PLoS ONE: Wild-Type HRAS estää alkuvaiheista tuumorigeneesiä geenimuunnossolulinjoissa hiirimallissa Haimasyöpä
tiivistelmä
onkogeeninen, aktivoivat mutaatiot
KRAS
aloittaa haimasyöpä. On kuitenkin kaksi muuta
Ras
perheenjäsenet,
sääntelyviranomaisten
ja
HRAS
, jotka voidaan aktivoida läsnäollessa onkogeenisten
Kras
. Rooli näiden villin tyypin
Ras
proteiinien syöpä on edelleen epäselvä, koska niiden häiriö on osoitettu lisäävän tai estää kasvaimen kehittymisen kontekstista riippuen. Koska haimasyöpä on kriittisen riippuvainen
Ras
signalointi, testasimme ja ilmoittavat nyt, että menetys
HRAS
kasvattaa kasvain kuormitusta ja vähentää selviytymistä onkogeenisessä
Kras
ajettavat haiman adenokarsinooma hiirimallissa. Nämä vaikutukset jäljittää varhaisimmista haimasyövän, mikä viittaa siihen, että villityypin
HRAS
voi tukahduttaa kasvaimen aloittamista. Normaaleissa soluissa, aktivoitu
Ras
voi estää leviämisen kautta p53-riippuvainen mekanismeja. Huomaamme, että kasvain tukahduttava vaikutus
HRAS
mitätöidään on homotsygoottinen mutantti p53 tausta. Sinänsä menetys villityypin
HRAS
edistää alkuvaiheista haimasyövän p53-riippuvainen tavalla.
Citation: Weyandt JD, Lampson BL, Tang S, Mastrodomenico M, Cardona DM, Counter CM (2015) Wild-tyyppi
HRAS
estää alkuvaiheista tuumorigeneesiä geenimuunnossolulinjoissa hiirimallissa Haimasyöpä. PLoS ONE 10 (10): e0140253. doi: 10,1371 /journal.pone.0140253
Editor: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, SAKSA
vastaanotettu: 27 helmikuu 2015; Hyväksytty 23 syyskuuta 2015 Julkaistu: 09 lokakuu 2015
Copyright: © 2015 Weyandt et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään
Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.
Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Cancer Institute, USA (https://www.cancer.gov) avustus CA123031. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
on arvioitu, että noin 1,5% amerikkalaisista kehittää haimasyöpä, ensisijaisesti
p
ancreatic
d
uctal
DENO
c
arcinoma (PDAC). Suurin osa näistä henkilöistä periksi tämän taudin, jossa on viiden vuoden eloonjäämisaste vain 6,7% [1]. Näin ollen on tärkeää selvittää signalointireittien taustalla erittäin tappava syöpä. Aktivoivat mutaatiot
KRAS
ovat yleisin geneettinen muutos löydetty ihmisen PDAC, on läsnä yli 90% kaikista tapauksista. Itse asiassa Ras polku väitetään harjoittavan oleellisesti kaikki PDAC [2].
KRAS
, ja muut Ras perheenjäsenet
sääntelyviranomaisten
ja
HRAS
, koodaavat korkeasti liittyviä pieniä GTPaaseja. Normaalisti stimulaatio guaniininukleotidiä vaihto tekijät [GEFs] edistetään muuntaminen Ras-aktiivisesta, GDP-sitoutunut tilasta aktiiviseen, GTP sitoutuneena. Ras-GTP sitoutuu ja aktivoi efektoriproteiinit jotka kytkeytyvät MAPK, PI3K, RalGEF, ja muut signaalinvälitysreittien osallistuvien solujen kasvua ja selviytymistä. GTPaasia aktivoivat proteiinit (GAP) sen jälkeen parantaa hydrolysoimalla GTP ja palata Ras takaisin aktiiviseen tilaan [3].
somaattiset mutaatiot havaittu
KRAS
geenin inaktivoivat endogeeniset tai GAP stimuloi GTPaasi-aktiivisuus koodatun proteiinin, jolloin konstitutiivisesti GTP: hen sitoutuneen ja aktivoitu Kras [3]. Sen lisäksi, että yleisesti havaittu PDAC [2], nämä mutaatiot löytyy myös alkuvaiheista tämä tauti [4], ja kun viedään hiiren
Kras
geeniä, indusoi varhaisessa vaiheessa haimasyöpä, jotka voivat edistyminen frank PDAC [5]. Sellaisenaan, onkogeeninen mutaatiot
KRAS
ajatellaan olevan kuljettajan mutaatioiden PDAC.
