Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on vastahakoinen maligniteetti erottuva biologinen ominaisuuksia. Vasta-aine kohdistaminen hoito on tutkittu aktiivisesti uuden lääkkeen modality.

Methods

Testasimme ilmentyminen IGF-1 R ja lasketaan selviytymistä 61 SCLC potilailla. Olemme myös arvioineet antituumorivaikutuksia anti-IGF-1 R monoklonaalinen vasta-aine Figitumumab (CP) on SCLC, ja kokeillut kahden lääkkeen yhdistelmiä parantamiseksi CP terapia.

Tulokset

kliiniset tiedot osoittivat, että korkea IGF-1 R ilmentyminen korreloi alhaisen SCLC potilaan selviytymistä. Sitten osoitti vaikutus CP oli todennäköisesti kautta IGF-1 R tukos ja alassäätö ilman IGF-1 R auto-fosforylaation ja PI3K /AKT aktivointi. Olemme kuitenkin havaittu kohonnut MEK /ERK aktivoinnin yhteydessä CP hoitoa SCLC soluissa, ja tämä MEK /ERK aktivaatio tehostettiin ß-arrestin1 Knockdown taas vaimenee ß-arrestin2 knockdown. Löysimme molemmat MEK /ERK-estäjän ja metformiinin voisivat tehostaa CP hoitoa SCLC soluissa. Olemme edelleen havainnollistettu lisäävältä metformiinin todennäköisesti edistämällä entisestään IGF-1 R alassäätöä.

Johtopäätös

Tuloksemme korostettiin mahdollisuuksia anti-IGF-1 R hoidon ja adjuvanttihoitona strategia joko MEK /ERK-estäjän tai metformiini kohdistaa SCLC, jotka oikeuttavat lisätutkimuksia.

Citation: Cao H, Dong L, Shen H, Xu J, Zhu L, Liu Q, et al. (2015) Combinational Therapy, tehostaa anti-IGF-1 R-mAb Figitumumab Target pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 10 (8): e0135844. doi: 10,1371 /journal.pone.0135844

Editor: Andrea Morrione, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 29 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 27 heinäkuu 2015; Julkaistu: 19 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Cao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: tuettiin maakunnan tieteen ja teknologian kehityksen suunnittelu Shandong (2012GG0021836 ja 2014WS0342), National Natural Science Foundation of China (81301728), Key Project of Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2013HZ001), ja Shandong Natural Science Fund (ZR2014HQ073). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on vastahakoinen maligniteetti korkea toistuminen ja matalan viiden vuoden pysyvyys tavanomaisissa kemoterapiaa ja sädehoitoa [1]. Hoito SCLC on haastavaa johtuen sen nopeasta kasvu ja kehitys lääkeresistenssin aikana sairauden. SCLC hallussaan joitakin selviä molekyyli- ja solumuutoksia, jotka johtavat sen synnyssä, kuten mutaatiot /poistot noin tuumorisuppressorien, aktivointi useiden onkogeenien, epänormaali toiminta joidenkin kehitys- polkuja, ja ylössäätöä tiettyjen reseptorin (RTK: t) [2] . Koska ainutlaatuinen patologinen /biologiset ominaisuudet SCLC, etsien uusia-täsmähoitoihin on korkea prioriteetti. Koska nopeasti laajeneva huume komodaalisuudessa vasta-lääkkeitä vastaan ​​RTK on tutkittu aktiivisesti hoitoon SCLC, ja insuliinin kaltaisen kasvutekijän reseptori (IGF-1 R) on yksi tällainen mahdollisten RTK tavoitteet [3-7].

IGF-1 R ja sen ligandit ilmaistaan ​​yleensä suurentunut tasoilla SCLC, ja raportoidaan korreloivan huonon ennusteen [8,9]. On alustavaa näyttöä siitä, että IGF-1 R signalointireitin on ratkaiseva rooli mitogeneesiä, anti-apoptoosin, pahanlaatuisiksi ja metastasoituneen tapahtumat [10,11]. IGF-1 R katsotaan nyt olevan houkutteleva kohde syövän hoitoon ja joitakin käynnissä kliinisiä kokeita testaamalla IGF-1 R-kohdennettuja lääkkeitä. Figitumumab (CP-751, 871, CP), ihmisen anti-IGF-IR monoklonaalista vasta-ainetta (mAb), on osoitettu olevan anti-proliferaatiota ja anti-kasvainten muodostumiseen vaikutuksia syöpäsolujen ja ksenosiirrettyjä hiirillä, ja se on osoittautui tehokkaasti yhdessä muiden sytostaattien kohdistamaan monia syöpätyyppejä [12-14]. CP tutkittiin vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa yhdessä etoposidin ja sisplatiinin käyttöä ensisijaisena hoitona laaja vaiheessa SCLC (NCT00977561). Kuitenkin tässä tutkimuksessa oli ennenaikaisesti vuonna 2011 johtuen hitaasta ilmoittautuminen potilaista. Kannustaa jatkaa kliinisten tutkimusten, molekyylitason mekanismi, miten CP tavoitteet SCLC on tarpeen. Lisäksi yhdistyminen CP muiden lääkkeiden lisäämiseksi sen teho on myös kriittinen vakuuttaa potilaita ilmoittautua kliinisissä tutkimuksissa.

