Krooninen sairaus

tiivistelmä

medulloblastoomien ja glioblastomas yleisin ensisijainen aivokasvaimia lapsilla ja aikuisilla, vastaavasti, on erittäin vaikea käsitellä. Pyrkimykset tunnistaa uusia proteiineja olennaista kasvua näistä kasvaimista voivat auttaa edelleen ymmärrystä biologian näiden kasvainten sekä, tunnistaa tavoitteet tulevia hoitoja. Viimeaikainen tunnistaminen useiden transkriptiotekijän-keskeinen proteiini vuorovaikutuksen maisemien alkion kantasoluja on tunnistettu lukuisia tutkittu ilmiö proteiineja, jotka ovat välttämättömiä itseuudistumisen näiden kantasoluja. Tunnistamaan uusia proteiineja olennaista kohtalo aivojen kasvainsoluja, tutkimme proteiinien vuorovaikutusta verkon transkriptiotekijän, Sox2, on medulloblastoma soluissa. Tätä tarkoitusta varten, moniulotteinen Protein Identification Technology (vääntelehtien mutakuopassa) tunnistettu 280 Sox2 liittyviä proteiineja medulloblastoma solulinjassa Daoy. Alkaa ymmärtää roolit Sox2 liittyvien proteiinien aivosyövän keskityimme kaksi Sox2 liittyvien proteiinien, Musashi 2 (MSI2) ja Ubiquitin proteaasilla 9x (USP9X). Viimeaikaiset tutkimukset ovat osallisina MSI2, otaksutun RNA sitova proteiini, ja USP9X, joka on deubiquitinating entsyymi, useita syöpiä, mutta ei aivokasvaimet. Osoitamme, että knockdovvn MSI2 vähentää merkittävästi kasvua Daoy solujen sekä U87 ja U118 glioblastoomasoluista. Osoitamme myös, että knockdovvn USP9X vuonna Daoy, U87 ja U118 aivokasvaimen solut voimakkaasti vähentää niiden kasvua. Yhdessä tutkimuksemme tunnistaa suuri joukko Sox2 liittyvien proteiinien Daoy medulloblastoma soluissa ja tunnistaa kahden proteiinin, MSI2 ja USP9X, jotka edellyttävät lisätutkimuksia sen määrittämiseksi, ovatko ne mahdollisia terapeuttisia kohteita aivosyövän.

Citation: Cox JL, Wilder PJ, Gilmore JM, Wuebben EL, Washburn MP, Rizzino A (2013) Sox2-Interactome in Brain Syöpäsolut Tunnistaa vaatimus MSI2 ja USP9X kasvulle aivosyövän Cells. PLoS ONE 8 (5): e62857. doi: 10,1371 /journal.pone.0062857

Editor: Robert W. Sobol, University of Pittsburgh, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 joulukuu 2012; Hyväksytty: 26 maaliskuu 2013; Julkaistu: 7. 2013

Copyright: © 2013 Cox et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat avustusta Nebraska Department of Health (2011-29, 2012-33). EW tukivat osittain jota NCI koulutus avustus (CA009476). JMG ja MPW tukivat Stowers Institute for Medical Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Glioblastoomat (GB) ja medulloblastoomien (MB) ovat erittäin heikentävistä sairauksista, jotka ovat hyvin vaikea hoitaa. Huolimatta parantunut terapeuttinen järjestelmiä, joilla potilailla on diagnosoitu GB yleisin ensisijainen aikuisten aivokasvain, on mediaanielossaolosta 10-14kuukausi [1]. Potilaiden hoito MB, yleisimmät lapsipotilailla aivosyöpä, aiheuttaa lisäongelmia. Nykyinen hoitomuotojen MB aiheuttaa dramaattisia heikentynyt kognitiivisten toimintojen ja altistaa potilaat tulevaisuuden hoitoon liittyviä kasvaimet [2]. Näin ollen on olemassa pakottava tarve tunnistaa uusia proteiineja ja signalointireittejä, jotka voivat toimia uusia tavoitteita hoito on kehittynyt GB ja MB. Merkitystä on kuvattu tässä tutkimuksessa kohonneet transkriptiotekijän Sox2, joka pelaa kriittinen rooli kehittämiseen hermoston, on osoitettu korreloivan huonon kliinisen tuloksen aivokasvain potilaiden [3]. Kriittinen rooli Sox2 vuonna aivokasvainten tukee havainto, että knockdovvn Sox2 RNA interferenssin pienentää

in vitro

ja

in vivo

kasvun GB solujen [4]. Lisäksi Sox2 ilmentyy MB soluissa [3] ja viime aikoina olemme selvittäneet, että knockdovvn Sox2 vuonna Daoy MB soluissa vähentää niiden lisääntymistä (Cox ja Rizzino, julkaisemattomat tulokset).