Vaikka osallistuminen onkogeeninen mutantti muoto Kras haimasyövän on hyvin kuvattu, jäljellä villin kirjoita Ras isoformeja voidaan myös aktivoida. Ensimmäinen vihjeitä olivat tältä osin havainnot että kohdistettu negatiivinen säätelijä RasGAP solukalvoon [6] tai vähentämiseksi villityypin sääntelyviranomaisten ilmaisun [7], joka on kostutettu onkogeenista HRAS signalointi. Todellakin, villityypin sääntelyviranomaisten ja HRAS on todettu aktivoida alavirtaan onkogeenisten Kras tavalla riippuvainen
S
-nitrosylation [8] tai ilmaus GEF son-of-sevenless- [SOS] [9 ]. Lisäksi villityypin Ras-proteiinit ovat edelleen alttiita aktivaatio kasvutekijöiden, vaikka läsnä onkogeenisten Kras [10].
Wild-type Ras-proteiinit voivat olla erilaiset vaikutukset riippuen asetuksesta. Yhtäältä ne voivat estää kasvaimien syntyyn. Erityisesti, onkogeeninen Ras voi aiheuttaa senescent kasvun pysähtymistä, kun ilmentyy normaaleissa soluissa [11], ja estää kasvaimen muodostumisen [12], mikä viittaa siihen, tuumoria tukahduttavan rooli villityypin Ras-proteiineja. Yhteisymmärryksessä, karsinogeeni aiheuttama onkogeenisen mutaatiot
Kras
tai
HRAS
keuhkojen ja ihon kasvaimet hiiriä liittyy usein menetyksen vastavuoroista villityyppisen alleelin [13-15]. Samoin, heterotsygoottisuuden menetys onkogeenisen
RAS
geeni on raportoitu ihmisen syövissä, [16]. Lisäksi hiiret puuttuu yksi alleeli villityypin
Kras
[15], tai molempien alleelien joko
HRAS
tai
sääntelyviranomaisten
, kehittää
Kras
mutaatio-positiivisten keuhkokasvaimia [17]. Kasvain-tukahduttava rooli villityypin
sääntelyviranomaisten
havaittiin myös hiirimallissa kateenkorvan lymfoomat ohjaavat onkogeeninen
sääntelyviranomaisten
[18]. Täten villin tyypin Ras proteiinit voivat olla kasvain tukahduttava, erityisesti asetuksista varhaisen kasvaimen kehittymisen.
Villityypin Ras proteiinien voi myös edistää kasvaimien syntyyn. Erityisesti joilta puuttuu yksi tai molempien alleelien villityypin
HRAS
tai
sääntelyviranomaisten
kehittää vähemmän karsinogeeni aiheuttama
HRAS
mutaatio-positiivisten ihokasvaimia [17]. Kaatamalla ilmentymistä villityypin Ras proteiinien [8, 19], tai vähentää niiden aktivointia eNOS [8] tai SOS [9], inhiboi solujen elinkelpoisuus, transformaatio, ja /tai tuumorigeenisia kasvua
KRAS
mutaatio-positiivisia ihmisen syöpäsolujen linjat. Sitä vastoin stimulaatio villityypin Ras-proteiinien EGF edistää proliferaatiota sellaisten solujen [10]. Näin ollen, erityisesti malleissa enemmän edenneen taudin, villityypin Ras-proteiinit voivat parantaa kasvaimen kehittymisen.
Koska villityypin Ras-proteiineja voidaan aktivoida alavirtaan onkogeenisten Kras, mutta aiheuttaa vastakkaiset vaikutukset tuumorigeneesiä riippuen yhteydessä, on tärkeää varmistaa niiden roolia syövän useimmin liittyvä
KRAS
mutaatioita, eli haiman. Siten arvioimme seuraus häiritä endogeenisen villityypin
HRAS
geenin kehittämiseen onkogeenisten
Kras
ajettavat tuumorigeneesiä haimassa hiirillä. Me raportoimme että menetys villityypin
HRAS
edistää kasvainten synnyssä tässä mallissa, mikä viittaa kasvaimen tukahduttava rooli villityypin
HRAS
alkuvaiheessa haimasyövän.