metformiinin, laajalti käytetty diabeteksen huumeiden johdettu ranskan lila, on kalorien rajoittaminen toimia solujen aineenvaihduntaa. Äskettäin metformiini on nousemassa ehdokkaaksi syöpälääkkeen. Kertymistä tutkimusten mukaan metformiini on anti-syöpä vaikutuksia leukeeminen, pään ja kaulan okasolusyöpä, eturauhassyöpä, rintasyöpä, keuhkosyöpä ja muut kiinteät kasvaimet, mutta sen tarkkaa mekanismien edelleen ratkaisematta [15-20].

pahanlaatuiset solut on yleensä korkeampi glukoosin sisäänoton nopeus ja lisääntynyt glykolyysistä täyttämään metabolinen vaatimuksen nopeasta proteiinisynteesiä ja soluproliferaatiota. Valitettavasti, hyperglykemia on raportoitu olevan yksi erittäin tapahtui haittatapahtumat kliinisissä kokeissa anti-IGF-1 R-mAb-hoidon, joka saattaa hyötyä kasvainsolujen kasvua ja alentaa tehoa lääkkeen [21]. Koska metformiini on sekä hypo glykeemisen ja syöpälääkkeen vaikutuksia, siitä tulee lupaava ehdokas yhdistelmänä anti-IGF-1 R-mAb: iden kohdistaa SCLC.

Lisäksi mahdollinen käyttö metformiinin, toinen ryhmä osoitti, että estyminen MEK /ERK signalointipolkujen edisti vaikutuksia CP ruokatorven syöpä [22]. MEK /ERK estäjiä on käytetty yksinään tai yhdessä muiden lääkkeiden hoitoon useita syöpiä, kuten herkistäviä sädehoidon ja /tai parantaa kemoterapia. Yhdistäminen Selumetinib (AZD6244), joka on MEK1 /2-estäjä, tavanomaisten kemoterapeuttisten aineiden parantanut tehokkuutta kohdistaa eri tuumoriksenografteja [23]. Vuonna NSCLC mallissa käyttöä Selumetinib alensivat VEGF ilmaisun /aktivointi ja kytkentä MEKin ja VEGFR-inhibiittorit edelleen esti kasvaimen angiogeneesi, kasvua ja etäpesäkkeiden [24]. Lisäksi yhdistyminen OSI-906 (IGF-1 R /insuliini-estäjä) kanssa MEK 1/2 estäjien (U0126 ja selumetinib) osoittivat synergististä antiproliferatiivisia vaikutuksia kohdistaa peräsuolen syövän soluja [25]. Koska niiden menestys useita syöpiä, on syytä tutkia, MEK /ERK estäjät voivat parantaa CP-pohjainen hoito SCLC.

Tässä tutkimme molekyylitason mekanismeja antituumorivaikutukset CP SCLC ja osoitti, että Yhdistämällä CP joko MEK /ERK estäjän U0126 tai metformiinia voisi parantaa terapeuttisia vaikutuksia CP kohdistaa SCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Tämä tutkimus oli suoritettu takautuvasti peräkkäisinä primaarisessa SCLC, joille oli tehty kirurginen resektio tammi 2007 joulukuuta 2010 Shandongin maakunnan sairaalassa. Tämä tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt eettinen komitea Shandongin maakunnan sairaala, ja kirjallinen suostumus antoivat osallistujille. Tukikelpoisuusvaatimukset olivat histologinen diagnoosi SCLC, kirurginen resektio ensisijainen vaurio eikä kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta. Potilaat, jotka kuolivat kuukauden kuluessa leikkauksen jälkeen, tai positiivinen kirurgisten marginaali suljettiin pois. Lopuksi, 61 arkistointia formaliinilla kiinnitetyt parafinoidut kasvain näytteet saatiin.

Staging määritettiin perustuen 7. painos kasvaimen solmu-etäpesäke (TNM) luokitus keuhkosyöpään [26]. Seuraavat tiedot kuten ikä, sukupuoli, tupakointi, kasvaimen sijainti, kasvaimen koon, patologisen, ja TNM kerättiin. Kaikkia potilaita hoidettiin mukaan National Kattava Cancer Network (NCCN) ohjeet. Potilaita seurattiin 3 kuukauden välein 1 vuoden kuluessa leikkauksen jälkeen 6 kuukauden välein 3 vuotta, ja sen jälkeen vuosittain.

