Krooninen sairaus

tiivistelmä

aktivointi kasvutekijän reseptorin (EGFR) mutaatiot kirjataan biomarkkereita metastasoituneen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) käsiteltiin EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (TKI). EGFR TKI voi olla myös aktiivisuutta NSCLC ilman EGFR mutaatioita, jotka vaativat tunnistamista osuvilla biomarkkereita. Aiemmat tutkimukset kasvainten EGFR-proteiinin tasot ja EGFR geenikopiomäärä paljasti ristiriitaisia ​​tuloksia. Tavoitteena oli selvittää uusien biomarkkereiden annetun vastauksen TKI in NSCLC tutkimalla koko genomin lauseke on eksoni-tason. Käytimme eksonin taulukot ja kliinisistä näytteistä aiemman tutkimuksessa (SAKK19 /05) tutkia ilmaisun vaihtelut eksoni-taso 3 geenien potentiaalisesti keskeinen rooli moduloitaessa hoitovaste: EGFR, V-Ki-ras2 Kirsten rat sarkooma viruksen onkogeenin homologi (KRAS) ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGFA). Olemme tunnistaneet ilmaus EGFR eksonin 18 uutena ennustavan markkeri potilaille, joilla on hoitamaton metastasoitunut NSCLC käsitelty bevasitsumabi ja erlotinibin ensimmäisellä rivillä asetusta. Yli-ilmentyminen EGFR eksonin 18 kasvain merkitsevästi yhteydessä kasvaimen kutistuminen, riippumatta EGFR-mutaatio aseman. Samanlainen merkittävää yhteyttä voisi löytyä verinäytteistä. Lopuksi eksoni EGFR erityisesti eksonissa 18 todettiin olevan asianmukainen ennustavan biomarkkeri vastauksena bevasitsumabi ja erlotinibin. Näiden tulosten perusteella ehdotamme uuden mallin EGFR testaus kasvaimen ja veren.

Citation: Baty F, Rothschild S, Früh M, Betticher D, Dröge C, Cathomas R, et al. (2013) EGFR eksoni-taso biomarkkerit Response bevasitsumabille /erlotinibin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (9): e72966. doi: 10,1371 /journal.pone.0072966

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 06 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2013; Julkaistu 10 syyskuuta 2013

Copyright: © 2013 Baty et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: eksoni erilaisia ​​analyysi rahoitettiin Sveitsin ryhmän Clinical Cancer Research (SAKK). Tärkeimmät kokeiluaktiviteeteista tuettiin Sveitsin valtiosihteeristön koulutus ja tutkimus (SER) ja Roche Pharma (Schweiz) AG. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: LB sai palkkiot Rochen ja Astra Zenecan luentoja ja läsnäoloa neuvottelukunnan kokouksissa. OG julistaa saaneet maksamalla palkkioita neuvottelukunta. Kaikki muut kirjoittajat Julistan joilla ei ole kilpailevia kiinnostusta. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

ennustetta potilaille, joilla on vaiheen IV ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) jatkuu olla huono. Huolimatta standardi solunsalpaajahoito, lähes 50% ei selviä enintään 12-14 kuukausi [1], [2]. Viimeisten vuosien aikana, parannuksia eloonjäämisluvut ovat pääosin saavutettu löytö ennakoivan molekyylitason markkereita tunnistettu potilasalaryhmissä johtuvat huomattavan hyödyn kohdennetun hoidon. Useat Satunnaistetussa vaiheen III kokeet ovat äskettäin osoittaneet merkittävää hyötyä kasvutekijän reseptori tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI) in kemoterapiaa saamattomien potilaiden kätkeminen aktivoivaa EGFR-mutaatio [3] – [6]. EGFR mutaatioita esiintyy noin 10-15% valkoihoisiin [7]. EGFR villin tyypin potilaiden ensilinjan hoito EGFR-TKI saattaa jopa vahingoittaa verrattuna perinteisiin kemoterapiaa [8]. Kuitenkin valitsemattomat kemoterapiaa aiemmin saamattomilla potilailla rooli EGFR-TKI on vähemmän selkeä ja aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet huonompia tuloksia kanssa TKI tai ilman bevasitsumabia kemoterapiaan verrattuna [9] – [11]. Nämä tulokset osoittavat, että on olemassa alaryhmä EGFR villityypin potilaat, jotka hyötyisivät hoidon TKI tai TKI plus anti-angiogeeninen aine. Sama pätee valitsematta ja aiemmin hoidetut potilaat missä rooli TKI on käsitelty lukuisissa tutkimuksissa tehoa ja eloonjäämisluvut ovat osoittaneet olevan verrattavissa tavanomaisiin kemoterapiaa [12] – [14]. Lisäksi viimeaikaiset biomarkkereiden analysoi kolmen suuren kokeiden testaus ylläpitohoito erlotinibin osoitti selvästi, että osajoukko EGFR villityypin potilaat myös saa merkittävää hyötyä EGFR-TKI-terapialle [15] – [17].