Materiaalit ja menetelmät
hiiri haimasyöpä mallit
Kras
LSL-G12D /+
,
Trp53
LSL-R172 /+
, ja
Pdx-1-Cre
tg /+
hiiret saatiin Jackson Labs ja ystävällinen lahjoitus David Kirsch.
HRAS
– /-
hiiret olivat ystävällinen lahja NCI ja Eugenio Santos.
Kras
LSL-G12D /+
; HRAS
+/-
ja
Pdx-1-Cre
tg /+
; HRAS
+/-
hiiriä kasvatettiin tuottaa
HRAS
+ /+
ja
HRAS
– /-
KC (
LSL-Kras
G12D /+
; Pdx-1-Cre
tg /+
) littermates.
Kras
LSL-G12D/+
;Trp53
LSL-R172/+
;Hras
+/+
ja
Pdx-1-Cre
tg /+
; HRAS
+ /+
hiiriä kasvatettiin tuottamaan
HRAS
+ /+
KPC (
LSL-Kras
G12D/+
;Trp53
LSL-R172/+
;Pdx-1-Cre
tg/+
) hiirillä.
Kras
LSL-G12D/+
;Trp53
LSL-R172/+
;Hras
-/-
ja
Pdx-1-Cre
tg /+
; HRAS
– /-
hiiriä kasvatettiin tuottamaan
HRAS
– /-
KPC hiirillä.
Kras
LSL-G12D/+
;Trp53
LSL-R172/+
;Hras
+/+
ja
Pdx-1-Cre
tg /+
; Trp53
LSL-R172 /+
; HRAS
+ /+
hiiriä kasvatettiin tuottaa
HRAS
+ /+
KPPC (
LSL-Kras
G12D /+
; Trp53
LSL-R172 /LSL-R172H
; Pdx-1-Cre
tg /+
) hiirillä.
Kras
LSL-G12D/+
;Trp53
LSL-R172/+
;Hras
-/-
ja
Pdx-1-Cre
tg /+
; Trp53
LSL-R172 /+
; HRAS
– /-
hiiriä kasvatettiin tuottaa
HRAS
– /-
KPPC hiirillä. Kuvattu Hiiriä seurattiin terveyden ja paino kolme kertaa viikossa ja tapettiin joko ilmoitettuun kiinteiden ajankohtina tai päästyään kuoleman lähestyminen päätepisteen. Kuoleman lähestyminen päätepisteitä määriteltiin laihtuminen yli 15% koko kehon painosta, merkkejä vatsan askitesta tai turvotusta, tai merkkejä kipua tai tuskaa. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla Tässä tutkimuksessa oli nimenomaan hyväksynyt Institutional Animal Care ja käyttö komitea Duken yliopistossa (protokolla A279-13-11).
Hiiri PDAC solulinjoissa
Haiman kasvainkudoksen kolmesta
HRAS
+ /+
ja kolme
HRAS
– /-
KPC hiirten jauhetaan kollagenaasi V (Sigma-Aldrich ) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ja tuloksena soluja viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Media (DMEM) + 10% FBS vähintään 4 kohtia.
kvantifiointi normaalin haiman rauhasrakkuloiden alueen
prosenttiosuus normaali asinussolujen alue määrällisesti 8 ja 36 viikon määräajan pisteitä KC hiiret sokkotutkimuksessa 4-5 satunnaisesti valitun suuritehoisia aloilla H E-värjätty haiman osassa hiirtä kohti. Määrä asinussolujen alueen lohkolle ilmaistiin prosentteina kokonaispinta-alasta kudoksen alalla, määritetään Adobe Photoshop vapaalla kädellä valinta työkalu.
