessä promoottorialueiden eikä geeni elimen tai 3’UTR. Akvaporiini 1 (

AQP1

) on raportoitu hypermetyloitunut ja vaimentua in NSCLC [17].

AGER

, joka koodaa reseptoria immunoglobuliinisuperperheen, on raportoitu vaimentua NSCLC [18]. Korkeimmat käänteinen korrelaatio arvot hypometyloidut CpG sivustojen ja ilmaisun arvot havaittiin

MB

(-0,63),

ADA

(-0,60) ja

MAGEA6

(-0,60) geenejä. Myoglobin (

MB

) liittyy kasvaimen etenemiseen ja auttaa voittamaan hypoksia syöpäsoluissa [19]. Hypermetylaation ja /tai downregulation joidenkin tunnistettujen geenien tutkimuksessamme (esim

ALDH1A2

,

HOXA5

,

MT1E

,

SOX17

) on ole raportoitu muissa syövissä [20], [21], [22], [23], mutta ei vielä keuhkosyöpään. On oletettu, että

RASSF1

toimii tuumorisuppressori keuhkosyövän etenemisessä [24]. Niistä hypometyloidut ja voimistunut geenit, yleisimmin raportoituja geeni oli

SERPINB5

(maspiini). Yliekspressio

SERPINB5

on liittynyt syövän etenemiseen ja huonon ennusteen keuhkosyövän [25].

Voimme olettaa, että geenit kanssa käänteinen korrelaatio on suurempi todennäköisyys tulla säädellään metylointi . Kuitenkin monet geenit todennäköisesti tullut metyloitu satunnaisesti aikana syövän synnyn, ja tämä ei välttämättä ole tasaisen vaikutus geeniekspressiotasot.

Kun kyse on eri histologia ryhmien pystyimme löytämään käänteinen korrelaatio differentiaalisesti metyloitu CpG sivustoja ja geenien ilmentyminen arvot 337 780 CpG sivustoja (43,2%). Korkeimmat käänteinen korrelaatio arvot olivat

ACOX2

(-0,75),

ARSE

(-0,70) ja

SLC39A4

(-0,68), joita ei ole liittynyt NSCLC histologisia alatyyppejä ennen. Niistä korreloi käänteisesti geenejä, on raportoitu, että

PIGR

,

MUC1

ja

FOLR1

ovat vaimentua SCC verrattuna AC [26], [27], [ ,,,0],28], joka on sopusoinnussa tuloksemme.

analyysi käyttäen IPA ohjelmistoa paljasti, että hallitseva toiminnot erilaisesti metyloitua geenit olivat solusta soluun signaloinnin ja vuorovaikutus, DNA: n replikaatio ja korjaus, solujen kasvun ja lisääntymisen, solukuolema, syöpä, tulehduksellinen vaste, jne. Useat geenin toimintoja, kuten solun kasvua, lisääntymistä ja solujen kuolemaan, ovat suoraan osallisina syövän etenemisen, mutta immuunijärjestelmä on myös tärkeä rooli torjuttaessa syöpäsoluja. On myös laajalti tunnettua, että puutteet reitit DNA: n korjaukseen ja vaurioiden valvontaa ovat vastuussa suurimmasta tai jopa kaikki ihmisen syövissä. Sen jälkeen myös tunnetut epäsuorat suhteet, näkyvin geeni verkkoon paljasti liittyi

TNF

(kuva S5).

TNF

on kaksoisrooli kasvaindiagnostiikassa. Se on sytokiini tunnettujen syövän vastaisia ​​ominaisuuksia, mutta voi myös edistää syövän kehittymistä ja etenemistä [29]. Hypometyloidut geenien

TNF

verkko olivat sytokiinien (

CCL3, CCL4, CCL7, CCL8, CCL22, IL21, IL17A, EBI3

), joka voi joko stimuloida tai estää kasvaimen kasvua ja etenemistä.

TNF

verkko sisältää myös tunnettu voimakas antiapoptoottisten geeni

BCL2

, joka myös pääosin hypometyloidut meidän NSCLC näytteitä.

