Krooninen sairaus

tiivistelmä

tunnistaminen somaattisten mutaatioiden syöpä on tärkeä tavoite ymmärtämiseen ja seurantaan liittyvien tapahtumien syöpään aloittamista ja etenemiseen. Korkean resoluution sulattamalla (HRM) käyrä analyysi edustaa nopea, post-PCR suurikapasiteettisten menetelmä skannataan somaattisten sekvenssimuutosten kohdegeenien. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida herkkyys ja spesifisyys HRM analyysi kasvaimen mutaation seulonnan eri kasvain näytteet, jotka sisälsivät 216 jäädytetyn lapsipotilailla pieni pyöristetty blue-kasvainten sekä 180 parafinoidut kasvaimia rinta-, kohdun limakalvon ja munasarjojen syöpien (60 kutakin). HRM-analyysi tehtiin eksonit seuraavista kandidaattigeeneihin tiedetään satamaan perustettu yleisesti havaittu mutaatioita:

PIK3CA

,

ErbB2

,

KRAS

,

TP53

EGFR

,

BRAF

,

GATA3

, ja

FGFR3

. Kaksisuuntainen sekvenssianalyysi käytettiin määrittämään tarkkuuden HRM analyysin. Sillä 39 mutaatiot havaittiin jäädytetyistä näytteistä, herkkyys ja spesifisyys HRM analyysi oli 97% ja 87%, vastaavasti. Oli 67 mutaation /variantit parafinoidut näytteitä, ja herkkyys ja spesifisyys HRM analyysissä oli 88% ja 80%, vastaavasti. Parafinoidut näytteet vaativat suurempi määrä puhdistettua DNA korkean suorituskyvyn. Yhteenvetona, HRM analyysi on lupaava kohtalainen seulontaan testi mutaatioista tunnettu ehdokas genomialuetta. Vaikka yleinen tarkkuus näyttää olevan parempi jäädytetty yksilöitä, somaattisia muutoksia havaittiin DNA uutettu parafinoidut näytteitä.

Citation: Gonzalez-Bosquet J, Calcei J, Wei JS, Garcia-Closas M, Sherman ME, Hewitt S, et ai. (2011) havaitseminen somaattisista mutaatioista High-Resolution DNA Sulaminen (HRM) Analysis in Multiple Syövät. PLoS ONE 6 (1): e14522. doi: 10,1371 /journal.pone.0014522

Editor: Philip Awadalla, University of Montreal, Canada

vastaanotettu: 02 maaliskuu 2010; Hyväksytty: 08 joulukuu 2010; Julkaistu: 17 tammikuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoittajat: Nämä kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että mitään kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Äskettäin ensimmäinen syöpä genomit voidaan sekvensoimattomat ovat paljastaneet unanticiapted laajuus ja monimutkaisuus somaattisten muutosten [1], [2], [3]. Löytö somaattisen jaksojen muutoksia, on kiihtynyt tutkinnassa ir taustalla mekanismeja karsinogeneesissä. Somaattiset muutoksia osallisena syövän kehittymistä ja kasvua etu kutsutaan

kuljettaja

mutaatioita. Kuitenkin suurin osa somaattisen muutoksia syöpä genomien ovat seurausta genomci epävakauden ja näyttävät olevan

matkustaja

tai sivullista mutaatioita, jotka eivät todennäköisesti mukana oncogenesis [4], [5]. Laajamittainen sekvensointi tutkimukset ovat osoittaneet, että esiintyvyys ja allekirjoitus somaattisten mutaatioiden ihmisen syövissä vaihtelevat suuresti [5], [6], [7], [8]. Näiden tutkimusten perusteella voidaan arvioida, että suurin somaattisten mutaatioiden syöpäsolut ovat todennäköisesti matkustaja mutaatioita, kun taas vähemmistö on arvioitu olevan kuljettajan mutaatioita [5], [7]. Täydellinen maisema esiintyvyys mutaatiot sekä niiden toiminnalliset seuraukset eivät arvostaa vasta tuhansia syöpä genomien on sekvensoitu.

Yhdistelmät syöpä genomeja on valtava tehtävä, joka vaatii kalliita teknologioita ja laskennallisia tukea koota suuria osia genomista. Koska voimakasta kiinnostusta yksilöimään keskeiset somaattisten muutoksia, tutkimus on keskittynyt seulomiseen tai analysointi kiinnostavat alueet. Useimmat tutkimukset ovat keskittyneet koodaavat alueet ja viereisten introni tai otaksuttu säätelyalueita [9]. Yksi näistä tekniikoista on korkea resoluutio sulaa (HRM) käyrä analyysi, polymeraasiketjureaktio (PCR), joka perustuu korkean suoritustehon määritystä havaitsemiseksi DNA-sekvenssin vaihtelun muutoksia mittaamalla sulamisen DNA-dupleksin, joka on onnistuneesti käytetty DNA uutetaan sekä jäädytettyjen ja parafinoidut kudoksen [10], [11], [12].