aikana viimeisten 10 vuoden aikana , huomattavia ponnistuksia on omistettu ymmärtämään mekanismeja, joilla olennaisia ​​transkriptiotekijät välittävät niiden vaikutuksia. Viime aikoina huomattavia edistysaskelia on tehty kohti kartoitus proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen maisemien olennaisten transkriptiotekijöiden useissa solukkojärjestelmissä. Esimerkiksi laaja on edistytty määritettäessä proteomiin transkriptiotekijöitä, erityisesti Sox2, Oct4 ja Nanog, ylläpitämiseen tarvittavat itseuudistumisen ja pluripotenttisuuden alkion kantasolujen (ESC) [5] – [11]. Integrointi interactomes varten Sox2, Oct4 ja Nanog, väittää, että nämä pluripotenttisuus liittyvä transkriptiotekijät ovat osa pitkälle integroitu proteiini-proteiini vuorovaikutus maiseman, joka sisältää monia muita transkriptiotekijöitä, kromatiinin remodeling koneet, DNA kuntoutuskoneet ja RNA sitovia proteiineja [9 ], [11] – [13]. Lisäksi puolueeton proteomic näytöt tunnistaa proteiinit, jotka liittävät Sox2 hiiren ESC ovat osoittautuneet tehokas lähestymistapa tunnistaa alle tutkittu proteiineja, kuten Banf1 ja Musashi2 (MSI2), joka vaikuttaa merkittävästi kohtalo ESC [11] – [ ,,,0],15]. Koska Sox2 kumppaniaan monipuolista tärkeitä proteiineja, on todennäköistä, että proteomiikka analyysi Sox2-interactome aivojen kasvainsoluissa voisi auttaa tunnistamaan uusia proteiineja, jotka vaikuttavat kasvun näiden kasvaimia.

parannetaan ymmärrystä aivokasvainten, työ on raportoitu tässä tutkimuksessa esitetyt käsitellä kahta kysymystä. Mikä on koostumus Sox2-interactome että MB kasvaimen solulinja Daoy? Voiko proteomic näytöllä Sox2 liittyvien proteiinien auttaa tunnistamaan uusia proteiineja, joita tarvitaan aivojen kasvainsoluja? Me raportoimme että Sox2 assosioituu 280 proteiineja Daoy soluissa. Lisäksi osoitamme, että kaksi Sox2 liittyvien proteiinien, MSI2 ja Ubiquitin Specific Peptidaasistabiloidut 9x (USP9X), joita on viime aikoina liitetty kasvua muiden syöpien [16] – [21], joita vaaditaan tukemaan kasvua ja selviytymistä Daoy solut ja kaksi GB kasvainsolulinjoja, U87 ja U118.

Kokeelliset menetelmät

Cell Culture

Daoy (HTB-186, ATCC, Manassas, VA), i- Sox2-Daoy, U87 (HTB-14, ATCC), U118 (HTB-15, ATCC) ja HEK293T (CRL-11268, ATCC) viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [22]. Lentivirus- partikkeleita tuotettiin, ja solut infektoitiin, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Solujen kasvua tutkittiin käyttäen MTT-määritystä, kuten aiemmin on kuvattu [15] käyttämällä soluja maljattiin uudelleen 3-4 päivää sen jälkeen, kun lentiviral infektion.

Plasmidi Production

FUW-tefO-Sox2 (20724) saatiin alkaen Addgene (Cambridge, MA). pLVX-Tet-On® Advanced vektori saatiin Clontech (632162, Mountain View, CA). Vektorit tuottaa shRNA lentiviruksien varten MSI2 (RMM4534-NM_011443) ja USP9X (RHS4533-NM_001039590) knockdowns saatiin Open Biosystems (Huntsville, AL). Aikaisemmin validoitu epäspesifinen shRNA (Salattu) käytettiin negatiivisena kontrollina pudotus kokeissa [23]. shRNA sekvenssit tarjotaan täydentävän Taulukko S4.

insinööri pLVX-tetO- (fs) Sox2, Strep ja Flag-tunnisteet lisättiin peräkkäin N-päähän Sox2 kaksi kierrosta PCR. Ensimmäinen PCR kierroksella käytetty FUW-tefO-Sox2 mallina, ylävirran aluke: CAAGAAGCTTGCC

AACTGGAGCCACCCACAATTCGAGAAG

GGCGGAATGTATAACATGATGGAGACGGAGCTGAAG (alleviivattu: HindIII, kursivoida: Strep-epitoopin, rohkea: Sox2 CDS, lihavoitu alleviivattu: hiljainen mutaatio tuhota endogeeninen BsrGI- kohtaan) ja alukkeen alavirtaan: AGGACTCGAGCGCGGGACCACACCATGAAGG (alleviivattu: XhoI). Tämä fragmentti digestoitiin HindIII: lla ja Xhol: llä ja ligoitiin vastaaviin kohtiin Bluescript KS + (Sratagene, Santa Clara, CA). Toinen PCR-kierros käyttämällä väli- plasmidia templaattina, ajettiin seuraavat ylävirran aluke: AAGGTCTAGATGTAC