Rinnalla EGFR muut druggable onkogeenisten mutaatioiden kehittynyt NSCLC on kuvattu [18], [19]. Valitettavasti useimmat potilaat NSCLC eivät satama vastaavaa molekyylikohteena siten kemoterapian edelleen heidän ensimmäinen hoito valinta. Siksi tunnistaminen edelleen potilasalaryhmissä jotka voivat hyötyä siihen kohdennetun hoidon tutkimalla uusia molekyylimarkkereina on ratkaiseva.

hoito bevasitsumabin ja erlotinibin (BE) on potentiaalisia etuja kemoterapiaa, erityisesti huomioon enemmän suotuisa myrkyllisyysprofiilia. On näyttöä, että lisäämällä verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) kohdistaminen monoklonaalinen vasta-aine bevasitsumabi on EGFR-TKI erlotinibin näyttelyitä suurempi teho verrattuna erlotinibin yksinään valitsemattomat potilailla, jotka olivat aikaisemmin saaneet kemoterapiaa [20]. Tämä havainto todennäköisesti seurausta tehostetun erlotinibin toimintaa, koska asiasta ei ole tehoa bevasitsumabi monoterapiana keuhkosyöpään.

Sveitsin ryhmä Clinical Cancer Research (SAKK) raportoivat äskettäin mediaani aika taudin etenemiseen (TTP) ja 4,1 kuukautta potilailla, joilla on hoitamaton edenneen ei-levyepiteelikarsinooma NSCLC käsitelty BE [21]. Tämä tulos näyttää olevan huonompi kuin mitä olisi odotettavissa modernit kemoterapiaa yhdistelmien vastaavissa potilasryhmissä [2], [22]. Nykyisessä alatutkimus, pyrittiin tunnistamaan mahdollisia potilaiden alaryhmässä osallistuvien SAKK 19/05 tutkimuksessa etenkin sisällä EGFR villin tyypin ryhmä, jotka voivat hyötyä hoidon BE. Päätavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida korrelaatio eksoni-ilmentymistä muunnelmia 3 erityisiä geenejä [EGFR, V-Ki-ras2 Kirsten rat sarkooma viruksen onkogeenin homologi (KRAS) ja endoteelikasvutekijä A (VEGFA)] ja vastauksena ensimmäisen rivin BE potilailla, jotka osallistuivat SAKK 19/05 tutkimus.

tulokset

Potilaan ominaisuuksista ja potilaan kliinisen

SAKK 19/05-tutkimuksessa 103 potilaat, 101 tietoja voitiin ensisijaisen tilastollista analyysiä. Kaiken mediaani-ikä oli 65 (vaihteluväli 32-80) vuotta. Kaikki potilaat olivat hyvä suorituskyky tila (WHO 0-1), 48 oli miehiä (48%), 53 oli naisia ​​(52%). Suurin osa (86%) oli vaiheen IV tauti. EGFR mutaatioita tunnistettiin 15 potilaalla (15%). Yhdellä potilaalla oli ensisijainen mutaatio T790M eksonissa 20. KRAS mutaatio havaittiin 13 potilaalla (13%). Tavoite tuumorivasteita 12 viikon (PR tai CR) havaittiin 15 potilaalla (15%). Nämä potilaat olivat seuraavat EGFR mutaatiostatuksesta tila: EGFR del19 (n = 5), L858R (n = 2), ei tunneta mutaatiostatuksesta tila (n = 1), ja EGFR villityypin (n = 8). Yksi potilas, jolla EGFR villityypin ja vaste BE hoito oli KRAS mutaatio G12D.

Näistä potilaista, kasvainkudokseen eksonissa erilaisia ​​analyysi saatiin 42 potilaalla ja verinäytteet 75 potilasta (taulukko S1 tukeminen Information). Yksityiskohtainen kuvaus potilaan ominaisuudet on esitetty taulukossa 1 (kasvain kudosnäytteitä) ja taulukossa 2 (verinäytteitä). Kudosnäytteet vastasi meidän ensisijainen aineisto käytetään biomarkkereiden tunnistamiseen. Verinäytteet käytettiin uudistetun tarkoitukseen (validointi sarja).

Target geenien ilmentymisen analyysi eksoni-tason

epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR).

