Krooninen sairaus

tiivistelmä

vapautettiin aktiivisuus transkriptiotekijöiden (TF: t) ja Sp /KLF perhe, kuten SP1 SP3 ja SP4, ja siitä yli-ilmentyminen Sp geenien esiintyy usein ihmisen syövissä. Tämä antaa perusteet kehittämiseksi estäjiä Sp TF: istä kuin syöpähoitojen. Mitramysiini A (MTM-A) on luonnollinen polyketidi, joka sitoo runsaasti GC: DNA-sekvenssit, inhiboi aktiivisuutta Sp TF: ien ja jolla on voimakas antituumorivaikutus kokeellisissa järjestelmissä. Kuitenkin kliininen käyttö MTM-A rajoittaa vakavaa myrkyllisyyttä yhdisteen. Tässä tutkittiin kaksi MTM-A analogeja, jotka oli tuotettu geneettisesti engineering MTM-A biosynteesireitistä, ja arvioidaan niiden vaikutus ihmisen eturauhassyövän soluviljelmissä ja hiiri malleja. Yhdisteet, nimeltään MTM-SDK ja MTM-SK, olivat erittäin tehokkaita

in vitro

proliferaation estossa eturauhassyöpäsolujen ja transkription Sp geenien estämällä sitoutumista Sp proteiinien geenin promoottorit Kun hiirille molemmat yhdisteet olivat hyvin siedettyjä suurimpaan sallittuun annoksilla MTM-SDK ja MTM-SK vastaavasti 4- ja 32- kertaisia ​​MTM-A. Systeemisen antamisen jälkeen, molemmat yhdisteet poistuu nopeasti verenkierrosta mutta säilyy plasmassa huomattavasti yli aktiivinen pitoisuuksilla tarvitaan

in vitro

eston Sp TF aktiivisuutta ja soluproliferaatiota. Johdonmukaisesti, MTM-SDK ja MTM-SK esti transkriptio Sp geenien eturauhasessa tuumoriksenografteja ja näytteillä voimakas antituumorivaikutus in ihonalaisen ja etäpesäkekasvainten ksenograftimalleja vähän tai ei ollenkaan toksisuutta. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että MTM-SDK ja MTM-SK omaavat huomattavasti paremmat farmakologiset ja toksikologiset ominaisuudet kuin MTM-A ja edustavat lupaavia lääkkeitä edenneen eturauhassyövän.

Citation: Malek A, Núñez LE , magistri M, Brambilla L, Jovic S, Carbone GM, et ai. (2012) modulaatio aktiivisuuden Sp transkriptiotekijöiden mitramysiini analogeja uuden strategian metastaattisen eturauhassyövän. PLoS ONE 7 (4): e35130. doi: 10,1371 /journal.pone.0035130

Editor: Leo T.O. Lee, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 07 lokakuu 2011; Hyväksytty: 13 maaliskuu 2012; Julkaistu: 19 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Malek et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro, Swiss National Science Foundation ja Sveitsin Cancer liigan CVC ja GMC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Muut tekijät FM ja LEN ovat työntekijöitä ja FM on osakkaana EntreChem SL, luvanhaltijan yhtiö kuvattujen yhdisteiden käsikirjoituksen. Kaikki muut kirjoittajat ovat toteamaan ole kilpailevia intressejä exist.This ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Kasvaimen aloittamista ja etenemistä ovat välittävät useita signalointireittien ja terapeuttisia hyötyjä saavutettavissa kohdistamalla yksittäiset reitit voidaan rajoittaa [1]. Kohdistaminen sivustoja lähentymistä erilaisten sääntelyyn laskeutuu voi edustaa lupaavampi strategia syövän hoitoon. Transkriptiotekijät (TF: t) ovat erityisen houkuttelevia tässä suhteessa, koska ne ovat solmukohtina signalointipolkujen ja usein vapautettiin ihmisen syövissä [1], [2]. Poikkeava ekspressiota tai aktiivisuutta jäsenten Sp /KLF perhe ien, kuten SP1, SP3 ja SP4, esiintyy monissa ihmisen syövissä [3] Sp TF: t sitoutuvat GC-rikas DNA-elementtejä (GC-box) geenin promoottorit, vuorovaikutuksessa komponenttien kanssa pohjapinta transkription koneet, yhteistyössä muiden TF: ien ja ovat alavirtaan efektoreja useita signalointireittien [3]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että Sp-TF: iä on tärkeä tehtävä patogeneesissä ihmisen syöpien ja ovat lupaavia terapeuttisina kohteina [3], [4], [5],.

