Krooninen sairaus

tiivistelmä

Noin 50% potilaista, joilla ensisijainen kolorektaalisyöpää kehittää maksametastaaseja. Ymmärtäminen geneettiset erot ensisijaisen paksusuolensyöpä ja niiden etäpesäkkeiden maksaan on välttämätöntä suunnitella paremmin terapeuttinen lähestymistapa tähän tautiin. Suoritimme koko exome sekvensointi ja kopioluvun analyysi 15 kolmoset kukin käsittää normaali peräsuolen kudokseen, ensisijainen kolorektaalikarsinooma, ja sen synkroninen Hyväksytty maksan etäpesäke. Analysoimme yhtäläisyyksiä ja eroja ensisijaisen kolorektaalisyöpää ja Hyväksytty maksametastaaseista Suhteen somaattisten mutaatioiden ja somaattisten kopioluku alterationss. Genominen profilointi osoitettu mutaatioita APC (73%), KRAS (33%), ARID1A ja PIK3CA (6,7%) geenien välissä ensisijaisen peräsuolen ja metastaattinen maksan kasvaimet.

TP53

mutaatio havaittiin 47% perusnäytteelle ja 67% maksan metastasoituneen näytteissä. Ryhmitetty pareittain in hierarkkinen klusterointi osoitti samanlaista somaattisten kopioluvun muutos malleja, toisin kuin ungrouped paria. Monet mutaatiot (mukaan lukien tunnettujen keskeisten syövän kuljettaja geenit) jaettiin vuonna ryhmitelty pareittain. Ungrouped paria näytteille erillisiä mutaatiota kuvioita ilman jaetun mutaatioita avaintekijä geenejä. Neljä ungrouped maksa etäpesäke näytteillä oli mutaatioita DNA mismatch korjaus geenejä yhdessä hypermutaatiot ja huomattava määrä kopioluvun muutoksia. Tuloksemme viittaavat siihen, että noin puolet metastasoitunutta kolorektaalisyöpää oli sama kloonialkuperää niiden ensisijaisen peräsuolen karsinoomat, kun taas loput tapaukset olivat geneettisesti erillään niiden ensisijainen karsinoomat. Nämä havainnot korostavat tarvetta arvioida etäpesäkeleesioita erikseen optimoitu hoitoa, sen sijaan tehdä päätelmiä primaarikasvaimen tiedot.

Citation: Lee SY, Haq F, Kim D, Jun C, Jo HJ, Ahn SM, et al. (2014) Comparative Perimän analyysi Ensisijainen ja Synchronous Metastaattinen kolorektaalisyövissä. PLoS ONE 9 (3): e90459. doi: 10,1371 /journal.pone.0090459

Editor: Harriet Wikman, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Saksa

vastaanotettu: 30 syyskuu 2013; Hyväksytty: 30 tammikuu 2014; Julkaistu 5 maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama tiede, ICT Tulevaisuuden suunnittelu (nro 2012R1A1A1013369). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syntymässä käsite Polyklonaalisuuden yhä tärkeämmäksi syöpäbiologian [1]. Monoklonaalinen kehitys kasvaimen yhdestä syöpäsolu on tutkittu laajasti, ja on yleisesti katsotaan aiheuttavan selektiivistä kloonilaajenemisen määräävän kasvaimen klooneja. Viime aikoina, vaihtoehtoinen käsite polyklonaalisten kehitys on syntynyt. Tämä malli koostuu kahdesta keskeisiä käsitteitä: itse kylvö hypoteesi ja mutaattorikannasta fenotyypin mallia. Entinen ehdottaa, että kasvain kloonit poistua ensisijainen sivusto, anna verenkiertoon kautta verisuonien, ja asuttaa kaukainen sivuston, luoden näin uuden alapopulaatio [2], [3]. Mutaattorikannasta fenotyyppi malli ehdottaa joitakin erittäin monipuolinen kasvaimen solukloonien (polyklonaaliset) sijasta muutamia kilpailevia klonaalinen kannan osiin; Itse asiassa, useita kiinteä kasvain tyypit, mukaan lukien paksusuolen syöpä, on ehdotettu olevan erittäin polyklonaalinen [4].