HRM erityisiä PCR-tuotteet tuotetaan kysellä konformationaalisten erojen, joka tunnetaan myös nimellä dissosiaatiokäyrä analyysi, käyttämällä tavanomaisia ​​reaaliaikaista PCR alustoille. Sitä käytetään yhdessä kaksijuosteisen DNA: ta sitova väriaineen karakterisoimiseksi aluke liittyviä ei-spesifinen monistuminen (tai alukedimeeristä) havaitsemista varten tietyn tavoitteen. Yksipohjaiseksi muutoksia PCR-tuotteet havaitaan muuttuneen HRM ominaisuuksia seurataan vapauttamaan loisteputki kaksijuosteisen DNA sitova väriaine [13], [14]. Tarkkojen ja edullisia välineitä, jotka tarjoavat HRM ominaisuudet, ja uudet fluoresoivat väriaineet, jotta tämä menetelmä houkutteleva kohdennetun mutaation skannauksen ja myös iturataa genotyypitys. HRM analyysi käytetään ennalta scan kandidaattigeenit epäluuloisia mutaatioita, vähentää merkittävästi määrää DNA: n sekvensointi voidaan suorittaa [15], [16], [17], [18], [19], [20].

tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida herkkyys ja spesifisyys edullinen HRM analyysi alustan mutaation skannausta yksipohjaiseksi vaihtelua eri kasvain näytteet: jäädytetty lapsipotilailla pieni pyöristetty blue-solujen kasvaimia ja parafinoidut kasvaimia rinta-, kohdun limakalvon ja munasarjasyövän syöpiä. Kaksisuuntainen sekvenssianalyysi suoritettiin määrittämään paikkansapitävyyden DNA HRM teknologia.

Methods

Ethics lausunto

Institutional Review Board Puolan rinta-, munasarja-, ja kohdun limakalvon syövän tutkimus hyväksyttiin National Cancer Institute (NCI), Bethesda, MD, M. Sklodowska syöpäinstituutti ja Cancer Center Varsovassa, ja Institute of Occupational Medicine (IOM) Lodzissa sekä Puolassa [21] . Kirjallinen suostumus osallistumista tutkimuksiin saatiin klo osallistuvien laitosten kaikilta osallistujia.

Kaikki pakastetut näytteet lapsipotilailla pienten pyöristetty blue-solujen kasvaimia ja saatu Cooperative Human Tissue Network (http: //chtn. nci.nih.gov/), olivat anonymisoidaan, ja meidän protokolla tarkasteli toimiston ihmiskoe National Institutes of Health, Bethesda, MD, ja sovelletaan poikkeusta.

DNA-näytteet

jäädytetyt kudosnäytteet.

Snap pakastetut kasvainnäytteet saatu Cooperative Human Tissue Network (https://chtn.nci.nih.gov/). Neuroblastoomasolu- linjat ja niiden viljelyolosuhteet kuvattu muualla [22]. Genomi-DNA uutettiin jäädytetyistä primaarikasvaimen näytettä (neuroblastooma, n = 140; rabdomyosarkooman, n = 63) ja neuroblastooma solulinjat (n = 13) käyttäen julkaistua protokollaa [23]. DNA: n konsentraatio kvantifioitiin käyttämällä NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE), ja säädettiin sitten sama konsentraatio, 10 ng /ul, että 12 määrityksissä. Hyväksytty ohjaus genomista DNA oli saatavilla Ääreisverenkierrosta 43 syöpiä.

parafinoidut kudosnäytteistä.

Puolan rinta-, munasarja- ja kohdun limakalvon syöpä tutkimus on osa välisessä tutkimuksessa sekä Yhdysvaltojen National Cancer Institute (NCI), M. Sklodowska syöpäinstituutti ja Cancer Center Varsovassa, ja Institute of Occupational Medicine (IOM) Lodzissa [21] on suunniteltu tutkimaan riskitekijöitä rinta-, kohdun limakalvon ja munasarjasyövän [24], [25], [26]. Parafiiniblokit kasvainkudoksen osallistujilta tämän tutkimuksen, joka leikattiin kerättiin. Kaikkiaan otimme mukaan kudos 60 osallistujaa rintasyöpä, 60 kohdun limakalvon syöpä ja 60 munasarjasyöpä.

