Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suhde peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorin γ (

PPARg

) ilmaisun ja epigeneettiset tapahtuvia muutoksia ja peräsuolen syövän synnyssä ei juuri tunneta. Me tutkimme,

PPARg

on epigeneettiseltä säädellään peräsuolen syöpä (CRC) eteneminen.

PPARg

ilmentyminen arvioitiin CRC kudoksissa ja pariksi normaali limakalvo Western blot ja immunohistokemia ja liittyvät potilaiden kliinis parametrit ja selviytymistä.

PPARg

promoottori metylaatio analysoitiin metylaatiospesifistä-PCR ja bisulfiitin sekvensointi.

PPARg

ilmaisun ja promoottori metylaatio oli samalla tutkittiin myös CRC solulinjat. Kromatiinin immunosaostus basaali olosuhteissa ja sen jälkeen epigeneettiset käsittely suoritettiin yhdessä nakutuksen alas kokeita oletettujen sääntelyn tekijöistä. Geenien ilmentyminen seurattiin immunoblotting ja funktionaalisia määrityksiä solujen lisääntymisen ja invasiivisuus. Metylointi tietylle alueelle promoottorin korreloi voimakkaasti

PPARg

puute ilmaisun 30% ensisijaisen CRC ja potilaiden huonoon ennusteeseen. Merkillistä, sama metylaatiokuvion löytyy

PPARg

-negatiivinen CRC solulinjoissa. Epigeneettiset hoito 5′-atsa-2′-deoksisytidiini voi palauttaa tämän tilan ja yhdessä trikostatiini A dramaattisesti uudelleen aktivoi geenin transkription ja reseptorin aktiivisuutta. Transkriptionaalinen hiljentäminen johtuu rekrytointi MeCP2, HDAC1 ja EZH2 jotka antavat tukahduttava chromatin allekirjoituksia määrittämiseksi lisääntynyt soluproliferatiivisen ja invasiivisia potentiaalia, ominaisuuksia, jotka voidaan kokeellisesti voi palauttaa. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy uusi mekanistinen käsitys epigeneettisellä vaiennettu

PPARg

CRC jotka saattavat olla merkittäviä ennustetyövälineenä merkki syövän etenemisen.

Citation: Pancione M, Sabatino L, Fucci A, Carafa V, Nebbioso A, Forte N, et al. (2010) Epigeneettiset vaiennettu Peroksisomien proliferaattoriaktivoidut Receptor γ Onko biomarkkeri peräsuolen syövän eteneminen ja haitalliset potilaiden tulos. PLoS ONE 5 (12): e14229. doi: 10,1371 /journal.pone.0014229

Editor: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 10. heinäkuuta 2010 Hyväksytty: 09 marraskuu 2010; Julkaistu: 3. joulukuuta 2010

Copyright: © 2010 Pancione et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuetaan avustuksilla AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) VC ja L.A .; EU-projekti LA Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Peroksisomien proliferaattoriaktivoidut reseptorit (PPAR: t) ovat ligandista riippuvan transkriptiotekijöiden kuuluva nukleaarihormonireseptorit superperheen [1]. Kolme eri PPAR isoformeja, α, β ja γ on eristetty tähän mennessä, jotka koostuvat erilaisista kuvio kudosilmentämisen ja kyky olla vuorovaikutuksessa erilaisia ​​yhdisteiden luokat. Erityisesti, PPARy-isoformi on osallisena monenlaisissa fysiologisissa prosesseissa [2]: se yhdistää ohjaus- energian, lipidien ja glukoosin homeostaasiin ja sillä on keskeinen rooli adipogeneesin tulehdusvastetta ja erilaistumista monissa epiteelisolujen [3]. Johdonmukaisesti, vaihtelut

PPARg

ilmentymisen tai geenin mutaatioita on liitetty kasvainten synnyssä [4] – [6]. Kuitenkin ristiriitaisia ​​tuloksia on raportoitu tähän mennessä, kysyen, onko PPARy helpottaa tai estää kasvaimen kehittymisen [7], [8]. Viime aikoina olemme osoittaneet, että satunnainen kolorektaalisyövissä (CRC) esittämällä vähensi PPARy ekspressiotasot liittyvät merkittävästi potilaiden huonompi ennuste; samantyyppistä kasvainten,

PPARg

on osoitettu olevan riippumaton ennustetekijä [9], [10], mikä viittaa siihen, mahdollisuus kohdistaa tätä geeniä huumeiden kliinisissä sovelluksissa [10]. Molekyylimekanismeja taustalla

PPARg

ilmaisun sääntelyn CRC eteneminen ei vielä tunneta [9].