tunnistaminen alkuperä syöpä on keskeinen ymmärtää geneettisiä tapahtumia osallistuu kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen [5] . Kuten primaarisyöpien, etäpesäkkeitä voi myös olla joko yksi- tai polyklonaalinen alkuperästä [6], [7]. Yleensä etäpesäkkeitä kuljettaa samanlaisia ​​mutaatioita kuin ensisijainen syövät, josta ne ovat peräisin, mutta ylimääräisiä mutaatioita esiintyy transformaation jälkeen [6], [8]. Jatkuva, ja usein kiihtyvä esiintymistiheys mutaatioiden johtaa geneettisen heterogeenisyyden välillä ensisijainen ja metastaattinen syövät; Tämä enimmäkseen kasvattaa vastustuskykyä hoidon jälkimmäisessä, joka on vallitseva syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [6], [9].

kolorektaalisyöpää (CRC) on kolmanneksi yleisin maligniteetti ja toiseksi johtava syy syöpäkuolemista monissa maissa [10], [11]. Lähes 50% CRC potilaista kehittyy peräsuolen maksan etäpesäke (CLM) [12]. Ilman hoitoa potilaille, joilla CLMs on mediaanielossaolosta vain 5-10 kuukautta, jossa on alle 0,5% elossa 5 vuoden kuluttua [13]. Useat tutkimukset ovat käsitelleet kloonialkuperää ja geneettinen heterogeenisyys CRC [14], [15]. Mitään selvää päästy yksimielisyyteen tästä niin, vaikka yksi raportissa todetaan, että kasvaimia pääasiassa peräisin yhdestä kloonista [15], tuloksia muiden tutkimusten ehdotti, että suurin osa kasvaimista on polyklonaalinen alkuperä [16], [17]. Äskettäin koko Genomikartoituksen Hyväksytty primaarinen ja metastaattinen raajojen melanooma on myös paljastanut huomattavia geneettisiä heterogeenisyys välillä ensisijainen ja etäpesäkkeitä, mistä on osoituksena

de novo

, ei-synonyymi yhden nukleotidin variaatio [18]. Haimasyöpä etäpesäkkeitä on myös sekvensoitu arvioida klonaalisia suhteita ensisijainen ja metastaattinen syövät, mikä tunnistaminen klonaalisia populaatioita, joka johti etäispesäkkeitä [19], [20]. Siksi on tärkeää ymmärtää eri käsitteet alkuperään liittyviä syövän ja geneettisen heterogeenisyyden välillä primaarikasvaimen ja sen etäispesäkkeitä kehittää tehokkaita terapeuttisia strategioita [21], [22].

Jotta voidaan arvioida Polyklonaalisuuden ja geneettinen heterogeenisyys CRC, arvioimme geneettinen ja klonaalisen suhde ensisijaisen CRC ja niiden yhteensovitettujen CLMs suorittamalla kohdennettuja exome sekvensointi ja korkean resoluution kopioluvun vaihtelu (SCNA) analyysi 15 kolmoset normaalin peräsuolen kudokseen, ensisijainen CRC, ja Hyväksytty CLM näytteet. Tuloksemme antavat arvokasta oivalluksia klonaalinen suhteeseen ja geneettisiä eroja ensisijaisen CRC ja niiden yhteensovitettujen CLMs, ja näin ollen auttaa määrittelemään potentiaalisia systeemisiä hoitoja.

Tulokset

Patient kohortti kuvaus

potilaiden mediaani-ikä tutkimuksessa oli 61 (taulukko 1). Kohortti sisältyy 1 T2 vaiheessa 10 T3 vaiheessa, ja 4 T4 CRC kasvaimet, jotka kaikki ovat ensisijainen resektio yksilöitä. Kuudella potilaalla oli yksi maksan etäpesäkkeiden taas 9 potilaalla oli kaksi tai useampia maksametastaaseja osoitteessa resektio. Kliiniset ja histo-patologinen tietoa kohortin asetettu käytettiin tutkimuksessa esitetään taulukossa 1.