Yhden 0,6 mm kudoksen ytimet kohdennetaan alueille, joilla kasvain, joka oli tunnistettu ja merkitty patologi (MES ) saatiin kustakin kasvainblokki DNA: n eristämiseksi, käyttäen kudosta mikrosirulla ytimenottoväline neula jokaisesta näytteestä. Mikrodissektion suoritettiin pieni osa näytteistä, mikä vaikeuttaa tarkasti arvioida prosenttiosuus kasvaimen materiaalia. Nukleiinihapon uuttaminen suoritettiin Agencourt® FormaPure ™ kit (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Häiriöiden välttämiseksi PCR poistimme RNA puhdistetuista yhteensä nukleiinihappo aikana uuttomenetelmällä. Eristyksen ja DNA pitoisuuden ja puhtauden kvantitoitiin käyttäen NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE). Yhteensä genomista DNA uutetaan tällä menetelmällä tuotti keskimäärin 2,07 mikrog (vaihteluväli 0,03-7,69 ug). Puhtaus DNA jokaisen uuton menetelmää arvioitiin mittaamalla intensiteetti absorbanssi DNA aallonpituuksilla 260 nm (A260) ja 280 nm (A280).

valinta eksonien seulomiseksi

joukko eksonien valittu tätä mutaatiota tysanalyysiä vedettiin syöpään geeneistä usein mutatoitunut (

PIK3CA

,

ErbB2

,

KRAS

,

TP53

EGFR

,

BRAF

,

GATA3

, ja

FGFR3

) julkaistuissa raporteissa, joissa painotetaan erityisesti rinta-, munasarja- ja kohdun limakalvon syöpiä [ ,,,0],5], [9], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Lisäksi, HRM analyysi näiden tiettyjen genomi- alueiden jo optimoitu.

pohja- ja pre-HRM PCR

Alukkeet eksonien, samoin kuin koko amplikonien, käytetään ennen -HRM PCR on lueteltu taulukossa 1. keskimäärin 40 emäsparia proksimaalisen – tai 5′-introni-alueella, jotka reunustavat tavoite eksonin ja 41 emäsparia 3 ’introni alueelle, joka reunustaa tavoite eksonin kuuluivat amplikonin. Ainoa poikkeus oli eksonin 6

GATA3

, joka mittaa 1462 emäsparia, joista 284 emäsparin vastaavat koodausta nukleotidin. Tässä nimenomaisessa tapauksessa amplikoni ei ulotu yli 3 ’puolella intronin (taulukko 1 lisätietoja).

Huomiota yksityiskohtiin ennalta HRM PCR-olosuhteet on ensiarvoisen optimointi: 1) suunnittelu PCR-alukkeiden pitää GC-pitoisuus alle tai niin lähelle kuin 60% kuin mahdollista, tuotteen koko noin 200 emäsparia ja välttää tunnetut variantit sisällä pohjamaali alueella; 2) valinta optimaalinen hehkutuslämpötiloja kaltevuus PCR; 3) ja suunnittelu PCR kokeissa johdonmukaisesti: samassa kokeessa, jossa samasta näytteestä erän ja samalla koneella ajaa.

PCR-pohjainen analysoi eri geenien suoritettiin 96 kuopan muodossa 10 ui volyymit ja oli 10 ng genomista DNA: ta jäädytettyä näytettä, ja 1 ui liuosta, joka sisältää genomista DNA: ta varten parafiiniin upotettu kudosnäytteistä, jossa keskimääräinen pitoisuus 25,8 ng /ul (SD = 21,7), ja aina 2 yli 55 ng /ul ( ensimmäinen kvartiili 8,4 ng /ul, ja kolmas kvartiili 36,3 ng /ul). Master Mix, joka sisälsi kaikki deoksinukleosiditrifosfaatteja, Taq ja LCGreen® PLUS (Idaho Technology, Salt Lake City, UT) käytettiin ennen HRM PCR. PCR suoritettiin käyttäen MJ Research PTC 225 Thermal Cycler (MJ Research, GMI Inc., Ramsey, MN), jossa on alkudenaturaatio 95 ° C 2 minuuttia, jota seurasi 45 sykliä 2 vaiheessa lämpösykleillä 95 ° C: ssa 30 sekuntia, ja 66 70 ° C 30 sekuntia (

PIK3CA

,

ErbB2

,

KRAS

66 ° C;

TP53

,

EGFR

,

BRAF

68 ° C;

GATA3

,

FGFR3

70 ° C: ssa). PCR: n jälkeen näytteet lämmitettiin 93 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja jäähdytettiin sitten 25 ° C: ssa ennen HRM.