On käymässä yhä selvemmäksi, että sen lisäksi, geneettisiin muutoksiin, epigeneettiset muutokset edistävät kasvaimien syntyyn [11] . Epigeneettiset asetus liittyy perinnöllisiä muutoksia, jotka eivät muuta DNA-sekvenssit, mutta antaa ”extra” kerrosta ohjaus säännellä chromatin järjestämisestä ja geenien ilmentymisen [12]. Poikkeava DNA: n metylaatio on CpG-rikkaiden sekvenssien, jotka tunnetaan myös ”CpG-saarekkeiden”, joka sijaitsee promoottorin alueilla noin puolet tunnettujen geenien, johtaa epigeneettisiä vaiennettu geeni-ilmentymisen [11], [12]. CRC, laaja DNA: n metylaatio on todettu useissa loci, nimenomaan promoottorialueiden tuumorisuppressorigeeneille (TSG), ominaisuus alaryhmä kasvaimia esittää niin kutsuttu ”CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi” (CIMP) [13] . Muut epigeneettiset tapahtumat, kuten tukahduttava histonimodifikaation yhteistyötä vakaan geenien. ”Histoni koodi” on ehdotettu antamaan allekirjoituksen erityisistä aminohappotähteitä korreloi aktiivinen tai tukahdutettu geenin ilmentymisen [11], [12]. Välisen DNA: n metylaation ja histonimodifikaation näyttää välittyvän metyyli CpG DNA: han sitoutuvia proteiineja, jäsen, joka MeCP2 tärkeä rooli vahvistaa tämän vuorovaikutuksen [14]. DNA metyloitu alueilla, yleensä rikastettua muutettu histones, tuottaa enemmän tiiviisti pakattu kromatiinin, jossa yhteys tiettyjen transkriptiotekijöiden niiden samankaltaisiin sitoutumiskohtien on huomattavasti heikentynyt [12]. Näin DNA: n metylaatio, ja kuvio histonimodifikaation on promoottorialueet spesifisten geenien liittyy syöpään taudin alkamisen ja etenemisen, erityisesti satunnaista CRC, on vielä selvittämättä [15]. Tässä raportissa olemme analysoineet sadan viisikymmentä kaksi ensisijaista CRC ja pariksi normaali limakalvo jotta korreloivan

PPARg

ilmaisua vaihtelut välittyvät epigeneettisellä tapahtumia taudin etenemiseen ja potilaan selviytymistä. Olemme laajentaneet analyysin CRC solulinjat järjestelmänä tutkimaan molekyylitason mekanismeista

PPARg

hiljentäminen takia epigenetic vaihteluista.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Tämä tutkimus suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of Fatebenefratelli sairaalan Beneventossa. Kaikki potilaat kunhan kirjallinen lupa varten otetaan näytteitä ja myöhempää analysointia.

Tuumorinäytteet

Sata ja viisikymmentä kaksi diagnosoidaan ensisijainen satunnaista CRC ja kirurgisesti käsitelty laitoksella Kirurgian Fatebenefratelli Hospital, Benevento, Italia, välillä 1999-2004, tutkittiin tässä tutkimuksessa. Viisikymmentäkaksi tapauksissa käsittävät sekä nestemäistä typpeä snap-jäädytetty yksilöitä, saadaan heti kirurgisen resektion ja parafiiniblokit. Kukin näyte sovitettu viereisen normaalisti limakalvon (20 cm: n etäisyydellä syöpäkasvaimen) poistetaan saman leikkauksen. Yhdelläkään potilaalla ei ollut suvussa suoliston toimintahäiriöitä tai CRC, olivat saaneet kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen resektiota eikä ollut ottanut steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden säännöllisesti. Tavanomaisen leikkauksen jälkeen hoitoja tarjotaan kaikille potilaille, riippuen sairauden vakavuudesta. Kliinis-patologisia piirteitä potilaista tutkittiin raportoidaan (taulukko 1). Seurannasta oli saatavilla kaikille potilaille, joiden mediaani leikkauksen jälkeinen kesto 59,5 ± 26,5 kuukautta. Kokonaispituus selviytymisen laskettiin alkaen ensimmäisestä leikkauksesta. Potilaita prospektiivisesti seurasi kunnes kuolema tai viimeisimmästä lääkärintarkastus.

Solulinjat ja 5′-atsa-2′-deoksisytidiini ja Trichostatin Hoito

kaksitoista CRC solulinjat olivat tässä tutkimuksessa käytetyt ja saatiin ATCC ja viljeltiin kuten on ehdotettu. DNA demetylaatio, soluja käsiteltiin 1 tai 5 uM 5′-atsa-2′-deoksisytidiini (AZA) 72 hs tai 300 nM Trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 24 hs, yksin tai yhdistelmänä. Käsittelyjen jälkeen solut otettiin talteen DNA, RNA: n tai proteiinin uuttamalla.

