Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

mekaaniset ominaisuudet soluväliaineen on tärkeä rooli solun kasvua ja erilaistumista. On kuitenkin epäselvää, missä määrin syöpäsolut vastata muutoksiin mekaanisten ominaisuuksien (jäykkyys /jäykkyys) ja microenvironment ja miten tämä vaste vaihtelee syöpäsolun linjat.

Menetelmät /Principal Havainnot

tässä tutkimuksessa käytettiin hiljattain kehitettyä 96-kuoppaiselle levylle, joka taulukot soluväliaineen-konjugoidun polyakryyliamidigeeleillä, jotka lisäävät jäykkyyttä vähintään 50-kertaisesti levyn poikki. Tämä levy käytettiin määrittämään, miten muutokset jäykkyyden soluväliaineen moduloida biologisia ominaisuuksia kasvainsoluissa. Testatuissa solulinjoissa jakautuvat kahteen ryhmään perustuen niiden leviämisen substraateilla eri jäykkyys: ”jäykkyys riippuvainen” (jotka osoittavat kasvua solujen kasvua solunulkoisen jäykkyys lisääntyy), ja ”jäykkyys itsenäinen” (jotka kasvavat yhtä molemmin pehmeä ja jäykkä alustoille). Solut, jotka kasvoivat heikosti pehmeillä geeleillä myös osoitti väheni levittäminen ja siirtäminen näissä olosuhteissa. Vielä tärkeämpää on, kylvö solulinjat keuhkoihin nude-hiirten paljasti, että solujen kyky kasvaa pehmeässä geelit

in vitro

korreloi niiden kyky kasvaa pehmytkudoksen ympäristö

in vivo

. Keuhkojen karsinooma A549 vastasi kulttuurin pehmeän geelit ilmaisemalla eriytetty epiteelin merkki E-kadheriinin ja vähentämällä ilmaus mesenkymaalisten transkriptiotekijän Slug.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä havainnot viittaavat siihen, että mekaanisia ominaisuuksia matriisin ympäristön merkittävä rooli säätelyssä leviämisen ja morfologiset ominaisuudet syöpäsolujen. Edelleen monisyvennyslevyjä muoto pehmeä levy määritys on käyttökelpoinen ja tehokas täydennys perustettu 3-ulotteinen soluviljelymalleissa.

Citation: Tilghman RW, Cowan CR, Mih JD, Koryakina Y, Gioeli D, Slack -Davis JK, et ai. (2010) Matrix Jäykkyys säätelee syöpäsolujen kasvua ja Cellular fenotyyppiin. PLoS ONE 5 (9): e12905. doi: 10,1371 /journal.pone.0012905

Editor: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 15 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 24 elokuu 2010; Julkaistu 23 syyskuuta 2010

Copyright: © 2010 Tilghman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia NIH-NCI CA40042 (National Institutes of Health-National Cancer Institute) (www.nih.gov) ja rahoitusta Coulter Foundation Translational Partners Award (www.whcf.org) (JTP), NIH HL092961 (DJT) ja NIH CA124706 (PO). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ohjaus epiteelisolujen (EY) erilaistuminen ja proliferaatio on kriittinen kudoksen homeostaasiin [1], [2]. EY lisääntymistä säädellään monimutkaista vuorovaikutusta ympäröivän mikroympäristön, mukaan lukien altistuminen kasvutekijöitä, kosketuksiin viereisten solujen adheesiota komponenttien soluväliaineen (ECM) [3] – [6]. Muuttaminen signalointi polkuja, jotka säätelevät vastaus näihin microenvironmental vihjeet on kriittinen tapahtuma kasvaimen aloittamista etenemisen ja etäpesäkkeiden.

mekaaniset ominaisuudet ECM on todettu tärkeä tekijä säätelevät erilaistumista ja lisääntymistä lukuisia solutyyppejä sekä

in vitro

ja

in vivo

. Tarkemmin sanottuna jäykkyys ( ”jäykkyys”) ECM, määritelty sen kimmokerroin (

E

) yksiköissä voimassa alaa kohden (Pa), vaikuttaa kasvuun, erilaistumiseen ja toimivuus monissa solutyypeissä, mukaan lukien kantasolut, fibroblastit, gliasolut, ja sydänlihassolujen [7] – [11]. Lisäksi tautitiloja liittyy usein paikallinen kasvu ECM jäykkyyden [12], [13]. Syövän etenemisessä pehmeissä kudoksissa liittyy tyypillisesti lisääntyminen jäykkyys johtuu paikallisen kertyminen tiheä, silloitettu kollageeni matriisi mahdollistaa havaitsemisen kasvaimeen fyysinen tunnustelemalla [14], [15]. Niinpä ei aiheuttanut kasvaimia rintarauhasen epiteelisolujen, jotka tavallisesti asuvat pehmeä (