SCNA analyysi

Me tehdään SCNA analyysi 15. kolmoset normaalin peräsuolen kudokseen, CRC ja CLM näytteitä. Käyttämällä pariksi analyysi (ts normaali peräsuolen kudokseen verrattuna CRC tai normaali peräsuolen kudokseen vs. CLM), olemme määritelleet somaattisten SCNAs joko CRC tai CLM näytteet (taulukko 2 ja kuvio S1). CRC ja CLM paria 11 potilailla esiintyi saman verran SCNAs (taulukko 2); kuitenkin, loput 4 paria (# 250, # 262, # 526 ja # 721) osoitti huomattavaa lisäystä kokonaismäärää SCNAs että CLM näytteissä, joihin osallistuu homotsygoottinen kopio menetys ja Heterotsygotian menetys (LOH) (taulukko 2).

suoritetaan ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi somaattisen SCNA tiedot 15 paria CRC ja CLM näytteitä, jotta voidaan arvioida geneettisen monimuotoisuuden välillä ensisijainen ja metastaattinen CRC. Valvomaton hierarkkinen klusterointi SCNA tietoja on käytetty aiemmin määrittämiseen geneettisiä suhteita ensisijainen ja metastaattinen syövät [23]. Esillä analyysi perustui oletukseen, että geneettisesti samankaltaisia ​​CRC ja niiden yhteensovitettujen CLMs tullaan läheinen hierarkkinen klusterointi. Viisikymmentäkolme prosenttia (8 15) ensisijaisen CRC olivat läheisesti niiden Hyväksytty CLMs, mikä osoittaa klonaalinen ja geneettinen samankaltaisuus näillä CRC-CLM paria. Loput 47% (7 15) CRC-CLM paria olivat vain kaukaista sukua, mikä viittaa siihen, selvä geneettinen suhteita näiden CRC ja niiden yhteensovitettujen CLMs (kuvio 1).

8 CRC-CLM paria (53 %), jokaisen parin läheisimmin liittyvien hierarkkisessa puussa (punainen); 7 CRC-CLM parit (47%), jokainen pari kaukaista liittyvät, mikä osoittaa, että ensisijainen CRC ja niiden yhteensovitettujen CLMs on erilaiset geneettiset ominaisuudet (sininen). Somaattiset mutaatiot syöpään liittyvien geenien mainittiin myös.

Huomattavaa. SCNA kuviot 8 läheisesti paria oli samanlainen kun taas 7 kaukaista sukua CRC-CLM parit erosivat (kuva S2). Olemme myös lasketaan ja verrattiin keskimääräinen lukumäärä yhden kopion voittoja, yksi kappale tappiot, korkea kopio voitot, homotsygoottinen tappiot ja LOH välillä ryhmitelty ja ungrouped CRC-CLM parit (kuva S3). Perusteellinen vertailu hierarkkinen klusterointi ja geneettisiä yhtäläisyyksiä on kuvattu seuraavassa osassa tuloksista.

Exome sekvensointi

Me tehdään koko exome sekvensointi 15. kolmoset normaalin peräsuolen kudokseen, CRC, ja CLM näytteet . Käyttämällä PCR-pohjainen microsatellite määrityksessä, me vahvisti, että kaikki 15 ensisijaista CRC näytteet Mikrosatelliittimarkkerien vakaa. Mutaatiot havaittiin ja suodatetaan mukaan meidän talon bioinformatiikan työnkulku (kuva S4). Kaikkiaan 1079 ja 4366 mutaatioita tunnistettiin CRC ja CLM näytteet, vastaavasti (taulukko S1). Mutaatio spektrit havaittu CRC ja CLM näytteet olivat yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen kiinteitä kasvaimia ja eivät eronneet merkittävästi välillä CRC ja CLM näytettä (kuva S5) [24].

Hypermutaatio ja SCNA

neljä CLM näytettä (# 250, # 262, # 525 ja # 721) on hypermutated (taulukko S2). Jotta voitaisiin tunnistaa syy hypermutaatioon, arvioimme mutaatioita DNA-polymeraasia geenit (POLN, POLL, POLQ, POLH, POLE, POLD1 ja POLG) ja DNA mismatch korjaus reitin geenit mukaan lukien