Näytteet käsittely

Jäädytetyt. HRM analyysit tehtiin kahtena kaikista näytteistä saatiin joko Frank (n = 59) tai vähän vaihteluita (n = 99) on normalisoitu HRM käyrä, ja myös 20% satunnaisesti valitun negatiivisista näytteistä (n = 45). Toinen kierros HRM suoritettiin arvioimaan menetelmän uusittavuuden, käyttäen tunnettuja negatiivisten kontrollien ja positiiviset kontrollit. Frank vaihtelut määriteltiin ne HRM käyrät tulkittu ohjelmisto epäilyttäviä kantavan nukleotidin muutos tai mutaatio /muunnos, ja edustivat punaisena grafiikka (kuva S1). Vähäinen vaihtelu otokseen pidettiin kun ohjelmisto havaittu vähäinen varianssi HRM käyrä suhteessa keskimäärin villityypin käyrä käymättä sitä mutaatio (3% kaikista puheluista) (Kuva S1). Nämä näytteet olivat edustettuina joko harmaa tai vihreä, riippuen niiden erotusaste kanssa keskimäärin villityypin käyrä. Kaikki näytteet Frank tai minimaalinen vaihtelu käyrä tehtiin toistuva HRM analyysi, ja myös sekvensoitiin.

parafinoidut. Analysoimme 60 rintasyöpä näytteitä, 60 kohdun limakalvon syöpä näytteitä ja 60 munasarjasyöpä näytteitä. Laatu uutettua DNA: ta mitattiin läsnäolo ennalta HRM PCR tuote HRM analyysi ja läsnäolo yhden juovan 1,5% agaroosigeelissä [33]. Tässä kokoonpanossa, kaikki näytteet olivat kaksisuuntaisesti sekvensoitiin.

HRM Curve Analysis

Näytteet monistettiin 96-kuoppalevyille, ja HRM käyrät hankinta suoritettiin prototyyppiversio HRM instrumentin , LightScanner ™ käyttäen LCGreen® Plus + Dye (Idaho Technology, Salt Lake City, UT). Riippuen määrityksen yhdistelmä lautaselle HRM alue asetettiin vastaamaan kutakin määritystä yksittäisen profiilin, jossa on vähintään 4 ° C ennen ensimmäistä sulaa siirtyminen lautasella, joiden kaltevuus on 0,3 ° C /s, ja vähintään 3 astetta kun viimeinen fragmentti on kokonaan sulanut.

koska HRM tehtiin tässä tutkimuksessa, koska seulonta teknologian, käyrät analysoitiin käyttämällä mukautettuja LightScanner ™ -ohjelmistoa (Idaho Technology, Salt Lake City, UT). Normalisointi ja taustan vähentäminen ensin suoritettiin sovittamalla eksponentiaalisesti taustalle ympäröivä HRM siirtymät kiinnostava. Normalisoitu HRM käyrät olivat lämpötila-päällekkäin, eliminoimiseksi on lämpötilan väliset virheet kaivoja tai ajoja. Ero tonttien näistä normalisoitu ja lämpötila-päällekkäin käyrät saatiin ottamalla fluoresenssi ero kunkin käyrän keskiarvosta villityypin käyrä ollenkaan lämpötilassa pistettä [13], [14]. HRM käyrät juoni tulkittu ohjelmisto on erilainen kuin keskimäärin villityypin käyrä katsottiin epäilyttäviä kantavan nukleotidin muutos tai mutaatio /variantti (Kuva S1). Näitä analyyttisiä menetelmiä on sovellettu aiemmin mutaatio skannauksen [34], [35].

Kaksisuuntainen Sequence Analysis

Kaksisuuntainen sekvenssianalyysi suoritettiin alukkeilla, jotka on suunniteltu laajentamalla kukin oligonukleotidia käytetään ennalta HRM PCR universaali sekvensointialukkeena: M13 eteenpäin (TGTAAAACGACGGCCAGT) tai M13 reverse (CAGGAAACAGCTATGACC). PCR-olosuhteet sekvenssianalyysi suoritettiin 96-kuoppaformaatissa 10 ui määrä ja mukana 1 ui monistettua DNA: ta ennalta HRM PCR-reaktiossa. Genomista DNA: ta käytetään vain silloin, kun sekvenssi reaktio epäonnistui vahvistetulla DNA. PCR-tuotteet sekvensoitiin käyttäen modifioitua ABI PRISM® BigDye Terminator-protokollan (Applied Biosystems, Foster City, CA). Rekisteröimätön väriaineet terminaattorit ja suolat poistettiin käyttäen Sephadex G-50 (Sigma, St Louis, MO) spin sarakkeita MultiScreen®-HV 96-kaivo- suodatinlevylle (Millipore, Billerica, MA). Reaktiot ajettiin ABI 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sequence jälkiä analysoitiin ja verrattiin kahdella ohjelmistopaketteja (SeqScape ™ v2.5 ja Variant Reporter ™ v1.0, niin Applied Biosystems, Foster City, CA) ja tarkistaa kaksi riippumatonta arviointia [9]. Kun ohjelmisto ei voinut yhdenmukaistaa ja koota eteenpäin ja käänteinen sekvenssejä näytteen katsottiin epäonnistuneen sekvensointi prosessia varten tässä tutkimuksessa. Jotta parafinoidut määrityksiä, joita ei ole suoritettu, sekä niiden jäädytetty kollegansa (erityisesti eksonit geeneistä