mitramysiini A (MTM-A) on luonnollinen polysyklisiä aromaattisia polyketidisyntaasi valmistaa erilaisilla

Streptomyces

lajit [14]. MTM-A sitoutuu ensisijaisesti GC-rikas sekvenssit DNA, estää kilpailevasti sitoutuminen Sp TF: ien ja muiden GC-sitovat proteiinit kuin GC-rikas elementtejä geenin promoottorit ja estää transkription Sp geenien [15], [16], [ ,,,0],17], [18], [19]. Esto Sp säännellyn geenien on tärkeä tekijä biologisen aktiivisuuden MTM-A kokeellisissa järjestelmissä [20], [21]. Kliininen käyttö MTM-A on kuitenkin rajallinen, koska yhdisteen toksisuutta [22]. Geneettisesti engineering MTM-A biosynteesireitistä on antanut mahdollisuuden luoda uusia analogeja MTM-A, jotka saattavat hallussaan parantaa farmakologisten ja toksikologisten ominaisuuksien [23], [24], [25], [26]. Äskettäin kaksi yhdisteet, nimeltään MTM-SDK ja MTM-SK, saatiin käyttämällä metabolista lähestymistapa [27], [28]. MTM-SDK ja MTM-SK osoitti suurempaa kykyä estää SP1 DNA: han sitoutumisen ja soluunottoa verrattuna MTM-A. Tämä lisäsi biologisen aktiivisuuden inhibiittoreina Sp säännellyn geenin transkription ja syöpäsolujen lisääntymistä sekä in vitro että in vivo [27], [29]. Niinpä nämä uudet MTM-A analogit saattavat olla hyödyllisiä syöpien hoidossa epänormaaliin aktiivisuuteen Sp TF: istä.

Tässä tutkimuksessa arvioimme aktiivisuutta MTM-A analogit MTM-SDK ja MTM-SK kokeellisissa malleissa ihmisen eturauhassyövän. Eturauhassyöpä on yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuoleman miehillä länsimaissa [30]. Perinteiset eturauhassyövän hoito kuuluu leikkaus, sädehoito ja androgeenideprivaatio [31]. Huolimatta asteittainen kasvu tautivapaan elinajan ja elämänlaatu, metastaattisen levittäminen on edelleen tärkein kuolinsyy eturauhassyöpäpotilaiden [31]. Advanced eturauhasen syöpä on usein resistentti hormonihoidon ja systeemistä kemoterapiaa on rajoitettu tehoa [31], [32]. Lievittävä hoito on edelleen tärkein vaihtoehto monille näistä potilaista. Siksi uusia terapeuttisia lähestymistapoja on toteutettu hallita metastaattinen eturauhassyöpä. Tila Sp TF: iä eturauhassyövässä on heikosti tutkittu tähän mennessä. Kuitenkin löysimme todisteita rooli vapautuneilla aktiivisuuden Sp TF: ien in taudin alkamisen ja etenemisen eturauhassyöpä. Monet geenit raportoitu olevan osallisena eturauhasen kasvainten synnyssä säätelee Sp tekijät (katso Methods S1 Taulukko S1, S2 ja viitteet). Yhdisteet, jotka häiritsevät Sp TF: iä eri mekanismeilla on vastaavaa tehtävää erilaisten syöpien, mukaan lukien eturauhassyöpä [7], [8], [9], [10], [11], [33], [34], [35] , [36], [37], [38]. Nämä seikat yhdessä bioinformatiikan analyysit julkaistaan ​​geeniekspression aineistoja, johti meidät oletuksen, että Sp-TF: voisi olla merkitystä tavoitteet eturauhasen kasvaimia ja että uusi MTM-A analogeja parannetulla farmakologisia ominaisuuksia voi olla hyötyä tämän taudin hoitamiseksi.