ALDH1A3

(aldehydidehydrogenaasille 1 perhe, jäsen A3) epäsuorasti säätelee

TNF

on rooli vieroitus aldehydien tuottaman alkoholin aineenvaihduntaan ja lipidiperoksidaation. Hypometylaatio Tämän geenin liittyi huonompi ennuste tutkimuksessamme kohortissa (kuva S6).

Huomasimme, että

TP73

oli kolme eri tavalla metyloitu CpG: t, joista kaksi hypometyloidut kasvainkudoksessa ja lähellä TSS sen lyhyempi isoformeja. Hypermetyloitunut CpG sijaitsi ylävirtaan TSS ja täyspitkän mRNA: n isoformi. Mittasimme ilmaisun eri isomuotojen avulla qPCR analyysiä, mutta ei löytänyt mitään tilastollisesti merkitseviä eroja (p-arvo 0,36, pariksi t-testi) in kasvain näytteissä, vaikka pitkä isoformin ilmentyi hieman alhaisemmalla tasolla kuin lyhyt isoformi . Suoritimme Kaplan-Meier selviytymisen testi CpG sivustoja, josta meillä jaettu niiden metylaatio arvot 3 ryhmään: matala (0-0,25), keskipitkän (0,25-,75) ja korkea (0.75-1). Tuloksena löydettiin 10 CpG: t 10 geenejä, joiden metylaatio taso vaihtelee eri eloonjäämisen ryhmissä (kuva 4).

UGT1A7

on entsyymi osallistuu metaboliaan (esi) karsinogeenien läsnä tupakansavussa. Precarcinogens ja niiden metaboliittien katsotaan olevan tärkeä rooli karsinogeneesin tupakansavun liittyviä syöpiä [30]. On osoitettu, että polymorfismien UGT1A7 geeni liittyy keuhkosyövän, viittaa siihen, että nämä polymorfismit vähentää entsyymiaktiivisuutta [31]. Korkea metylaatio tasolla voisi vaikuttaa

UGT1A7

toimintaa ja aiheuttaa huonon ennusteen pienisoluista keuhkosyöpää.

CYP1A1

(kuuluvat P450 superperheen) katalysoi monia reaktioita mukana lääkeainemetaboliaa, myös konversion polysyklisiä aromaattisia hiilivetyjä reaktiiviseen aineenvaihduntatuotteiden ja detoxifications ympäristön karsinogeenien. On osoitettu, että

CYP1A1

on hypermetyloitunut keuhkosyöpä näytteissä verrattuna normaaliin keuhkojen näytteitä, ja tämä liittyi alentunut mRNA-tasoja [32]. Tutkimuksessamme korkeampi metylaatiotasoilla olivat yhteydessä huonoon säilymiseen keuhkosyöpäpotilaiden joka tukee oletusta, että

CYP1A1

voi olla suojaava rooli syövän etenemiseen. Muita geenejä löytyy selviytyminen analyysi ei ole toimittaja olla mukana keuhkosyöpään potilaan selviytymisen.

Käyttäen erityyppinen selviytymisen analyysin, jossa ero metylointianalyysi suoritettiin yhdistämällä Coxin suhteellinen vaara-analyysi ja Wilcoxonin rank-sum test, pystyimme analysoimaan 12 potilasta, joiden selviytyminen vähintään 24 kuukautta ja 15 potilasta, jotka selvisivät 60 kuukautta tai enemmän leikkauksen jälkeen. Tämä analyysi eri selviytymisen ryhmiä paljasti 15 erilaisesti metyloituja geenejä.

RTEL1

, säädin on telomere pidentymisen helikaasin 1, näyttää olevan kaikkein toiminnallisesti mielenkiintoisen yksi näistä. Tämä on ATP-riippuvaisena DNA helikaasin tarvitse tukahduttaa sopimatonta homologisen rekombinaation siten keskeinen rooli DNA: n korjaukseen ja ylläpitoon genomista vakautta.

RTEL1

havaittiin hypermetyloitunut meidän huono selviytymisen ryhmässä.

Vertaamalla tupakoimattomien (n = 3, 6,4%) ja tupakoitsijat (n = 44, 93,6%), neljä differentiaalisesti metyloituja CpG-sivustot liittyvät kolme geeniä, hypermetyloitunut tupakoimattomien ryhmä havaittiin:

CXorf38, MTHFD2

ja

TLL2

. Puuttuvat tilastollisesti merkittävää eroa metylaatiotasoilla eri tasojen välillä tupakoinnin voisi osoittaa huonon luotettavuuden pack-vuoden saadut.