TP53

ja

GATA3

), PCR-olosuhteet sekä niiden alukkeita muunnettu parantamaan sekvensointi . Tämä sisältyi tuottaa alukkeita, joka ulottui useammassa perimän alueita tai liukua 20-30 emäsparin ylös tai alas stream. Mutta me totesi, että uusi erityisiä määrityksiä ei optimoida kun testaus eri alueilla muuttaisivat tutkimuksen tarkoituksesta. Yhteenvetona sekvensointi virheprosentti oli 2,5% jäädytettyä yksilöitä ja 20,0% for parafinoidut.

nukleotidin muutokset havaita sekvensoimalla luokiteltiin uusia muutoksia tai tunnettujen SNP (tai yhden emäksen monimuotoisuus) jos löytyy dbSNP, Build 130, NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) käyttäen Genewindow (genewindow.nci.nih.gov) [36].

tilastollinen analyysi

välisen assosiaation määrän DNA uutetaan parafinoidut kudoksen (tasot: ≤10 ng /ul, 11-20 ng /ul, 21-30 ng /ul, ja 30 ng /ul), ja onnistuneen pre-HRM PCR-määritys, mitattuna joko läsnä yhden amplikonin agaroosigeelissä tai, kun läsnä on DNA-tuotteen HRM analyysi suoritettiin logistista regressioanalyysiä. Välinen sopimus 2 muuttujat (tai luotettavuus) määritettiin Kappa testi. Kappa-arvot olivat alle 0,40 osoittavat alhainen yhdistys, välillä 0,40 ja 0,75 osoittavat keskisuurten yhdistys, ja arvot ovat yli 0,75 osoittavat korkea yhdistyksen kahden toimenpiteitä. Seulonta valmiuksia HRM ja johdonmukaisuutta analyysin olivat toimenpiteen käyttämällä klassisia mittareita, kuten herkkyys, spesifisyys, väärät negatiiviset ja positiiviset hinnat, ottaen huomioon Sekvensointianalyysin standardina mittauksen sekä pakaste- ja parafinoidut uuttaa näytettä.

tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Microsoft® Excel (Redmond, WA) ja R tilastollinen paketti (www.r-project.org/).

tulokset

Frozen näytteitä

mutaatio seulonta suoritettiin 12 amplikoneja kullekin 216 pakastettujen näytteiden alkuvaiheen HRM analyysin (2592 eri määritykset). Havaitsimme 59 HRM positiivista näytettä, 2510 HRM negatiivinen, ja vain 23 näistä mittauksista ei pystytä arvioimaan (alle 1%). Jotta toista HRM kokeiluja, 47 oli positiivisia, 156 negatiivinen, ja vain 1 ulos 204 ei arvioitavissa. Kaikkiaan 2772 ulos 2796 (2592 ensimmäisellä HRM kierroksella, ja 204 toisella HRM kierroksen), eli 99,1%, kokeiden tietoja voitiin mutaatioiden seulonta /varianttien HRM analyysi.

Alkuperäisessä kierroksella analyysi, 4 määrityksissä ei ollut mutaatiota havaittu:

ErbB2-

eksonin 25, distaalinen alue

TP53

eksoni 5,

GATA3

eksonin 5, ja proksimaalinen alue

GATA3

eksonin 6. muilta testattu eksonit, välillä 1-9 putatiivista nukleotidikorvautumisten havaittu; erityisesti eksonia 13

FGFR3

oli eniten, 30. Tulokset mutaatio seulonta HRM teknologian molemmissa kokeissa alku- ja toista, sekä validointi sekvensointi jäädytettyä näytettä on esitetty taulukossa 2.