Materiaalit ja menetelmät

yhdisteet ja solulinjat

Ihmisen eturauhassyöpä PC3, DU145, 22Rv1 ja LNCaP-soluja ylläpidettiin RPMI 1640 [39]. Ihmisen normaaleja fibroblasteja ylläpidettiin DMEM: ssä [27]. MTM-A, MTM-SK (EY-7072) ja MTM-SDK (EY-7073) valmistettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [27]. Stock yhdisteiden liuoksia (10 mM) valmistettiin steriiliin suolaliuokseen tai DMSO: hon ja laimennettiin steriiliin suolaliuokseen välittömästi ennen käyttöä [29]. Geenien ilmentyminen ja kromatiinin immunosaos- (ChIP) soluja käsiteltiin 100 nM MTM-SDK ja MTM-SK tai ajoneuvon 24 h.

RNA: n ja proteiinin analyysi

kokonais-RNA viljellyistä soluista ja kasvaimen kudokset eristettiin ja käänteiskopioitiin kuvatulla [27], [29]. Kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä (qRT-PCR) suoritettiin käyttäen ABI PRISM 7000HT Sequence Detection System ja SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems), kuten on kuvattu [29]. PCR-alukkeet on esitetty taulukossa S3.

GAPDH

ja

B2M

käytettiin sisäisen valvonnan. Expression data ilmaistiin prosentteina kontrollista geenin ilmentymisen, kuten on kuvattu [29]. Loppupiste RT-PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu käyttäen SuperScript One-Step RT-PCR-järjestelmä (Invitrogen) ja geenispesifisiä alukkeita [27]. Solulysaatit valmistettiin ohjaus ja lääkkeellä käsiteltyihin soluihin ja proteiinit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Immunoblottaus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [27], [40].

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) B

Solut kerättiin, silloitettu formaldehydillä ja käsitellään sen jälkeen, kun modifioitu EZ-ChIP kitin (Upstate Biotechnology) kuvatulla [41]. Kromatiinin immunosaostettiin vasta-ainetta SP1 ja normaaliin hiiren IgG negatiivisena kontrollina. DNA-proteiini ristisidosten olivat päinvastaiset, ja DNA puhdistettiin kokosoluliuotteista (input) ja immunosaostettiin jakeet. qPCR suoritettiin kuten edellä on esitetty. Alukkeet ChIP analyysi C-myc ja VEGF-promoottori on esitetty taulukossa S3. Sitoutuneen DNA laskettiin viitaten standardikäyrää ja ilmaistaan ​​prosenttiosuutena tulo DNA [41].

In vitro

solujen kasvun esto

Solujen elinkelpoisuus oli määritettiin käyttäen MTT kolorimetristä määritystä, kuten on kuvattu [27]. Solut maljattiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin ajoneuvon tai yhdisteiden 24 ja 72 tuntia. Kukin käsittely suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Eläimet ja ksenograftimalleissa

Kateenkorvattomia nude-hiiret (Balb c nu /nu, 6-8 viikkoa vanhoja) hankittiin alkaen Harlan Laboratories. Hiiriä pidettiin alle patogeenivapaissa olosuhteissa ruokaa ja vettä tarjotaan

ad libitum

ja heidän yleinen terveydentila seurattiin päivittäin. Kaikki protokollat, joissa käytetään koe eläimet tehtiin mukaisesti vakiintuneiden ohjeiden ja noudattaen kansallisia ja kansainvälisiä lakeja ja politiikkaa. Kokeelliset menettelyt ja tutkimus protokollat ​​on tarkistettu ja hyväksytty Sveitsin kantonien Veterinary Authority (hyväksyntä no. 05/2011). Perustaa ihonalainen tuumoriksenografteja, PC3-solut (2 x 10

6 solua) inokuloitiin kylkeen hiirillä. Sillä metastaattinen ksenograftimallia, PC3-solut (0,6 x 10

6) injektoitiin kahdesti häntälaskimoon 24 h antokerrasta.

myrkyllisyys

Healthy CD-1 hiiret antamat Oviedon yliopisto Animal Facility hoidettiin yhdellä tai toistuvasti IV injektiot MTM-SK, MTM-SDK ja MTM-A. Kukin ryhmä koostui 4 hiirtä. Toistuvaan annoksia, lääkkeet annosteltiin IV injektioita joka toinen tai kolmas päivä, yhteensä 10 injektiota. Kehon paino, kuolemat, muutoksia käyttäytymisessä, liikkuvuuteen, syöminen ja juominen tottumukset, ja muita merkkejä paikallisen tai systeemisen toksisuuden kirjattiin päivittäin.