ATGGACTACAAGGACGACGATGACAAG

GGGTCGGCCGCC

AACTGGAGCCACCCACAATTCGAGAAG

(alleviivattu: XbaI, harmaa: BsrGI-, rohkea ja kursivoitu: Flag-epitooppi, kursivoida: Strep-epitoopin) ja alavirran aluketta, joka sisälsi Xhol kuvatulla tavalla. Tämä PCR-tuote pilkottiin sitten Xbal: llä ja Xhol: llä ja ligoitiin vastaaviin kohtiin Bluescript. Flag-Strep merkitty 5 ’päähän Sox2 eristettiin tämän välituotteen vektori ja siirretään FUW-tefO-Sox2 vektoriin käyttäen BsrGI- ja sisäinen RsrII sivuston, luoda FUW-tetO- (fs) Sox2. (Fs) Sox2 eristettiin FUW-tetO- (fs) Sox2 käyttäen EcoRI ja liitettiin pLVX-Tight-Puro (632162, Clontech), luoda pLVX-tetO- (fs) Sox2. Suunta varmistettiin sekvensoimalla.

i-Sox2-Daoy Cell Engineering

Daoy soluja ympättiin kloonitiheydessä ja tartunnan pLVX-Tet-On® Advanced lentivirus tuottaa rtTA-Daoy. Soluja syötetään uudelleen tuoreella kasvualustalla 2-3 kertaa viikossa. Kahdeksan päivää ymppäyksen jälkeen on kloonitiheydessä, yksittäiset pesäkkeet eristettiin, ja kaksi päivää myöhemmin, eristetty pesäkkeet altistettiin G418 (300 ug /ml). rtTA-Daoy klooneja laajennettiin ~ 2 viikon ajan G418-valinnan. rtTA-Daoy solut ympättiin kloonitiheydessä ja tartunnan pLVX-tetO- (fs) Sox2. Soluja syötetään uudelleen tuoreella kasvualustalla 2-3 kertaa viikossa. Kahdeksan päivää ymppäyksen jälkeen, solut altistettiin puromysiiniä (5 ug /ml) 72 tuntia, minkä jälkeen 6 kloonia eristettiin. Kukin klooni viljeltiin väliaineessa, jota oli täydennetty doksisykliiniä (0,1 ug /ml) 24 tunnin ajan, ja tumaproteiinit eristettiin. Indusoituva ilmentyminen (fs) Sox2 varmistettiin Western blot -analyysillä (tuloksia ei ole esitetty). Yksi klooni, jota kutsutaan i-Sox2-Daoy, käytettiin Proteomiikan analyysiin.

Protein eristäminen ja immunosaostus

Dounce homogenointi käytettiin eristämään ydinvoiman proteiineja vääntelehtien mutakuopassa analyysiä kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],24]. Immunosaostukseen tumauutteita ladattiin M2-helmien (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja pestiin, ja proteiini-kompleksit eluoitiin käyttäen 3X Flag-peptidi (Sigma-Aldrich), kuten aiemmin on kuvattu [9]. Ero pulldown välinen aiheuttama (+ Dox) ja indusoimattomia (-Dox) näytteet varmistettiin hopeavärjäyksellä [9].

vääntelehtien mutakuopassa tunnistaminen Sox2 liittyvien proteiinien

Moniulotteinen Protein Identification Technology (vääntelehtien mutakuopassa ) analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [9]. MS /MS aineistoja tutkittiin käyttäen SEQUEST ja

Homo sapiens

proteiini tietokantaan (NCBI, 2010-11-22 release). Hajautettu Normalized Spectral runsaus tekijät (dNSAF) laskettiin kunkin havaitun proteiinin, kuten muualla on kuvattu [25]. Kolmen erillisen kokeen ja tilastollinen analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [9]. Spektrin vääriä löytö määrä määritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [9], [26].

Western blot -analyysi

Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [9]. Ydin- ja sytoplasminen proteiini-uutteet valmistettiin käyttäen NE-PER sarjat (Thermo-Scientific, Rockford, IL) käytettiin mukaisesti valmistajan protokollan eristämiseksi proteiinien western blot-analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [9]. Suhteelliset tasot havaittiin proteiineja määritettiin kuten aiemmin on kuvattu [11]. Primaaristen vasta-aineiden käytettiin: a-MSI2 (ab83236, Abcam, Cambridge, MA), α-USP9X (ab56461, Abcam), α-USP7 (A300-033A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), α-Flag (F3165, Sigma -Aldrich), α-GAPDH (G8795, Sigma-Aldrich), α-NRON (ab4147, Abcam), α-Sox2 (abl5830, Abcam), α-MCL1 (sc-819, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) , α-β-kateniinin (9562, Cell Signaling Technology, Danvers, MA).

