Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen paksusuolen syöpä (HCT-8) solut näyttävät vakaa siirtyminen alhaisesta korkeaan metastaattisessa kun viljelty sopivasti pehmeää alustoille (21 kPa). Aluksi epiteelin (E) luonnossa, HCT-8 solut tulevat pyöristetty (R) seitsemän päivän viljelyn pehmeillä alustalle. R soluissa näkyy useita metastaattisen tunnusmerkkejä [1]. Täällä käytämme kaltevuus jäykkyys alustoille, bio-MEMS voima-anturi, ja Coulter counter määrityksiä tutkimaan mechanosensitivity ja tarttuvuus E ja R soluissa. Huomaamme, että HCT-8-solujen menettävät mechanosensitivity niille tehdään E-to-R siirtyminen. HCT-8 R solujen jäykkyys, levitä alue, proliferaatio ja migraatio tulla tunteeton alustaan ​​jäykkyys vastakohtana niiden epiteelin vastine. Ne ovat pehmeämpiä, proliferatiivinen ja muuttavien kaikille pinnoille. R-solut osoittavat vähäistä solu-solu-homotyyppistä adheesiota, samoin kuin ei-spesifisiin solun alustaan ​​tarttumista. Niinpä ne osoittavat samaa leviäminen alue kaikille pinnoille toisin E soluihin. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että R solut hankkia itsenäisyyttä ja ankkurointiriippumattomuudeksi, ja ovat siten mahdollisesti invasiivisia kuin E soluja. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen raportti määrällisten liittyvien tietojen muutoksia syöpäsolujen tarttumista ja jäykkyys aikana ilmaisuksi

in vitro

etäpesäkkeitä kaltainen fenotyyppi.

Citation: Tang X, Wen Q, Kuhlenschmidt TB, Kuhlenschmidt MS, Janmey PA, Saif TA (2012) vaimennus Cell Mechanosensitivity vuonna koolonkarsinoomasoluissa aikana

in vitro

etäpesäke. PLoS ONE 7 (11): e50443. doi: 10,1371 /journal.pone.0050443

Editor: Fan Yuan, Duke University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 elokuu 2012; Hyväksytty 22 lokakuuta 2012 Julkaistu: 30 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Tang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukee taloudellisesti National Science Foundation (NSF) myöntää nro ECCS 07-25831, 10-02165 ja NIH RO1 083272-03. XT rahoittivat NSF Grant 0965918 IGERT: koulutus seuraavan sukupolven Tutkijat Cellular and Molecular mekaniikka ja BioNanotechnology. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useimmat syöpäkuolemista aiheutuu etäpesäkkeiden eikä ensisijainen vanhempi kasvain [2], [3], [4], [5], [6]. Etäpesäkkeen muodostumisen aikana, pahanlaatuisten syöpäsolujen paeta kasvaimen irrottamalla toisistaan ​​tai muista soluista ja soluväliaineen (ECM) [2], [3], [6], [7]. Pakeni solut aktiivisesti ilmaista proteinaaseja ja muuttaa niiden tarttumisen ligandien hajota ja muuttaa niitä ympäröivän ECM [3], [4], [5], [8], [9]. Samalla ne ajan säännellä liikkuvuutta ja kestävyys apoptoosin onnistuneen verisuonten leviämisen ja invaasion kaukaisten terveiden elinten [6], [7], [10]. Samanaikaisesti nämä solut alentaa jäykkyys [11], [12], [13], [14], eli lisätä niiden noudattamista virrata pieni hiussuonien [4], [15], [16]. Kvantitatiivinen tutkimus mekaanisten ominaisuuksien syöpäsolujen aikaisten vaiheiden aikana etäpesäkkeiden; kuitenkin puuttuu [17], [18], [19], [20], pitkälti siksi haasteista havaitsemisessa puhkeamista etäpesäkkeiden

in vivo

ja heterogeenisyys ja biokemiallisten solujen ominaisuuksia yksittäisten kasvain solut [3], [17], [21], [22].

Havaitsimme äskettäin [1], että ihmisen koolonkarsinoomasoluja (HCT-8) voidaan johdonmukaisesti näyttää

in vitro

etäpesäke kaltainen fenotyyppi (MLP) viljeltynä pehmeälle hydrogeeliin alustoille asianmukaisella mekaanisella jäykkyys (polyakryyliamidigeelien Youngin: 21~47 kPa [1], [23]). HCT-8-solut ovat epiteelin (E) luonnossa. Kun viljelty pehmeillä alustoille, ne ensin muodostaisivat erillisiä epiteelin klustereita tai saarilla. 7 päivän jälkeen, solut irtoavat saaria, ja olettaa pyöristetty muoto (R solut). Nämä R-solut ovat erittäin proliferatiivisen, vaeltavia ja ne merkittävästi alas-säädellä E-kadheriiniekspressiota – tyypillinen tunnusmerkkejä etäpesäkkeiden [1], [24]. Lisäksi E R siirtyminen on toistettavissa ja peruuttamaton [1], [24]. Kovilla alustoille (3 GPa polystyreeniä substraatteja), tämä E R siirtymistä ei tapahdu.