Farmakokinetiikka

Healthy CD-1-hiiriin ruiskutettiin IV jossa MTM-SK (18 mg /kg) ja MTM-SDK (2 mg /kg). Veri kerättiin viiden ajankohtina välillä 5 ja 120 min. Kunakin ajankohtana 3 hiirtä ryhmää kohti analysoitiin. Plasma näytteet laimennettiin 4 tilavuudella asetonitriiliä, vorteksoitiin ja sentrifugoitiin poistamiseksi liukenematonta sakkaa. Sitten supernatantti käytettiin mittaamaan MTM-SDK ja MTM-SK LC-MS: llä. Plasmatasot arvioitiin jälkeen vatsaonteloon (IP) ja IV injektio MTM-SK (18 mg /kg) myös HPLC-UV.

geeniekspressioanalyysissä vuonna tuumoriksenografteja

vaikutusten arvioimiseksi transkriptioon kasvainkudoksissa, hiirillä, joilla on ihonalainen kasvaimia käsiteltiin MTM-SDK (1,2 mg /kg) ja MTM-SK (8 mg /kg) tai suolaliuosta, jonka IV injektiona. Eläimet tapettiin 1, 3 ja 7 päivää injektion. Kasvaimet heti talteen ja jäädytettiin varten RNA: n eristämistä. qRT-PCR suoritettiin kuten edellä on kuvattu. Kunakin ajankohtana 4 hiiret analysoitiin kunkin koeryhmän ja qRT-PCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin näytteelle.

Antituumoriaktiivisuus

Hiiret, ihonalainen kasvaimia käsiteltiin yhdisteillä tai vehikkeliä. Jokainen koeryhmä koostui 10 hiirestä. Lääkeaineet valmistetaan steriiliin suolaliuokseen ja annetaan IP-injektiot joka 3 päivä. Kontrollihiiret saivat IP-injektion steriiliä suolaliuosta. Tuumorin koko mitattiin paksuus kahdesti viikossa. Tulokset edustavat keskimääräistä ± SD 10 hiirtä per ryhmä.

antimetastaattista aktiivisuutta

yhdisteiden arvioimiseksi kyky estää metastaattista kasvaimen kasvua, hiiret saivat häntälaskimoon injektion kasvainsolujen perustaa keuhkometastaasitestissä. Sitten hiiriä käsiteltiin MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM-SK (8 mg /kg) tai steriiliä suolaliuosta antama IP-injektiot joka 3 päivä alkaen kahden viikon kuluttua injektoinnin häntälaskimoon syöpäsoluja. Kaksi ryhmää käsittelemättömiä hiiriä (

n = 3 per ryhmä

) tapettiin 1 ja 2 viikkoa injektion vahvistaa istutusta ja kasvua metastaattisen soluja. Ohjaus ja lääkkeellä käsiteltyjen hiirten (

n = 3 per ryhmä

) sitten tapettiin 1 ja 2 viikon hoidon alussa. Keuhkojen kudokset kerättiin qPCR analyysin ja histologinen tutkimus sen jälkeen, kun H 0,01; **, P 0,001. C) taso SP1, SP3 ja SP4 mRNA määritettiin RT-PCR PC3-soluissa inkuboitiin 100 nM MTM-SDK, MTM-SK tai ajoneuvon 24 ja 48 tuntia. GAPDH käytettiin kontrollina. D) Proteiinin taso SP1, c-Myc, XIAP, ja sykliini D1 määritettiin immunoblottauksella PC3-soluissa inkuboitiin 100 nM MTM-SDK, MTM-SK tai ajoneuvon 24 ja 48 tuntia.

MTM-A ja sen analogit sitoutuvat GC-rikas DNA-elementtejä ja estää sitoutumisen GC-sitovia proteiineja, kuten Sp TFS geenin promoottorit. Sen määrittämiseksi, oliko vaikutukset transkription johtuivat estämällä Sp sitovia, mittasimme sitoutuminen SP1

C-myc

ja

VEGFA

promoottorin valvonnan ja lääkkeellä käsiteltyjen solujen chromatin immunosaostuksella . MTM-SDK ja MTM-SK vähensi sitoutumisen SP1