Ensimmäinen päätepiste oli kokonaiselinaika (OS), määritellään aika toimenpidettä kuolinpäivä, päivämäärä hävisi seuranta tai jona viimeisessä seurannassa. Toinen päätepiste oli tautikohtaisia ​​eloonjäämisen (DSS), ja epäonnistuminen määriteltiin kuolema keuhkosyöpään tai hoitoon liittyviin komplikaatioihin. Muita loppupiste sisältyvät tautivapaan elinajan (DFS), määritellään välinen aika, jona lopullisen resektio ja havaitsemista ensimmäisen tauti uusiutuu, etäpesäke, tai viimeisimmän seurannan.

immunohistokemiallinen (IHC) analyysi kasvaimen yksilöiden

immunohistokemia (IHC) IGF-1 R ja Ki-67 suoritettiin. Tiedot IHC analyysi on kuvattu aiemmin [27]. IGF-1 R-ekspressio tekee tehon määrittämiseksi ja positiivisten solujen prosenttiosuuden. Intensiteetti pisteytettiin negatiivisiksi (0), heikko (+1), kohtalainen (+2), tai vahva (+3). Laajentamalla positiivisten solujen teki kuuteen kategoriaan: ei värjäytymistä (0), 1-5 (+1), 5-25 (+2), 25-50 (+3), 50-75 (+4), ja 75-100% (+5) positiivisia soluja. Immunoreaktiivisuus pistemäärä (IRS) laskettiin kertomalla värjäyksen intensiteetti ja laajennus, johtaen asteikolla 0 15. IRS jaettiin kahteen ryhmään: negatiivinen tai heikko värjäytyminen (IRS 0-5) ja positiivinen tai korkea värjäytymistä ( IRS 6-15). Ki-67 värjäys pisteytettiin prosenttiosuutena positiivisten tumavärjäystä soluja ja cutoff taso jakaa ryhmiin prosenttiosuudet tumavärjäystä 50% positiivisia.

reagenssit

IGF-1Rß, fosforia IGF-1 R (Tyr1135 /1136), fosfori-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) ja fosfo-Akt (Ser473) mAb: t ostettiin Cell Signaling Technology. Anti-ß-arrestin1 ja anti-ß-arrestin2 mAb: t olivat Abcam. Anti-GAPDH mAb oli Santa Cruz. Ihmisen IGF-1 ja metformiinin hankittiin Sigmalta. Figitumumab toimitti Pfizer.

Cell Culture

H446, H526 ja SKBR3 solut hankittiin ATCC. H446 ja H526 pidettiin RPMI-H1640 väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS). SKBR3 pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää.

Transfektio

siRNA: t vastaan ​​ß-arrestin-1 ja ß-arrestin-2 saatiin GenePharma (Shanghai, Kiina). Ohimenevä transfektio siRNA: iden (30 nM) suoritettiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollan.

Western-blottaus-määritys

Protein näytteet liuotettiin litium umdodekyylisulfaattinäytepuskuria (Invitrogen) ja yhtä suuret määrät näytteitä erotettiin SDS /PAGE: lla. Yksityiskohdat Western blotting-analyysi on kuvattu aikaisemmin [22].

Densitometria Analyysi

Band intensiteetti kvantifioitiin ImageJ ja tulokset normalisoitiin vastaavaan lastaus valvontaa.

solunelinkykyisyysmääritys

Solulisääntyminen mitattiin MTT (Sigma Chemical). Soluja inkuboitiin 96-kuoppaisilla levyillä, ja sopivan käsittelyn jälkeen ajan, solujen elinkykyisyys testattiin valmistajan protokollaa. Triplikaatteina tehtiin kunkin hoitoon.

Tilastollinen analyysi

erot potilasryhmät ryhmää kohti ja koekspressoimalla markkereita laskettiin Fisherin testiä. Survival käyrät laskettiin Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin log-rank-testi. Tunnistaa ennustavat tekijät OS ja DFS, yhden muuttujan Coxin regressio analyysit tehtiin. Studentin t-testiä tai ANOVA suoritettiin korjaamiseksi useiden vertailujen, kuten siirrettäväksi. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia ja tehtiin SPSS ohjelmistoa 19,0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Tulokset

IGF-1 R ekspressiotaso negatiivisesti korreloi selviytymisen SCLC potilaiden

ensimmäinen tutki, IGF-1 R ilmentymisen tasolla voisi ennustaa selviytymisen SCLC potilaista. Kaikkiaan 61 potilasta oli mukana Tutkimuksessamme lukien 39 miestä ja 22 naista, joiden keski-ikä oli 57,21 vuotta (vaihteluväli 30-75 vuotta). Mediaani seuranta-aika oli 40 kuukautta, jotka vaihtelevat 5-81 kuukautta. Tärkeimmät kliiniset ominaisuudet potilaat olivat taulukossa 1 ja edustava immunohistokemiallinen värjäys osoitti kuviossa 1 a. Vuonna Vastaavaa analyysin, IGF-1 R ilmaisun ja kliinisten parametrien, IGF-1 R-ekspressio liittyi merkitsevästi kasvaimen kokoa, N tilan vaiheessa, ja Ki-67 (taulukko 1).