E

= 150 pascalia [Pa] tai N /m

2) microenvironment rinnasta, näyttää lisääntyvän leviämisen kun viljeltiin jäykempi matriisit (

E

= 4500 Pa), sekä lisääntynyt maahanmuutto, täydennetty ERK signalointi, ja menetys solun polariteetin [16]. Nämä ominaisuudet pidetään tunnusmerkkejä kasvainsolujen ja luonnehtia olevan erottamaton osa siirryttävä suhteellisesti lepotilassa on ”pahanlaatuinen” fenotyyppi vetämänä paikallinen kasvu ECM jäykkyyden [16].

laajuus ja vaihtelevuus joihin ihmisen syövän solulinjoja ovat herkkiä vaihteluille microenvironmental jäykkyys on epäselvä. Fibroblastien transformoitu onkogeenisella H-Ras enää osoittaa kasvun esto pehmeässä alustoille [11]. Lisäksi kasvu ominaisuudet klonaalisen väestöjen rintasyövän MDA-MB-231 eroavat vastauksena jäykkyys, ja ne korreloivat kyky kasvaa pehmeässä keuhko- tai jäykkä luun

in vivo

[ ,,,0],17]. Tämä viittaa siihen, että kasvu ominaisuudet tietyn syövän solulinja vastauksena substraatin jäykkyys voidaan määrittää sen geneettinen tai epigeneettisiä koostumusta.

analyysi ihmisen syöpäsolulinjoja suoritetaan yleensä käyttäen soluja viljellään jäykästä muovista, tai in Matrigel tai pehmeässä agarissa, mekaaniset ominaisuudet, jotka ovat huonosti määriteltyjä ja /tai vaikea moduloida. Tässä tutkimuksessa olemme sovitettu menetelmä solujen viljelemisen biologisesti merkityksellisiä ”pehmeitä” substraatit käyttäen ECM-konjugoitua polyakryyliamidi (PA), geelit, joka voi ulottua jäykkyys alueella 100 Pa-150000 Pa. Käytimme viime aikoina kehitetty 96-koejärjestelmässä että paneelit PA geelit vaihtelevien jäykkyys käyttäjän määrittämiä välein levyn poikki. Tätä järjestelmää käytettiin määrittämään, miten muutokset jäykkyyden ECM moduloida biologisia ominaisuuksia kasvainsolujen, mukaan lukien lisääntyminen, morfologia ja muuttavat ominaisuuksia. Solulinjat testattiin eriytyneet kahteen ryhmään perustuen niiden leviäminen profiileja: ”jäykkyys riippuvainen” linjat yleensä näytteillä yhä solujen kasvua solunulkoisen jäykkyys lisääntyi, kun taas ”jäykkyys itsenäinen” linjat kasvoi yhtä hyvin koko testattu kirjon matriisin jäykkyys. Tärkeää on, solut, jotka kasvoivat heikosti pehmeillä geeleillä myös osoitti väheni levittäminen ja siirtäminen näissä olosuhteissa. Olemme arvioineet kasvun neljän edustavan solulinjat valitaan näistä kahden

in vivo

viemällä solut pehmytkudoksen ympäristön keuhkoissa. Kaksi jäykkyys riippumattomia solulinjoja (PC-3 ja mPanc96) kasvoi hyvin pehmeä (keuhkojen) kudosta, kun taas jäykkyys solulinjojen (A549 ja MDA-MB-231) ei kasvanut hyvin keuhkoissa. Keuhkojen karsinooma A549 vastasi kulttuurin pehmeän geelit ilmaisemalla eriytetty epiteelin merkki E-kadheriinin ja vähentämällä ilmaus mesenkymaalisten transkriptiotekijän Slug. Nämä havainnot viittaavat siihen, että mekaaniset ominaisuudet matriisin ympäristön merkittävä rooli säätelyssä leviämisen ja morfologiset ominaisuudet syöpäsolujen, ja että ”jäykkyys profiilin” on luontainen ominaisuus jokaisen tasyöpäsolulinja.