HRM kokeet toistettiin kaikki näytteet todisteet oletetun mutaation HRM käyrä, ja myös osajoukko negatiivisten näytteiden. Välinen sopimus alkuperäisen ja toista näytön HRM kokeissa oli 91%, joiden kappa testi arvo 0,77, tai korkea vastaavuutta molempien. Yleensä HRM käyrät esitetään vastaavia muotoja sekä erillistä määritystä (kuva S2). Suurin erimielisyyksien asuisivat näytteissä kutsutaan epänormaalia aloitusnäyttö ja normaali, tai ilman mutaatio, toistetun HRM kokeessa (n = 12), joka vahvistettiin normaali sekvensoimalla. Vain 1 toistettiin HRM analysoitaessa havaita nukleotidisubstituution näytteessä suhteessa aloitusnäyttö. Myöhemmin sekvensointi tästä näytteestä havainnut korvaaminen viite GG alleelien, asemassa 7518234 kromosomin 17 (eksoni 7 geenin

TP53

), AA.

herkkyys ja mutaation /muunnos seulonta olivat 97% ja 87% vastaavasti verrattuna kaksisuuntaiseen sekvensointi, jossa on väärä negatiivinen korko 3%. Yleinen tarkkuus testi oli 89% (taulukko 3). Kun toinen, toistuva HRM analyysi verrattiin sekvensointi tuloksia, spesifisyys kasvoi 94%, samoin kuin tarkkuus, 94% (kappa 0,82); mutta väärä negatiivinen korko kasvoi myös 5%. Tiedot sekvensointi tulokset mutaatioita on kuvattu taulukossa 4. Yksi väärä negatiivinen havaittiin verrattaessa HRM kokeiluja sekvensointi, koska se ei ole havaita nukleotidin muutos, AA: sta AG sekä alku- ja toista näytöt. Tämä variantti osoittautui tunnettu SNP eksonissa 13

FGFR3

, rs7688609 (taulukko 4). Erityisesti kattava julkisia tietokantoja (dbSNP ja Ensembl) osoitti G esi, viittaus alleelin DNA-sekvenssin tässä lokuksessa, mutta suurin jaksotelluille näytteiden Tutkimuksessamme 63 ulos 67 (tai 94%), oli homotsygoottisia AA , ja vain 6% oli heterotsygoottinen G (GA). Koska tämä epäsuhta on alleeli taajuuksilla saatavilla julkista tietoa, päätimme kulkua 3 populaatioita HapMap sekä SNP500 väestön tähän nimenomaiseen amplikoni (n = 366) [37], [38]. Kaiken alleeli Taajuus oli 94%, ja alleeli G taajuus oli 6%. Joruba väestö oli korkein G usein 17%. Samalla, sekvensoimme tällä alueella 43 käytettävissä ituradan DNA kärsivien potilaiden näistä lapsipotilailla kasvaimista; kaikki olivat homotsygoottisia AA. Sekvensoinnin jälkeen kaikki parafinoidut näytteitä, löysimme samanlaisia ​​alleelifrekvenssien.

Parafiini-upotettu näytteitä

A260 /A280-suhde, joka on mitta puhtauden parafiini -Embedded uutettua DNA: ta, keskiarvo oli 1,92 (SD = 0,45) kaikille rintasyövän näytteet, keskimäärin 1,82 (SD = 0,12) ja kohdun limakalvon syöpä näytteitä, ja keskimäärin 2,0 (SD = 0,27) ja munasarjasyöpä näytteitä. Oli välillä suoraa yhteyttä DNA: n pitoisuus (ng /ul), uutettu parafinoidut näytteet, DNA käytetty määrä pre-HRM PCR, ja kun läsnä on yhden juovan agaroosigeelistä (p 0,001 ). Lisäksi siellä oli yhdistyksen välillä uutettu DNA keskittyminen ja läsnäolo riittävän HRM käyrä analysoitavaksi (p 0,001). HRM onnistui 96%, kun määrä parafinoidut uutettua DNA: ta käytettiin tätä tekniikkaa oli yli 30 ng verrattuna 92%, kun määrä oli ≤30 ng (taulukko 5).

Kaiken 93% (2008 ulos 2153) on mittausten parafinoidut näytteiden HRM analyysi oli arvioitavissa. Tämä tekniikka on onnistunut, kun jäätynyt DNA näytteet analysoitiin kuin silloin, kun DNA: ta paraffiiniin upotetut näytteet käytettiin 99,1% vs. 93,3% (p 0,001).

