Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

tryptaasi- on seriiniproteaasiin varastoidaan ja vapautuu syöttösoluista (MC), joka on rooli kasvaimen angiogeneesiä. Tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan seerumin tryptaasi- tasoilla Colo-peräsuolen syöpä (CRC) potilasta ennen (STLBS) ja jälkeen (STLAS) radikaali kirurginen resektio. Olemme myös arvioineet mastsolun tiheys positiivisesta tryptaasi- (MCDPT) ja mikrovaskulaarinen tiheys (MVD) perusterveydenhuollossa kasvainkudoksessa.

Methods

sarja 61 potilasta vaiheen B ja C CRC (mukaan Astler ja Coller lavastus järjestelmä) valittiin. Seerumin verinäytteet kerättiin potilailta päivää ennen ja yhden päivän kuluttua leikkauksesta. Tryptaasi tasot mitattiin käyttäen UniCAP tryptaasi Fluoroenzymeimmunoassay (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi). Kasvaimen leikkeitä immunovärjättiin ensisijainen anti-tryptaasi–aineella (klooni AA1, Dako, Glostrup, Tanska) ja anti-CD-34-vasta-ainetta (QB-END 10; Bio-Optica Milano, Italia) avulla Immunohistokemian ja arvioidaan sen jälkeen kuva analyysimenetelmät.

tulokset

keskiarvo ± sd STLBS ja STLAS oli 5,63 ± 2,61 ug /l, ja 3,39 ± 1,47 ug /l, tässä järjestyksessä, ja merkittävä ero keskiarvon tasojen havaittiin: p = 0,000 t-testillä. Keskiarvo ± S.D. of MCDPT ja MVD oli 8,13 ± 3,28 ja 29,16 ± 7,39 vastaavasti. Vahva korrelaatio STLBS ja MVD (r = 0,83, p = 0,000); STLBS ja MCDPT (r = 0,60, p = 0,003); ja MCDPT ja MVD (r = 0,73; p = 0,001) havaittiin.

Johtopäätös

Tulokset osoittivat korkeampia STLBS CRC potilailla, mikä viittaa osallistuminen MC tryptaasi- CRC angiogeneesiä. Data osoitti myös alempi STLAS, mikä viittaa vapauttamaan tryptaasisubstraatti kasvain infiltroituneen MC. Seerumin tryptaasi- pitoisuudet voivat siksi olla merkitystä uutena biomarkkerimenetelmin ennustavat vastaus radikaaleja. Tässä yhteydessä tryptaasin estäjien kuten gabeksaatilla ja nafamostaatin mesilate voidaan arvioida adjuvanttia kliinisissä tutkimuksissa uutena antiangiogeenisiä lähestymistapa.

Citation: Ammendola M, Sacco R, Sammarco G, Donato G, Montemurro S, Ruggieri E, et ai. (2014) Korrelaatio Serum tryptaasisubstraatti, Mast Cells Positiivinen tryptaasi- ja mikrovaskulaarisia Density in Colo-peräsuolen syöpä Potilaat: Mahdolliset Biologiset-kliinistä merkitystä. PLoS ONE 9 (6): e99512. doi: 10,1371 /journal.pone.0099512

Editor: Michael Muders, University Hospital Carl Gustav Carus Dresden, Saksa

vastaanotettu: 02 joulukuu 2013; Hyväksytty: 15 toukokuu 2014; Julkaistu: 10 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Ammendola et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Angiogeneesi on monimutkainen prosessi mukana kasvun, invaasio, ja etäpesäkkeiden useiden ihmisten ja eläinten kasvainten [1] – [3]. Mast Cells (MC) puuttua tässä prosessissa vapautuu klassisen pro-angiogeenisten tekijöiden, kuten verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), tymidiinifosforylaasin (TP), fibroblastikasvutekijä-2 (FGF-2), ja interleukiini-6 (IL- 6), sekä ei-klassisen pro-angiogeenisten tekijöiden, kuten tryptaasi, tallennetaan niiden eritysjyvästen [4] – [8]. Tiedot kokeellisen kasvaimen mallit viittaavat siihen, että MC kertyy lähellä tuumorisoluihin ennen puhkeamista angiogeneesin ja että niitä tarvitaan makroskooppisen venytyksen ja metastaattisen leviämisen ensisijainen syöpäsoluja. Todisteet erityinen tehtävä MC on raportoitu eläinten ja ihmisten syöpien, kuten MC kasvaimia, pään ja kaulan, mahalaukun, kolorektaalista, keuhkojen ja ihon maligniteetit, jossa MC tiheys korreloi voimakkaasti laajuudesta tuumoriangiogeneesin [9 ] – [19].