MLH1

,

MLH3

,

MSH2

,

MSH6

,

PMS2

,

PMS6

,

ERCC2

,

ERCC5

,

ERCC6

,

MUTYH

,

RAD9A

,

EXO1

,

SLX4

,

ATR

, ja

BLM

. Tuloksista ilmeni, että vain neljä hypermutated CLM näytettä (# 250, # 262, # 526 ja # 721) oli yksi tai useampi missensemutaatioita DNA polymeraasi geenejä ja DNA mismatch korjaus geenejä (taulukko S3). Nämä neljä hypermutated näytettä osoitti myös suurta SCNAs verrattuna niiden Hyväksytty ensisijaisen CRC (taulukko 2), ja se oli erityisen huomionarvoista, että hypermutaatiolle oli merkitsevästi yhteydessä tiheä LOH (

P

= 2,782 x 10

-9) (kuva 2).

näytteitä, joiden hypermutaatiolle sisältävät myös korkea LOH taajuus (P-arvo = 2.782e-09).

Somaattiset mutaatiot profiilit ja merkittävästi muuttuneen väyliä

Havaitsimme, että 2224-geenit oli vähintään 1 non-synonyymejä, liittämiseen tai lukukehyksen sisään CRC: t tai CLMs (taulukko S5). Näitä tietoja käytetään sitten tutkia mutaation aseman suurten signalointireittien muuttaa CRC (eli ne, keskitetty P53, Wnt, TGF-beta, ja VEGF), vertaamalla taajuuksia, jotka liittyvät geenit näiden reittien mutatoitiin (kuvio 3). Tämä osoitti, että

APC

oli mutatoitunut 73% sekä CRC ja CLM näytteitä,

TP53

47% CRC näytteistä ja 67% CLM näytteiden, ja

KRAS

33% sekä CRC ja CLM näytteitä.

Smad4

,

FAT4

, ja

BRAF

myös mutatoitu CRC ja CLM näytteitä vaihtelevalla taajuuksilla. Vuonna VEGF signalointireitin, löysimme mutaatiot

KDR

(0% ja 27%),

FLT1

(7% ja 7%), ja

FLT4

( 0% ja 7%) geenien CRC: t ja CLMs, vastaavasti (kuvio 3). Mutaatiot VEGF-reitin geenit lähinnä rajoittuu CLM näytteitä, silmiinpistävin esimerkki, joka on

KDR

geeni, joka oli vasta mutatoitunut siinä hypermutated CLM näytteet (taulukko 3).

arvioiminen geneettisiä suhteita pohjalta mutaatioiden ja SCNA

arvioimiseksi geneettisiä suhteita 15 paria CRC ja CLM näytteitä, arvioimme, onko sama genotyyppimuutoksia ja mutaatioita suurten syöpä kuljettaja geenejä esiintyi kussakin parissa. Tämä arviointi perustuu oletukseen, että CRC ja CLM paria samanlaisia ​​geneettisiä muutoksia ovat todennäköisesti jakaa mutaatioita merkittävä tekijä geenejä. Kahdeksassa tapauksessa, CRC-CLM pari teki todellakin osuus mutaatioita keskeisten CRC liittyvien geenien (

APC

,

KRAS

,

TP53

,

Smad4

,

BRAF

, ja

FAT4

) (taulukko S4). Näiden parien, ei havaittu merkittävää eroa määrä mutaatioita CRC ja CLM näytteet (

P

= 0,28) (taulukko 4). Sitä vastoin loput seitsemän tapausta, mikään CRC-CLM paria jakoi mutaatio keskeisten CRC liittyvien geenien; kuitenkin, kokonaismäärä mutaatioita erosivat toisistaan ​​merkittävästi CRC ja CLM näytteet (

P

0,05) (taulukko 4 ja taulukko S4).

Mikä tärkeintä, konkordanssin analyysi mutaatio data sovitetaan yhteen SCNA tietojen analysointi. Kaikki CRC-CLM paria, jotka liittyvät läheisesti siinä ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi SCNA tietojen jaetun mutaatiot avaimen CRC liittyvien geenien (53%). Kuitenkin seitsemän CRC-CLM pareja, jotka vain etäisesti liittyvät hierarkkisessa ryhmittely SCNA tietojen ei jaa mutaatio keskeisten CRC liittyvien geenien (47%).

Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että 53%: ssa tapauksista, kukin CRC-CLM pari oli samankaltaiset geneettiset muutokset, kun taas jäljellä 47% tapauksista oli selvä geneettiset muutokset.

keskustelu

vertaamalla SCNA data ja mutaatio profiilit 15 pariksi CRC ja CLM näytteitä, huomasimme, että noin puolet niistä, osoittivat geneettinen heterogeenisyys suhteessa niiden vastaavan ensisijaisen CRC. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen kattava tutkimus käyttää genomista profilointiin ensisijaisen CRC ja niiden yhteensovitettujen etäpesäkkeitä ja määritellä erilliset piirteet etäpesäkeleesioita mitattuna niiden mutaation ja SCNA profiileja.

Viisikymmentä -kolme prosenttia CRC-CLM paria klusteroitu ryhmässä jakoivat suuri määrä mutaatioita, joista osa on

APC

,

KRAS

,

TP53

, ja

Smad4

geenejä (taulukko 4, kuvio 1). Läsnä monia yhteisiä mutaatioiden (30-65%) osoitti, että somaattiset mutaatiot voivat kertyä microenvironment primaarisen syövän ennen levittämistä niiden metastaasien, jotain jota kutsutaan yleisesti lineaarisen etenemisen malli kasvaimen kehittyminen [22]. Loput 47% CRC-CLM paria, jotka on ryhmitelty toisistaan ​​riippumatta, osoittivat merkittäviä eroja niiden mutaatio profiilit ja SCNA tietoja. Heillä ei ollut yhteisiä mutaatioita syövän aloittamista geenejä eikä merkittäviä eroja SCNA profiileja (kuvio 1). Erillinen suhde ja näkyvästi geneettinen heterogeenisyys näiden parien osoittavat, että CLMs saattavat olla peräisin ryhmä geneettisesti erilaista ensisijainen CRC kloonien vuorovaikutuksessa lähellä polyklonaalisilla mallin syövän etenemisen.

Kuusi CRC-CLM pareja oli somaattisia KRAS mutaatioita vähintään yksi näyte. Kolme paria oli sama KRAS mutaatiot, ja kolme muuta ei. Siksi diskordanssi- määrä KRAS mutaation välillä CRC-CLM pareja oli 50% (3/6) (kuvio 1 ja taulukko S4). Knijn ja työtovereiden [25] raportoitu korkea konkordanssin nopeudella KRAS mutaatioiden välillä ensisijaisen CRC ja CLM kasvaimia. Sen sijaan joukko tutkimuksia ovat osoittaneet korkea ristiriita korko, välillä CRC-CLM paria, on KRAS mutaatiot vaihtelevat 8% -60% [26] – [28]. Tutkimuksessamme näiden kolmen CRC-CLM pareittain ristiriitainen KRAS-mutaatio asema myös ryhmittyneet selvästi mukaan SCNA analyysi. Eripuraisuus on KRAS-mutaation yhdessä erilliset SCNA klusterointi kuvioita, näiden CRC-CLM pareja tukee hypoteesia, että ensisijainen CRC ja niiden vastaavat CLMs voi olla eri klonaalinen alkuperä näistä näytteistä.

polyklonaalinen syövän etenemiseen malli voi auttaa suoraan hoitostrategioita [4]. Suurin puute monoklonaalinen kasvain alkuperä malli on oletus, että suurin osa alkuperäisen tapahtumia, jotka johtivat ensisijainen syövän myös löytyä metastasized soluissa, josta on näköala mahdollisuus, että pienet populaatiot syöpäsolujen erottuva geneettisiä ominaisuuksia lähellä toistensa suhteen voi olla vastuussa etäpesäkkeiden [4]. Kuten metastaattinen soluja, jotka ovat peräisin primaaristen kasvainten, voi olla eri hoitovasteen.

Hypermutaatio aiheuttama DNA: n menettämisen virhepariutumista korjaavan aktiivisuuden kutsutaan MSI [29]. Huomasimme, että neljä CLM näytteet olivat instable mikrosatelliittia, johtaen hypermutaatiot.