DNA: n eristämiseksi, bisulfiitti hoito, metylointianalyysi ja sekvensointi

Genominen DNA eristettiin jäädytetyistä kudoksista tai parafiiniin näytteitä normaali menettely [6], tai FFPE kudoksen kit (56404, Qiagen, Hilden, Saksa), tässä järjestyksessä. Yksi ug kutakin DNA-näytettä oli bisulfiitti mukaisesti modifioituja valmistajan protokollan (59104, Qiagen, Hilden, Saksa). Sekä yleisesti metyloimattomia (59665) ja CpGenome yleisesti metyloitua DNA: ta (59655, Qiagen, Hilden, Saksa) käytettiin kussakin reaktiossa metyloimattomia tai metyloituja ohjaus, vastaavasti. Etsintä CpG sisällön

PPARg

promoottori suoritettiin käyttäen Methprimer ohjelmiston mukaan CpG-saarekkeen määritelmään. PCR-alukkeet metylaatiospesifisen PCR (MS-PCR) suunniteltiin käyttäen metyyli Primer Express -ohjelmisto v1. Molemmat metyloimatonta (U) ja metyloitu (M) erityiset alukejoukkoa suunniteltu perustuu positiivisen juosteen bisulfiitti-muunnetaan DNA kattaa CpG saarilla

PPARg

promoottorialueen. MS-PCR-reaktiot suoritettiin käyttämällä MS-PCR-kittiä (59305, Qiagen, Hilden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR-tuotteet ladattiin ei-denaturoivalla 3% agaroosigeeleillä, värjättiin etidiumbromidilla ja visualisoitiin UV-transilluminaattori. Alukesekvensseissä luetellaan (taulukko S1). Bisulfiitti sekvensointi (BS) on automaattisesti suoritettiin PCR-monistus, joka on saatu käyttämällä alukesarjaa, joka ei sisällä CpG-sivustoja niiden sekvenssit ja suunniteltu bisulfiitin muunnettua DNA: ta (Applied Biosystems, Applera, Foster City, USA).

siru ja MeDIP määritys

ChIP määrityksiä ja q-PCR-monistamisen (Biorad, Hercules, USA) suoritettiin kuten on kuvattu [16]. Käytetyt alukkeet on kuvattu (taulukko S1). MeDIP määritys suoritettiin toimittajan suosittelemien (Diagenode, Liège, Belgia). -Aineita, joita: AcH3K9, H3K4me3, HDAC1 ja MeCP2 (Abcam, Cambridge, UK), H3K27me3, (Millipore, Billerica, USA), RNA pol II ja P-RNA pol II (Covance, Dallas, USA), ZAC ja puhdistettu IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) käytettiin hakkeen määrityksissä.

Western blot ja immunohistokemiallista analyysiä

Western blot-analyysi suoritettiin proteiiniextraktien kasvain kudosten ja viereisen normaali limakalvo otettujen leikkaus ja CRC-solulinjat, kuten aiemmin on raportoitu [6], [9]. Immunohistokemiallinen analyysi kasvaimia ja kaukana ei-neoplastisia limakalvon suoritettiin, kuten on kuvattu [9]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: anti-PPARy (E-8), anti-ZAC (H-253), anti-ERK 1/2 (MK1) ja anti-p-ERK (E-4) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA); anti-E-kadheriinin (610405) (BD Transduction Laboratories, Lexington, USA); anti-MeCP2 (ab55538), anti-HDAC1 (ab19845) (Abcam, Cambridge, UK); anti-EZH2 (4905) (Cell Signaling, Boston, USA); anti-β-aktiini (A5441) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

MTT ja apoptoosin määrityksiä

Solut ympättiin kolmena rinnakkaisena 24 tai 96 kuoppalevyillä ja MTT-määritystä (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) suoritettiin valmistajan protokollan 0, 24, 48, 72 ja 96 hs saavuttamisen jälkeen yhtymäkohdassa, kuten on osoitettu. Kasvukäyrät perustettu ottaen huomioon tulosten keskiarvo saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. Analysoida kemiallis-herkkyys PPARy-agonistit soluja käsiteltiin 5 uM troglitatsoni (TZD). Apoptoosimäärityksessä suoritettiin virtaussytometria-analyysi (FCA) käyttäen propidiumjodidia (PI) -värjäyksellä. Lyhyesti, inkubaation jälkeen TZD, solut otettiin talteen ja kiinnitettiin 70%: isella jääkylmällä etanolilla /PBS: lla ja säilytettiin 4 ° C: ssa yön yli. Keskeytetty jälkeen solut pestiin PBS: llä, inkuboitiin PI liuokseen 15 minuutin ajan. 37 ° C: ssa ja heti analysoitiin FAC scan virtaussytometrillä (Becton Dichinson, San Jose, USA).