(a) immunohistokemiallinen värjäys ja IGF-1 R ja Ki-67 (X400) in SCLC potilaan näytteiden mukaan ilmentymistason IGF-1 R. (B) Kokonaiselossaoloaika /tautikohtaista selviytymisen SCLC mukainen matalan ja korkean IGF-1 R ilme. (C) Tautivapaa eloonjääminen SCLC mukainen matalan ja korkean IGF-1 R ilme.

arvioinut ennusteen arvioinnissa IGF-1 R ilmentyminen liittyvät kolmeen loppupisteet: kokonaiselossaoloaika (OS ), tautikohtaisia ​​eloonjäämisen (DSS), ja taudista vapaan eloonjäämisen (DFS). Huomasimme, että kaikki kuolemat olivat SCLC liittyviä, joten DSS oli sama tulos kuin käyttöjärjestelmä. Kaplan-Meier -käyrät kahden potilasryhmien for OS /DSS oli kuvassa 1b. OS /DSS oli merkitsevästi pienempi potilailla, joilla IGF-1 R-alhainen kasvaimia kuin IGF-1 R-korkea kasvaimet (P = 0,031). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös DFS-analyysi (p = 0,048) (kuvio 1c). Tuloksemme osoittivat mahdollisen käytön IGF-1 R markkerina huonon ennusteen SCLC. Lisäksi käytimme Coxin suhteellisen vaarat regressiomalleja määrittää itsenäisen ennustavat OS /DSS ja DFS (taulukko 2). Sex, vaihe, ja IGF-1 R ilmentyminen olivat merkittäviä OS /DSS (p = 0,006, 0,039, 0,037) että yhden muuttujan Coxin analyysi, kun taas vain IGF-1 R ilmentyminen todettiin olevan itsenäisesti ennusta monimuuttujakalibrointiin Cox analyysi (p = 0,037). DFS, sukupuoli, vaihe, ja IGF-1 R ilmentyminen oli tilastollisesti merkitsevä Yksiulotteisissa Cox analyysi (p = 0,002, 0,023, 0,048), kun taas mitään parametreja oli merkittävä Coxin monimuuttuja analyysiä. Kaiken kaikkiaan meidän kliiniset tiedot osoittivat, että IGF-1 R ekspressiotaso korreloi negatiivisesti potilaiden selviytymiseen, mikä tarkoittaa, että IGF-1 R-kohdistaminen terapiassa, kuten CP, on mahdollista terapeuttista arvoa.

antituumorivaikutukset CP in SCLC solulinjoissa

Koska IGF-1 R on todennäköisesti tärkeä rooli SCLC, IGF-1 R CP, joka kilpailee IGF sitoa reseptoriin, voi olla hyödyllistä hoitoon SCLC. Valitsimme H446 ja h526, tyypillinen SCLC solulinjat, tutkia vaikutuksia CP. Kuten on esitetty kuviossa 2a, IGF-1 stimulaatio johti IGF-1 R: auto-fosforylaation ja aktivaation alavirran PI3K /AKT ja MEK /ERK signalointireittien on H446 ja H526-soluissa, kun taas SKBR3, rintasyöpä solulinja tunnetaan ilmaista pieni määrä IGF-1 R, ei vastausta hyvin.

(a) Soluja ilman ravintoa 12 tuntia ja stimuloidaan 6.5nM IGF-1 10 min. p-IGF-1 R, t-IGF-1 R, p-ERK, t-ERK, p-AKT, t-AKT ja GAPDH havaittiin WB. (B) Soluja käsiteltiin 0.065nM, 0.65nM, ja 6.5nM CP 48 h läsnäolon tai puuttumisen seerumia. Solujen elinkelpoisuus testattiin MTT. Useita elävien solujen seuraavista CP hoidon esitettiin prosentteina käsittelemättömien solujen. Teimme kutakin koetta varten kolme kertaa, ja tiedot olivat edustettuina keskiarvo ± SEM. Tilastollinen analyysi: * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

Sitten tutkittiin herkkyys SCLC solulinjojen CP hoitoon. Kuten on esitetty kuviossa 2b, kun käsiteltiin 0.65nM CP, H446 ja H526 solujen elinkelpoisuuden verrattuna käsittelemättömään kontrolliin solut olivat 84,2% vs. 48,6% ja 75,1% vs. 63,9% seerumissa-lisätty keskipitkän ja seerumivapaassa väliaineessa (SFM ), tässä järjestyksessä, kun taas SKBR3 solujen elinkelpoisuus ei juuri muuttunut, kun CP hoitoa. Tämä merkitsee sitä, että vaikutukset CP on IGF-1 R riippuvainen. SFM ryhmä piti suojata kilpailua IGF-1 sisälsi normaalissa seerumiväliaineessa. CP oli alun perin suunniteltu kilpailemaan IGF1 IGF-1 R estämään reseptorin aktivoitumisen, ja antiproliferatiivinen vaikutus seerumin tuovia väliaineessa tukenut tätä teoriaa. Kuitenkin antiproliferatiivinen vaikutus SFM olosuhteissa ehdotettu, että CP voisi joko edelleen tukahduttaa jotkut pohjapinta IGF-1 R aktiivisuus, joka oli havaittavissa Western blot, tai se voi olla muiden anti-lisäkasvu /apoptoosin vaikutuksia riippumaton IGF-1 R auto-fosforylaatio /aktivointi.