tulokset

jäykkyys-riippuvaista kasvua syöpäsolulinjojen

mittaamiseksi kasvun syöpäsolulinjoissa funktiona matriisin jäykkyys meillä on sovitettu uuden 96-kuoppaisen koejärjestelmässä ( ”soft-plate96” ), joka käyttää kollageenin kovalenttisesti kytketty polyakryyliamidigeeleillä substraatteina sijasta ECM-pinnoitettu jäykästä muovista. Pehmeä-levyt koostuu viidestä osasta, joista jokainen sisältää kaksi saraketta kollageenipäällysteisiin PA geelit tietyn kimmokerroin (Fig. 1), 150 Pa ja 1200 Pa (verrattavissa keuhko- ja rinta-), 2400 Pa ja 4800 Pa ( verrattavissa maitorauhasen kasvain), ja 9600 Pa (vastaten suunnilleen poikkijuovaisten lihas). Nämä kimmoisuusmoduulien valittiin perustuvat julkaistuihin mittauksiin jäykkyys pehmeiden kudosten ja kasvainten [7], [10], [16], [18], ja alustavat tiedot osoittavat, että suurimmat muutokset jäykkyys riippuvaista soluproliferaatiota tapahtui vuosina 150 Pa ja 4800 Pa: n (tietoja ei esitetty).

tyypillinen 5 päivän kasvun määrityksessä käyttäen pehmeän plate96 tuottaa ”kasvua profiili”, joka ilmentää vaikutusta jäykkyyden proliferaatioon solulinjan.

määrittää kasvun profiilia neljäntoista syöpäsolulinjojen maljaamalla solut pehmeä-plate96 ja mittaamalla kertainen muutos solujen määrä viiden päivän jälkeen käyttäen fluoresoivaan DNA: han sitova väriainetta (Fig. 2) . Lisäksi kasvun profiilit ei tuumorigeeninen nisäepiteelisoluissa (MCF-10A) ja kaksi fibroblastien riviä määritettiin. Solujen kasvu valituilla matriiseilla syntyy laadullisesti ”kasvuprofiiliin” jokaiselle solulinjan (Fig. 1, 2). Kasvu profiilit solulinjojen putosi kahteen ryhmään: ”jäykkyys riippuvainen” solut, ainakin 2-kertainen muutos solujen määrä koko alueella solunulkoisen jäykkyys testattiin (esim, MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen ja A549 keuhkosyövän soluja), ja ”jäykkyys riippumaton” soluja, jotka kasvoivat yhtä hyvin koko joukko tutkittuja matriisin jäykkyys (esim PC-3 syöpäsolujen ja mPanc96 haimasyöpäsoluissa) (Fig. 2). Ei ollut korrelaatiota muoto jäykkyyden riippuvan kasvuprofiili ja kudosten alkuperän, vai soluja perin viljeltiin primaarikasvaimen tai metastaattinen vaurio.

taulukko on kooste 5 päivän kasvun määritykset 17 solulinjoja. Mukana taulukossa ovat alkuperäisen lähteen solujen (merkitty kirjallisuus lainaukset), kyky kasvaa 150 Pa ja 9600 Pa alustoille (maasta SoftPlate96 määritykset), ja pehmeä-plate96 kasvu profiilin kullekin solulinjan. Harmaa profiilit osoittavat jäykkyys riippuvia linjat ja mustan profiilit osoittavat jäykkyys riippumaton linjat. Kasvua mitataan seuraavasti: – 1-kertainen; + 1-5 kertainen; ++ 5-10 kertainen; +++ 10-15 kertainen; ++++ 15-20 kertainen; +++++ 20 kertainen nousu solujen lukumäärän 5 päivää.

lisäksi tunnettu kaksi solulinjaa, jotka osoittivat jäykkyys riippuvaista kasvua (MDA-MB-231 ja A549) ja kaksi solua linjat, jotka osoittivat jäykkyyttä riippumatonta kasvua (mPanc96 ja PC-3). Kukin solulinja osoitti vahvaa solujen kasvua jäykkiin kollageenipäällysteisiin muovia (Fig. 3A). Jäykkyys-riippuvaisten solujen osoitti 4-5 kertaisen lisäyksen numero jäykempi geelit (4800-9600 Pa) suhteen pehmeä (150-1200 Pa) geelejä (Fig. 3B, top paneelit). Sen sijaan kaksi jäykkyys riippumaton solulinjoissa osoitettu lähes vastaava määrä on pehmeä ja jäykkä geelit (Fig. 3B, alapaneelit). Sen määrittämiseksi, ero kasvun pehmeillä tai jäykät pohjat edusti valintaan solupopulaation joilla etuoikeutettu kasvua eri alustoille, A549 tai MDA-MB-231-soluja viljeltiin muoviin tai 150 Pa alustoille 15 päivää. Nämä solut kerättiin sitten ja alistetaan 5 päivän kasvun määrityksessä pehmeälle-plate96. Ei muutosta pehmeä-levy kasvuprofiiliin jälkeen havaittiin pitkäaikainen viljely pehmeillä alustoille (Kuva. S1). Nämä tiedot selvästi, solulinjassa erityisiä eroja kyvyn kasvaa pehmeällä vs. jäykät pohjat ja viittaavat siihen, että ”jäykkyys profiilin” on luontainen ominaisuus jokaisen solulinjan.