KDR

geeni, merkittävä prognostinen markkeri kolorektaalikarsinoomasta [30], mutatoitiin vain hypermutated näytteissä. On myös huomionarvoista, että oli olemassa ilmeinen suhde hypermutaatiolle ja kromosomi epävakautta. Äskettäin selvä kopiomäärä asema DNA mismatch korjaus geeni

MLH1

osoitettiin liittyvän kohonneita mutaation haimasyövän [31]. Aiemmat tutkimukset osoittivat ristiriitaisia ​​todisteita siitä MSI kasvainten ja kromosomi epävakautta kolorektaalisyövissä. Joissakin tutkimuksissa on raportoitu, että MSS kasvaimia osoittavat korkeampaa kromosomi epävakauden kuin MSI kasvainten [32] – [35]. Muut tutkimukset raportoitu merkittävät päällekkäisyydet MSI kasvainten ja kromosomi epävakautta [32], [35] – [38]. Huomattavaa on, että kaikki nämä tutkimukset tehtiin käyttämällä ensisijaista CRC näytteitä, ja suhde MSI ja kromosomin epävakautta CLM näytteiden vielä paljastettu. Olemme havainneet, että MSI kasvainten liittyy suuri määrä geenin deleetioita /monistukset ja useammin LOH, toisin sanoen, kromosomi-epävakaus CLM kasvaimia. Lisätutkimuksia tarvitaan paljastaa suhdetta MSI, kromosomin epävakaus ja etäpesäkkeiden ensisijaisen CRC.

Angiogeneesi säätelee pääasiassa vuorovaikutuksia verisuonten endoteelin kasvutekijöiden VEGF-reseptoreihin ja niillä on keskeinen rooli syövän kasvua ja etäpesäkkeiden [ ,,,0],39], [40]. Useat tutkimukset ovat raportoineet geneettistä polymorfismia KDR geenin syytetään riski sepelvaltimotauteja [41], [42]. Kuitenkin selkeä rooli yksittäisten KDR SNP ja niiden elintoimintojen syövän etenemisen ja ennusteen edelleen tuntematon. Nykyisessä tutkimuksessa kaikki potilaat KDR SNP: iden (eli rs187037 ja rs2305948) oli uusiutumisen jälkeen parantava resektio CRC ja maksan (p = 0,925; tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin, koska pieni otos KDR mutaatiota ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Suurempi määrä näytteitä tarvitaan validoimiseksi KDR mutaatio ja sen ominaisuuden osassa kasvaimen uusiutumisen.

keskimääräinen elinaika metastasoituneen CRC on lisääntynyt 6-8 kuukautta ja enintään 2 vuotta johtuen syntyminen hoitojen ja parannettu kirurginen orientointia. Kuitenkin terapeuttinen vaihtoehto vastaamattomien oksaliplatiinia tai irinotekaania kemoterapian kanssa tai ilman setuksimabin tai bevasitsumabin, on hyvin rajallinen. Siksi parempi hoitostrategioiden metastaattisen CRC on kehitettävä. Syntymässä todistusaineisto viittaa siihen, että ensisijainen CRC voi ilmetä polyklonaalinen luonne ja että tuloksena etäpesäkkeiden voisi siis olla geneettisesti erilainen kuin valtaosa primaarikasvaimen. Tällaisissa tapauksissa, biologian ja geneettinen profiili primaarikasvaimen voi olla huomattavasti erilainen kuin etäpesäkkeitä. Tämä olisi tärkeä huolenaihe kohdennettua, yksilöllistä hoitoa. Tuloksemme viittaavat siihen, että Mutaatioiden noin 50% metastasoituneen maksakasvaimien saattaa olla erilainen kuin primaarikasvaimen, mikä korostaa tarvetta arvioida metastaasien erikseen tunnistamiseksi potentiaalisia systeemistä hoitoa.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimuskanta

välisenä kesäkuuta 2009 ja kesäkuun 2011 53 potilaalle tehtiin parantava resektio CRC ja maksan etäpesäke at Gachon University Gil Hospital (Incheon, Etelä-Korea). Sisällyttämisperusteita tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: (1) maksan etäpesäke CRC vahvistettu kierre abdominopelvic tietokonetomografia; (2) maksa etäpesäke ensimmäisenä ilmentymänä M1 taudin ilman dokumentoitua laajalle levinneenä tautina, määritettynä preoperative kuvantaminen; (3) ei ole aiempaa neoadjuvant chemoradiation tai kemoterapia, kuten molekyyli kohdennettuja aineet; (4) parantava resektio suoritettiin sekä ensisijainen peräsuolen ja maksan vaurioita; (5) resektoitua näytteet tulisi olla synkroninen kasvaimia (samanaikainen resektio,