CP indusoi IGF-1 R endosytoosin /alassäätöä lisääntynyt ERK aktivointia, mutta ei IGF-1 R ja PI3K /AKT

Kuten jotkut mAb: t saattavat antaa kohdistaminen reseptorin endosytoosin ja alaspäin sääntely, tutkimme jos CP on samankaltaisia ​​vaikutuksia. Kuten on osoitettu kuviossa 3a, CP voi alas-säädellä IGF-1 R on ajasta riippuva tavalla, joka on samanlainen kuin IGF-1-indusoitua reseptorin endosytoosin /hajoamista. Mielenkiintoista, verrattuna IGF-1, CP jatkuvasti vähentynyt IGF-1 R ilmaisu taas IGF-1 R alkoi ilmaista takaisin sen jälkeen 48 tuntia IGF-1 stimulaatio (kuvio 3a), mikä viittaa siihen, voimakas ja jatkuva vaikutus CP IGF-1 R alassäätöä .

(a) H446 ja H526-soluja seerumia 12 h ja käsiteltiin joko 0.65nM CP tai 6.5nM IGF-1. IGF-1 R ja GAPDH havaittiin kautta WB. Intensiteetti IGF-1 R kvantitoitiin densitometrillä, normalisoitiin GAPDH, ja näytetään prosentteina intensiteetin 0h. (B) Soluja ilman ravintoa 12 tuntia ja käsiteltiin 6.5nM IGF-1 tai 0.65nM CP sarjalle ajankohtina. Solulysaatit analysoitiin WB p-IGF-1 R, t-IGF-1 R, p-AKT, t-IGF-1 R, p-ERK, t-ERK ja GAPDH. (C) Soluja ilman ravintoa 12 tuntia ja käsiteltiin 6.5nM IGF-1 tai 6.5nM IGF-1 plus 0.65nM CP sarjalle ajankohtina. Solulysaatit analysoitiin WB p-IGF-1 R, t-IGF-1 R, p-AKT, t-IGF-1 R, p-ERK, t-ERK ja GAPDH. (D) Soluja käsiteltiin U0126 (0, 0,5, 1, 2, 3, 5, 8, 10 uM) ja 60 min, ja sitten inkuboitiin kanssa tai ilman 0.65nM CP 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus testattiin kautta MTT. Solulysaatit valmistettiin eri pitoisuudet U0126 tai ilman CP, p-ERK ja t-ERK analysoitiin WB. (E) Knock alas beta-arr1 ja ß-arr2 by siRNA H446-soluissa. (F) H446 soluja pudotettiin joko SS-arr1 tai ß-arr2. Sitten soluihin ilman ravintoa 12 tuntia, käsiteltiin 0.65nM CP tai 6.5nM IGF-1 24 tuntia. Solut transfektoidaan salatun siRNA kontrollina. IGF-1 R ja GAPDH havaittiin kautta WB. (G) H446 soluja pudotettiin joko SS-arr1 tai ß-arr2. Sitten soluihin ilman ravintoa 12 tuntia, käsiteltiin 0.65nM CP tai 6.5nM IGF-1 10 min. Solut transfektoidaan salatun siRNA kontrollina. p-IGF-1 R, p-ERK ja GAPDH havaittiin kautta WB. Teimme kutakin koetta varten kolme kertaa, ja tiedot olivat edustettuina keskiarvo ± SEM. Tilastollinen analyysi: * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

Kasvutekijän indusoiman reseptorin endosytoosin on kriittinen RTK signaalitransduktion ja esto endosytoosin voisi lieventää alavirran signalointia reittejä [28]. Koska CP näyttää olevan samanlainen vaikutus kuin IGF-1 on IGF-1 R endosytoosin ja hajoaminen, tutkimme jos CP hoito voisi muuttaa alavirran signalointireittejä. Kuten kuviossa 3b, kun solu nälkään, IGF-1 voisi aktivoida IGF-1 R-signalointireitin on ajasta riippuva tavalla, jossa Pakt ja Perk huipussaan 10 min kuluttua stimulaation. Kuitenkin CP onnistunut indusoimaan automaattinen fosforylaation IGF-1 R tai aktivoida PI3K /AKT (Kuva 3b). Aktivointi ERK oli hieman korkeampi, varsinkin kun 60min CP hoitoa, mutta se oli vielä paljon heikompi kuin aktivoidaan IGF-1 (kuvio 3b). Lisäksi tutkimme vaikutus CP IGF-1 riippuvainen alavirran signalointia. Kuten kuviossa 3c, esimerkiksi lisäämällä CP voi lieventää fosforylaation IGF-1 R, AKT ja ERK erottamisesta muista stimuloidaan IGF-1. Meidän tiedot osoittivat, että CP voisivat alas-säädellä IGF-1 R H446 ja H526-soluissa, joka on luultavasti kautta mAb aiheuttama reseptorin endosytoosin /hajoamista, ja endosytoosin reseptori ei merkittävästi aktivoi alavirran signalointireitteihin verrattuna IGF-1. Tämä lähes ”hiljainen” reseptori down-regulation Ilmiö saattaa osittain selittää antituumorivaikutuksia CP.