tulokset mutaation seulontaa HRM teknologian ja sen validointi kaksisuuntaisen sekvenssianalyysi varten parafinoidut näytteet on esitetty taulukossa 6. myös esitys näistä arvoista kuvataan kuviossa S3. Yleinen herkkyys ja spesifisyys näytteiden epäilyttäviä varten mutaation HRM analyysissä oli 88% ja 80% vastaavasti verrattuna sekvensointi, jossa on väärä negatiivinen osuus 12% (taulukko 7). Kuitenkin suhteellisen pieni prosenttiosuus DNA: ta paraffiiniin upotetut näytteet oli vaikea sekvenssin. Kuten mainittiin, sekvenssi reaktio toteutetaan käyttämällä monistettiin DNA: pre-HRM PCR. Kun sekvensointi tietyn määrityksen epäonnistunut, genomista DNA: ta käytettiin ja sekvensointi toistettiin. Tämän strategian, uudistetun järjestyksessä jäädytetyistä näytteistä voidaan suorittaa yli 97% ajasta. Näin ei ollut asianlaita DNA: ta parafinoidut kudos, jossa sekvensointi saatiin aikaan 80% ajasta käyttäen samaa strategiaa. Erityisesti onnistumisprosentti DNA sekvensoitiin parafinoidut kudosta oli vähemmän kuin 50% eksonit geeneistä

TP53

(distaalinen alue eksoni 5, ja eksoni 7) ja

GATA3

( proksimaalinen alue eksonin 6), jotka vaikuttavat vertailu sekvenssianalyysillä ja HRM käyriä. Sekvensointi näistä amplikonien epäonnistuneet 341 ulos 397 reaktioita, joiden osuus 86% kaikista epäonnistui sekvensoinnilla. Kun nämä epäonnistuneet määritykset jätettiin vertailun HRM käyriä ja sekvensointi, herkkyys kasvoi 92%, joiden tarkkuus on 80%. Parafinoidut sekvensointi yksityiskohdat on kuvattu taulukossa S1. Kaikki uudet nukleotidit muutokset löytyvät tutkittavat näytteet toimitettiin dbSNP (build 131) ja näytetään taulukossa S2.

Keskustelu

HRM analysoinnin LightScanner ™ edustaa kohtalainen seulontaan testi mutaatioista ehdokasta genomialuetta. Vertailu kaksisuuntainen Sekvensointianalyysin tarjoaa vahvaa näyttöä sen tarkkuudesta huolimatta alhainen esiintyvyys mutaation /variantti korko, varsinkin kun valittu eksonit kanna mutaatioita. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [28], [39]. Havaittu oli 39 2569 (eli 1,5%) mutaation /muunnos kaikille analysoitiin eksonien 216 jäädytetty lapsipotilailla pieni pyöristetty blue-solujen kasvaimia ja 67 1586 (4,2%) mutaation /muunnos kaikille analysoitiin eksonien 180 gynekologiset kiinteät kasvaimet (taulukot 4 ja S1, vastaavasti).

herkkyys ja spesifisyys HRM analyysi oli korkeampi jäädytetyistä näytteistä verrattuna parafinoidut näytteitä, joiden havaitun herkkyys 97% DNA uutettu jäädytetyistä näytteistä taas se on 88% DNA uutettu parafinoidut kudosta. Alempi kehitys joissakin testeissä verrattaessa DNA parafinoidut yksilöitä vastaan ​​pakastetut näytteet on kuvattu myös aikaisemmissa tutkimuksissa

KRAS

ja

EGFR

[12]. Nämä erot johtuvat, ainakin jossain määrin, sekvensoida muutoksia DNA liittyvät silloitusaineen välillä proteiinien ja DNA: n, ja kääntäen korreloi solujen määrän näytteitä [40], [41], [42]. Lisäksi, kun läsnä on useita mutaatioita ja pisteen deleetiot voivat muuttaa analyysin tehokkuutta, mahdollisesti syy alhaisen suorituskyvyn

TP53

määrityksiä [16], [43]. Suurin osa HRM tutkimuksissa tähän mennessä varmana, että joitakin rajoituksia, tämä on suhteellisen yksinkertainen, nopea ja edullinen tekniikka havaitsemiseksi genomista vaihtelua parafinoidut kudosnäytteistä [43]; johdonmukainen raportit joitakin geenejä seulotaan meidän tutkimuksen [11], [16], [40], [44]. Sen rajoitukset liittyvät alhaisempi tehokkuus alueisiin poistoineen (tai lisäyksiä), toteamiseen homotsygoottinen vaihtelut (verrattuna heterozigous), erityisistä määrityksiä, ja puute sopimuksen optimaalinen pituus PCR-tuotteen tai sulaminen verkkotunnusten kohti amplikoni [ ,,,0],12], [13], [16].