RNA Analysis

RNA: n eristys ja cDNA-synteesi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [9]. Geeniekspression MSI2 ja USP9X in Daoy, U87, tai U118-soluja käsiteltiin kohdistamista tai salattu shRNA analysoitiin SYBR Green (SuperArrayBioscience Corporation, Federick, MD) määrälliset Real-Time polymeraasiketjureaktiolla (RT-qPCR) [9]. Alukkeita, joita käytetään PCR-vaiheessa analyysissä MSI2 RNA oli h-MSI2-F (AAGTATTAGGTCAGCCCCAC) ja h-MSI2-R (TTCTCAAAAGTGACAAAGCC). Alukkeita, joita käytetään PCR-vaiheessa analyysissä USP9X RNA oli h-USP9X-F (CAGATGACCAAGATGCTCC) ja h-USP9X-R (GGGGATACTTCTTCACTGCC). Alukkeet GAPDH kontrolli ilme on kuvattu aiemmin [15].

Tulokset

Engineering i-Sox2-Daoy Solut ja vääntelehtien mutakuopassa analyysi Sox2 liittyvien proteiinien

Jotta tunnistaa uusia proteiineja olennaista kasvun MB solujen, selvitimme Sox2-interactome in Daoy MB soluissa. Tärkeää on, transkriptiotekijät, kuten Sox2, eivät toimi eristyksissä, mutta toimivat osana suurta proteiinia komplekseja. Tässä suhteessa, aiemmat tutkimukset suoritettiin ESC joille erilaistumisen ovat osoittaneet, että Sox2 on läsnä useita suuria proteiinien molekyylipainon komplekseja, jotkut yli 880 kDa [27]. Tutkia Sox2-interactome, Daoy solut suunniteltu indusoituvan ilmentymisen epitooppimerkatun Sox2 (i-Sox2-Daoy), koska vasta-aineita, jotka kohdistuvat Sox2 eivät sovellu hyvin spesifisiä ja herkkiä eristäminen Sox2-proteiinin komplekseja. Tämän ansiosta voimme johdonmukaisesti eristää Sox2 ja siihen liittyvä proteiinit käyttäen M2-helmiä. Insinööri i-Sox2-Daoy, Daoy solut peräkkäin infektoitiin lentiviruksesta ottaa käyttöön konstitutiivisesti reverse-tet transaktivaattorin ja toisen lentivirusvektorikirjastojen joka ekspressoi Flag-streptokokin dual epitooppihäntäisille muodossa Sox2 [(fs) Sox2] alla valvontaan Dox-indusoituvan promoottorin (Fig. 1A).

(a) kaaviokuva lentiviruksen, jota käytetään käyttöön Dox-indusoituvan, epitooppimerkityn Sox2 osaksi Daoy MB soluihin. Kaksi lentivirusvektoreita käytettiin viemään konstitutiivisesti käänteisfaasi-tet-transaktivaattorin (rtTA) ja indusoituva (fs) Sox2 [leimattu: Flag-Sox2]. (B) pöytäkirja käyttää eristämään Sox2-proteiini kompleksit päässä Daoy MB solujen loppupään vääntelehtien mutakuopassa analyysiä. (C) Western blot -analyysiä varten varten Sox2 kanssa Sox2 vasta-aineella. Taso (fs) Sox2 verrattiin endogeenisen Sox2, joka oli asetettu 1. (D) hopea tahra osoittamalla rikastuminen proteiinien induktion jälkeen (fs) Sox2 kanssa Dox ja immunosaostus M2-helmiä. Näkyvä bändi havaittu ~45 kDa on yleinen epäpuhtaus kun M2-helmiä käytetään immunosaostus. * Arvioitu asema (fs) Sox2 on merkitty nuolenpää. (E) Western blot -analyysiä varten Flag-Sox2 tarkistaa immunosaostus käyttäen M2-helmien.

eristämiseksi (fs) Sox2 ja sen yhteydessä oleva proteiini kompleksit i-Sox2-Daoy solujen (fs) Sox2 ilmentyminen indusoitiin 24 tunnin ajan (0,1 ug /ml Dox), ja (fs) Sox2 proteiini-kompleksit eristettiin tumaproteiiniuutteet immunosaostuksella käyttäen M2-helmien (Fig. 1 B). Kontrollina tumauutteita valmistettiin i-Sox2-Daoy soluja ilman altistumista Dox (indusoimaton näytettä). Induktion jälkeen Dox, taso (fs) Sox2, joka kulkeutuu hieman hitaammin kuin Sox2, havaittiin olevan ~2.5 kertaa korkeampi kuin endogeenisen Sox2 (Fig. 1 C). Kuitenkin, jos ilmaus eksogeenisen Sox2 vähentää endogeenisen Sox2, koska se tekee ESC [11], yhteensä tasot Sox2, että Dox-käsiteltyjä soluja oli vähemmän kuin 2,5 kertaa suurempi kuin käsittelemättömän Daoy soluja. Tärkeää on, hopeavärianalyysi immunosaostettiin eluaatista osoitti merkittävää rikastumista eristettyjä proteiineja, kun (fs) Sox2 indusoitiin (Fig. 1 D). Kuten odotettua, (fs) Sox2 voitiin helposti havaita Western blot analyysi indusoidun, mutta ei indusoimattomassa eluaatit (Fig. 1 E). Näkyvä bändi havaittu ~45 kDa (Fig. 1 D) on yleinen epäpuhtaus kun M2-helmiä käytetään immunosaostus [9], [11].