Tässä tutkimuksessa ensin esittää yksityiskohtaista tutkimusta mechanosensitivity sekä ennen ja jälkeen etäpesäke kaltainen HCT-8 -soluihin käyttäen gradienttia jäykkyys alustaan. Tutkimus paljastaa menetys mechanosensitivity HCT-8 R solujen sijaan sekä E-solujen ja normaalien fibroblastien. Jäykkyys R solujen mitattuna AFM, tulee riippumattomaksi alustan jäykkyyttä. Sitä vastoin jäykkyys E solujen korreloi alustan jäykkyyttä. Coulter counter ja BioMEMS määritykset osoittavat, että T-solut ovat alhaiset homotyyppisessä solu- soluadheesiota ja mitätön epäspesifisiä tarttuvuus verrattuna E soluihin.

Tulokset

1. Heikko tartunta välillä HCT-8 R soluissa ja alustan

Tutkitaan kuinka HCT-8 R solut reagoivat eri fysiologisesti relevantti alustoille vaihtelevan jäykkyys, HCT-8 R solut kerättiin pehmeästä PA geelit, laajennettu kuvatulla materiaalit ja menetelmät ja sen jälkeen viljeltiin tuore jäykkyyteen-kaltevuus PA geeli alustoille, joilla jäykkyys vaihtelee jatkuvasti 1-20 kPa (Fig. 1a, vasemmalta oikealle). Jäykkyys-gradientti päällystetään yhtenäinen fibronektiinin pitoisuus, jotta solun sitoutumista substraattiin [25], [26], [27]. Vertailun vuoksi sekä HCT-8 E-solut ja normaali apinan munuaisen fibroblastien (MKF solut), ilman edeltävää altistumista PA geelit, maljattiin samalla jäykkyys kaltevuus substraatteja ja pinnan funktionalisointi (Fig. 1b ja 1c). Normaali MKF solut valittiin hallintaan, koska niiden tiedetään olevan mekanosensitiivisten substraatin jäykkyys [28]. Löysimme, toisin kuin HCT-8 E soluja ja normaaleja MKF solut, HCT-8 R solujen konstitutiivisesti osoitti hyvin rajallinen alustakosketinliitännästä alueita riippumatta alustan jäykkyyttä. R solut ”kontaktipinta alustaan ​​on noin 40-60% niiden näennäinen ennustetaan alue. Mitattuna 3D konfokaali- mikroskooppinen kuvantaminen, R solun kosketuspinta-ala substraatin on vain 49,5 ± 20,9 pm

2 (n = 34), joka on 3,8 ± 0,3 kertainen pienempi kuin E-soluja (n = 47), mikä viittaa siihen, että R- solut ovat heikommat tarttuvuus alustaan ​​kuin E soluja. Heikko adheesio R solujen alusta on myös yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että R solut osoittavat pienemmän ennustettu alue, kuin E solut samalle jäykkyys alustan (Fig. 1 d). Ennustettu alue eristettyjä soluja ilman naapurisolun kosketus, ja on 1,9 0,6 kertainen pienempi R soluja (n = 68) kuin E soluja (n = 61).

(a-c) Faasikontrasti- kuvia korjatut HCT-8 R soluissa, HCT-8 E soluja, ja normaali MKF solujen kaltevuus-jäykkyys PA geeli alustoille. Vastaavat 3 neliön paneelien (suljettu keltainen viiva ruutuun) osoittavat edustaja suurennettua näkemyksiä 1-5 kPa, 8-12 kPa, ja 15-20 kPa jäykkyys verkkotunnuksia. Valkoiset nuolet suurennetussa osoittavat yhden, ei-yhteyttä soluissa, kun taas keltaiset nuolet osoittavat yhteyttä solujen pesäkkeitä. Mittaviivat suurennettu näkymä paneelit ovat 100 pm. (D) yhden solut arvioitujen ala on 3 solutyyppejä koko jäykkyys alue näytetään. Täällä he ei ole mitään yhteyttä heidän naapurisolujen eri jäykkyys alustoille. (E) leviäminen alue yksittäisten solujen kanssa kosketuksissa naapurisolujen eri jäykkyys alustoille. (F) Näennäinen solujen pesäke ala on 3 solutyyppejä eri jäykkyys alustoille. (G) kenno muotokerroin 3 solutyyppejä, jotka eivät ole kosketuksissa niiden naapurisolujen eri jäykkyys alustoille. (H) solun muotokerroin yksittäisiä soluja, jotka ovat kosketuksissa viereisten solujen eri jäykkyys alustoille.