Arvostelu haiman vaurioiden
H Pdx-1-
C
re
tg /+
(KC) tausta [5]. Valitsimme HRAS, koska se aktivoituu alavirran onkogeenisten Kras vuonna PDAC solulinjoissa [8-10], ja kolmesta
Ras
geenejä, on ainoa, joka ei ole alkion tappava taustalla kuin että KC hiiriä joka koodaa ainoastaan yhden toiminnallisen
Kras
alleeli [22]. Valitsimme KC malli, koska aktivointiin endogeenistä onkogeenisten (G12D)
Kras
kehittyvissä haima näiden hiirten tulosten kehittämisessä ennalta invasiivisen haiman intraepiteliaalisia neoplasioihin (PanINs) että edistyminen alhaisella taajuudella PDAC läpi useita histologisia muutoksia, jotka muistuttavat nähdään ihmisen potilailla [5]. Kohorteissa 12
HRAS
+ /+
ja
HRAS
– /-
KC hiiret luotu ja sitten lopetettiin klo 36 viikkoa ikäisiä, aika, jolloin kirjo Panin vauriot havaitaan helposti [5]. H E värjäys haiman ilmeni, Frank menetys normaalin kudoksen ja laajentaminen Panin vaurioista
HRAS
– /-
KC hiirillä (kuvio 1A). N määrän normaalin asinussolujen kudosta paljasti, että
HRAS
+ /+
KC hiirillä oli keskimäärin 14,5% normaalia kudosta /kenttä, kun taas
HRAS
– /-
KC hiirillä oli 2,9%, huomattavasti pienempään lähes 5-kertaiseksi
HRAS
– /-
KC hiirillä (kuvio 1B). Vaikutus oli selvää, kun prosenttiosuus osien puuttuu normaali acinar Kudos määrällisesti. 5% Osastoluettelo
HRAS
+ /+
KC hiirillä puuttui normaali acinar kudoksessa tämä arvo oli 55,1% vuonna
HRAS
– /-
KC hiirillä, mikä on yli 11-kertaiseksi
HRAS
– /-
KC hiirillä (kuvio 1 C). Patologinen luokittelu 2146 haiman lohkoa päässä
HRAS
+ /+
KC hiirillä ja 1419 lohkoa päässä
HRAS
– /-
KC hiirillä 27,4% vähemmän lohkoa ilman vaurioita ja 30% enemmän lohkoa korkealaatuisinta olento Panin 1A
HRAS
– /-
KC hiirillä (kuvio 1 D). Täten villityypin
HRAS
estää kasvaimia aktiivisuutta onkogeenisten
Kras
aikana haiman tuumorigeneesin.
(A) edustaja H E värjätyt leikkeet (nuolenpäitä: normaali basaalisoluissa), (B) määrällinen% koko tavanomaisen acinar ala jäljellä per kenttä (at 4x suurennos, 4-5 kentät 12 hiirtä, bar: keskiarvo ± SEM), (C)% aloilla (4x suurennus) ilman normaalia basaalisoluissa kudosta (perustuu tietoihin B), ja (D)% lobules osoitetuilla korkein arvosana vaurio (NML: normaali, 1A: Panin-1A, 1B: Panin-1B, bar : keskiarvo ± SEM) haimasta eristetyt
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
KC hiiret 9 kuukauden iässä. (E) Kaplan-Meier käyrä
HRAS
+ /+
(n = 45) verrattuna
HRAS
– /-
(n = 23) KPC hiirillä. ns: ei merkittävää. * P 0,05. *** P 0,0001.
Laskua selviytyminen ilman villityypin
HRAS
On totta, että edellä lähestymistapa ei määrittää vaikutus
HRAS
tappio yleisesti diagnosoitu vaiheessa PDAC [23] tai eloonjäämiseen, kaikkein kliinisesti merkittäviä päätepiste. Voittaa nämä puutteet, me syntyy
HRAS
+ /+
ja
HRAS
– /-
hiiret
K
ras
LSL-G12D/+
;Tr
p
53
LSL-R172H/+
;Pdx-1-
C
re
tg/+
[KPC] asetus [24]. Nämä hiiret perustuvat KC geneettinen tausta, mutta sisältävät lisäksi indusoituvan vallitsevasti negatiivisia
Trp53
R172H
alleeli, joka edistää PDAC, että patologisesti muistuttaa ihmisen tautia [24]. Kohorteissa 45
HRAS
+ /+
ja 23
HRAS
– /-
KPC hiiriä tuotetaan ja seurata säännöllisesti . Hiiret lopetettiin saavuttaessaan inhimillinen kuoleman lähestyminen päätepisteitä määrittää niiden elinikää. Tämä analyysi paljasti, että mediaani hengissä
HRAS
+ /+
KPC hiirillä oli 183 päivää, mutta 141 päivää vuonna
HRAS
– /-
KPC hiirillä, joilla vähennetään merkittävästi lähes neljäsosa
HRAS
– /-
KPC hiirillä (kuvio 1 E). Siten menetys villityypin
HRAS
paitsi voimistaa alussa kasvaimia synnyttävän
Kras-
ajettu haiman kasvainten synnyssä, vaan liittyy myös vähenemiseen elinikä hiirillä kehittämisessä PDAC.