jotta poistamiseksi hienoisia eroja reagenssin komponenttien välinen lopullinen eluutiopuskureita useista louhintalautoilla ja minimoimaan vaihtelu näytteiden lähestymistapamme oli suorittaa DNA uuttamalla käyttäen yhteistä louhinta alusta, olosuhteet ja protokolla. Optimoitu näytteiden käsittely ja standardoituja DNA: n eristämiseksi, on mahdollista seuloa parafinoidut näytteiden suurempi herkkyys [40], [41]. Huolimatta lisääntyneestä pirstoutuminen DNA uutetaan parafiiniin upotettu kudokseen, on mahdollista luotettavasti seuloa lyhyemmässä monistustuotteet 250 bp pitkä. Lisäksi, siinä määrin kuin DNA-fragmentaation korreloi kudoksen tyypin [12], [45], [46]. Menestys molemmille, HRM käyrä ja sekvensointi analyysit, on yli 97%, kun 10 ng DNA: ta käytetään pakastetusta näytteistä. Mutta ne tuloksia ei voida saavuttaa sama määrä parafinoidut uutettu DNA (onnistunut HRM analyysi 84%). Lisäämällä määrän puhdistettua DNA lisätään ennalta HRM PCR ≤30 ng parani, osittain voittamisessa haasteen optimaalista kaksijuosteinen DNA. Optimointi ennen HRM PCR voidaan myös lieventää alentunut herkkyys, varsinkin kun käytetään erityistä väriainetta kemiaa [46].

DNA: ta paraffiiniin upotetut kudokset oli myös vaikeampi sekvensoida kuin DNA jäädytetyn kudoksen [47], [48]. Kuitenkin Tämän tutkimuksen tavoitteena ei ollut luoda optimoitu protokolla sekvensointi DNA uutetaan parafinoidut kudosta, vaan arvioida seulonta ominaisuuksia HRM analyysin. Kun optimaaliset koeolosuhteet HRM ja sekvensointia analyysejä jäätyneen näytteistä määritettiin, haimme heidät parafinoidut asettaa, saavuttaa tasapuolisen vertailun molemmat näytteitä. Pöytäkirja muunnoksia sekvensointi kokeilut voitaisiin vaatimattomasti parantaa suorituskykyä, kuten käyttämällä koko genomin monistamisen [49], [50], mutta tämä voi esitellä Heterotsygotian menetys. Vaiheet helpottaa parhaan voivat myös vaihtoehtoisia alukkeita tai denaturointiolosuhteiden.

Näiden ajatusten pohjalta, suosituksemme ylläpitää ja ehkä parantaa seulonta ominaisuuksia HRM analyysin parafinoidut uutetaan näytteitä LightScanner ™ olisi muun muassa seuraavat:

sisällyttäminen ≥30 ng genomista kokonais-DNA voi kasvaa HRM analyysi onnistumisprosentti jopa 96%.

Pre-HRM PCR optimointi pitää samaan pohjamaali valinta vähentää GC sisällön, riittävät amplikonin koko ja optimaalinen hehkutus lämpötila.

Amplikonit joka epäonnistui sekvensointi yli 50%: ssa myös heikkoa aikana HRM analyysi. Joten se voi olla hyödyllistä testata valitun amplikonit sekvensoimalla muutamia näytteitä alussa kokeen.

vääriä positiivisia HRM analyysin parafiiniin näytteissä oli noin 20%, mikä tarkoittaa, että ylimääräinen sekvensointi parantamiseksi tarvitaan tarkkuutta osajoukko näytteiden oletetun mutaatio [12]. HRM analyysi jäädytetyistä näytteistä vain pidetään 59 heistä poikkeava, 39 todellista mutaation /variantteja. Näin ollen olisi tarpeen sekventoida vähemmän näytteitä kunkin mutaation. Siksi, ei vain on suurempaa jäädytetyistä näytteistä suhteen parafiiniin näytteet, mutta myös kustannustehokkuutta.

Yhteenvetona HRM analyysin kanssa LightScanner ™ on lupaava seulonta väline mutaation /muunnos somaattisten DNA uutetaan joko jäädytettynä tai parafinoidut näytteitä, vaikka yleinen tarkkuus on parempi jäädytetty yksilöitä, todennäköisesti liittyvät DNA laatua. Tämä menetelmä pystyy havaitsemaan mutaatioita sekä tunnettujen SNP jopa genomista heikoilla alueilla mutaation esiintyvyys alueella 5% tai ehkä pienempi.

tukeminen Information

Kuva S1.

edustus HRM käyrän

BRAF

eksonin 15 genomisesta DNA: ta jäädytetyistä näytteistä. Punainen nuoli: HRM käyrät tontti tulkittu ohjelmisto epäilyttäviä kantavan nukleotidin muutos tai mutaatio /variantti. HRM toistettiin kaikki nämä näytteet, ja ne kaikki sekvensoitiin. Vihreät nuolet: HRM käyrät mahdollisimman vähän vaihtelua suhteessa keskimäärin villityypin käyrä. Kaikki nämä näytteet myös sekvensoitiin ja HRM toistettiin. Musta nuoli: Kaikki normalisoitu HRM käyrät katsoa olevan villityypin sekvenssin.