.) 5 päivän kasvun määritys neljä syöpäsolun riviä muovi. B.) 5 päivän kasvun määrityksissä neljästä syöpäsolun riviä pehmeälle-plate96. Tiedot ilmaistaan ​​kertainen muuttuvat ajan solujen lukumäärä alunperin päällystetty. Tulokset osoittavat, keskiarvo ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05 vs. kasvua 9600 Pa mitattuna yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukey testi.

Ominaisuudet jäykkyys riippuvaisia ​​ja riippumattaman solulinjojen eri alustoille

Olemme arvioineet vähentynyt kasvu jäykkyys-riippuvaisten solujen pehmeillä geeleillä johtui puutteista tartuntaa alustaan, lohko solusyklin tai apoptoosin induktio. A549 ja MDA-MB-231-soluja maljattiin pehmeän plate96, annettiin kiinnittyä kuusi tuntia, ja määrä kiinnittyneitä soluja mitattuna. Molemmat solulinjat kiinnitetty tehokkaasti kollageenin geelit riippumatta kimmomoduuli (Fig. 4A), mikä osoittaa, että alempi solujen määrä geeleille Viiden päivän kuluttua ei ole, koska ei ole Solukiinnittymisen.

.) A549 ja MDA-MB-231-soluja maljattiin pehmeälle-plate96 ja yhteensä solujen lukumäärät per kuoppa laskettiin 6 tuntia sen jälkeen kiinnitys. Tiedot ilmaistaan ​​prosentin adheesio 150 Pa geelit. B.) A549 ja PC-3-soluja viljeltiin 150 Pa tai 4800 Pa geeliä alustoille 5 päivän seurasi solusyklin analyysi. Tulokset osoittavat keskimäärin vähintään kolmen kokeen ± SEM. * P 0,05.

puute tarttumisen signaloinnin kiinnittymisestä riippuvaisten solujen johtaa lohko G1 /S tarkastuspiste solusyklin [19]. A549-soluja viljeltiin 150 Pa geeli viisi päivää oli vaatimaton, mutta merkittävä kerääntyminen G1 vaiheen solusyklin kanssa vastaavan vähennyksen prosenttiosuus soluja S-vaiheessa (Fig. 4B), joka noudattaa lohko on G1 /S tarkastuspiste. Sen sijaan, MDA-MB-231-soluja ei esiintynyt merkittäviä muutoksia niiden solusykliä profiilin, joka on samanlainen jäykkyys riippumattomia solulinjoja PC-3 ja mPanc96 (Fig. 4B). Kuitenkin, molemmat jäykkyyden-solulinjojen (A549 ja MDA-MB-231) oli merkittävä apoptoosia viljeltynä pehmeillä geeleillä viiden päivän ajan, kun taas jäykkyys riippumaton PC-3 ja mPanc96 solulinjat eivät (Fig. 5A- B). Yksikään neljästä solulinjojen näytteillä merkittävä apoptoosin viljelty on jäykempi (4800 Pa) geelejä. Nämä tulokset osoittavat, että ”jäykkyys profiilin” soluja ei heijasta eroja tarttuvuus matriisin, mutta todennäköisemmin heijastaa jäykkyys riippuvat muutokset solusyklin etenemisen ja solujen apoptoosin.

.) Edustaja micrographs A549 ja MDA-MB-231-solujen päällystetty 5 päivää on 150 Pa tai 4800 Pa geeliä alustoille. Kaikki soluytimet värjätään DAPI (sininen) ja TUNEL-positiivisten solujen leimataan fluoreseiini (vihreä). Bar = 100 pm. B.) kvantitointi TUNEL värjäystä. Keskimäärin 2 kokeiluja ± SEM yhteensä ainakin 400 solua laskettiin kullekin kunnossa.