proteiinien tunnistamiseen, jotka liittävät Sox2 in i-Sox2 -DAOY solut, Sox2-proteiini kompleksit indusoimattomista ja indusoi i-Sox2-Daoy solut altistettiin vääntelehtien mutakuopassa analyysiin. Auttaa minimoimaan kokeellista vaihtelua ja tilastollista analyysia, vääntelehtien mutakuopassa analyysi suoritettiin kolmen itsenäisen paria näytteitä. Spektrin vääriä löytö määrä meidän proteomic näytöt olivat 0,27% ± 0,16 ja 0,37% ± 0,08 indusoimattoman ja aiheuttama näytteitä vastaavasti määritettynä menetelmällä Elias ja työtovereiden [26]. Proteiinit tunnistettiin Sox2 liittyvien proteiinien ryhmiteltiin kolmeen pääryhmään pyrkimyksenä minimoida syrjäytymistä rehellisistä Sox2 liittyvien proteiinien: 1) proteiinit tunnistettiin vain meidän aiheuttama näytteistä kolmessa vääntelehtien mutakuopassa analysoi tiukempien BY-oikaistu merkitys p 0,05 (Fig. 2A, lisänä taulukko S1); 2) proteiinit tunnistettu vain aiheuttamaa näytteistä kolmessa vääntelehtien mutakuopassa analysoi ilman BY-oikaistu merkitys (p 0,05), mutta t-testi merkitys (p 0,05) (Fig. 2B, lisänä taulukko S2); ja 3) proteiinien, joita on rikastettu indusoidun näytteen yli 6-kertainen (Fig. 2C, täydentävän Taulukko S3). Luokka 1 ja luokka 2 oli 156 ja 39 proteiineja, vastaavasti. Kaikki proteiinit luokan 1 täyttänyt tilastollinen vaatimus käyttää luokan 2. Yhdessä luokan 3, joka sisälsi 88 proteiineja, yhteensä 283 Sox2 liittyvien proteiinien tunnistettiin kun kaikki kolme ryhmää yhdistettiin.

(A ) proteiinit tunnistettiin kaikissa kolmessa aiheuttama M2-helmi eluaatit, mutta ei tunnistettu indusoimattomassa näytteistä, kuten Sox2 liittyvien proteiinien vääntelehtien mutakuopassa analyysin, jotka olivat tilastollisesti merkitseviä mukaan bY-oikaistu menetelmä (p 0,05). NSAF arvot kolme toistoa lasketaan keskiarvo ja virhejanat edustavat keskihajonta. Juoni on jaettu kahteen; ”keskiverto NSAF arvot ’vasemman puolen nousevat vasemmalta oikealle, ja’ Keskimääräinen NSAF arvot” oikean puolen nousevat oikealta vasemmalle. (B) proteiinit tunnistettu 3 3, Dox aiheuttama, mutta ei indusoimattomassa, Daoy vääntelehtien mutakuopassa rinnakkaisnäytteiden jotka olivat tilastollisesti merkitseviä mukaan opiskelijan t-testiä (p 0,05), mutta eivät olleet merkittäviä mukaan BY-säätö ( p 0,05). (C) proteiinit tunnistettiin kaikissa kolmessa aiheuttama mutta ainakin yksi indusoimattomasta vääntelehtien mutakuopassa näyte, piirretään mukaan taittaa rikastus (NSAF arvot) in Dox aiheuttama näytteitä verrattuna indusoimattoman. Vain proteiinit rikastamiseen arvot 6-kertainen sisällytettiin. Proteiinit kuvattu musta viiva oli rikastamiseen arvot olivat tilastollisesti merkitseviä mukaan BY-säätö (p 0,05). Proteiinit kuvattu harmaalla palkit olivat tilastollisesti merkitseviä mukaan opiskelijan t-testiä (p 0,05), mutta ei merkittävää mukaan BY-säätö (p 0,05).

Ymmärtääksemme paremmin biologisen toiminnot Sox2 liittyvien proteiinien, suoritimme geeni ontologian luokitukseen tietokanta Huomautukset visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID). Kun otetaan huomioon ydin- sijainti ja Sox2, ei ole yllättävää, että transkriptio on yksi suurimmista toiminnallisten luokkien (Fig. 3). Kuitenkin, Sox2 liittyvien proteiinien on liitetty monia muita solun prosesseja. Tämä on samanlainen havainto, että Sox2 liittyvien proteiinien hiiren ESC ja hiiren ESC meneillään eriyttäminen ovat mukana monipuolisista toiminnoista [9], [11]. Näiden solujen yhteyksissä, samanlainen prosenttiosuus Sox2 liittyvien proteiinien osallistui ryhmiin RNA käsittelyn (6% ja 9%) ja kehittäminen (10%: sta 11%). Kuitenkin oli useita merkittäviä eroja. Prosenttiosuus Sox2 liittyvien proteiinien, jotka kuuluvat DNA korjaukseen ryhmän osuus 11% ESC käynnissä erilaistumista [9], mutta vain 1% Daoy soluissa. Luokitus kuhunkin Sox2 liittyvä proteiini annetaan täydentävää taulukossa S5.