C-myc

ja

VEGFA

promoottori (Fig. 1 B). MTM-SDK oli tehokkaampi kuin MTM-SK, yhteisymmärryksessä geenien ilmentyminen tietoja. Kuten Sp proteiinit voivat hallita omaa transkriptio [3], arvioimme onko MTM-SDK ja MTM-SK vaikuttanut heidän ilme. Sp1, Sp3 ja SP4 ilmaistaan ​​PC3-soluissa ja hoidon MTM-A analogeja vähensi mRNA-tasolla ja SP1, SP4 ja vähemmässä määrin SP3 (Fig. 1 C). Jälleen MTM-SDK oli tehokkaampi MTM-SK. Proteiini tasot SP1 ja Sp tavoitteita, kuten c-Myc, vähensi myös käsiteltäessä MTM-SDK- ja MTM-SK kanssa mRNA tiedot (Fig. 1 D).

MTM-SDK ja MTM- SK inhiboivat eturauhassyöpäsolujen

inhibitiota Sp TF: ien on osoitettu vaikuttavan proliferaatiota ja eloonjäämistä syöpäsoluja. Olemme tutkineet antiproliferatiivisia vaikutuksia MTM-SDK ja MTM-SK paneelissa eturauhassyövän solulinjoissa, jotka edustavat androgeeniriippuvaisissa (AD) ja androgeenista riippumaton (AI) eturauhasen kasvaimia. LNCaP-solut ovat androgeenireseptorin (AR) positiiviset ja riippuvat AR signalointi. 22Rv1 ovat AR myönteisiä mutta AI. PC3 ja DU145 ovat AR negatiivisia ja AI. Kasvu kaikkien testatuissa solulinjoissa, riippumatta niiden AR tilan, voimakkaasti inhiboivat sekä yhdisteet, MTM-SDK on tehokkaampi kuin MTM-SK (Fig. 2). IC

50-arvot on esitetty kuviossa 2. Lisäksi, kasvua eturauhasen syöpäsolujen estyi ≥50%: iin ≤100 nM kummankin lääkeaineen. Huomattavaa on, että lääkkeet ei ollut vaikutusta näillä annoksilla normaaleilla ihmisen fibroblasteissa (Fig. 2). Elinkelpoisuus normaalien fibroblastien vaikuttivat hieman vasta suuremmilla annoksilla (~20-30% inhibitio 500 nM). Tämä ero herkkyys normaalin ja syöpäsolujen oli linjassa aiempien tietoja, jotka osoittavat, että normaali fibroblastit olivat vastustuskykyisempiä kuin munasarjasyövän solujen apoptoosin altistuessaan MTM-SDK [27].

Eturauhassyöpä solut (DU145, 22Rv1, PC3 ja LNCaP) ja primaariviljelmiä normaalia ihmisen fibroblasteissa (NHF) inkuboitiin yhdisteiden kanssa 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin kolorimetrisellä MTT-määrityksellä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta näytteestä 3 riippumattoman kokeen. IC

50 jokaista solutyyppiä raportoidaan alapaneelin.

myrkyllisyys MTM-SDK ja MTM-SK

Systeeminen myrkyllisyys on merkittävä rajoitus kliinisessä käytössä MTM-A. Siksi arvioimme annoksilla, joilla MTM-SDK ja MTM-SK voitaisiin turvallisesti antaa hiiriin sekä akuutteja ja kroonisia hallinto. Suurin siedetty annoksilla (MTD) MTM-SDK ja MTM-SK kerta IV injektio olivat 4 mg /kg ja 32 mg /kg, vastaavasti (taulukko 1). MTD MTM-SK toistuvaa hoito oli 8 ja 18 mg /kg käyttäen Q2D × 10 ja Q3D x 10 aikataulu, vastaavasti. MTD MTM-SDK oli 1,2 mg /kg ja 1,8 mg /kg, tässä järjestyksessä, kun sitä annetaan kanssa Q2D × 10 ja Q3D x 10 aikataulu. Testasimme vertailun MTM-A ja totesi, että Mtds olivat 1 mg /kg ja 0,5 mg /kg ja toistuvan (Q2D × 10) annostuksesta. Annoksen suurentamista jatketaan sekä MTM-SK kuin MTM-SDK ja toistuva hoito johti etenevä painonlaskua ja muita merkkejä vaikea krooninen myrkyllisyys, mukaan lukien vähentynyt liikkuvuus, konjunktiviitti ja perifeerinen neuropatia. Lopuksi huomattavasti suuremmat annokset MTM-SK kuin MTM-SDK verrattuna MTM-A voidaan antaa turvallisesti sekä yhden ja toistuvia injektioita hiirille ilman merkkejä myrkyllisyydestä.