estäminen ERK aktivointi parantaa entisestään terapeuttinen vaikutus CP kohdistaa SCLC soluihin

sitten yritti yhdistää CP muiden lääkkeiden kasvattaa tehoa vastaan ​​SCLC. Huomasimme, että siellä oli joitakin pohjapinta MEK /ERK aktivaation H446 ja H526-solujen jälkeen solu nälkään ja Perk taso oli jopa hieman lisääntynyt jälkeen CP hoidon (Kuva 3b). Koska CP aiheuttama ERK aktivointi saattaa taustalla mekanismi SCLC solujen eloonjäämistä ja lääkeresistensseihin aikana CP hoidon, tutkimme vaikutuksia yhdistämällä CP kanssa U0126, tietyn MEK /ERK estäjä estää loppupään ERK aktivointi, on H446 solulinjassa . Kuten kuviossa 3d, solujen elävyyden piti pienenee konsentraation kasvaessa U0126, mikä viittaa keskeistä roolia MEK /ERK signalointia SCLC. Lisäksi oli lisäaineen vaikutuksista U0126 plus CP hoitoon verrattuna joko U0126 pelkästään tai CP vain, mikä mahdollinen hyöty ERK aikana CP hoidon. Ja western blot tulos osoitti estävää vaikutusta U0126 on MEK /ERK signalointi. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa Zinn.

et al

., Joka ilmoitti, että matalan esikäsittely p-ERK taso voi olla osoitus herkkyys IGF-1 R pienmolekyylisalpaajien hoidon SCLC [29].

Knockdown beta-arrestin2 nimenomaan estää MEK /ERK aktivaation CP-käsiteltyjen SCLC-solujen

Olemme osoittaneet, että CP voivat aiheuttaa IGF-1 R hajoamista ja ERK aktivointi. Sitten yritetään tutkia mekanismia IGF-1 R auto-fosforylaation riippumaton ERK aktivointia. Yhtenä tärkeimmistä vaikutuksista CP olivat aiheuttavan IGF-1 R endosytoosin /hajoamista, päätimme keskittyä SS-arrestins (ß-sov), keskeinen perheen proteiineja, jotka liittyvät IGF-1 R ubikinaation ja endosytoosin [30]. On kaksi ß-arrestin isoformeja, SS-arr1 ja 2, ja ne on ehdotettu olevan toiminnallisesti tarpeeton [31,32]. Käytimme siRNA on pudotus erityisiä SS-arrestin (ß-arr1 KD tai ß-arr2 KD) in H446-soluissa (kuvio 3e), jossa salattu siRNA kontrollina. Ensin tutkitaan niiden vaikutuksia IGF-1 R hajoamista. KD beta-arr1, mutta ei SS-arr2, pelasti IGF-1 aiheuttama reseptorin hajoaminen; kuitenkin, KD ei ß-arr1 eikä ß-arr2 voivat estää CP aiheuttamaa IGF-1 R hajoamista (kuvio 3f). Olemme edelleen tutkittu vaikutuksia beta-arrestins KD ERK aktivointia. Yllättäen kun pudotti ß-arr1 in H446-soluissa, lisäansiot taso dramaattisesti lisääntyi sekä IGF-1- ja CP-käsiteltyjen ryhmien (kuvio 3g), mikä viittaa estävä rooli beta-arr1 aikana ERK aktivoinnin. Sitä vastoin ß-arr2 KD-solujen aktivaation ERK oli alempi sekä IGF-1 ja CP käsiteltyjen solujen verrattuna kontrollisoluihin. Meidän tiedot osoittivat, että ß-arr2 oli kriittinen ERK aktivointia, ja yhdistelmä CP SS-arr2 KD dramaattisesti vähentynyt lisäansiot alle määritysrajan tason Western blot, joka osoittaa mahdollisia terapeuttisia arvoja yhdistää CP SS-arr2 estäjä hoitoon SCLC . Tuloksemme ovat myös mukaisesti julkaistussa kirjallisuudessa, jossa SS-arrestins tarkistettiin sen tukirakenteen tyrosiinikinaasiperheen ja voisi johtaa aktivoitumiseen ERK G proteiiniin kytkeytyneiden reseptorien (GPCR: t) [33].