MTHFD2

on osoitettu olevan suurempi ekspressio tupakoitsijoilla, suosimalla solujen nopeasta kasvusta. [33].

TLL2

on sinkki-riippuvainen metalloproteaasi. Expression of metalloproteinaasien tarvitaan solujen transformaatio, ja tämä korreloi kasvaimen etenemistä [34].

Vertaamalla genominlaajuisten muutoksia DNA: n metylaation normaalin ja keuhkosyövän soluja, pystyimme saamaan käsityksen monimutkaisuus metylaation tarvittava ohjelma solujen tulla täysin pahanlaatuinen. Tämän tuloksena löydettiin paneeli geenejä, jotka erottavat NSCLC-solujen vierekkäisten normaalin keuhkokudoksen soluja ja myös levyepiteelikarsinooma päässä adenokarsinooma. Analyysi paljasti joukon differentiaalisesti metyloitua CpG sivustoja, jotka näyttävät säädellä geeniekspressiota ja toinen joukko, joka oli vaikuttanut selviytymisen potilaista. Nämä vasta-tunnistetut metyloinnin markkereita ovat ehdolla edelleen molekyyliseulontaa NSCLC. Jotta voitaisiin vahvistaa nämä merkkiaineiden NSCLC syövän synnyn, lisätutkimuksia ja validoinnit tarvitaan. Tuloksista työmme ja aikaisemmista havainnoista, voimme olettaa, että muuttuneen DNA: n metylaatio on varhainen tapahtuma NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Ethics komitean Human Studies, Tarton yliopisto, on hyväksynyt tutkimuksen ja kirjallinen suostumus saatiin Tutkimushenkilöillä.

Näytteet

Analysoimme Union for International Cancer valvonta (UICC) vaihe I NSCLC näytteiden [35] 48 potilasta ja makroskooppisesti syöpä-free ”normaali” keuhkojen kontrollinäytteistä 18 potilasta. Kaikki yksilöt oli eristetty aikana keuhkoleikkauksen Tarton yliopistollisessa sairaalassa, Viro. Potilaiden adenokarsinooma (n = 6, 12,5%) ja sen alatyypin bronchioloalveolar karsinooma (n = 10, 20,8%) analysoitiin yhtenä ryhmänä (n = 16, 33,3%). Loput 32 (66,7%) analysoiduista potilailla oli levyepiteelikarsinooma. Ikäryhmä tutkimusryhmässä oli 41-80 vuotta (keski-ikä miehillä n = 40, 66,2 vuotta ja naisilla n = 8, 65,5 vuotta) (taulukko S3). Potilaat eivät tapahdu ennen leikkausta kemo- tai sädehoitoa.

leikkaus, kudosnäytteet sopivankokoinen (1-2 cm

3) leikattiin tumorous ja morfologisesti kasvaimettomina keuhkokudoksessa. Yksi puoli kunkin näytteen kiinnitettiin formaliinissa ja käytettiin patologiset tutkimukset. Toinen puoli kustakin näytteestä oli jäädytettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Ohjaus näytteet saatiin paikassa, joka on kaukana poistettu kasvain ja vahvistettiin olevan kasvain-free samalla patologi.

DNA Extraction ja bisulfiittimodifikaatio

DNA uutettiin 50 mg: sta kasvain ja matching kasvaimettomina keuhkokudoksesta kanssa Dneasy® Veren Tissue (Qiagen GmbH., Hilden, Saksa) sekä Nucleospin® Tissue Kit (Macherey- Nagel GmbH., Düren, Saksa). DNA: n saanto ja puhtaus määritettiin käyttämällä NanoDrop® ND1000 spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Kustakin näytteestä, 500 ng genomista DNA bisulfiitti muutettu käyttämällä EZ DNA Metylointi ™ Kit (Zymo Research, Orange, CA) valmistajan suositusten mukaisesti.