EGFR-geenin ilmentyminen mitattiin 451 loci, joista 51 sijaitsee eksonit, ja 400 sijaitsivat ulkopuolella eksonien,

eli

introni, geenien välinen tai olivat epäluotettavia (kuvio 1, yläpaneeli). Siten yhteensä 51 eksonista probesets ilmaisu voimakkuudet mitattiin sisällä EGFR geenissä. Yhteenveto mitta kaikkien näiden eksoni tason probesets toimitti PCA (pistemäärän ensimmäinen PC-akseli). Yhdistyksen välinen pisteet ja TS12 ja TTP alle BE, OS, ja TTP alle kemoterapiaa arvioitiin.

punainen punkkien näyttää eksoni probesets, harmaa punkkeja näyttää ei-eksoni probesets (introni, geenien välinen ja epäluotettavia ). EGFR, KRAS ja VEGFA, yhteensä 51 451, 13 262 ja 25 26 eksoni probesets mitattiin vastaavasti. Kaikki muut probesets sijaitsivat ulkopuolella eksonien,

eli

introni, geenien välinen tai olivat epäluotettavia.

Olemme löytäneet merkittävän korrelaatio EGFR PCA tulokset ja TS12 jälkeen BE hoidon (Spearmanin,) (kuvio 2A, vasen paneeli). Yksityiskohtainen analyysi probeset-by-probeset paljasti, että 86%: n eksoni probesets osoitti merkittävää korrelaatiota kasvaimen kutistuminen ilman korjausta useita testaus () (kuvio 2B, vasen paneeli). Kaksi probesets osoitti erityisen vahva korrelaatio TS12 (eksoni probesets ID 3002770 ja 3002769), joka pysyi merkittävän jälkeen Bonferroni korjauksen useille testaus. Nämä 2 probesets sijaitsevat eksonin 18 (kromosomissa 7, paikoittaa 55’238’440 ja 55’238’092, vastaavasti). Muita merkittäviä yhdistysten löytynyt. Kuudella potilaalla oli TTP 15 kuukautta tai enemmän. Kolme niistä oli EGFR del19, ja 3 olivat EGFR ja KRAS villityypin.

rivi A kuvaa assosiaatiota kasvaimen kutistumisen viikolla 12 ja eksoni-tason komposiitti pisteet (PCA akseli 1) varten EGFR, KRAS ja VEGFA (vasen, keskimmäinen ja oikea vastaavasti). PCA tulokset määritellään koordinaattien potilaista uutta tilaa määritellään yhdistämällä lineaarisesti alkuperäisen probeset voimakkuuden arvoja pääkomponenttianalyysi. Potilaat, joilla EGFR mutaatioita on merkitty punaisella, joilla on ei-saatavilla mutaatiostatuksesta riippumatta näkyvät tyhjät ympyrät. Rivi B esittää merkitys korrelaatio (-log (-arvo)) kunkin eksonin probeset ja kasvaimen kutistuminen viikolla 12. asento eksonien näkyy sinisenä.

Kuva 3 kuvaa merkittävää yhteyttä eksonin 18-EGFR intensiteetin ja TS12. Vasemmassa paneelissa näkyy vahvan yhteyden ilmentymisen intensiteetti eksoni 18-EGFR (probeset 3002770) ja TS12 (Spearmanin,).

Vasemmassa paneelissa kuvaa korrelaatiota ilmentymisen intensiteetti eksonin 18-EGFR ( probeset 3002770) ja kasvaimen kutistuminen viikolla 12. pystysuora viiva osoittaa mediaani ilmaus intensiteetti EGFR probeset 3002770. Potilaat, joilla on EGFR mutaatioita näkyvät punaisina tavallinen pisteitä ja merkitty accrodingly. Potilaat, joilla on ei-saatavilla mutaatiostatuksesta riippumatta näkyvät tyhjät ympyrät. Keskilevyn edustaa receiver operating (ROC) käyrä herkkyys /spesifisyys testi perustuu ekspressiotaso EGFR probeset 3002770 luokitella vasteen (kasvaimen kutistuminen viikolla 120/20 /30%) vs. ei-vastetta ( kasvaimen kutistuminen viikolla 120/20 /30%). Plain pisteet kuvaavat oikeita positiivisia ja vääriä positiivisia hinnat saadaan vahvistamisesta kynnysarvon keskiviivan ilmentymistason EGFR 3002770. Putous juoni (oikea paneeli) näyttää muutoksen kasvaimen koon viikolla 12 järjestettynä vasemmalta oikealle. Värit määritellään ilmaus intensiteetti EGFR 3002770 kahtia, jonka mediaani ilmaisun evel (sininen: matala ilme intensiteetti; punainen: korkea ilmentymisen intensiteetti).

vahva korrelaatio EGFR eksoni 18 lauseke ja TS12 pysyi erittäin merkitsevä (Spearmanin,) jälkeen rajoitetaan analyysin EGFR villityypin potilaille (katso kuva S1 tukevat tiedot). Tämä osa-analyysi osoittaa, että yhdistyksen välillä EGFR eksoni 18 ilme ja TS12 oli riippumaton EGFR-mutaatio asema.