Lisääntynyt määrä ihon syyliä puuttuessa villityypin
HRAS
lisäksi Panin vaurioita, KC hiiret ovat alttiimpia iho papillomas kasvoihin ja emättimen kudosten vuoksi Cre ilmaisun by
Pdx-1
näissä kudoksissa [5, 25-27]. Kehittäminen syyliä samassa KC hiiret tarjoaa hyvin ohjattu järjestelmä arvioida rooli villityypin HRAS toisessa itsenäisen kudostyyppi [25]. Tätä varten me seurataan määrä kasvojen syyliä kehittää kohortit 24
HRAS
+ /+
ja 27
HRAS
– /-
KC hiirillä. Silmämääräinen tarkastus paljasti selvä lisääntyminen kasvojen vaurioiden (kuvio 2A) papilloomaviruksen patologian (kuvio 2B) in
HRAS
– /-
KC hiirillä. Kvantifiointi paljasti, että oli keskimäärin 0,7 kasvojen syyliä /hiiri
HRAS
+ /+
KC kohortissa, mutta 2,5
HRAS
– /-
KC kohortti, merkittävää lisäystä lähes 4-kertaiseksi
HRAS
– /-
KC hiirillä (kuvio 2C). Lisäksi, vaikka vain noin puolet
HRAS
+ /+
KC hiirille kehittyi papilloomaviruksen jonka tutkimuksen päättyessä, kaikki
HRAS
– /-
KC hiirille kehittyi ainakin yhden papilloomavirus (kuvio 2D). PCR-DNA: ta osajoukko näistä syyliä paljasti odotetun rekombinaation
LSL-Kras
G12D
alleelin (S1 kuvio). Ehkä kuvaavin, keskimääräinen aika, jolloin nämä leesiot ensiesiintyminen
HRAS
+ /+
KPC hiirillä oli 123 päivää, mutta 80,5 päivää vuonna
HRAS
– /-
KPC hiirillä, merkittävää vähenemistä 42,5 päivää
HRAS
– /-
KPC hiirillä (kuvio 2D). Samoin vulvar papillomas myös esiintynyt keskimäärin 8 päivää aikaisemmin
HRAS
– /-
KPC hiirillä (kuvio 2E). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että menetys HRAS edistää onkogeenisten Kras perustuva ihon kasvainten synnyssä, potentiaalisesti hyvin varhaisessa vaiheessa, kuten aloittamista.
(A) edustaja valokuva (valkoinen nuoli) ja (B) H E värjättyä osa kasvojen syyliä, jotka kehittyvät KC hiirillä. (C) määrä kasvojen syyliä kohden
HRAS
+ /+
(n = 31) verrattuna
HRAS
– /-
(n = 28) KC hiiret (bar: keskiarvo ± SEM). (D)% koko
HRAS
+ /+
ja
HRAS
– /-
KC hiiriä (C: ltä ) että kehitetty kasvojen papillomas. (E)% kasvojen papilloomavirus elinaika on
HRAS
+ /+
(n = 45) verrattuna
HRAS
– /-
(n = 23) KPC hiirillä. (F)% vulvan papilloomavirus elinaika on
HRAS
+ /+
(n = 19) verrattuna
HRAS
– /-
(n = 11) naispuolinen KPC hiirillä. *** P 0,0001.