tryptaasi on neutraali seriiniproteaasi, jolla on molekyylipaino 134 kDa ja tetrameerinen rakenne, joka koostuu ei-kovalenttisesti toisiinsa sitoutuneesta alayksiköstä. Neljä eri tryptaasi- on tunnistettu ihmisen MC tähän mennessä: α-, β-, γ- ja δ-tryptaasi- [20]. Näistä α- ja β-tryptaasi- ovat kaksi parasta kiertävän isoformia kuvattu. α-tryptaasi- jatkuvasti vapautuu MC verenkiertoon. β-tryptaasi- selektiivisesti keskittynyt eritysjyvästen of MC ja vapautuu vasta degranulaatiota. Läsnäolo korkean pitoisuuden β-tryptaasi- verenkierrossa on siis selkeä osoitus MC aktivointi [21] – [23]. Kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että vapautuminen tryptaasi MCS on tehokas angiogeeninen ärsyke, joka pystyy aiheuttamaan neo-vascolarization sekä

vitro ja in vivo

ja siksi osallisina syövän kehitystä.

tässä pilottitutkimuksessa, me analysoitiin seerumin tryptaasi- tasot (STLs) CRC potilailla ennen (STLBS) ja jälkeen (STLAS) radikaali kirurginen resektio; MC tiheys positiivinen tryptaasi- (MCDPT); ja mikrovaskulaarinen tiheys (MVD) in primäärikasvain kudosta korreloivat kunkin muille ja arvioida STLs mahdollisena biomarkkerimenetelmin ennustavat vastaus radikaaleja. Tässä yhteydessä inhibition tryptaasi avulla gabeksaatilla ja nafamostaatti voidaan arvioida adjuvanttia kliinisissä tutkimuksissa uudeksi syövän hoidossa [24] – [26].

Materiaalit ja menetelmät

tutkimus populaatiot

sarja 61 CRC potilaista havaittiin kliinisen kirurgian yksikkö ”Magna Graecia” University of Catanzaro valittiin. Kierteiset tietokonetomografia rintakehän, vatsan ja lantion paljasti, että potilaalla ei etäispesäkkeitä. Erilaisia ​​kirurgisia lähestymistapoja käytettiin: vasen ja oikea avoin hemicolectomy paksusuolen syöpä; avoin anterior resektio yhteensä meso-peräsuolen poisto ja avoin Abdominoplastiikka-välilihan resektio peräsuolisyövässä [27] – [30]. Potilaat, joilla on vaiheen B ja C CRC mukaan Astler ja Coller lavastus järjestelmä otettiin. Globaalissa sarjassa oli 61 adenokarsinooman; histopatologisen luokittelu suoritettiin mukaisesti AJCC 7

th Edition [31] – [32]. Kliinis-patologisia piirteitä potilaista on koottu taulukkoon 1. Koko eettistä hyväksyntää ja allekirjoitetun suostumuksen yksittäisistä potilaista saatiin selvityksestä tehtiin. Koko nimi eettisen institutionaalisten komitean Review Board, joka hyväksyi Tutkimuksemme on: University Hospital eettinen komitea ”Mater Domini”, Germaneto, Catanzaro, Italia.

Näytteen valmistus

verinäytettä kerätty 7:00-09:00 jälkeen paasto yön yli, päivää ennen ja yhden päivän kuluttua kirurginen resektio kasvain. Näytteet välittömästi annosteltiin koeputkissa seeruminerotusputkiin ilman lisäaineita (Becton Dickinson Vacutainer Systems Hemogard, Plymouth, UK) ja jätetään vähintään 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, jotta täydellistä hyytymistä prosessi. Näytteet jälkeen sentrifugoitiin 1500 x g: ssä 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja supernatantti otettiin talteen. Potilaiden seerumit saatiin kerättiin, jaettiin osiin ja pakastettiin -80 ° C: ssa, kunnes analyysin vaiheessa.

Ennen käynnistämistä analyyttinen vaihe, näytteet sulatettiin huoneenlämpötilaan ja sekoitettiin perusteellisesti vorteksoimalla alhaisella nopeudella, jotta poistaa kaikki jäämät fibriinin tai muita hiukkasia, jotka saattavat vaikuttaa toistettavia tuloksia. Lipeemiset tai hemolysoituneet näytteitä mahdollisesti häiritsee määritystä jätettiin analyyttisen.