Kyky syöpäsolulinjois- muodostamaan pesäkkeitä pehmytkudoksen korreloi niiden pehmeä plate96 profiilit

arvioineet ero kyvyn kasvaa pehmeällä alustoille näytteille jäykkyys riippuvaa ja riippumattaman solulinjojen oli ennustava kyky näiden solujen kasvaa pehmytkudoksen ympäristö

in vivo

. Kaksi jäykkyys riippuvainen linjat (MDA-MB-231 ja A549) ja kaksi jäykkyys riippumattomia linjoja (PC-3 ja mPanc96) oli stabiilisti transdusoitu GFP-koodaavan lentivirus, ja injektoidaan häntälaskimoon nude-hiirten. Joko 2-24 tuntia tai 14 päivää injektion GFP-positiivisten solujen väestö keuhkohomogenaateissa määritettiin virtaussytometrialla ja histokemia. Kukin solulinjoista esillä merkittävä määrä soluja, keuhkojen injektion jälkeen (Fig. 6A, oikeanpuoleinen paneeli; tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin kahden viikon kuluttua keuhkot hiiriä, joihin injektoitiin kahden jäykkyyden-solulinjojen (MDA-MB-231 ja A549) sisälsivät vähemmän GFP-positiivisten solujen, verrattuna keuhkot hiiriä, joihin injektoitiin jäykkyys riippumattomia solulinjoja (PC- 3 ja mPanc96) (Fig. 6A, vasen paneeli). Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 vs. MDA-MB-231-soluissa mitattuna yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn testi. (Oikea) GFP-leimatun A549 ja mPanc96 solut ympättiin keuhkoihin ja prosenttiosuus GFP-positiiviset solut sijoitettiin väliajoin 24 tunnin aikana. B.) histologia hiiren keuhkon 14 päivän kuluttua injektion A549-solut (vasen paneeli) ja mPanc96 solut (oikea paneeli). Nuolet osoittavat micrometastases. C.) Vertailu kasvun solulinjojen muoville (otettu kuviosta. 3A) ja 1200 Pa alustoille (otettu kuviosta. 3B).

Lisääntynyt lisääntymistä ja solujen migraation jäykkyys riippuvaisten solut korreloi solujen leviämisen

seuraava arvioi leviämisen jäykkyys riippuvaisten solulinjojen korreloi solujen kyky levitä eri geelillä alustoille. Sekä MDA-MB-231 ja A549-solut osoittivat merkittävää nousua solun levittää 4800 Pa geelit verrattuna 150 Pa geelejä (Fig. 7A-B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun BxPC-3-soluja, haiman viiva, joka osoittaa vertailukelpoista kasvua profiili MDA-MB-231 ja A549-solut (Fig. 2), viljeltiin 150 Pa ja 4800 Pa geelit (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista on, että PC-3-soluja (jäykkyys riippumaton) pystyivät levittää 150 Pa geelejä samassa määrin kuin 4800 Pa geelit, kun taas mPanc96 solut (jäykkyys riippumaton) ei ole levinnyt merkittävästi joko pehmeitä tai jäykät pohjat (kuvio . 7A-B). Kyky levitä lisää jäykät pohjat korreloi myös kyky A549 ja MDA-MB-231-solujen siirtää. Sitä vastoin sekä PC-3 ja mPanc96 solujen ole osoittanut merkittäviä eroja muuttoliikettä kun pinnoitettu pehmeällä versus jäykempi alustoille (Kuva. 7C). Nämä tulokset osoittavat, että jäykkyys riippuvaisten solulinjojen kyky solujen levitä korreloi lisääntynyt proliferaatio ja migraatio. Jäykkyyden riippumaton solujen nämä käyttäytymiset näyttävät olevan irrotetaan.

.) Micrographs A549, MDA-MB-231, PC-3, ja mPanc96 solut, jotka maljattiin 150 tai 4800 Pa geeli substraattien 20 tuntia. B.) Alueet soluja, jotka oli päällystetty 20 tuntia 150 tai 4800 Pa geeliä alustoille. Tulokset osoittavat keskimäärin kertainen kasvu yli Jaksottama- solun ± SEM vähintään 20-solut laskettiin kullekin tilalle. C.) A549, MDA-MB-231, PC-3, ja mPanc96 solut maljattiin 2 tunnin ajan, sitten kuvattiin vielä 18 tunnin ajan. Mean solu nopeus ± SEM um /h määritettiin jäljittämällä ja mittaamalla polkujen 15 solua jäykkyys kohti solulinjaa. * P 0,05.

Focal tarttuvuus kinaasi (FAK) on kriittinen signaloinnin osa-integriinin signalointia ja on liitetty tunnistava jäykkyyttä ECM [20], [21]. FAK aktiivisuus, mitattuna sen autofosforylaatio on tyrosine397, oli vain hieman aktivoitu funktiona matriisin jäykkyyttä A549-soluja, ja ei muuttunut merkittävästi muissa testatuissa solulinjoissa (kuvio. S2). Nämä tiedot korostavat, että käyttäytymistä eri syöpäsolulinjoissa pehmeitä tai jäykät pohjat ei voi yksinkertaisesti johtua muutoksista yleisesti tarttuvuus signalointi FAK aktivaation.