Menetys villityypin
HRAS
vaikuttaa aikaisin haiman kasvainten synnyssä
Edellä havainnot osoittavat kohti
HRAS
null tausta vaikuttaa alkuvaiheessa kasvaimen, kuten aloittamista. Sen arvioimiseksi, onko tämä voi selittää havaitun kasvua haiman vaurioista KC hiirillä ja vähentää elinikä KPC hiiriin menetys villityypin
HRAS
, haiman tuumorigeneesin analysoitiin 8 viikon iässä, kun KC hiirillä tyypillisesti vähemmän ja alemman luokan vauriot [5]. H E värjäys haiman osien jälleen paljasti vähenemiseen normaalia kudosta ja laajentamiseen Panin vaurioista
HRAS
– /-
KC hiirillä (kuvio 3A). N määrän normaalin asinussolujen kudosta paljasti, että
HRAS
+ /+
KC hiirillä oli keskimäärin 94,6% normaalia kudosta /kenttä, kun taas
HRAS
– /-
KC hiirillä oli 75,9%, merkittävä väheneminen lähes 20% vuonna
HRAS
– /-
KC hiirillä (kuvio 3B ). Tämä vaikutus oli erityisen selvää, kun analyysi toistettiin kvantitoimalla osiot kaikki normaalit acinar kudosta jäljellä. 24%: n osiot
HRAS
+ /+
KC hiirillä tehty kaikki tavanomaiset rauhasrakkuloiden kudosta, verrattuna 4%
HRAS
– /-
KC hiirillä, vähennystä 6-kertaiseksi
HRAS
– /-
KC hiirillä (kuvio 3C). Patologinen luokittelu 1566 haiman lohkoa päässä
HRAS
+ /+
KC hiirillä ja 1544 haiman lohkoa päässä
HRAS
– /-
KC hiirillä 18,7% enemmän lohkoa ilman vaurioita ja suuntauksena Panin 1A solumuutoksia
HRAS
– /-
KC hiirillä (kuvio 3D). Mielenkiintoista, patologinen luokittelu paljasti myös merkittävän kasvun yli 2-kertainen määrä lobules kanssa asinussolujen-to-ductal metaplasiaa (ADM) kuin korkeimman asteen vaurio
HRAS
– /-
KC-hiiriä (kuvio 3D). ADM (
e
.
g
. Kuvio 3E) on yksi varhaisimmista muutoksia haimassa PDAC hiiri malleja, ja on ehdotettu olevan mahdollinen edeltäjä Panin vaurioiden [28, 29].
(A) edustaja H E värjättyä jakso (nuolenkärki: Panin leesio), (B) määrällinen% koko tavanomaisen acinar ala jäljellä per kenttä (at 4x suurennus, 5 kentät 10 hiirtä, bar: keskiarvo ± SEM), (C)% aloilla kaikilla tavallisilla acinar kudosta (B), ja (D)% lobules osoitetuilla korkein arvosana vaurio (NML: normaali, ADM: acinar-to-ductal metaplasiasta 1A: Panin-1A, bar: keskiarvo ± SEM) haimasta eristetyt
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
KC hiirillä 8 viikon iässä. (E) edustaja H E värjätään osa haimasta peräisin 8 viikon vanha KC hiiri (nuolenkärki: acinar-to-ductal metaplasiaa). (F)% lobules osoitetuilla korkein arvosana vaurio (NML: normaali, ADM: acinar-to-ductal metaplasiasta 1A: Panin-1A bar: keskiarvo ± SEM) haimasta eristetyt
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
KC hiirillä 4 viikon iässä. (G) edustaja haiman -osio 4 viikkoa vanha
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
KC hiiren immunovärjättiin soluja (DAPI, sininen) ja merkkiaineiden asinussolujen (amylaasi, punainen) ja ductal (CK-19, vihreä) solut korostamaan ADM vaurioita (co-värjäys, keltainen). (H) määrä amylaasin
+ /CK-19
+ positiivinen (ADM) solua kohti kentän (at 4x suurennus, (at 4x suurennus, 5 kentät 10 hiirtä) päässä haimasta eristetyt
HRAS
+ /+
versus
HRAS
– /-
KC hiirillä 4 viikon iässä (bar: keskiarvo ± SEM). * P 0,05. *** P 0,0001.