n

= 11, kaksivaiheinen resektio kuluessa 6 kuukausi,

n

= 4); ja (6) mikrosatelliittimerkkien vakaa ensisijainen CRC. Valitsimme 15 potilaalla, joilla CRC ja Hyväksytty maksa etäpesäke perustuu näihin kriteerit. Perusominaisuudet potilaiden on esitetty taulukossa 1. Kaikkien kasvainten arvostellut yksi patologi, ja ainoastaan ​​näytteeksi, joista 70% kasvain pitoisuus otettiin mukaan analyysiin. Tutkimuksessa protokollat ​​hyväksyi Institutional Review Board of Gachon University Gil Hospital (IRB hyväksyntänumero: GIRBA 2535). Kirjallinen suostumus vaadittiin kaikilta osapuolilta. Tiedot, kuten sukupuoli, ikä, kasvaimen vaiheessa eristettiin kliinisistä tietokannasta tälle kohortin.

PCR-pohjainen mikrosatelliittimerkkien määritys

joukko mikrosatelliittimarkkerin koostuvat kahdesta mononukleotidi toista markkereita ( BAT25 ja BAT26) ja kolme dinukleotidi toista markkereita (D2S123, D5S346, ja D17S250), suosittelemia National Cancer Institute Consensus Group, käytettiin määrittämään kasvaimen mikrosatelliittimerkki epävakaus (MSI) tila. Alikvootit, jotka sisälsivät 50 ng DNA: ta monistettiin 20 ul: reaktioseokset, jotka sisältävät 2 ui 10 x puskuria (Roche, Mannheim, Saksa), 1,7-2,5 mmol /l MgCl

2, 0,3 uM kutakin aluketta parin, 250 uM deoksinukleotiditrifosfaatteja ja 2,5 U DNA-polymeraasia (Roche, Mannheim, Saksa). PCR suoritettiin ensimmäinen denaturaatiovaihe 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 sykliä 1 min 94 ° C: ssa, 1 min 55 ° C: ssa, ja 1 min 72 ° C: ssa ja lopullinen laajennus vaihe 10 min 72 ° C: ssa. Näytteet analysoitiin ABI Prism 3100 Genetic Analyzer käyttäen 0,7 ui monistettua näytettä yhdistettynä 0,3 ui GeneScan 500 Size Standard ja 9 ui Hidi Formamidi mukaan valmistajan ohjeita (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Tiedot analysoitiin käyttäen ABI Prism 3100 Tiedonkeruu ohjelmisto (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

DNA: n eristämiseksi, kirjasto valmisteluun, ja kohdennettuja exome sekvensointi

DNA uutettiin käyttäen DNeasy veren Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA). DNA laatu tarkastettiin 1% agaroosigeelielektroforeesilla, ja DNA-pitoisuus mitattiin käyttämällä PicoGreen dsDNA Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). SureSelect sekvensointi kirjastot valmistettiin valmistajan ohjeiden (Agilent SureSelect Kaikki eksoni Kit 38 Mb, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) käyttäen Bravo automatisoitua nestekäsittelijää. Laatu monistettu kirjastojen varmistettiin kapillaarielektroforeesilla (Bioanalyzer; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), jonka jälkeen pariksi lopussa DNA-sekvenssit saatiin kirjastoista käyttäen Illumina HiSeq alustan (Illumina, San Diego, CA, USA).

bioinformatiikan analyysi

Jaksotiedot linjattu ihmisen viite genomin GRCh37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc/ihmisen /index.shtml) käyttäen Burrows-Wheeler Aligner [43] kanssa oletusparametrit. Me sekvensoitiin keskisyvyys 52.44X kohdennettua alueille. PCR kaksoiskappaleet poistettiin käyttäen Picard algoritmia (https://picard.sourceforge.net). Suoritimme Säätö ja laatu uudelleenkalibrointi varten sekvensoitiin dataa Genome Analysis Toolkit (GATK) [44]. Sen jälkeen kohdistus, käytimme Varscan [45], Strelka [46], ja Mutect [47] soittaa mutaatioita, kuten insertiot ja deleetiot (indeleitä), kunkin kromosomiasemassa ja käytetään myös GATK [44] Indel havaitsemiseksi 15 kolmikon yksilöitä joka koostuu normaalista peräsuolen kudokseen, ensisijainen CRC, ja Hyväksytty CLMs. Me selityksin mutaatiot käyttäen ANNOVAR [48] kanssa Ensembl Gene merkintä tietokantaan ihmisen genomin rakentaa 37 (https://www.ensembl.org/) ja etsitään otteluiden dbSNP137 (http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/projects/genome/assembly/grc/human/index.shtml), 1000 genomit data [49], ja COSMIC tietokanta [50]. Me suodattanut mutaatiot kohdealueilla ja valittujen ei-synonyymi synonyymi, voitto tai tappio lopetuskodonista, kehyksenvaihdon indeleitä, ei-kehyksenvaihdon indeleitä, ja liittämiseen mutaatiot.