mekaaniset ominaisuudet mikroympäristön säännellä epiteeli- ja mesenkymaalisten ominaisuudet A549-solut

konversio normaalien epiteelisolujen pahanlaatuiseen, metastaattisen kollegansa usein menetys ilmaisua E-kadheriinin ja hankinta useamman muuttavan fenotyyppi – prosessi kutsutaan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT). A549-soluja kasvatetaan pehmeä (150 Pa) geelit 5 päivää muodostettu klustereiden ilman näkyviä paikallisia tarttumista tai stressi kuituja (Fig. 8A). Sitä vastoin solut jäykempi (4800 Pa ja 19200 Pa) geelit levitettiin ja hajottamaan näytteille näkyvämpi stressiä kuituja ja paikallisia tarttumista (kuvio. 8A), kaikki tunnusmerkkejä mesenkymaalisten fenotyypin. Immunofluoresenssivärjäyksen tai Western blot -analyysi viljeltyjen solujen on 150 Pa geelejä tai 4800 tai 19200 Pa geelit osoittivat, merkittävästi ylössäätely E-kadheriinin ilmentymisen pehmeitä alustoille (Fig. 8B-C). Kuitenkaan mitään merkittävää muutosta ilmaus mesenkymaalisten markkeri vimentiinista soluissa havaittiin kasvavat eri alustoille (Kuva. 8C).

.) A549-soluja viljeltiin 3 päivää geelien jäykkyyksiä 150 , 4800 tai 19200 Pa. Solut kiinnitettiin ja värjättiin aktiini (vihreä) ja paksilliini (punainen). Nuolet osoittavat polttoväli kiinnikkeistä. B.) A549-soluja viljeltiin geelien jäykkyydet 150 tai 19200 Pa. Solut kiinnitettiin ja värjättiin aktiini (vihreä) ja E-kadheriinin (punainen). C.) A549-soluja viljeltiin PA, geelit, 3 päivää lyysattiin ja niitä blotattiin ilmentämiseksi E-kadheriinin, vimentiinin, ja aktiini. D.) suhteellinen taso Slug ja E-kadheriinin mRNA A549-soluja viljeltiin PA geelit 3 päivää mitattuna reaaliaikaisella RT-PCR. Tulokset osoittavat, keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

transkription repressori Slug on jäsen Snail perheen DNA: ta sitovien elementtien, joka säätelee E-kadheriinin ilmentymisen [22] ja sen on osoitettu olevan kriittinen antavan metastaattisen fenotyypin kokeellisessa mallissa melanooman [23]. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi A549-solut viljeltiin substraateilla eri jäykkyyksien paljasti säätelyä Slug mRNA kun soluja kasvatettiin jäykempi geelit (4800 ja 19200 Pa) verrattuna pehmeä geeli (150 Pa) (Fig. 8D). Slug mRNA korreloi käänteisesti E-kadheriinin mRNA-tasoja, jotka olivat alhaisempia A549-soluja viljellään jäykempi geelit verrattuna soluihin viljelty pehmeä geeli, sopusoinnussa havaitut muutokset E-kadheriinin proteiinin ilmentymisen (Fig. 8B-C) . Nämä tulokset osoittavat, että matriisi jäykkyys voi moduloida E-kadheriinin ja Slug ilmaisun A549-soluja. Mielenkiintoista on, että MDA-MB-231-soluja, samalla kun ne osoittavat jäykkyys-riippuvaisen proliferaation, ei ilmaista havaittavia määriä E-kadheriinin joko 150 Pa: n tai 19200 Pa (tietoja ei esitetä), mikä viittaa siihen, että nämä solut, kun taas morfologisesti samanlainen kuin A549-solujen pehmeä ja jäykät pohjat, eivät muuta ilmaisua tämän epiteelin merkki, kun se altistetaan pehmeä mikroympäristön.