ROC-analyysi (keskimmäinen kuva) esittää suhdetta herkkyys ja tarkkuus riippuen eri cut-off tasoa eksonista 18-EGFR (probeset 3002770) ilmaisu luokitella potilaita ”hoitovasteen” vs. ”ei vastetta”. Varten tämän ROC analyysi, luokittelu ”hoitovasteen” vs. ”ei vastetta” johdettu TS12. Ehdotimme 3 vaihtoehto määritelmiä ”vasteen” asettamalla TS12 cut-off kuin suurempi tai yhtä suuri kuin 0, 20, tai 30%, riippuen siitä onko yhdellä sisälly kaikki tai osa stabiili tauti potilaiden ”hoitovasteen” -luokkaan . Käyttämällä mediaani ilmentyminen EGFR probeset 3002770 koe-kynnyksen tarjoaa luokittelun tarkkuus oli 75% (herkkyys = 100%, spesifisyys = 67%). Kuten kuviossa on ROC-käyrä, korkeampi luokitus tarkkuutta voidaan odottaa edelleen hienosäätöä tämän kynnyksen (pinta-ala käyrän [AUC] = 0,93).

2 eksoni 18-EGFR probesets osoittaa vahvin korrelaatio TS12 osoitti myös merkittävää yhdistyksen saman päätepisteen, kun mitataan veren ().

vakauteen havainto arvioitiin käyttäen bootstrap, ja ristivalidointi strategioita. Menettely vahvisti vahvan luokitustarkkuudesta eksonin 18 EGFR mediaani ROC-AUC 0,94 (95% CI: 0,70-1,00) ja assosiaatio eksonin 18 alueella ja kasvaimen kutistuminen viikolla 12 (katso kuva S2 ja teksti S1 yksityiskohtaiset menettely).

Kirsten rat sarkooma viruksen onkogeenin homologi (KRAS) ja endoteelikasvutekijä-alfa (VEGFA).

Kaikkiaan 13 ja 25 eksoni probesets ilmaisu voimakkuudet mitattiin sisällä KRAS ja VEGFA (kuvio 1, keski- ja oikea paneeli). PCA tulokset saatiin sekä sarjaa probeset (KRAS ja VEGFA) eivät osoittaneet merkittävää yhteyttä minkään kliinisen vasteita. Yksityiskohtainen analyysi probeset-by-probeset ei paljastanut mitään merkittävää yhteyttä joko TS12 (kuvio 2A, B, Keski- ja oikea paneelit) tai muiden tutkittujen päätetapahtumien.

Keskustelu

Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus tutkia korrelaatio geenien ilmentymisen arvioitiin klo subgenic eksoni tasolla käyttäen Affymetrix Human eksoni 1.0 ST taulukot ja hoitovastetta kanssa EGFR-TKI yhdessä antiangiogeenisen aineena. Tutkimme eksonin intensiteetti vaihtelu 3 avaimen geenejä (EGFR, KRAS ja VEGFA) liittyy mahdollisesti hoitovasteen BE. Pystyimme osoittamaan vahvan yhteyden enemmistön, mutta eivät kaikki, 51 EGFR eksonin probesets ja TS12 ensilinjan BE potilailla, joilla on hoitamaton edenneen ei-levy- NSCLC. Eksoni 18-EGFR tasoilla osoitti parasta yhdessä vastauksena BE. Perustuen edellisten kokeiden oletamme, että signaalin mittasimme EGFR eksoni 18 ei riipu kasvainsolun sisältö [23]. Lisäksi oli kvantitatiivinen suhde – korkeamman EGFR mRNA taso korreloi selvemmin kasvaimen kutistumista, riippumatta EGFR mutaatiostatuksesta riippumatta. EGFR eksoni-tason ilmentymisen analyysi voisi tulla hyödyllinen biomarkkereiden päivittäiseen kliiniseen käytäntöön, koska se tarjoaa useita etuja verrattuna perinteisiin mutaatioanalyysiin geenin sekvensointi. Tyypillisesti, EGFR geenin ilmentyminen mitataan käyttäen kvantitatiivisia RT-PCR: llä alukkeilla sitoutumalla yhden geenin alueella usein lähellä 3′-pää geenin. Kuitenkin kuten on esitetty Tutkimuksessamme geenien ilmentyminen ei poikkea merkittävästi yli span EGFR-geenin. Syyt ilmaisun variaatiot kuuluvat vaihtoehtoisen silmukoinnin. EGFR-variantti tyyppi III (EGFRvIII) on in-frame poistetaan eksonien 2-7, joka on havaittu syntyä geenin uudelleenjärjestyminen tai poikkeava mRNA [24], [25]. Tämä vaihtoehtoinen silmukointi lomake on löydetty NSCLC [26], [27]. Prekliinisissä kokeissa solut, jotka ilmentävät EGFRvlll olivat vastustuskykyisiä palautuvia EGFR-TKI, mutta edelleen herkkiä peruuttamattomia EGFR: n estäjien [28]. Löysimme paras korrelaatio TS12 ja eksonin 18. ääripäät EGFR-geenin useita eksoni probesets ei osoittanut merkittävää yhteyttä lopputulokseen. Dziadziuszko ja kollegat ilmoitti, että korkea EGFR mRNA: n ilmentymisen analysoitiin kvantitatiivisen RT-PCR liittyy lisääntynyt vaste ja pitkittynyt PFS saaneilla potilailla gefitinibin [29]. Kiinalaisessa tutkimuksessa 79 valitsemattomat hoidetuista potilaista erlotinibin ole merkittävää korrelaatiota EGFR mRNA ilmaisun, EGFR mutaatioita, KRAS-mutaatioita ja kliinisten päätepisteiden todettiin [30].