Gene ontologia analyysi Sox2 liittyvien proteiinien tunnistettu Daoy MB soluissa suoritettiin käyttäen Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID). Erityiset ontologian kuvaukset Sox2 liittyvien proteiinien jaettiin 14 pääryhmään.

vääntelehtien mutakuopassa on erittäin herkkä menetelmä, joka pystyy havaitsemaan proteiinien näytteet, joita ei ole helppo havaita Western blot -analyysillä. Tästä syystä käytimme perinteisemmän biokemiallinen lähestymistapa ja valittujen proteiinien vaatimaton NSAF arvojen vahvistamaan meidän tunnistamiseen Sox2 liittyvien proteiinien. Erityisesti MSI2, proteiini löytyy vain meidän aiheuttama näytteistä (Fig. 2A), ja USP7, rikastettu -20-kertaisesti (kuvio. 2C), vahvistettiin yhdistää Sox2 kautta samanaikainen immunosaostus käyttäen ydinvoiman uutteita valmistettiin Daoy soluista ( täydentävää Fig. S1A). Olemme myös päättäneet, että Sox2 pystyy yhdistää MSI2 ja USP7 muissa solun yhteyksissä. Tässä suhteessa MSI2 ja USP7 tunnistettiin Sox2 liittyvien proteiinien yhdessä proteomic näytön Sox2 liittyvien proteiinien U87 GB-soluissa (Wilder ja Rizzino, julkaisemattomat tulokset). Lisäksi olemme päättäneet, että ektooppisesti ilmaistu Flag-Sox2 kumppaniaan endogeenisen USP7 löytyy HEK293T soluissa (täydentävä Fig. S1B). Olemme myös vahvistaneet, että ektooppisesti ilmaistu Flag-MSI2 co-immunopresipitaateista ektooppisesti ilmaistu Sox2 in HEK293T soluissa (täydentävä Fig. S1C).

integrointi Sox2-proteiinin Interactomes paljastivat eräitä yhteisen liittyvien proteiinien

lisäksi Sox2 proteomic näyttö suoritetaan Daoy soluissa, olemme hiljattain tehty vääntelehtien mutakuopassa analyysi tunnistaa Sox2 liittyvien proteiinien useissa muissa solun yhteyksissä, mukaan lukien erilaistumaton ESC [11] ja ESC olevien erilaistumista [9]. Tärkeää on, että kolmen Sox2-interactomes tunnistettu määritettiin käyttäen samoja menetelmiä proteiinien eristämiseksi ja proteomiikka-analyysi, ja samanlaisen spektrin väärä löytö korko ( 0,4%) määritettiin kunkin itsenäisen yhteydessä [9], [11]. Kussakin tapauksessa, Flag-epitooppi merkitty Sox2 ja siihen liittyvät proteiinit eristettiin käyttäen M2-helmien tumauutteista valmistaa Dounce homogenoimalla, minkä jälkeen vääntelehtien mutakuopassa analyysi käyttämällä samaa proteomic alustalla. Siksi vertasimme Sox2-interactomes yksilöity kussakin näistä solun yhteyksissä (täydentävä Fig. 2, täydentävää taulukko S6), koska proteiinit, jotka liittävät Sox2 useilla solujen yhteyksissä ovat myös todennäköisesti pelata olennaisia ​​rooleja käyttäytymistä aivokasvain soluja. Tässä suhteessa ihmisen MB-solut ja hiiren ESC oli useita Sox2 liittyvien proteiinien yhteistä, vaikka dramaattisia eroja solujen yhteydessä. 283 proteiinit tunnistettu Sox2-interactome in Daoy MB soluissa, 19 liittävät Sox2 ainakin yhden muun solun yhteydessä, kuten MSI2 ja USP9X, ja kaksi liittävät Sox2 kaikissa kolmessa solujen yhteyksissä (täydentävä Fig. S4, lisänä Taulukko S6 ). Viime aikoina olemme osoittaneet, että Msi2 tarvitaan itseuudistumisen ja pluripotenttisuuden hiiren ESC [14] ja viime aikoina olemme päättäneet, että knockdovvn Usp9x hiiren ESC lisää olennaisesti erilaistumista ESC (julkaisemattomat tulokset). Lisäksi MSI2 ja USP9X ovat sekaantuneet muiden syöpien [16] – [21], mutta niiden roolit aivokasvaimia ei ole tutkittu. Siksi laajensimme analyysi Sox2 liittyvien proteiinien määrittämällä vähentämällä MSI2 ja USP9X ilme vaikuttaa käyttäytymiseen aivokasvain soluja.