farmakokinetiikkaa MTM-SDK ja MTM-SK

Veren MTM-SK ja MTM-SDK mitattiin kerta IV injektion annoksella 18 ja 2 mg /kg (Fig. 3). Molemmat yhdisteet poistuu nopeasti verenkierrosta samanlaisia ​​yleisen kinetiikkaa. 5 minuutin jälkeen plasmapitoisuudet olivat noin 20 ja 0,7 uM MTM-SK ja MTM-SDK, vastaavasti. 1 h kuluttua tasot MTM-SK ja MTM-SDK oli noin 1 ja 0,1 uM, tässä järjestyksessä. Siten plasmatasot molemmat yhdisteet olivat yhtä suuri tai suurempi pitoisuus, joka vaaditaan

in vitro

solujen kasvun esto ja tukahduttaminen SP1 riippuvaisen transkription. Seuraavaksi vertasimme farmakokinetiikkaa MTM-SK kerta IV ja IP injektiot. Rinnalla alkuperäisen huippu nähty IV injektio, kinetiikka seuraavat IV ja IP hallinto olivat melko samanlaisia, saavuttaa verrattavissa lääkkeen pitoisuuksia plasmassa 15-30 min ja säilyttää samalla tasolla yli 2-h ajan analyysi (Fig. S3 ).

Hiiret (n = 3 /ryhmä) saivat yksittäisen IV-injektio MTM-SK (A) tai MTM-SDK (B) ja plasman tasot määritettiin LC-MS: llä. Annokset MTM-SK ja MTM-SDK olivat 18 mg /kg ja 2 mg /kg, tässä järjestyksessä.

MTM-SDK ja MTM-SK estävät geenin ilmentymistä ihmisen eturauhasen tuumoriksenografteja

onko MTM-A analogeja pystyivät häiritä toimintaa Sp TF: iä in vivo kun systeemisen annon, hiirillä PC3 tuumoriksenografteja hoidettiin yhdellä IV injektion MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM -SK (8 mg /kg) tai suolaliuosta. Kasvaimet leikattiin 1, 3 ja 7 päivää injektion jälkeen ja RNA: n tasot on valittu Sp geenien mitattiin qRT-PCR: llä. Expression of

C-MYC

,

hTERT

,

VEGFA

,

C-SRC

,

CCDN1

,

CCNE1

,

XIAP

,

MCL1

ja

BIRC5

pieneni merkitsevästi sekä MTM-SDK ja MTM-SK 24 h (Fig. 4). Oli kuitenkin ero joukossa kaksi yhdistettä kinetiikka toipuminen transkription inhibition. Vaikutus MTM-SDK kesti pidempään. Useimmat geenit olivat vielä tukahdutettu 30 50% 3 päivän kuluttua. Jopa 7 vuorokauden kuluttua

VEGFA

,

C-SRC

ja

XIAP

ne olivat yhä huomattavasti alassäädetty. Vaikutus MTM-SK oli päinvastainen nopeammin useimpien geenien palaavat hallitsemaan tasoille 3 tai 7 päivää. Näin ollen molemmat lääkkeet olivat tehokkaita vähentäen transkriptiota Sp-geenien, kun annetaan systeemisesti hiirille, vahvistaa kertyminen aktiivisen lääkeaineen pitoisuuksia kasvainkudoksessa. Lisäksi vaikutus MTM-SDK oli jyrkempi ja pysyviä verrattuna MTM-SK, sopusoinnussa

in vitro

tietoja SP1 sitova ja geenien ilmentymisen.

Hiiret (n = 4 /ryhmä ) ihon alle kasvaimia käsiteltiin yhdellä IV injektion MTM-SDK, MTM-SK tai steriiliä suolaliuosta. Annokset MTM-SK ja MTM-SDK oli 8 mg /kg ja 1,2 mg /kg, tässä järjestyksessä. Kasvaimet kerättiin 1, 3 ja 7 päivää sen jälkeen, kun lääkkeen injektion. Geenien ilmentyminen arvioitiin qRT-PCR. Data edustaa keskiarvoja ± SD transkriptin tason normalisoitu B2M RNA ja ne on esitetty prosentteina ilmentymisen verrattuna kontrollieläimiin, jotka saivat steriiliä suolaliuosta. *, P 0,01; **, P 0,001.