Useat tutkimukset osoittivat, että kliinistä hyötyä EGFR-TKI oli ei rajoitu potilaille, joilla on aktivoivia EGFR mutaatioita [13], [16], [31]. Sitä vastoin IPASS tutkimukset ovat osoittaneet, että potilailla, joilla EGFR villityypin käsitelty gefitinibin oli huomattavasti lyhyempi PFS verrattuna potilaiden kemoterapian käsivarren (riskisuhde (HR): 2,85; 95% CI: 2,05-3,98;) [ ,,,0],8]. Tässä tutkimuksessa, pystyimme tunnistamaan 3 potilaille, joilla on EGFR villityypin ja korkea eksoni 18-EGFR tasot (2 mitattuna biopsiat ja verta, ja 1 mitataan veren vain), joilla oli merkittävä TS12 hoidon jälkeen BE. Uskomme, että nämä tulokset ovat mielenkiintoisia, koska esiintyvyys aktivoivia EGFR mutaatioita valkoihoisten potilaiden keskuudessa on 10-15% ja meidän testi voi tunnistaa muita potilaita, jotka voisivat pärjäävät paremmin ensilinjan EGFR-TKI verrattuna kemoterapiaa. Tämä hypoteesi tarvitsee mahdollisille validointi.

Mielenkiintoista, potilailla, joilla on harvinaisempi EGFR-mutaatioita (

esim

del L747-S751 ja del R748-S752) ja vastaus EGFR-TKI on vielä oltava tutkia todettiin myös olevan suurempi eksoni tason EGFR ekspressiotasot joka korreloi TS12. Kaksi probesets sijaitsevat eksonin 18 voimakkaimmin yhdessä kasvaimen kutistuminen. Italialaiseen yhden laitoksen tutkimuksessa, harvinainen EGFR-mutaatioita (eksoni 18 ja 20 sekä harvinaista mutaatiot eksonit 19 ja 21 ja /tai monimutkaisia ​​mutaatioita) todettiin 2,6%: lla potilaista. He kertoivat PR erlotinibille potilaalla, jolla on E709A + G719C kaksinkertainen mutaatio sekä vastauksen erlotinibille potilaalla, jolla on G719S mutaatio [32]. Muut ryhmät raportoitu herkkyys EGFR-TKI varten E709A + G719C kaksinkertainen mutaatio sekä G719S eksonissa 18 [33] – [35].

Mielenkiintoista on, havaitsimme kasvaimen kutistuminen yhdellä potilaalla, jolla on KRAS mutaatio . Tällä potilaalla oli korkea EGFR eksoni ilme. Potilaat, joilla KRAS mutaatiot edustavat noin 25% pienisoluista keuhkosyöpää ja on kuvattu hyvin vastustuskykyinen EGFR-TKI hoidon RR lähellä 0% ja huonompi tulos mutatoitunut hoidetuilla potilailla EGFR-TKI joissakin tutkimuksissa [36], [37] . Biomarkkerin analyysi SATURNUS tutkimus osoitti ole haitallista vaikutusta PFS erlotinibin potilailla, joilla KRAS mutantti kasvaimia [17]. Siten korkea eksoni EGFR ekspressiotasot ehkä tunnistaa potilaat, joilla KRAS mutaatioita, jotka hyötyvät ensilinjan BE.