SCNA analyysi

yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) joukko CytoScan ™ HD (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA) käytettiin. SCNA analyysi CytoScan ™ HD Array suoritettiin käyttäen BioDiscovery Nexus kopiomäärän 6,1 (https://www.biodiscovery.com/software/nexus-copy-number/) -ohjelmisto. SNP-Fast Adaptive States segmentointimenetelmää 2 segmentointialgoritmi käytettiin oletusparametrit.

Clustering

Täydellinen sidos hierarkkinen klusterointi suoritettiin arvioimaan välistä yhdenmukaisuutta ensisijaisen CRC ja CLM näytteitä. Keskimääräiset ja yksi sidos hierarkkinen klusterointi sovellettiin myös; kuitenkin, kaikki klusterointi menetelmät tulokset olivat samanlaiset. Parilliset

t

-testin ja kahden otoksen

t

-testi käytettiin tilastollisiin analyyseihin, ja

P

0,05 katsottiin osoittavan tilastollista merkittävyyttä.

data Link

Koko exome sekvenointitulosten: Sequence Nouda Archive (SRA) liittymistä numero on SRP034161.

Cytoscan array tiedot: GEO-hakunumero on GSE53799.

tukeminen tiedot

Kuva S1.

työnkulku kopioluvun vaihtelu (CNV) analyysi.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s001

(TIF) B Kuva S2.

SCNA kuviot CRC-CLM paria. Voitot ovat edustettuina sininen, tappioita punaisella ja LOH ruskea. 8/15 CRC-CLM ryhmitelty pareittain osoitti korkea samankaltaisuus SCNA kuvioita verrattuna muuhun 7/15 CRC-CLM ryhmittelemättömiä paria.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s002

(TIF)

Kuva S3.

keskiarvo SCNA taajuudet ryhmitelty ja ungrouped CRC-CLM paria. (A) Korkea kopio voitot, homotsygoottinen tappiot ja LOH ovat hyvin vaihtelevia ungrouped CRC-CLM paria. Korkea kopio voitot ryhmitelty CRC-CLM osoitti myös vaihtelua. (B) Yksi kopio tappioita ungrouped CRC-CLM paria osoittivat vaihtelua.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s003

(TIF) B Kuva S4.

työnkulku koko exome Sekvensointianalyysin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s004

(TIF) B Kuva S5.

mutaatio spektrit CRC ja CLMs. (A) mutaatio spektri CRC ja niiden yhteensovitettujen CLMs paitsi hypermutated näytteitä. (B) mutaatio spektri neljän hypermutated CLM näytettä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s005

(TIF) B Taulukko S1.

lukumäärä somaattisten mutaatioiden CRC ja CLMs.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s006

(DOCX) B Taulukko S2.

kokonaismäärä mutaatioita jokaisessa CRC-CLM paria.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s007

(DOCX) B Taulukko S3.

Mutaatiotutkimukset asema DNA mismatch korjaus koulutusjakson geenejä ja DNA-polymeraasin geenien CRC ja CLMs.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s008

(DOCX) B Taulukko S4.

Mutaatiotutkimukset vastaavuutta välillä CRC ja CLM paria. Kaikki liittyy läheisesti CRC-CLM paria hierarkkinen klusterointi jaetun mutaatioita avaimen CRC liittyviä geenejä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s009

(DOCX) B Taulukko S5.

mutaatiot ja mutatoitunut geenien CRC ja CLMs (taulukon palvelee excel-tiedostoja).

doi: 10,1371 /journal.pone.0090459.s010

(XLSX) B