keskustelu

tutkimukset edellä kuvattujen korostettaisiin mekaanisten ominaisuuksien ECM säätelyssä syöpä solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen. Lisäksi kuvaamme tehokkaan ja joustavan määrityksen järjestelmä määrittää, miten muutokset matriisiin jäykkyyden vaikutus solujen ominaisuudet. Analyysi 14 syöpäsolulinjojen paljasti, että muuttamalla jäykkyys kollageenipäällysteisiin matriisi näkyvästi muuttaa kasvua tiettyjen syöpäsolulinjojen ( ”jäykkyys riippuvainen” kasvu), kun taas sillä on vain vähän vaikutusta muihin syöpäsolulinjoissa ( ”jäykkyys riippumaton” kasvua ), jotka kasvoivat voimakkaasti jopa substraateilla hyvin alhainen jäykkyys. Alempi kasvu pehmeillä geelit jäykkyyden riippuvaisten solulinjojen johtuivat ainakin osittain valikoivan muutoksen solusyklin etenemisen ja apoptoosin induktio kun solulinjojen maljattiin pehmeälle matriiseja. Lisäksi jäykkyys riippuva linjat osoittivat vähentyneen merkittävästi solujen leviämisen ja muuttoliike maljattaessa pehmeillä vs. jäykät pohjat, ja ainakin yksi solulinjojen (A549) osoitti jäykkyys riippuva sääntely E-kadheriinin ilmentymisen ja palautuvia modulaatio epiteelin ja mesenkymaaliset fenotyypin. Lopuksi, kun ympättiin hiiren keuhkoissa, jäykkyys-solulinjojen eivät kasvaneet sekä jäykkyys riippumaton linjat, mikä osoittaa korrelaatiota kyvyn kasvaa pehmeällä matriisit

in vitro

ja proliferatiivista kapasiteettia

vuonna vivo

keuhkoissa.

pehmeän plate96 monisyvennyslevyjä määritys on suhteellisen suurikapasiteettisten lähestymistapa arvioida roolin alustan jäykkyyttä ominaisuuksiin syöpäsolujen kulttuurissa. Tässä järjestelmässä menetelmän Pelham ja Wang [24] on sovitettu tuottamaan kuopan levy, jossa substraatti koostuu polyakryyliamidigeelien vaihtelevia jäykkyys, jotka on funktionalisoitu antamaan sitovan pinnan soluväliaineen proteiinien, esim., Kollageeni. Tutkimuksissa edellä kuvatut levyt on suunniteltu käsittämään viisi tasoa kimmomoduuli, jotka vaihtelevat 150-9600 Pa, mutta muita muotoja syntyy helposti. Päätepisteen määritys meidän tutkimuksissa oli soluproliferaatiota, mutta muita vasteita, esim solujen selviytymistä ovat helposti konfiguroida. Kuten on kuvattu, määritys tarjoaa nopean ja toistettava menetelmä arvioida sitä, miten matriisin jäykkyys solujen kasvua ja selviytymistä.

Tätä määritystä käyttämällä olemme kartoitettiin paneelin syöpäsolulinjoissa, jonka tavoitteena on määrittää, kuinka muutokset mekaanisten ominaisuuksien matriisin vaikutuksen solujen lisääntymistä. Yhdeksän syöpäsolun linjat ilmensivät riippuvuus matriisi jäykkyys kasvun, kasvava huomattavasti parempi jäykkä /jäykkä matriisit kuin vähemmän jäykkä /pehmeä matriiseja. Jäykkyys riippumattomia solulinjoja ei osoittanut olennaisesti muutoksia kasvuvauhti alueella matriisin jäykkyys käytetty levyihin. Merkillistä, kaikki syöpäsolulinjasta tässä tutkimuksessa kykenivät lisääntymään pehmeillä alustoille, kun taas normaali fibroblastit, sileän lihaksen ja epiteelisolujen näytteille tiukka riippuvuus matriisi jäykkyys kasvua [25]. Tämä oletettavasti heijastaa ”onkogeenisen” muutos syöpäsolulinjojen suhteessa normaaleihin soluihin, tapahtumia, jotka heijastavat useita mutaatioita, jotka luonnehtivat syöpäsoluja. On epäselvää tällä hetkellä, onko jäykkyys profiilin syöpäsolulinjoja heijastaa yhden tai useamman spesifisiä mutaatioita, jotka on hankittu yksittäisen solulinjan.