Muuttoliike ja invaasio määritykset

arpeutumisprosessit määritystä solut maljattiin 60 mm: n maljoille ja kasvatettiin täysiksi. Jälkeen 6 hs pitkä seerumistarvaatio, haava tehtiin mikropipetin avulla kärki kaapia pois soluihin. Soluliikkuvuus tutkittiin 24 ja 48 hs jälkeen solut eri mikroskooppikenttää. Lopuksi vastaava haava-alueella kunakin ajankohtana oli digitalisoitu ja kvantifioidaan Metamorph Imaging System Software versio 6.0 for Microsoft Windows. Keskimääräinen prosenttiosuus haavan laskettiin kolmen erillisen kokeen. Määrittää invasiivisuus Transwell-määritys suoritettiin käyttäen 24-kuoppaisen soluviljelyinsertissä, 8 um huokoskoko (3097, Falcon-Becton Dickinson, USA). Seuraavat hydraation Matrigel ylemmässä osastossa, solut ympättiin ja inkuboitiin. Kaksikymmentäneljä ja neljäkymmentäkahdeksan hs myöhemmin solut yläpinnan suodattimen poistettiin pumpulipuikolla; nämä alla kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, värjättiin 0,2% kristalliviolettia ja laskettiin. Kvantifiointi saatiin laskemalla vähintään 10 vähemmän virtaa kentät kolmesta itsenäisestä kokeesta.

RNA ja semikvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR

Kokonais-RNA eristettiin solulinjoista ja kudoksista, joissa Trizol kanssa vähäisiä muutoksia (Invitrogen Carlsbad, USA). Käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) suoritettiin käyttäen Super-script II (Invitrogen, Carlsbad, USA) ja PCR-monistus käyttäen spesifisiä alukkeita

PPARg

. RT-PCR-olosuhteet ja käytetyt alukkeet on aiemmin raportoitu [5]. Kaikissa PCR-reaktioissa,

GAPDH

toimi sisäisenä kontrollina normalisointia. Monistetut tuotteet ajettiin 2% agaroosigeelissä ja värjättiin etidiumbromidilla.

Plasmidit ja transfektiot

pPre-TK lusiferaasireportteriplasmidin, pcDNA3 kuljettavat villityypin

PPARg

cDNA ja transfektio olosuhteet on jo kuvattu [6]. Geeni uudelleen aktivaation määritykset, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, käsiteltiin AZA ja TSA yksinään tai yhdistelmänä, ja transfektoitiin väliaikaisesti reportteriplasmidilla. Jälkeen 12 hs, 1 uM TZD tai pelkästään vehikkeliä lisättiin väliaineeseen. Kun osoitettu, GW9662, selektiivinen PPARy-antagonisti, käytettiin.

siRNA

retrovirusvektori PSM2C (klooni ID VH2-203345), joka suorittaa lyhyen hiusneula DNA (shRNA, luettelonumero RHS1764- 9494331) kohdentamiseksi PPARy mRNA käytettiin. HT29-soluja transfektoitiin stabiilisti kanssa shRNA-PPARy-vektori ja positiiviset kloonit valitaan käyttämällä 1 uM puromysiini. Vektori kuljettaa ei-spesifinen shRNAs tai tyhjän vektorin käytettiin verrokkeina. SiRNA suunniteltu kohdistaminen ihmisen MeCP2 mRNA (koodi: HS-MECP2-7HP SI02664893, Qiagen, Hilden, Saksa) luovutti ystävällisesti professori Chiariotti. HCT116-solut ympättiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin väliaikaisesti MeCP2 siRNA tai ei-spesifisiä oligoja, mukaan valmistajan ohjeiden (Invitrogen, Carlsbad, USA). Hiljentää EZH2, retrovirusvektori PSM2C kuljettaa EZH2-shRNA (koodi: RHS1764-9100483, CN: V2HS-63033) salattu shRNAs tai tyhjän vektorin käytettiin, mukaan valmistajan ohjeiden (Invitrogen, Carlsbad, USA). Molemmissa tapauksissa solut kerättiin western blot-analyysi 56 hs myöhemmin.

Heterotsygoottisuuden menetys,

BRAF

ja

KRAS

mutaatioita ja mikrosatelliittien epävakautta analyysi

heterotsygoottisuuden menetys (LOH) arvioitiin kuten aiemmin on kuvattu, käyttäen mikrosatelliittimarkkerin D31259 ja D3S3701, jotka reunustavat

PPARg

[6]. Mikrosatelliitti epävakaus (MSI) suoritettiin, kuten on raportoitu [17].