MTM-SDK ja MTM-SK estävät kasvua eturauhasen tuumoriksenograftien

antituumorivaikutus MTM-SDK ja MTM-SK tutkittiin käyttäen ihonalainen tuumoriksenografteja PC3 eturauhasen syöpäsoluja. PC3-solut ovat AI, erittäin tuumorigeenisemmiksi ja metastaattinen. Siten nämä solut ovat hyvä malli kehittyneiden kastraation vastustuskykyisten eturauhassyöpä. Hiirillä, joilla PC3 tuumoriksenografteja sai MTM-SDK (0,6, 1,2 ja 1,8 mg /kg, Q3D x 10) ja MTM-SK (4, 8 ja 12 mg /kg,) joka 3 päivä IP injektiota. IP-anto valittiin, koska se on yleisesti käytetty pitkään hoitoja syöpälääkkeiden yhdisteitä. Lisäksi IV ja IP injektiot olivat lähes vastaavat toisiaan plasmapitoisuutta ja farmakokinetiikkaa. Annokset ja antotapaohjeita perustuivat myös farmakodynaamisen ja MTD tietoja edellä kuvatulla tavalla. Hoito lopetettiin, kun hiiret kontrolliryhmissä oli teurastettava liiallisen kasvaintaakkaa. Lääkeaineella hoidettuja hiiriä seurattiin vielä viikon jälkeen hoidon päättyessä. Hoito MTM-SDK ja MTM-SK vähensi kasvaimen kasvua (Fig. 5A-B). Ero käsitellyn ja käsittelemättömän hiirillä oli tilastollisesti erittäin merkitsevä kaikilla tutkituilla annoksilla. Käsittelyn jälkeen lopetettiin, kasvua ihonalaisen kasvainten hitaasti uudelleen hieman nopeampi kinetiikka tapauksessa pienempiä annoksia MTM-SK. Tämä on yhtäpitävä farmakodynaamisen tiedon, joka osoittaa nopeampi elpyminen geenin ilmentymisen jälkeen MTM-SK hoitoa. Mielenkiintoista on kuitenkin minimaalinen kasvaimen uusiutumista havaittiin hiirissä, joita hoidettiin suurimmalla annoksella MTM-SK. Hoito MTM-SDK ja MTM-SK johti lievää painon menetys, joka korreloi annostasolla mutta ei tilastollisesti merkitsevä (kuvio. 5C-D). Ei merkkejä akuutista toksisuudesta tai paikallista ärsytystä injektiokohdassa hoidon aikana. Kaksi hiirtä hoidettiin suurimmalla annoksella MTM-SDK (1,8 mg /kg) osoitti merkkejä toksisuudesta (esim vähentynyt liikkuvuus, perifeerinen neuropatia) jälkeen useita injektioita. Nämä hiiret otettiin pois jälkeen ja ne, jotka eivät sisälly arviointiin antituumorivaikutus. Koska sama annos annettiin turvallisesti ei ollut kasvainta kantavissa hiirissä, toksisuus, joka havaittiin tällä annoksella voi johtua kasvaimen läsnäolosta tai erot hiirillä kantaa tai sukupuolta.

Hiiret ihonalainen kasvaimia käsiteltiin ilmoitettu annokset MTM-SDK, MTM-SK tai steriiliä suolaliuosta (kontrolli) antama IP-injektiota kahdesti viikossa viiden viikon ajan (Q3D x 10). Kasvaimen tilavuus (A) ja paino (B) mitattiin kaksi kertaa viikossa. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD tuumorin tilavuus kussakin ryhmässä. Nuolet osoittavat alku ja loppu hoidon. **, P 0,001.