On mielenkiintoista, että solulinjat, jotka osoittivat, jäykkyyttä-riippuvaista kasvua myös osoittivat jäykkyys riippuvaa levittäminen ja siirtäminen. Tuloksemme rinnakkain analyysin sarja glioomasolulinjojen kasvatettiin fibronektiinillä päällystetyn polymeerisen substraatit on määritelty mekaaninen jäykkyys [26]. On erittäin jäykät pohjat ( 100 kPa) gliooma soluja levinnyt laajalti, muodostuu näkyvä stressi kuituja ja kypsä paikallisia tarttumista, ja siirtyneet nopeasti. Kuitenkin, kun viljellään vähemmän jäykkiä matriiseja (arvot verrattavissa normaaliin aivokudokseen), gliooma solujen ilmestyi pyöristetty ja jättänyt tuottavasti siirtyä, samanlainen jäykkyys-solulinjojen kuvattu tutkimuksissa. Mielenkiintoista, gliooma soluliikkuvuus korkeasti yhteensopivia alustoille pelastettiin farmakologinen esto actinomyosin-pohjainen contractility, mikä viittaa siihen, että actinomyosin contractility voi olla kriittinen osa mechanosensory laitteen. Muut tutkimukset ovat sekaantuneet FAK, ERK, ja pieni GTPaasi Rho sääntelyssä kasvun vastauksena jäykkyys [16], tai kasvu sykliini D tasoja alavirtaan Rac aktivointi [25]. Rho GTPaasit ja niiden loppupään tavoitteet, jotka ovat kriittisiä välittäjiä solujen leviämisen, muuttoliike, ja contractility [27], voivat toimia mechanosensory koneita, jotka vastaavat jäykkyyttä microenvironment. Esimerkiksi Rho ja sen efektori Rho-kinaasi (ROCK) osallistuvat palautetta silmukka, joka säätelee tubulogenesis normaaleissa epiteelisoluissa, kun ne viljellään pehmeitä 3-ulotteinen kollageenimatriiseihin [28]. Kun soluja viljellään jäykempiä, high-density matriiseja, tämä silmukka indusoi fosforylaation FAK ja ERK, jolloin kasvu liittyvien geenien ilmentymistä proliferaation, oletettavasti FAK-riippuvaisia ​​Ras aktivointi [20]. Vaikka nämä kokeet selvästi syytöstä Rho väylän mechanotransduction normaaleissa epiteelisoluissa, lisäkokeita vaaditaan vaikutusten määrittämiseksi supistumiskyvyssä Rho GTPaasi aktiivisuutta syöpäsolujen kasvua pehmeillä alustoille, erityisesti syöpäsolun linjat, jotka tarjoavat sataman mutaatioita Ras kautta.

Kuten osoitettu tässä paperissa, solunulkoisen jäykkyys vaikuttaa kasvua tiettyjen syöpäsolujen linjat, ja kyky solulinjan kasvaa pehmeälle alustalle

in vitro

voi ennustaa sen kyky kasvaa pehmeä ympäristössä

in vivo

. Lisäksi solulinja vastaus solunulkoiseen jäykkyys

in vitro

voi ennustaa sen reaktiota desmoplastic vastaus

in vivo

, toisin sanoen, onko kasvu jäykkyyden microenvironment

in vivo

suosii kasvua kasvainsoluja. Solulinja pehmeä pelti kasvuprofiiliin voi ennustaa sen herkkyys terapeuttista huumeiden pehmytkudoksen. Esimerkiksi, DNA-silloitin mitomysiini C: n on osoitettu estävän proliferaation mesenkymaalisten kantasolujen tehokkaammin jäykkä verrattuna soft substraatteja [29]. Lisäksi haimasyövän solulinjoissa, jotka ilmentävät epiteelin markkereita, kuten E-kadheriinin ja alemmille tasoille mesenkymaalisten merkki vimentiinista vastaavat paremmin erlotinibille hoitoon [30], [31]. Näin ollen, jos solulinja (kuten A549) oli tullut enemmän epiteelin kaltaisia, kun viljellään pehmeä ympäristössä, se voidaan ennustaa olevan herkempiä erlotinibi. Edelleen opiskella sekä

in vitro

ja

in vivo

tarvitaan tutkia ennustuskapasiteettia pehmeä-levy määritys määritettäessä syöpäsolujen vasteita

in vivo

pehmytkudoksen ympäristöjä ja terapeuttinen teho tällaisissa ympäristöissä.

Cellular plastisuus, tai kykyä siirtyä edestakaisin välillä sessile epiteelisolujen ja vaeltava mesenkyymisoluyhteisviljelmissä, on hyvin tutkittu ilmiö, joka on kriittinen useisiin fysiologisiin prosesseihin, mukaan lukien alkion kehitys, haavan paranemista, ja syövän etenemistä. Yhteinen piirre on EMT on downregulation solu-soluadheesion, pääasiassa estämällä E-kadheriinin ilmentymisen, ja hankinta liikkuvien fenotyypin yhdessä lisääntyneen ilmentymisen tiettyjen infrastruktuurin osien kuten vimentiinista. Kuitenkin, tämä siirtyminen ei ehkä aina ole täydellisiä, koska on olemassa monia esimerkkejä soluja, jotka läpikäyvät ”osittainen” EMT, jossa solut tulevat liikkuvia ohimenevästi hankkimalla jonkin verran, mutta ei kaikkia mesenkyymisolun ominaisuudet [32]. Tämä viittaa siihen, että solut läpikäyvät EMT monimutkaisessa ja vaiheittain, eivätkä kaikki EMT tapahtumat ovat tarpeen, jotta saavutetaan muuttolintujen fenotyyppi.