MLH1

promoottorin metylaation arvioitiin myös joitakin edustavia kasvainnäytteestä [18].

BRAF

ja

KRAS

mutaatiot kodonissa 600 eksonissa 15 ja kodonit 12/13 eksonissa 2, vastaavasti, arvioitiin PCR /sekvensointi ja Real-Time PCR käyttäen alukkeita aiemmin kuvattu [18 ].

tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin SPSS (versio 15.0) for Windows (SPSS Inc., Chicago, USA). Association välillä

PPARg

promoottori metylaatio, muut markkereita ja kliinis-patologisten parametrit arvioitiin käyttämällä χ

2 testiä tai Spearmanin testi, kuten on osoitettu. Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin arvioitaessa selviytymisen; selviytymisen eroja analysoitiin log-rank-testi. Tiedot on ilmoitettu keskiarvona ± SD, ja keskiarvot verrattiin käyttäen Studentin t-testiä tai Mann-Whitney testi. Tulokset katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun

P

≤0.05 saatiin.

Tulokset

PPARg

promoottori metylaation CRC korreloi geenien ilmentymistä ja liittyy potilas- lopputulokseen

roolin arvioimiseksi, että

PPARg

pelaa peräsuolen kasvainten synnyssä

in vivo

, analysoimme 152 ensisijainen satunnaista CRC ja vastaavan viereisen ei-neoplastisia limakalvolle

PPARg

ilmaisu (kuvio 1, paneeli A). Noin 60% kasvaimista osoitti

PPARg

yli-ilmentyminen ja 5%: ssa tapauksista osoittivat ei merkittäviä eroja kasvaimen kudosten ja vastaaviin normaaleihin limakalvo. Sen sijaan 35% kasvaimista osoittivat alempi PPARy tasolle kuin normaali limakalvo ja merkittävä yhdessä etäispesäkkeitä ja vähentää potilaiden eloonjäämisen, linjassa aiempien tietojen (kuva 1, paneelit B ja C) [9]. Olemme jo raportoitu, että alennetaan

PPARg

ilmentyminen satunnaista CRC ei liity LOH [6]. Siten onko

PPARg

pienentää ilmentyminen korreloi DNA: n metylaatio, selvitimme koko promoottorialueen. Tarkastus ihmisen

PPARg

promoottorin osoittivat, että ytimen alueella, -474-600 suhteessa transkription aloituskohdasta, on erityisen rikastettu ”CpG-saarekkeiden”, joka voi olla kohde-DNA: n metylaatio (kuvio 1 , paneeli D). Lyhyempi CpG-rikkaan DNA suolikanavan sijaitsee ylävirtaan (-793–580) on todettu pysyvästi metyloitu tutkimuksessa arvioidaan epigeneettiset vaaratekijä iällä aikuisten metabolisen oireyhtymän (kuvio 1, paneeli D) [19]. Tutkimaan, ovatko nämä kaksi aluetta ovat differentiaalisesti metyloitavaa ensisijainen CRC ja pariksi normaali limakalvo, suoritimme MS-PCR neljään promoottori segmenttiä (M1-M4 alkaen enemmän alavirtaan) (kuvio 1, paneeli D). Segmentit M4 (from-746–616) ja M1 (-123-+49) olivat aina metyloituja tai metyloimattomien normaaleissa ja kasvaimen näytteitä ja ei korreloi

PPARg

ekspressiotasot (kuvio 1, paneeli E ). M2 (-235–151) oli vaihtelevasti metyloitu ja lopuksi M3 (-359–260) metyloitiin noin 30% kasvaimista verrattuna 8% pariksi normaalista mucosas (n = 80) ja korreloivat vähentäminen /tappio

PPARg

ilmaisu (kuvio 1, paneeli E ja taulukko 1). Lähempi tarkastus M3 segmentin tunnistettu 9 CpG sivustoja, metylaatiostatuksen joka analysoitiin bisulfiittimassasta sekvensoimalla (kuvio 1, paneeli F). CpG saaret metylaatio taso oli huomattavasti korkeampi

PPARg

-negatiivinen kuin

PPARg

positiivisia kasvaimia ja pariksi normaali mucosas (kuvio 1, paneeli G). Johdonmukaisesti, M3 alue metylaatio korreloi potilaan iän, syvä invaasio, Duke C ja D vaiheissa, kun taas mitään yhdistys havaittiin kasvaimen sijainti (proksimaalinen tai distaalinen paksusuoli) ja sukupuoli (kuvio 1, paneeli H ja taulukko 1).