Muita mahdollisia molekyylimarkkereina jälkeen EGFR-mutaatiot on tutkittu niiden ennakoivaa roolia hoidon TKI tai TKI yhdessä VEGFR-estäjien. EGFR-proteiinin ilmentyminen havaita immunohistokemiallinen (IHC) on läsnä 60-90% NSCLC potilaista [13], [38] ja siksi todennäköisesti ole hyötyä kliinisten valinnan TKI-terapialle. Vaikka alaryhmä analyysit lumelääkekontrolloidusta vaiheen III tutkimuksissa pre saaneilla potilailla joitakin ennustearvo EGFR-proteiinin ilmentymisen [13], [39], nämä tulokset ole vahvistettu joko ensimmäisellä rivillä tai huollon asetus [17], [40] . Vastaavasti korkea EGFR kopioluku, jota esiintyy 30-50%: lla potilaista, joilla NSCLC, ja geenimonistuksen, jota esiintyy noin 10%: [41], on äskettäin osoitettu olevan € kumota euroihin vuoteen EGFR mutaatioita suhteessa niiden ennustava arvo vaste EGFR-TKI: [40]. Määrittämisen EGFR-mRNA: n ilmentymisen kvantitatiivisen PCR korreloi EGFR FISH ja IHC ja sen osoitettiin olevan ennustavan biomarkkeri gefitinibin [29]. Kumpikaan EGFR-proteiinin ilmentymisen eikä EGFR FISH testausta käytetään tällä hetkellä kliinisessä käytössä ja parempi molekyylimarkkereina siksi tarvitaan kiireesti.

EGFR geeni aiheuttaa useita RNA-transkriptien kautta vaihtoehtoisen silmukoinnin ja käyttöä vaihtoehtoisen polyadenylaatiosignaalit [42 ]. EGFR-geeni ulottuu lähes 200 kb ja täyspitkän 170 kDa EGFR koodaa 28 eksonit. Useat vaihtoehtoisen silmukoinnin variantteja on kuvattu [43]. Yleisimmin käytetty menetelmä tunnistaa EGFR-mutaatiot on suora sekvensointi PCR-monistetut eksonisekvenssejä. Kopioluvun mutanttialleelin, epätasapainossa PCR-monistus, ja suhteellinen määrä kontaminoivien villityypin alleelin ei-kasvainsolujen voi vaikuttaa herkkyyttä mutantin havaitsemiseen suoralla sekvensoinnilla [44]. Koska huoli herkkyyden suoraan sekvensointi menetelmä, erilaisia ​​muita menetelmiä on tutkittu herkkyyden lisäämiseksi mutaation määrityksessä. Täällä tutkimme ensimmäistä kertaa eksoni ilmentymisanalyysiä. Array käytetään mahdollistaa geenin ilmentymisen analyysi sekä havaitseminen eri isomuotojen geenin. Tässä tutkimuksessa jälkikäteen tunnistettu korrelaatiota eksoni intensiteetin tasoilla EGFR ja potilaiden hoitotuloksiin. Mekanismi, jonka kautta EGFR eksoni 18 lauseke määrittää lisääntynyt herkkyys bevasitsumabia erlotinibi ei tunneta, vaikkakin eri hypoteeseja voidaan ehdottaa. Eksoni array on edelleen hyvin viime joilla on runsaasti potentiaalia teknologian. Se jarrut yhteismarkkinoille ajatus, että geenin ilmentyminen on vakaana span koko geenin. Sen vuoksi, ei ole yllättävää, että saadaan voimakkaampi tilastollinen korrelaatio EGFR lähellä koodaavan alueen toiminnallinen transmembraanisen osan EGFR. Jos ennustearvo Tämän määrityksen voidaan vahvistaa prospektiivisessa tutkimuksessa, eksoni-tason geenin ilmentymisen voisi tunnistaa potilaat johtuvat hyötyvät EGFR- ja VEGFR-kohdistettuja hoitomuotoja kuin potilaat valitaan tavanomaisella geenin sekvensointi.

On tiettyjä rajoituksia nykyisen tutkimuksen. Se on yksi käsivarsi suunnittelu ja on suhteellisen alhainen määrä potilaita, joiden tuumoribiopsioissa oli saatavilla analyysiä varten. Vuoden ensimmäisellä puoliskolla SAKK 19/05 oikeudenkäyntiä hoitamattomilla biopsia ei vaadittu tutkimuksessa osallisuutta. Tänä aikana käytännössä mitään koepaloja kerättiin. Muutoksen jälkeen (lokakuu 2006) koepalan tuli pakolliseksi tutkimuksen mukaanotto hoitamattomilla biopsia voidaan ottaa lähes jokaiselle potilaalle myös myöhäisvaiheen pienisoluista keuhkosyöpää [23]. Eksoni array analyysit tehtiin ristiriitaisin kasvain koepaloja ilman kasvainsolulyysiksestä rikastuttava tekniikka kuten laser-capture mikrodissektion. Tämä johtaa todennäköisesti jossain laimennus todellisen kasvain signaalia. Kasvain-solujen rikastamista tekniikoilla voisi optimoida tehokkuuden biomarkkereita peräisin eksonista array analyysejä. Voimassaolo EGFR eksonin ilmentymisen analyysi biomarkkerina vasteen BE täytyy vahvistaa sekä käyttämällä RT-PCR-analyysi kohdistaminen EGFR eksoni 18. täysimääräistä toteuttamista validointi romaanin biomarkkereiden lopulta vaatii lisätutkimuksia käyttäen itsenäinen mahdollisille satunnaistetussa tutkimuksessa .