Koska kasvu alussa grade vauriot 8 viikkoa
HRAS
– /-
KC hiiret, selvitimme vaikutus
HRAS
null genotyypin 4 viikon iässä tyypillisesti on vain vähän tai ei lainkaan näyttöä haiman vaurioista KC hiirillä. patologinen luokittelu 867 lohkoa alkaen
HRAS
+ /+
KC hiirillä, odotetusti, lähes kaikki lohkoa (95,6%) puuttui vaurionhoito (kuvio 3F). Sitä vastoin kasvoi merkittävästi lähes 5-kertainen määrän lohkoa kanssa korkealaatuisinta ADM vaurioiden ja lähes 7-kertainen määrä lohkoa kanssa Panin 1A vaurioista
HRAS
– /-
KC hiirillä (kuvio 3F). Tätä eroa ei toisteta kulttuuriin, koska määrä ADM tapahtumia oli samankaltainen viljeltiin
HRAS
– /-
versus
HRAS
+ /+
asinussolut, kun
LSL-Kras
G12D
aktivoitiin Ad-Cre (ei esitetty). Olemme kuitenkin itsenäisesti ja sitä validoitu kasvu ADM vaurioita
in vivo
HRAS
– /-
KC hiiret kvantitoimalla solujen määrä co -staining varten immunoflourescent merkkiaineiden asinussolujen (amylaasi) ja ductal (CK-19) soluista (kuvio 3G). Kvantifiointi paljasti keskimäärin 4,7 amylaasi /CK-19 co-värjäys haiman vaurioita /kenttä
HRAS
+ /+
KC hiirillä, mutta 6,6
HRAS
– /-
KC hiirillä, merkittävä kasvu
HRAS
– /-
KC hiirillä (kuvio 3H). Ei ollut eroja määrän Ki67 (merkki soluproliferaation), CC3 (merkki apoptoosin), SA-β-gal tai p16 (markkereita vanhenemisen) positiivisen-värjäys vaurioiden välillä
HRAS
+ /+
ja
HRAS
– /-
KC hiiriä (S2A-S2D kuvassa), mikä viittaa siihen, että ero opetetaan menetys HRAS oli jo tapahtunut, kun vauriot havaittiin. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että HRAS vaimentaa aikaisin haiman kasvainten synnyssä, kenties vaiheessa aloittamista.
Wild-type
HRAS
aktivoidaan PDAC
Villityypin Ras voidaan aktivoida läsnäollessa mutantti onkogeenisen alleeli syöpäsolulinjoissa [8-10, 19]. Haimakudoksessa 8 viikon iässä, kun on muutamia PANIN vaurioita
HRAS
+ /+
KC-hiiriä (kuvio 3A ja 3B), HRAS ei havaittu merkittävää tasot (ei esitetty). Arvioidaan tilan HRAS myöhemmissä vaiheissa taudin, PDAC solulinjat perustettiin kolmesta eri
HRAS
+ /+
ja
HRAS
– /-
KPC hiirillä. GTP: hen sitoutuneen HRAS Sitten affiniteetti otettuja Raf-RBD seurasi immunoblottaus, jossa on anti-HRAS-vasta-aineen havaitsemiseksi proteiinia. Kaikissa kolmessa
HRAS
+ /+
KPC solulinjat, HRAS-GTP otettiin talteen. Sitä vastoin, tämä allas aktiivisen HRAS oli täysin poissa, että PDAC kasvainsoluissa, jotka ovat peräisin kolmesta
HRAS
– /-
KPC hiirissä (kuvio 4A). Lisäksi tämä pooli aktiivisen Ras palautui upon uudelleen ilmentävät villityyppistä HRAS kahdessa
HRAS
– /-
KPC solulinjoissa varhaisessa passage (kuvio 4B), vaikka tämä vaikutus katosi, kun solut siirrostettiin (ei esitetty). Siten menetys HRAS poistaa altaan aktiivisen Ras haiman syöpäsoluja.
immunoblottianalyysi HRAS ja HRAS-GTP in PDAC johdetut solulinjat (A)
HRAS
– /-
(solulinjat 1-3) ja
HRAS
+ /+
(solulinjat 4-6) KPC hiiriä tai (B) PDAC solu linjat 1 ja 3, jotka ovat peräisin
HRAS
– /-
KPC hiirillä stabiilisti infektoitu retroviruksella, joka koodaa ei-siirtogeenin (vektori, V), tai villityypin HRAS (H). Tubulin toimii latauskontrollina. (C) edustaja H Trp53
LSL-R172H/LSL-R172H
;Pdx-1-Cre
tg/+
(KPPC) tausta lopetettiin tiettyyn aikaan pisteen 14 päivän ikäisiä, ja määrä normaalin asinussolujen kudoksen jäljellä haimassa arvioitiin (kuvio 4C). Kvantifiointi H E värjättiin haiman osien ei paljastanut mitään merkittävää eroa määrä normaalin kudoksen jäljellä kahden ryhminä (kuvio 4D). Kohorteissa 20
HRAS
+ /+
ja 11
HRAS
– /-
KPPC hiiriä myös annettiin vanheta kunnes kuoleman lähestyminen päätepisteitä, paljastaen lähes identtinen mediaanielossaolosta 50 ja 47,5 päivää, vastaavasti (kuvio 4E).