Musashi-2 on välttämätön leviämisen Brain Syöpäsolut

Aiemmat raportit osoittivat, että MSI2 on välttämätöntä etenemisen KML [16] – [18], ja knockdown toisen perheenjäsenen, Musashi-1 (MSI1), häiritsee elinkelpoisuutta Daoy MB solujen ja GB soluihin [28], [29]. Voit selvittää MSI2 on tarpeen leviämisen Daoy MB solujen shRNA konstrukteja käytettiin kaataa endogeenisen MSI2. Erityisesti, lentivirukset ja joka ilmentää shRNA vastaan ​​MSI2 käytettiin infektoimaan Daoy MB-soluja. Kaksi itsenäistä shRNA konstrukteja käytettiin pudotus MSI2, ja aiemmin tunnettu epäspesifinen shRNA (Salattu) käytettiin verrokkina [15], [23]. Valinnan jälkeen tartunnan solujen puromysiini, western blot-analyysi osoitti, että MSI2 isoformeja 1 ja 2 olivat huomattavasti tippuu alas (Fig. 4A). Tämä vähennys MSI2 tarkistettiin RNA tasojen RT-qPCR (Supplemental Fig. S3A). Lisäksi, verrattuna kasvuun Daoy infektoitujen solujen kanssa salatut shRNA lentivirusvektoreita, havaitsimme suuren vähenemisen kasvua, kun solut infektoitiin MSI2 shRNA lentivirusvektoreita (Fig. 4B). Lisäksi mikrovalokuvia jotka on otettu 7 päivää infektion jälkeen osoittivat, että solut, joissa MSI2 oli tippuu alas oli tasaisempi ja suurempi, muistuttaa postmitoottisia soluissa, verrattuna Scrambled ohjaus (Fig. 4C).

(A ) Western blot-analyysi MSI2 tasojen Daoy kokosoluekstraktien 96 tunnin kuluttua infektion salatut tai MSI2 shRNA lentivirukset. Kaksi muotoa havaittiin: isoformin 1 (MSI2-1) ja isoformin 2 (MSI2-2). GAPDH koetettiin latauskontrollina. MSI2 tasot ovat määrällisesti, jossa tasoja löytyy salatut säädin asetettu 1,00. (B) Solujen kasvu tutkittiin kolmena kappaleena MTT: llä 6 päivää sen jälkeen, kun on päällystetty 10

4 solua per kuoppa 12-kuoppalevyllä. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja suhteessa Scramble valvontaa. Virhe palkit kuvaavat keskihajontaa. P-arvot määritettiin Studentin t-testiä ja sen todettiin olevan 0,01 molemmille MSI2 shRNA 1 ja 2 (C) mikrovalokuvia Daoy MB solujen infektion jälkeen joko epäspesifisiä (Salattu) tai MSI2 kohdistaminen (nro 1 , nro 2) shRNA lentivirukset. Solut infektoitiin päivänä 0, valitaan käyttämällä elatusainetta, johon puromysiinin päivänä 1 ja syötettiin uudelleen tuoretta elatusainetta päivänä 2. Solut valokuvattiin päivänä 7 infektion jälkeen. (D) Western blot analyysi NRON in Daoy MB uutteet kuviossa 4A.

Tällä hetkellä, suhteellisen vähän tiedetään roolit MSI2, mutta hiirimallissa leukemia uskotaan alas- säädellä proteiinin Numb [16], joka on osoitettu säätelevän sekä Notch ja Wnt signaloinnin [30], [31]. Siksi me tutki knockdovvn MSI2 vuonna Daoy soluissa vaikuttaa ilmaus tunnoton. Olemme todenneet, että pudotus on MSI2 kanssa shRNA lentivirusvektoreita # 1 ja # 2 aiheuttanut lisäystä proteiinin tasot NRON (Fig. 4D). Näin ollen, knockdovvn MSI2 aiheuttaa sekä suuri vähennys kasvua Daoy MB kasvainsolujen ja lisää ekspressiota NRON.

Tutkimme myös vaikutuksia kaatamalla MSI2 GB tuumorisoluissa, koska MSI2 tunnistettiin myös kuin Sox2 liittyvä proteiini in U87 GB soluissa (Wilder ja Rizzino, julkaisemattomat tulokset). Tätä tarkoitusta varten olemme alun perin tartunnan U87 GB kasvainsoluja, joilla on sama MSI2 shRNA lentivirusvektoreita aiemmin on kuvattu. Jälleen salattu shRNA käytettiin kontrollina. Kolme päivää infektion jälkeen lentivirusvektoreita, western blot-analyysillä määritettiin, että MSI2 isoformi 1 ja isoformia 2 olivat molemmat vähentää huomattavasti (Kuva. 5A) ja väheneminen MSI2 tarkistettiin RNA tasojen RT-qPCR (täydentävä Fig. S3B) . Kuten tapauksessa Daoy solujen, U87 GB infektoidut solut MSI2 shRNA konstruktien osoitti selvästi vähentää solujen lisääntymistä (kuvio. 5B) ja merkittävä nousu solun kokoa (Fig. 5C). Jatkaa näitä havaintoja, U118 GB solut infektoitiin MSI2 shRNA lentivirukset. Samanlaisia ​​Daoy ja U87-solujen, knockdovvn MSI2 in U118-soluissa johti väheneminen MSI2 proteiinin ja RNA, suuri väheneminen solujen kasvua, ja merkittävä kasvu solun koon (täydentävä Fig. S4 ja Fig. S3C). Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että MSI2 tarvitaan ylläpitämään selviytymisen Daoy MB soluja, ja proliferatiivinen kapasiteetti U87 ja U118 GB soluja.