Yhteenvetona tuella uusi geeniekspression array tekniikka eksoni kattavuus, pystyimme tunnistamaan eksoni 18-EGFR mahdollisena ennustavan biomarkkeri erlotinibin ja bevasitsumabin potilailla, joilla on kehittynyt, hoitamaton NSCLC .

Materiaalit ja menetelmät

SAKK 19/05

SAKK 19/05 tutkimuksessa (ClinicalTrials.gov: NCT00354549) otettiin 103 potilasta, joilla on edennyt ei-levyepiteelikarsinooma NSCLC, 101 potilaat olivat arvioitavissa tarkempaa analysointia [21]. Tukikelpoisuusvaatimukset mukana ikä vuotta, riittävä luuytimen toiminta, normaali munuaisten ja maksan toiminta ja mitattavissa oleva tauti. Potilaat, joilla on välitöntä tarvetta kemoterapiaa, suuret keskeisellä paikalla kasvaimia, ennestään kasvaimen kavitaatio ja aivometastaasien jätettiin pois. Extra esikäsittely bronkoskooppiset koepaloja varten käännöstiede otettiin 49 potilasta, joista 42 oli riittävän laadukkaita myöhempää eksonin erilaisia ​​analyysi. Toistaiseksi alatutkimus, esikäsittely verinäytteet oli saatavilla 95 potilaalla, ja näytteitä 75 potilaista oli riittävän laadukkaita eksonin taulukot. Kaikkiaan 76 potilaalla on joko kasvain tai verinäytteiden tai molempia, sisällytettiin nykyiseen osatutkimukseen. Kirjallinen suostumus Translaatiotutkimuksen saatiin kaikista potilaista. Kliininen tutkimus sekä nykyiset alatutkimus hyväksyi IRB St. Gallen (EKSG 06/012).

Trial suunnittelu

SAKK 19/05 oli prospektiivinen, avoin -etiketti yksihaaraisessa, vaiheen II tutkimuksessa aikaisemmin hoitamattomilla potilailla. Tammikuun 2006 ja huhtikuussa 2009 103 potilasta 14 Sveitsin laitosten otettiin ja sai BE taudin etenemiseen saakka tai hyväksyttävää myrkyllisyyttä. Tuolloin etenemisen potilaat saivat kemoterapiaa 4-6 sykliä sisplatiinin ja gemsitabiinia. Ensisijainen päätepiste oli sairauden vakauttaminen korko (DSR) määritellään niiden potilaiden osuus, joilla täydellinen vaste (CR), osittainen remissio (PR) tai stabiili tauti (SD) 12 viikon BE hoidon. Toissijaiset päätetapahtumat olivat TTP alle BE sekä alle CT, kokonaiseloonjääminen (OS), kasvaimen kutistuminen 12 viikon ja 6 kuukautta. Kliininen tulokset Tämän kokeen on raportoitu aiemmin [21].

Patologian analyysi

formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin näytteet tarkistetaan ja luokitellaan Maailman terveysjärjestön (WHO) kriteerit. Mutaatioanalyysit EGFR (eksoni 18-21) ja KRAS (eksoni 12) tehtiin vuosina unstained kudosnäytteiden (3 pm) tai Papanicolaou-värjätty Sytologisten yksilöitä käyttämällä suoraa sekvensointia kuten aikaisemmin on kuvattu [45], [46]. Kasvainsolujen rikastus saavutettiin joko macrodissection tai laser-kaapata mikrodissektion ja DNA-sekvenssianalyysillä.

eksoni-tason geeniekspressioanalyysissä

Kokonais-RNA koko bronkoskooppiset biopsianäytteissä uutettiin ja esitti riittävän laadun microarray hybridisaatio 42 49 näytettä. Kiertävä RNA aäreisverinäytteiden uutetaan ja tarjonneet riittävästi laatua microarray hybridisaatiota kaikissa 75 näytteissä. mRNA hybridisoitiin päälle Affymetrix Human eksoni 1.0ST paneelit (Affymetrix, Santaclara, CA, USA) seuraavan standardin valmistajan suositusten (yksityiskohtainen menettely saatavana teksti S1). Raakadata on talletettu NCBIs Gene Expression Omnibus (GEO), ja pääsee läpi GEO Sarjan hakunumero GSE37138. Eksoni ja geeni tasolla probesets olivat esikäsitellyt, laatu tarkastetaan ja normalisoitu käyttäen RMA menettelyä [47]. Kudos ja veri aineistot analysoitiin itsenäisesti ilman yhdistämistä datan. Kudos aineisto käytettiin biomarkkereiden löytö taas verta aineisto käytettiin sisäistä validointi.