Metformiini inhiboi SCLC kautta IGF-1 R signalointireitistä

Seuraavaksi kysyimme, jos voisimme käyttää CP yhdessä toinen mahdollinen syöpälääkettä, metformiini, parantaa sen tehokkuutta. Ensin yrittivät vahvistaa anti-kasvain vaikutuksia metformiinin SCLC käsittelemällä H446 ja H526-solujen kanssa metformiinin yksinään tai yhdessä IGF-1 (kuvio 4a). Koska IGF-1 stimulaatio vaimensi antiproliferatiivisia vaikutuksia metformiinin, me arveltu, että metformiini ja CP saattavat lisätä antituumorivaikutuksia. Olemme myös arvioinut seuraus metformiinin IGF-1 R-signalointireitin ja kuten kuviossa 4b, IGF-1-stimuloitujen IGF-1 R fosforylaation ja loppupään PI3K /AKT ja MEK /ERK aktivointia laskivat jälkeen käsittelemällä soluja metformiinin kanssa. Myös edellisiin tuloksiin, KD beta-arr1 edistänyt ERK aktivointi taas KD beta-arr2 heikennetty ERK aktivointia, ja nämä vaikutukset havaittiin sekä IGF-1 vain ja IGF-1 plus metformiini olosuhteet H446 solulinjassa (kuvio 4c) . Lisäksi metformiini voi myös alas-säädellä IGF-1 R on ajasta riippuva tavalla H446-soluissa (kuvio 4d). Kaiken kaikkiaan vaikka hienomekanismin metformiinin n syöpälääkkeen vaikutukset olivat vaikeasti, meidän tiedot osoittivat, että se toimii osittain estämällä IGF-1 R-signalointireitin.

(a) H446 ja H526-soluja käsiteltiin 48 h metformiinilla (3mm ) yksinään, IGF-1 (6.5nM) yksinään, tai IGF-1 ja metformiinin. Solujen elinkelpoisuus testattiin kautta MTT. Useita elävien solujen seuraavista käsittelyistä on esitetty prosentteina käsittelemättömien solujen. (B) 12 tunnin kuluttua nälkään, H446 ja H526-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 3 mM metformiinin 1 tunti. Sitten soluja käsiteltiin 6.5nM IGF-1 sarja ajankohtina. Solulysaatit analysoitiin WB p-IGF-1 R, t-IGF-1 R, p-AKT, t-IGF-1 R, p-ERK, t-ERK ja GAPDH. (C) ß-arr1 ja ß-arr2 KD H446-soluja ilman ravintoa 12 tuntia ja käsiteltiin tai ilman 3 mM metformiinia 1 h. Soluja stimuloitiin sitten 6.5nM IGF-1 10 min. Solulysaatit analysoitiin p-IGF-1 R, p-ERK ja GAPDH kautta WB. (D) Soluja inkuboitu 3 mM metformiini sarjan ajankohtina, ja taso koko IGF-1 R havaittiin kautta WB. Teimme kutakin koetta varten kolme kertaa, ja tiedot olivat edustettuina keskiarvo ± SEM. Tilastollinen analyysi: * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

lisäaine vaikutuksia CP metformiinin kohdistaa SCLC

Koska vaikutuksia metformiinin ja CP olivat melko samanlaiset kannalta reseptorin alassäätö ja IGF-1 R signalointireitistä esto, me kysyi onko lisäaine antituumorivaikutuksia kun yhdistetään metformiinia CP. Testasimme H446 solujen elinkykyä (MTT-määritys) hoidon jälkeen CP yksinään tai CP ja metformiinin, ja koe suoritettiin sekä ilman seerumia. Edellisiin tuloksiin, CP oli dramaattisempi antiproliferatiivisia vaikutuksia nälkään olosuhteissa verrattuna seerumia sisältävällä olosuhteissa (kuvio 5a). Kiinnostavaa, metformiini edistää CP: n vaikutuksia vastaan, SCLC-soluja sekä seerumia, joka sisälsi (82,6% vs. 64,5%) ja SFM (49,4% vs. 40,7%) olosuhteissa.

(a) H446-soluja esikäsiteltiin 3 mM Metformin 1 h, ja sitten 0.65nM CP lisättiin läsnäolon tai puuttumisen seerumia. MTT tehtiin testaamiseksi solujen elinkyky sen jälkeen, kun 48 tunnin inkuboinnin jälkeen. Useita elävien solujen käsittelyn jälkeen on esitetty prosentteina käsittelemättömien solujen. (B) 12 tunnin kuluttua nälkään, solut käsiteltiin tai ilman 3 mM metformiinin 1 tunti, ja käsiteltiin sitten 0.65nM CP 10 min. Solulysaatit analysoitiin p-IGF-1 R, t-IGF-1 R, p-ERK, t-ERK ja GAPDH kautta WB. (C) 3 mM Metformin lisättiin soluihin 1 tunti, sitten 0.65nM CP lisättiin sarjan ajankohtina. Ilmaisu taso IGF-1 R ja GAPDH havaittiin kautta WB. (D) ß-arr1 KD H446-soluja käsiteltiin 3 mM metformiinin 1 tunti, ja sitten inkuboitiin 0.65nM CP 24 tuntia. IGF-1 R ja GAPDH havaittiin kautta WB. Teimme kutakin koetta varten kolme kertaa, ja tiedot olivat edustettuina keskiarvo ± SEM. Tilastollinen analyysi: * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