(A) Western blot-analyysi MSI2 tasojen U87 tumaekstrakteilla 96 tunnin kuluttua infektion Salatut tai MSI2 shRNA lentivirukset. MSI2 tasot ovat määrällisesti, jossa tasoja löytyy salatut säädin asetettu 1,00. (B) Solujen kasvu tutkittiin kolmena kappaleena MTT: llä 5 päivää sen jälkeen, kun ne maljattiin tiheytenä 1,5 x 10

4 solua per kuoppa 12-kuoppalevyllä. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja suhteessa Scramble valvontaa. Virhe palkit kuvaavat keskihajontaa. P-arvot määritettiin Studentin t-testiä ja sen todettiin olevan 0,01 molemmille MSI2 shRNA 1 ja 2 (C) mikrovalokuvia U87 GB solujen infektion jälkeen joko epäspesifisiä (Salattu) tai MSI2 kohdistaminen (nro 1 , nro 2) shRNA lentivirukset. Solut infektoitiin päivänä 0, valitaan käyttämällä alustaa, johon puromysiinin päivänä 1 ja syötettiin uudelleen tuoreella kasvualustalla päivänä 3. Solut valokuvattiin päivänä 6 infektion jälkeen.

knockdovvn USP9X Vähentää elinkelpoisuus Brain syöpäsolut

myös tutki USP9X tarvitaan selviytymisen aivojen syöpäsolujen. Tätä tarkoitusta varten käytimme shRNA välitteisen knockdovvn USP9X. Tarkemmin sanottuna kolme riippumatonta lentivirukset käytettiin tuottamaan konstitutiivisesti aktiivisia shRNA rakentaa vastaan ​​USP9X transkriptien Daoy MB soluissa. Kuten meidän MSI2-pudotus tutkimuksissa Salatut shRNA käytettiin kontrollina. Knockdovvn USP9X varmistettiin western blot analyysi sekä ydin- ja sytoplasman otteet (Fig. 6A) tarkisti RNA tasojen RT-qPCR (täydentävä Fig. S5a). Joskin vähäisiä vaikutuksia kaatamalla USP9X kolmen ensimmäisen päivän viljelyn havaitsimme suuren lukumäärän vähentäminen solujen, jotka voivat liittää uudelleen (tietoja ei esitetty). Lisäksi muutaman soluja USP9X pudotus väestön reattached jälkeen subculture esillä vähän, jos lainkaan proliferaatiota (Fig. 6, B ja C). Lisäksi olemme tutki, knockdovvn USP9X vaikuttaa ilmaus useiden sen tunnettujen kohteiden Daoy soluissa. USP9X on raportoitu deubiquitinate suuri määrä proteiineja, mukaan lukien MCL1 ja β-kateniinin [19], [32] – [35]. Kuitenkin knockdovvn USP9X ei näytä muuttavan ilmentymistä MCL1 tai β-kateniinin ydin- tai sytoplasmisen osastoihin (Fig. 6D).

(A) Western blot -analyysi tarkistaa knockdovvn USP9X in Daoy MB solujen infektion jälkeen lentiviruksien esitellä konstitutiivisesti aktiivisia shRNA vastaan ​​USP9X selostukset. Nuclear ja sytoplasmaproteiinin fraktiot valmistettiin 4 päivää sen jälkeen, kun tartuttamisesta solut lentivirukset. USP9X tasot määrällisesti, ja tasot keitetty säädin on asetettu 1,00. (B) Solujen kasvu tutkittiin kolmena kappaleena MTT: llä 6 päivää sen jälkeen, kun on päällystetty 10

4 solua per kuoppa 12-kuoppalevyllä. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja suhteessa Scramble valvontaa. Virhe palkit kuvaavat keskihajontaa. P-arvot määritettiin Studentin t-testiä ja sen todettiin olevan 0,01 molemmille USP9X shRNA 1, 2 ja 3 (C) mikrovalokuvia Daoy MB seuraavaa solujen knockdovvn USP9X käyttäen lentiviruksen toimitetaan shRNA rakentaa vastaan ​​USP9X selostukset. Päivänä 0 solut infektoitiin USP9X shRNA lentivirukset. Alkaen päivänä 1, infektoidut solut valittiin käyttämällä puromysiiniä 48 tuntia.