Statistical näkökohdat

Ensimmäinen otoskoko laskelma perustui primaarivasteen kliinisen tutkimuksen (DSR at viikko 12 (DSR12) alle BE hoito). 101 potilaalla, kertyneitä taattu suurella tarkkuudella estimoinnissa DSR12. Kohdennetusti geeni lähestymistapaa, 3 geenejä erityisesti tutkittu: EGFR (ENSG00000146648), KRAS (ENSG00000133703) ja VEGFA (ENSG00000112715). EGFR mukana 51, KRAS 13, ja VEGFA 25 eksoni probesets (kuvio 1). Päätepisteet huomioon tässä biomarkkereiden tutkimuksessa mukana kasvaimen kutistuminen 12 viikon jälkeen (TS12) BE hoitoa, TTP alle BE ja OS. OS mitattiin rekisteröinnistä kuolemaan saakka tahansa syystä. Tuloksena Edellisen kasvaimen EGFR sekvensointia käytettiin alatutkimus analyysiä. Yksiulotteista assosiaatio eksoni-tason intensiteettiä ja time-to-tapahtuman päätepisteet arvioitiin Coxin suhteellista riskiregressioanalyysiä. Korrelaatio eksoni-tason intensiteetin ja kasvaimen kutistuminen mitattiin käyttäen Spearmanin korrelaatiokertoimen ja testattiin merkittävä ero 0. Bonferroni korjauksia käytettiin aiheutua moninkertaisia ​​testaus. Pääkomponenttianalyysi (PCA) käytettiin yhteenvedon tiedot sisältyvät useisiin eksonissa tason probesets osaksi komposiitti- tulokset (pisteet ensimmäisellä pääkomponenttien). Vastaanotin Operating Characteristic (ROC) käyriä käytettiin arvioida herkkyys, spesifisyys ja tarkkuus eksonin ilmaisun perustuvan ennustajia. Jotta voidaan arvioida vakautta havaintomme, rajat validointi strategiaa käytettiin. Tarkkuus luokittelumallin arvioitiin käyttäen bootstrapping. Kaikki analyysit tehtiin käyttäen R tilasto-ohjelmalla (versio 2.13.0, paketteja xmapcore, ade4, ROCR, Daim ja selviytyminen) [48].

tukeminen Information

Kuva S1.

Association välillä EGFR eksoni 18 ilme ja kasvaimen kutistuminen viikolla 12 – sub-analyysi. Vain EGFR villityypin potilasta osallistui tähän analyysiin. Sirontakuvaaja kuvaa korrelaatiota ilmentymisen EGFR eksonin 18 (probeset 3002770) ja kasvaimen kutistuminen viikolla 12. pystysuora viiva osoittaa mediaani ilmaus intensiteetti EGFR eksonista 18.

doi: 10,1371 /journal.pone.0072966 .s001

(TIF) B Kuva S2.

vakaus ennustaminen kyky EGFR biomarkkereiden avulla ristivalidointi strategioita. Vasemmassa paneelissa kuvaa kykyä EGFR biomarkkereiden merkittävimmin liittyy TS12 (≤ / 20%) käyttäen alkuperäistä aineisto (probeset 3002770) luokittelemaan BE vasteen. Paras cut-off-arvo, yhdessä niihin liittyvien väärien positiivisten määrä (FPR), tosi positiivisten määrä (TPR) ja ala ROC-käyrän (AUC) on annettu. Oikeassa paneelissa kuvaa keskimäärin ROC käyrä saadaan, kun 0,632 bootstrap ristivalidointi menettely. Boxplots osoittavat jakautuminen FPR koko uudelleen näytteet aineistoja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0072966.s002

(TIF) B Taulukko S1.

Yhteenveto kaikista potilaista sisältyvät SAKK 19/05 oikeudenkäyntiä. DST W12: taudin eteneminen pysähtyi viikolla 12, 0 = vika, 1 = menestys.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0072966.s003

(PDF)

Text S1.

Lisämateriaali ja menetelmiä tiedon. Ensimmäisessä kohdassa säädetään laajennetun kuvauksen eksonin tason geeniekspressioanalyysissä. Toisessa kohdassa annetaan tietoja arviointia vakautta saadut tulokset.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0072966.s004

(PDF) B

Kiitokset

Sample kerääminen, kuljetus ja käsittely suoritettiin rakenteessa Sveitsin Lung koepala Biopankkiverkosto mistä olemme hyvin kiitollisia. Olemme hyvin kiitollisia Philippe Demougin suorittaneen RNA: n eristys ja eksonin array hybridisaatio. Tutkimuksessa ei olisi voitu tehdä ilman halukkuutta potilaiden osallistumaan tähän tutkimukseen, erityisesti käymään läpi ylimääräinen bronkoskopia tietyissä tapauksissa.

osallistujien

jäsenet SAKK 19/05 Study Team