PPARg

metylaatio havaittiin useammin alaryhmässä Mikrosatelliittimarkkerien korkea (MSI-H) kuin mikrosatelliitti vakaa (MSS) kasvaimia. Lisäksi nämä tapaukset eivät liittyneet kanssa

KRAS

tai

BRAF

mutaatiot (kuva S1). Kaikki yhdessä nämä tulokset osoittavat, että

PPARg

promoottori metylaatio, nimenomaan M3 alueella, on merkittävästi korreloi taudin etenemiseen ja potilaan heikko tulos (kuvio 1, paneeli I).

(A) viisikymmentä ug kokonais-uutteissa kasvainkudoksista (T) ja sovitettu ei-neoplastisten limakalvon (N) analysoitiin Western blot. Paneelissa vain joitakin edustavia näytteitä (1-8) on esitetty. Histogrammi raportoi kvantifiointiin ß-aktiini, käytetään sisäisenä kontrollina. (B) korrelaatio

PPARg

ekspressiotasot puuttuessa = M0 tai esiintyminen = M1 kaukaisten etäpesäkkeitä. (C) Kaplan Meier selviytymisen analyysin liittyvät

PPARg

ekspressiotasoja.

P

arvo ilmoitetaan kunkin kaavion. (D) Kaaviokuva rakenne

PPARg

promoottori ja tunnistaminen CpG-rikastettu alueesta, jotka transkription aloituskohdasta ihmisen geenin. MS-PCR tutkituilla alueilla (M1-M4) ja kannoista käytettyjen alukkeiden ovat kuvattu suorakaiteen. (E) edustaja MS-PCR: t osoittavat myös korrelaation metylaation M3 alueella ja vähentää

PPARg

ilmentymisen tuumorikudoksissa vs. vastaaviin normaaleihin limakalvo, C + ilmaisee metyloitu (M) ja metyloimattoman (U) valvontaa. (F) M3 nukleotidisekvenssi on raportoitu; CpG saaret korostuvat. Kromatogrammit osoittavat joka CpG on metyloitu joissakin edustavan näytteen jälkeen BS. Musta tai valkoinen ympyrät ilmaisevat metyloidut tai metyloimatonta sytosiinit, vastaavasti. (G) metylointi havaittavia määriä BS kasvain ja normaali limakalvo yksilöitä. M3 alue metylaatio liittyy kasvaimen ”vaiheeseen (Duke A: sta D) (H) ja potilaiden eloonjäämisen (I).

P

arvo ilmoitetaan kussakin kaaviossa.

PPARg

hiljentäminen CRC solulinjoissa korreloi promoottori metyloinnin

tutkimiseksi molekyylitasolla mekanismi (t) taustalla tätä suhdetta, yritimme käyttää

in vitro

soluviljelmäjärjestelmässä. Seuloimme sarjan ihmisen CRC solulinjoja (taulukko S2)

PPARg

ekspressiotasot ja korreloi nämä mahdollisesti hiljentämiseen tapahtumia. PPARy ilmentyminen tutkittiin mRNA ja proteiini tasolla RT-PCR: llä ja western blot -analyysillä, vastaavasti (kuvio 2, paneeli A). PPARy mRNA peilattu proteiini tasoilla monenlaisia ​​variaatioita korkein HT29 on alhaisin HCT116-soluissa. Havaittujen erojen johtuvan transkriptio vaihtelut; alennettua proteiinin ilmentyminen ei liity mRNA-tasojen havaittiin vain Caco-2-solut, mikä johtuu todennäköisesti translaation jälkeisiä mekanismi (t). Näistä solulinjoista, valitsimme HT29 ja HCT116 lisätutkimuksia. Emme havainneet Heterotsygotian menetys on

PPARg

locus molemmissa solulinjoissa. Samoin emme korreloida eri

PPARg

havaitun HCT116 ja HT29 kanssa translaation jälkeiset modifikaatiot aiheuttama aktiivinen mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK /ERK) reitin (kuva S2) [6], [20]. Sen tutkimiseksi,

PPARg

ilmaisu korreloi promoottorin metylaation CRC solulinjoissa, suoritimme MS-PCR (kuvio 2, paneeli B). M4 ja M1 segmentit olivat vakaasti metyloituja tai metyloimattomien kaikissa solulinjoissa, riippumatta PPARy ilmaisua. M2 segmentti metyloitavaa 5 ulos 8 solulinjojen, mukaan lukien HCT116. Mielenkiintoista, M3 segmentti metyloitiin ainoastaan ​​HCT116 kahdeksasta CRC solulinjoissa analysoitiin (kuvio 2, paneeli B). Tutkimalla neljä ylimääräistä CRC solulinjojen, huomasimme, että myös RKO solut olivat negatiivisia

PPARg

ilmaisua, koska poikkeavasti metyloitua M3 alue (taulukko S2 ja tuloksia ei esitetty). MeDIP määrityksiä vahvistivat nämä tulokset:

PPARg

promoottori DNA (-368–166) oli kolme kertaa enemmän metyloitu HCT116 kuin HT29, mikä osoittaa tiukemmin pakattu kromatiinirakenteeseen (kuva S2). 90% CpG sivustojen sisältämä M3 -segmentin metyloitavaa HCT116, kun taas vain vähän tai ei yhtään metyloitiin muissa solulinjoissa arvioimana bisulfiittimassasta sekvensoinnilla (kuvio 2, paneeli C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että promoottori metylaatio saattaa olla merkitystä äänenvaimennusjärjestelmissä

PPARg

ilmentymistä CRC solulinjoissa analysoitiin.