metylointi validointi Sanger Sequencing

metylaation siru validointi 11 geenit valittiin, joista viisi oli geenien selviytyminen analyysin ja loput kuusi olivat geenien eron syövän ja normaalin kudoksen (alukkeet käytetään tutkimus osoitti taulukossa S4). Alukkeet vetysulfiitilla käsitellyn DNA: n PCR suunniteltiin käyttäen MethPrimer [36]. 20 ui PCR suoritettiin 80 mM Tris-HCl (pH 9,4-9,5), 20 mM (NH4) 2SO4, 0,02% Tween-20 PCR-puskuria, 3 mM MgCI2, 1 x betaiini, 0,25 mM dNTP-seosta, 2 yksikköä Hot-start Taq-polymeraasia, 50 pmol eteenpäin aluketta, 50 pmol reverse-aluketta, 20 ng ui bisulfiittikäsiteltyä genomista DNA: ta. PCR-syklien olosuhteet olivat 95 ° C 15 min entsyymin aktivointia, 95 ° C 30 sekuntia, 62 ° C 45 sekuntia, 72 ° C 120 sekuntia 17 sykliä, maakosketusta -0,5 ° C jokaista kierrosta ja 95 ° C 30 sekuntia, 52 ° C 30 sekuntia, 72 ° C 120 sekuntia 21 sykliä. Sekvensointi tehtiin palveluna, jonka Core Facility Viron Biocenter. Analysoimme sekvensointi jäljet ​​Mutaatio Surveyor ohjelmisto (Softgenetics, State College, PA, USA) ja R tilastollinen tietojenkäsittely ohjelmistot (https://www.r-project.org/).

RNA ja Gene Expression Analysis

yksityiskohtainen kuvaus RNA ja geenin ilmentymisen analysointi prosessi on esitetty viime paperin [14].

10-geenien ja kahdeksan näytteen paria (kasvain ja vieressä normaali näyte) käytettiin vahvistamaan microarray data. Kvantitatiivista RT-PCR (qPCR), cDNA syntetisoitiin 700 ng kokonais-RNA käyttämällä First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Vilna, Liettua) ja oligo dT-alukkeita mukaan valmistajan protokollaa. Kolmena kappaleena qPCR reaktiot suoritettiin 384-kuoppalevyillä käyttämällä SYBR Green ROX mix (ABgene, Epsom, UK tai Fermentasilta, Vilna, Liettua) ja ABI 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Tiedot analysoitiin käyttäen SDS 2.2.2 (Applied Biosystems) ja R tilastollinen tietojenkäsittely ohjelmistot (https://www.r-project.org/).

geometrinen keskiarvo ilmentymistä kaksi viite geenien (

ESD

ja

S18RNA

) käytettiin referenssinä. Expression kertaluokkamuutos välillä normaalin ja kasvaimen näytteen laskettiin 2

-ΔΔCt menetelmällä. Pearsonin korrelaatio analyysit käytettiin arvioimaan mukaisesti välillä kertamuutoksia tunnistetaan qRT-PCR ja array kokeita.

Lisäksi qRT-PCR: ää käytettiin määrittämään

TP73

ekspressiotason. Käytetyt alukkeet

TP73

qPCR monistukset on lueteltu taulukossa S5.

DNA Metylointi Analyysi

metylointi analyysi suoritettiin käyttäen Infinium® HumanMethylation27 RevB BeadChips (Illumina Inc.). Määritys kattaa 27578 CpG: t vuonna 14495 geenit sijaitsevat pääasiassa CpG saarilla proksimaalisen promoottorin alueiden välillä 1,5 kb ylävirtaan ja 1 kb alavirtaan transkription aloituspaikkoja (TSS). CpG island tässä määrityksessä on määritelty nukleotidisekvenssi (1) 200 emäsparin tai suurempi pituus, (2) 50%: n tai suurempi GC-prosenttia, ja (3) 0,60 tai suurempi suhteessa havaittujen CpG sivustoihin odotettu CpG sivustoja tällä alueella [10]. HumanMethylation27 beadchips kattaa myös CpG sivustoja säätelyalueita 1000 tunnettujen syövän geenien, 150 differentiaalisesti metyloituja geenejä erilaisissa syövissä ja 110 miRNA geenejä.