MTM-SDK ja MTM-SK estävät kasvua metastasoituneen eturauhassyövän

Olimme kiinnostuneita onko hoidon MTM-A analogit oli myös tehokkaiksi metastaattisessa malli eturauhassyöpää. Tätä varten käytimme kokeellista keuhkometastaasitestissä malli tutkia vaikutuksia hoidon levitetään ihmisen syöpäsoluja immuunipuutteisilla hiirillä. PC3-soluja injektoitiin häntälaskimoon hiirten ja kasvu keuhkojen etäpesäkkeiden seurattiin qPCR yli 4 viikon ajan [42]. Ryhmä käsittelemätön kontrolli hiiret uhrattiin jälkeen, kun ensimmäinen ja toinen viikko alkaen kasvainsolujen injektion. Tällä hetkellä, keuhkoihin sisälsi 0,015 ja 0,135% ihmisen soluja, vastaavasti, mikä vahvistaa implantaatiota ja proliferaatiota injektoidun ihmisen syöpäsoluja (Fig. 6A). Sen jälkeen, hiiret saivat joka 3 päivä IP-injektiota MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM-SK (8 mg /kg) tai vehikkeliä. Ryhmät ohjaus ja huumeiden-käsitellyistä hiiristä tapettiin kahden päivän kuluttua toisesta ja neljännestä injektio ja niiden keuhkot tutkittiin läsnäolo etäpesäkkeitä. Tällä hetkellä, verrokkihiirten sisälsi 2,08% ja 5,94%, vastaavasti, ihmisen syöpäsoluja sopusoinnussa laajennus etäispesäkkeitä keuhkoissa (Fig. 6A). Sen sijaan, hiiriä hoidettiin MTM-SDK oli 0,14% ja 0,09% rinnastettavalle MTM-SK oli 0,43% ja 0,42% ihmisen syöpäsolujen jälkeen toisen ja neljännen injektion, vastaavasti. Täten kasvua ja levittää ihmisen metastaattisten solujen lähes täysin tukahdutetaan käsittelemällä. QPCR -aineisto varmistettiin histologisella tutkimuksella keuhkojen kohdissa lopussa otetun kokeen (Fig. 6B). Useita etäpesäkenystyröiden havaittiin keuhkoissa hiirien, kun taas ei ollut mitään metastaaseja havaittavissa mikroskoopilla leikesarjojen keuhkoihin lääkkeellä käsiteltyjen eläinten.

Hiirille annettiin PC3, jonka IV injektiona häntälaskimoon ja sitten alkaen 3 viikkoa myöhemmin vastaanotetun IP-injektioita MTM-SDK, MTM-SK tai steriiliä suolaliuosta kahdesti viikossa kahden viikon ajan. Annokset MTM-SK ja MTM-SDK oli 8 mg /kg ja 1,2 mg /kg, tässä järjestyksessä. A) qPCR arviointi keuhkometastaasitestissä. Ohjaus hiiret uhrattiin 1 ja 2 viikkoa ennen hoitoa ja sen jälkeen hallita ja lääkkeellä käsiteltyjen hiiret tapettiin lopussa ensimmäisen ja toisen viikon hoidon jälkeen. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD prosenttiosuus ihmisen solujen suhteessa koko hiiren soluihin keuhkoissa (n = 3). Nuolet osoittavat aika lääkeinjektioita. B) mikroskooppinen arviointi keuhkometastaasitestissä. Keuhkokudoksen kerättiin kontrollista ja lääkkeellä käsiteltyihin hiiriin kokeen lopussa ja värjättiin H 0,001.

Keskustelu

Sp perheen transkriptiotekijöitä ohjata monia soluprosesseja välttämättömiä kehittämiseksi ihmisen kasvaimissa [3]. Monipuolinen strategioita on tutkittu viime vuosina puuttua toimintaan Sp TF: istä, mukaan lukien luonnollisia yhdisteitä ja pieniä häiritseviä RNA: ita. Aureolic hapon johdannaiset, kuten MTM-A, ovat tehokkaita inhibiittoreita Sp TF: ien [15], [18], [19], [20]. Nämä yhdisteet sitoutuvat GC-rikas DNA: ta ja estää vuorovaikutusta TF: ien GC-rikas sekvenssejä geenin promoottorit. Lisäksi koska Sp TF: t hallitsevat omaa transkriptio, MTM-A vähentää taso Sp proteiineja, mikä vahvistaa vaikutusta transkriptionaalista aktiivisuutta [21], [34]. Erilaiset tekijät voivat vaikuttaa farmakologisista ja toksikologisista ominaisuuksista aureolic antibiootit: affiniteetti GC-rikas sekvenssit, yhdistys /dissosiaatiokinetiikalla DNA, kyky kilpailla Sp proteiinien sitoutumisesta DNA ja soluunottoa [17], [20], [ ,,,0],27], [43].