Seerumin tryptaasi tasot mitattiin fluori-entsyymi-immunomääritys (FEIA) kullekin näytteelle käyttäen Uni-CAP100 (Pharmacia Diagnostics AB, Uppsala , Ruotsi).

immunohistokemia

arvioimiseksi MCPT ja MVD kolmikerroksinen biotiini-avidiini-peroksidaasi järjestelmä käytettiin [33]. Lyhyesti, 4 pm paksu leikesarjojen formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut kasvaimen näyte ja viereisen normaali limakalvo leikattiin. Sitten leikkeitä mikroaalloilla 500 W: ssa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen endogeeninen peroxidise aktiivisuus estettiin 3% vetyperoksidia liuokseen. Kasvaimen leikkeitä inkuboitiin anti-tryptaasin (klooni AA1, Dako, Glostrup, Tanska) laimennettuna 1:100 1 h huoneen lämpötilassa, ja anti-CD34-vasta-aine (QB-END 10; Bio-Optica Milano, Italia) laimennettiin 1 :50 1 h huoneen lämpötilassa yleiseurooppalainen endoteelimerkkiaine vastaavasti. Vieressä normaali limakalvo leikkeitä inkuboitiin anti-tryptaasin (klooni AA1, Dako, Glostrup, Tanska) ja käsiteltiin sitten edellä kuvatulla tavalla. Kasvaimen osat inkuboitiin myös anti-VEGF (Clone VG-1) (Dako Glostrup, Tanska), laimennettuna 1:200 1 h huoneen lämpötilassa. Sitoutunut vasta-aine visualisoitiin käyttämällä biotinyloitua sekundääristä vasta-ainetta, avidiini-biotiini peroxidise monimutkainen ja nopea punainen. Nuclear counterstaining suoritettiin Gillin hematoksyliinillä no. 2 (Polysciences, Warrington, PA, USA). Primaarisen vasta-aineen jätettiin pois negatiivisia kontrolleja.

Morphometrical määrityksessä

kuva-analyysi-järjestelmän (Quantimet500 Leica, Wetzlar, Saksa) käytettiin [34]. Tuumorisektioiden viisi eniten immuunivär- alueita (hot spot) valittiin pienellä suurennuksella ja yksittäisten MCDPT (Fig. 1A) ja MVD (Fig. 1 B) laskettiin x400 suurennoksella (0,19 mm

2 alue). Yksityiskohdat arvioitiin x1000 suurennoksella öljyssä (kuviot. 2A ja 2B vastaavasti). Viereisissä normaali limakalvo kohdat viisi eniten immuunivär- alueita (hot spot) valittiin pienellä suurennuksella ja yksittäisten MCDPT (Fig. 3A) laskettiin x400 suurennoksella (0,19 mm

2 alue). Kasvainkudoksessa VEGF ilmentyminen arvioitiin (kuvio 3B).

In A ensisijainen anti-tryptaasi–vasta on käytetty. Nuolet osoittavat punaiset syöttösoluista positiivisesta tryptaasi-. B ensisijainen anti CD-34-vasta-ainetta on käytetty. Nuolet osoittavat punainen positiivinen pienten verisuonten.

In A ensisijainen anti-tryptaasi–vasta on käytetty. Iso nuolet osoittavat yksi punainen syöttösoluista positiivisesta tryptaasi-. Pieni nuoli osoittaa degranulation edessä mastsolun muodostaa pienten suonten. B ensisijainen anti CD-34-vasta-ainetta on käytetty. Iso nuoli osoittaa punaisen positiivinen pienten suonten. Pieni nuoli osoittaa ytimen endoteelisolujen. Huomaa ontelon pienten suonten.

In A primaarisen anti-tryptaasin-vasta-aine on käytetty. Nuoli osoittaa yhden ja ainutlaatuinen punaiset syöttösoluista myönteisesti tryptaasi- havaittuun kenttään. B ensisijainen anti-VEGF-vasta-aine on käytetty. Monet punaiset immunovärjättiin syöpäsoluja. Big nuolet osoittavat yksi punainen sytoplasmisen syöpäsolujen positiivisia VEGF.

Tilastollinen

MCDPT ja MVD keskiarvoja ± 1 keskihajonnat (SD) arvioitiin kaksi riippumatonta tarkkailijaa (GR ja GD) kunkin kasvaimen näytteen ja kaikki sarjan osat. MCDPT keskiarvoja ± 1 SD arvioitiin myös kunkin viereisen normaali limakalvo. Korrelaatiot STLs, MCDPT, ja MVD laskettiin Pearsonin (r) analyysi. Väliset korrelaatiot edellä indeksit ja kliinis-patologisia piirteitä on lueteltu taulukossa 1 analysoitiin Chi-square testi. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS tilastollista ohjelmistopaketti (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Tulokset