(A)

PPARg

mRNA ja proteiini havaittavia määriä RT -PCR ad western blot-analyysi paneelissa kahdeksan CRC solulinjoissa.

GAPDH

ja β-aktiini käytettiin kontrolleina vastaavasti. (B) MS-PCR saadut tulokset M1-M4 promoottorialueille analysoidaan; M, metyloitu; U, metyloimattomia; C + osoittaa metyloitu ja metyloitumaton valvontaa. Metylaatiostatuksen kaikkien CRC solulinjojen analysoitavaan tiivistää, HCT116 ja HT29 kuvattu harmaalla. (C) CpG dinukleotideissä metylaatio arvioitiin BS. Tulokset joitakin edustavia solulinjojen on raportoitu. Metyloitu tai metyloimattoman CpG dinukleotidit on kuvattu musta tai valkoinen ympyrät, vastaavasti. (D) Farmakologiset demetylaatio aiheuttama

PPARg

ilmaisun HCT116 kun taas mitään merkittävää eroa löytyi HT29 käytettiin kontrollina. Solut altistettiin 1 ja 5 uM AZA 72 hs, MS-PCR suoritettiin M2 ja M3 alueilla, ennen ja jälkeen hoidon, **

P

0,01.

PPARg

ilmaisu uudelleen aktivoidaan farmakologisen demetylaation

voit tarkistaa, onko

PPARg

ilmentyminen voidaan aktivoida uudelleen farmakologisen demetylaation, käsittelimme HCT116-solujen kanssa AZA , tunnettu estäjä DNA: n metylaatio. RT-PCR-analyysi HCT116 alttiiksi 1 ja 5 uM AZA oli annosriippuvainen nousu PPARy-mRNA: n kun taas ei havaittu merkittäviä eroja HT29, kuten odotettua (kuvio 2, paneeli D). MS-PCR suoritetaan M3 aluetta, joka on metyloitu vain HCT116-soluissa, osoitti menetys metylaation käsittelyn jälkeen; M2 alueella, että perusolosuhteissa metyloidaan molemmissa solulinjoissa, mutta demetyloitunut käsittelyn jälkeen (kuvio 2, paneeli D). Kaikki yhdessä nämä tiedot osoittavat, että laaja promoottori metylaatio liittyy alentunut

PPARg

ilmentyminen CRC solulinjoissa.

Osuuskunta vaikutus AZA ja TSA

PPARg

uudelleen aktivointi

Tämä erityinen alueilla

PPARg

promoottori ovat differentiaalisesti metyloitu huomauttaa, että epigeneettiset mekanismi (t) osallistuvat sen vapautuneilla ilmentymistä CRC soluissa. Voit tarkistaa tämän hypoteesin, käsittelimme HCT116 kanssa AZA, yksin tai yhdessä TSA, tunnettu histonideasetylaasi- estäjä (HDACi). HT29-soluja käytettiin kontrollina.

PPARg

ilmentyminen synergistisesti aiheuttama yhdistetyn atsatiopriini- ja TSA HCT116-soluissa, kun taas ei vaikuta HT29, kun lääkkeitä käytettiin joko yksinään tai yhdessä (kuva S3). Nämä tiedot osoittavat, että kromatiinin liittyvät histoni entsyymit voivat edistää geenien. Sen määrittämiseksi, onko uudelleen aktivoitua PPARy käyttäytyy

bona fide

toiminnallinen transkription tekijä, käsittelimme HCT116 solut AZA tai TSA yksinään tai yhdessä ja sen jälkeen transfektoitu pPre perustuva lusiferaasireportterigeenillä. Lusiferaasiaktiivisuutta määritelty soluekstrakteissa taas nostaa AZA ja /tai TSA hoitoa ja, silmiinpistävän, vielä lisättäessä troglitazone, tietyn PPARy ligandia (kuva S3). Sen osoittamiseksi, että lisäys lusiferaasin aktiivisuus oli todella riippuvainen uudelleen aktivoidun reseptorin, altistimme transfektoidut solut PPARy-antagonisti, GW9662. Merkittävä väheneminen reportterigeenin aktiivisuuden havaittiin, koska GW9662 kyky peruuttamattomasti häiritä transaktivoivan kyky kypsän proteiinin (kuvio S3). Kaikki yhdessä nämä tiedot osoittavat, että DNA: n promoottorin metylaation ja histonimodifikaation todennäköisesti toimivat yhdessä alas-säädellä

PPARg

ilmaisua, mikä viittaa siihen, että epigeneettiset hoidot palauttaa geenin transkription ja toimintaa.