Sitten tutkittiin mekanismia tämän lisäaineen syövän vaikutusta. Koska CP yksin stimuloi Perk ja olemme osoittaneet jotkin lisäaineiden lääkkeen vaikutuksia MEK /ERK estäjä, metformiini saattavat toimia samoin auttaa sammuttaa ERK aktivointia. Vaikka CP yksin kasvoi edelleen Perk tasolla, jossa yhdistyvät CP metformiinin voinut estää sitä (kuvio 5b). Näin ollen meidän tulokset ymmärtää, että lääkkeen additiivinen vaikutus metformiinia on erilainen kuin MEK /ERK-inhibiittoria. Sitten tutkittiin, metformiinilla oli jotkin lisäaineiden vaikutuksia reseptorin down-regulation. Kuten kuviossa 5c, aikariippuvainen IGF-1 R hajoaminen nähtiin sekä CP yksin ja CP ja metformiinin ryhmiä, ja metformiini voisi entisestään tehostaa CP aiheuttama reseptorin down-regulation. Myös edellisiin tuloksiin, ß-arr1 KD voisi osittain pelastaa IGF-1 ja metformiinin aiheuttama IGF-1 R alassäätöä, mutta ei CP metformiinin (kuvio 5d), kun taas SS-arr2 KD voisi pelastaa ole (tietoja ei esitetty). Kaiken kaikkiaan tuloksemme ehdotti additiivinen terapeuttinen vaikutus CP metformiinin kohdistaa SCLC. Tämä monimuotoiset terapeuttinen vaikutus saattaa olla indusoimalla edelleen IGF-1 R alassäätöä, ja meidän tiedot osoittivat, että tämä prosessi on säännelty riippumaton beta-arrestins.

Keskustelu

Vasta lääkkeet ovat äskettäin laajalti käytetty syövän hoitomuotoja. Vaikka CP osoitti rohkaisevia tuloksia vaiheen II kliinisissä kokeissa hoitoon useita syöpiä, tulos vaiheen III kliinisessä tutkimuksessa oli pettymys. Yksi tärkeimmistä haitoista CP oli puutteellista tehoa. Toinen tuore kliinisessä tutkimuksessa testataan CP oli ennenaikaisesti hitaiden ilmoittautuminen potilaista. Siksi nykyään on tarve arvioida, CP on tarpeeksi terapeuttinen arvot jatkaa kliinistä tutkimusta, ja jos on, miten voisimme kannustaa ilmoittautuminen potilaista. Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme mekanismi CP ja arvioitiin mahdollisuuksia yhdistelmähoidon kohdistaa SCLC.

Tutkimme eri SCLC potilaan kudosten ja yhdenmukaisia ​​arvokas tuloksia, löysimme potilaat, joilla on korkeampi IGF-1 R lauseke kasvaimia oli huonompi eloonjäämisprosentti (kuvio 1 b), mikä viittaa mahdollista terapeuttista arvoa CP kohdistaa SCLC. Samanlainen SCLC potilaan kudoksiin, H446 ja H526-soluissa on suhteellisen korkea ilmentyminen IGF-1 R (kuvio 2a), ja CP hoito voisi inhiboida H446 ja H526-soluissa sekä seerumia lisättiin ja seerumittomissa olosuhteissa (kuvio 2b). Antiproliferatiivista vaikutusta seerumia olosuhteissa oli yllättävää, koska IGF-1 R oli yleisesti fosforyloitumaton ja aktiivinen ilman seerumia ja pääasiallinen vaikutus CP ajateltiin kilpailla IGF-1 sitoa /inhiboida IGF-1 R. Tuloksemme ymmärtää, että vieressä kuin IGF-1 kilpailijan, CP voi myös estää SCLC sellaisen mekanismin kautta, joka on riippumaton IGF-1 R: auto-fosforylaation. Löysimme CP voi käynnistää IGF-1 R endosytoosin /alas-asetusta, joka oli voimakkaampi kuin indusoi IGF-1, ja CP aiheuttama endosytoidut IGF-1 R hoidettu fosforyloitumaton ja aktiivinen (kuvio 3b). Näin ollen, yksi mahdollinen selitys voisi olla endosytoosin fosforyloitumaton IGF-1 R voi laukaista muiden signalointireittejä, jotka edistävät antiproliferatiivisia /apoptoosin vaikutuksia. Tämä hypoteesi on validoitu tulevissa tutkimuksissa.

Vaikka CP ei aktivoida PI3K /AKT, joka on alavirtaan IGF-1 R signalointireitistä, osoitimme, että CP voisi edistää ERK aktivointia, joka välittyy ß -arrestin2 samalla estettiin SS-arrestin1.