keskiarvo ± S.D. STLBS ja STLAS olivat 5,63 ± 2,61 ug /l ja 3,39 ± 1,47 ug /l, tässä järjestyksessä, ja merkittävä ero keskiarvon tasojen havaittiin: p = 0,000 t-testillä (taulukko 2, kuvio. 4). Kasvainkudoksessa keskiarvo ± S.D. of MCDPT ja MVD oli 8,13 ± 3,28 ja 29,16 ± 7,39 (taulukko 2). Merkittävä korrelaatio STLBS ja MVD (r = 0,83, p = 0,000, Fig. 5), STLBS ja MCDPT (r = 0,60, p = 0,003, Fig. 6), ja MCDPT ja MVD (r = 0,73; p = 0,001 , Fig. 7) löydettiin. Viereisissä normaalin limakalvon keskiarvo ± S.D. ja MCDPT oli 2,63 ± 1,17 (Fig. 3A). Merkittävä ero kasvainkudoksen MCDPT tarkoittaa ja viereisen normaalin limakalvon MCDPT keskiarvo havaittiin (p = 0,000). VEGF ilme osoitti vahvan sytoplasmisen immunovärjääminen syöpäkudoksessa (Fig. 3B), mutta perustuu aiemmin julkaistut tiedot, jotka osoittavat vahvaa ilmaisua VEGF CRC kudosten ja verenosassa potilaista verrattuna viereiseen normaaliin limakalvo ja terveillä verrokeilla vastaavasti tietoja ei näytetty [35] – [38].

muita merkittäviä korrelaatioita edellä indeksien ja tärkeimpien kliinis-patologisia piirteitä lueteltu taulukossa 1 löydettiin .

keskustelu

tässä pilottitutkimuksessa olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että STLBS vahvasti korreloi MCDPT ja MVD perusterveydenhuollossa kasvainkudoksessa. Tuloksemme osoittavat myös, että STLs laskevan seuraavien poistettu kirurgisella CRC potilaalla on huomattavasti alhaisempi arvo STLAS. Koska vapautumista tryptaasisubstraatti MC aktivointia, suosittelemme, että MCDPT perusterveydenhuollossa CRC kasvainkudoksen edustaa tärkein seerumin tryptaasi. Meidän hypoteesi, jos ensisijainen kasvain kudos on kokonaan poistettu STLs pitäisi laskea päivässä, koska niiden on noin 4-h pitkän käyttöiän. Näistä syistä olemme havainneet STLs 24 h ennen leikkausta arvioida niiden mahdollinen rooli kiertävän biomarkkeri, jotka viittaavat kasvainkudoksen, ja jälleen 24 h käsittelyn jälkeen vahvistaa pitoisuuden lasku ja sen seurauksena, sen mahdollista vaikutusta puuttumisen kasvainkudoksesta. Me muotoilee taustalla meidän hypoteesi perustuu aiemmin julkaistu pilot data joka ehdotti lisäystä MCDPT perusterveydenhuollossa kasvainkudoksessa, ja tässä tuloksemme vahvistivat myös raportoitu data (kuvio 1A, 3A). Näissä tutkimuksissa STLBS ja MCDPT korreloivat MVD, mikä viittaa niiden merkitys CRC angiogeneesiä. Meidän data samaa mieltä aiemmin julkaistu tutkimus, joka osoitti osallistuminen MC eri syöpäsairauksista, kuten hematologisen maligniteetteja, melanooma, rintasyöpä, maha ja kolorektaalista syöpiä, ja myös eläinten kasvainmalleissa [38] – [43]. Kuitenkin edellä tutkimukset eivät keskittyä muutoksiin STLs ennen ja jälkeen leikkauksen, ja välillä ei STLs, MCDPT ja MVD arvioitiin. Mielenkiintoista, tryptaasi- vapautunut MC osallistuu kasvainangiogeneesissä useilla mekanismeilla: ensinnäkin tryptaasi- stimuloi verisuonten putkien

in vitro

ja

in vivo

kokeellisissa malleissa; Toiseksi, tryptaasi on agonisti proteinaasi-aktivoidun reseptorin-2 verisuonten endoteelisoluissa, joka puolestaan ​​indusoi angiogeneesiä [44]; Kolmanneksi tryptaasi- voi edistää vapauttamista piilevä angiogeenisten tekijöiden sidottu soluväliaineen [45] – [47]. Tarkastellaan yhdessä, edellä esitettyjen tietojen mukaan tryptaasi- voi olla mahdollinen korvike biomarkkerimenetelmin tuumoriangiogeneesin joka pystyy ennustamaan vaste leikkaushoitoa.

Siksi ensisijaisena lähteenä tryptaasi- tuotanto ei enää olemassa olevien jälkeen 24 ha merkittävä väheneminen STLs olisi odotettavissa. Jos potilaan STLs jatkuvat leikkauksen jälkeen, tämä viittaisi siihen, että jäljellä kasvainkudoksen jää jälkeen poistettu kirurgisella tai vaihtoehtoisesti että tuntematon etäpesäkkeet ovat läsnä. Tässä yhteydessä useat tryptaasi inhibiittorit kuten gabeksaatilla tai nafamostaatin mesilate voidaan arvioida tulevaisuudessa kliinisissä tutkimuksissa uutena anti-kasvain ja antiangiogeenisen lähestymistapa.

Kiitokset

Tekijät haluavat kiitos Caroline Oakley varten käsikirjoituksen muokkausta.