Erityisiä tukahduttava chromatin merkit ja DNA: n metylaatio liittyy

PPARg

transkriptio

Tuottaa oivalluksia mekanismi (t), johon DNA: n metylaation ja histonimodifikaation vaikuttaa

PPARg

ilme, kvantitatiivinen ChIP määritykset suoritettiin tutkivat promoottori segmentti ulottuu -368–166 sisään HCT116-soluissa. Yhdenmukainen MeDIP tietojen HDAC1 oli tiukasti sidoksissa

PPARg

promoottori, kun taas RNA-polymeraasia II (RNAPol-II) ja sen fosforyloitua muotoa (P-RNAPol-II) olivat tuskin läsnä käsittelemättömissä HCT116-soluissa (kuvio 3, paneeli A). Kun altistuminen AZA ja TSA yhdistelmänä, HDAC1 oli huomattavan köyhdytettyä yhdessä alennettu DNA: n metylaatio (kuva S2), kun taas RNAPol-II ja P-RNAPol-II oli huomattavasti parantunut, mikä osoittaa transkriptio talteen (kuvio 3, paneeli A). Vastaavasti trimetyloidaan H3K4 ja asetyloitu H3K9, jotka ovat histonimodifikaation normaalisti liittyy transkription aktiivisuutta, olivat lähes vähennetty käsittelemättömiä HCT116-soluissa ja merkitsevästi lisääntynyt TSA, AZA tai niiden yhdistelmä (kuva 3, paneeli B). Huomattavaa on, että trimetyloidaan H3K9, merkkiaine vaiennettu kromatiinin, oli rikastettu

PPARg

promoottori ja vähitellen köyhdytettyä jälkeen epigeneettiset hoitoja, kun taas trimetyloidaan H3K27 väheni merkittävästi ainoastaan ​​AZA /TSA yhdistelmähoito (kuvio 3, paneeli C). Tämä analyysi viittaa siihen, että DNA: n metylaatio on tiiviisti mukana tukahduttavia kromatiinin tavaramerkkien

PPARg

promoottori haittaamaan geeniekspression CRC soluissa.

(A) Quantitative ChIP analyysi HCT116-soluissa tehtiin ennen ja käsittelyn jälkeen AZA ja TSA yksin tai yhdessä. Native kromatiinin inkuboitiin vasta-aineiden kanssa osoitetut proteiinit. Immunosaostunut DNA: ta käytettiin templaattina qPCR reaktioita käyttäen spesifisiä alukkeita

PPARg

promoottorialue *

P

0,05, **

P

0,01. (B) pelimerkin määritykset suoritettiin edellä kuvatulla tavalla vastaan ​​asetyloitu H3K9 ja trimetyloidaan H3K4 *

P

0,05, **

P

0,01 tai (C) trimetyloidaan H3K9 ja H3K27 *

P

0,05. Aika-pisteitä yhteistyön hoidot olivat 72 hs 5 uM AZA ja 24 hs 300 nM TSA, yksin tai yhdessä; CC kertoo käsittelemätön kontrolli soluja. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, kukin suoritettiin kaksinkertaisina.

siRNA välittämä knock-alas MeCP2 ja EZH2 pelastamiseen

PPARg

ilmentymistä HCT116 koolonkarsinoomasoluissa

välinen yhteys DNA: n metylaation ja histonimodifikaation näyttää välittävän ryhmä proteiineja, joilla on metyyli-DNA-sitoutumisaktiivisuutta, joka sisältää metyyli-CpG: tä sitova proteiini 2 (MeCP2) [14]. Nämä proteiinit paikallistaa metyloiduksi promoottorialueille ja rekrytoida proteiinia sisältävät kompleksit HDAC, erityisesti HDAC1, ja histoni metyylitransferaasit (HMTs). Enhancer of zeste 2 (EZH2) on jäsen Polycomb Repressorikompleksin 2 (PRC2), jossa histoni metyyli-transferaasin aktiivisuutta spesifisissä H3K27 sivustoilta [21]. Sekä MeCP2 ja EZH2 on raportoitu osallistuvan

PPARg

tukahduttaminen hiiren tähtisolut Maksansiirtopotilaista fibrogenesis [22]. *

P

0,05. **

P

0,01.