HCT-8 R-soluja osoittavat myös huomattavan epäherkkyys muuttuviin mekaanisen jäykkyyden niiden viljelyalustasta. Ne säilyttävät pyöristetty fenotyyppi ja rajoitettu tartunta-alue alustoihin riippumatta substraattien ”jäykkyys (Fig. 1a, ilmaistaan ​​valkoisilla nuolilla, Fig. 1 d, 1 e ja 1 g). Kun alustan jäykkyyttä vaihteli yli 20-kertainen alue, leviäminen alue yhden R-solujen määrä nousi vain noin 27%, (mistä 156,2 ± 42,1 um

2 on 1 kPa alue (n = 62) 197,9 ± 83,6 pm

2 (n = 56) on 20 kPa alue) (Fig. 1 d). Across jäykkyys testataan, kasvu R solujen leviäminen alue ei ole yhtä dramaattista kuin E ja MKF soluja. 5 kPa, 10 kPa ja 15 kPa alueita, niiden leviäminen alueet ovat 158,2 ± 40,3 um

2 (n = 56), 182,3 ± 32,2 um

2 (n = 63), ja 190,9 ± 82,5 um

2 (n = 57), vastaavasti (Fig. 1 d). Myös R solu muotokerroin muuttaa vain 7% 0,9 ± 0,2 on 1 kPa alueella 0,8 ± 0,2 on 20 kPa alue (Fig. 1 g; muotokerroin, S = 4 * πA /P

2, jossa A on solun alueella ja P on kehä. S = 1 täydellisen pyöreä muoto ja 0 epäsäännöllinen muoto), joka osoittaa konstitutiivista pyöristetty riippumaton alustan jäykkyyttä. 5 kPa, 10 kPa ja 15 kPa alueiden muoto tekijät yksittäisen R solut ovat 0,8 ± 0,1, 0,8 ± 0,2, ja 0,9 ± 0,2, tässä järjestyksessä (Kuva. 1 g). Pitkien kulttuuri (60 päivää), R-solut eivät osoittaneet mitään kääntyminen kohti epiteelin morfologian kaikille materiaaleille, riippumatta jäykkyys, jopa hyvin jäykkä polystyreeni (3 GPa) [1]. Lisäksi päivittäinen tallennus kautta video mikroskoopilla osoittaa, että R solut eivät näytä merkkiäkään heikentyvän lisääntymisaktiivisuus jopa useiden kuukausien viljelmässä. Sitä vastoin sekä HCT-8 E-solut ja MKF soluja viljeltiin samantyyppisiä jäykkyys kaltevuus substraattien osoittavat selvää herkkyyttä mekaanista jäykkyyttä niiden viljelyalustasta. Yksittäiset eristetyt E solut leviävät alue kasvaa 2,5-kertaiseksi yli 20-kertainen substraatin jäykkyyden muutos, mistä 239,6 ± 191,9 um

2 on 1 kPa alueen 578,1 ± 429,8 um

2 on 20 kPa alue (Fig. 1b , merkitty valkoisilla nuolilla). Substraatteina tulla jäykkä, HCT-8 E soluissa näyttää suuremman leviämisen alue, jossa on niiden leviäminen alueille 270,8 201,7 um

2 (n = 51), 276,0 ± 104,8 um

2 (n = 62), ja 442,7 ± 367,7 um

2 (n = 55) 5 kPa, 10 kPa ja 15 kPa alueilla, tässä järjestyksessä (Kuva. 1 b). Heidän muotokerroin laski 0,9 ± 0,2 on 1 kPa alueella 0,6 ± 0,2 on 20 kPa alue (Fig. 1 g). Across muut jäykkyys testataan, yhden E solut muoto tekijät ovat 0,8 ± 0,2 (5 kPa alue), 0,8 ± 0,1 (10 kPa alue), ja 0,7 ± 0,3 (15 kPa alue), tässä järjestyksessä. Mechanosensitivity on MKF on vieläkin suurempi verrattuna HCT-8 syöpäsolujen (Fig. 1 c). Leviäminen alue yksittäisten eristetyt MKF soluja (Fig. 1 c; merkitty valkoisilla nuolilla) kasvaa 5 kertaa poikki kaltevuus alustan, mistä 286,4 ± 86,2 um

2 (n = 46) on 1 kPa alueen 1421,7 ± 845,7 um

2 (n = 31) 20 kPa alue (Fig. 1 d). Koska alustan jäykkyyttä kasvaa, niiden leviäminen alue kasvaa dramaattisesti, ja ovat 578,1 ± 373,1 um

2 (n = 62), 749,9 ± 355,5 um

2 (n = 63), ja 1218,6 ± 773,5 um

2 (n = 59) 5 kPa, 10 kPa ja 15 kPa alueilla, vastaavasti. Samanaikaisesti yhä alustan jäykkyyttä, yksi MKF solut leviävät entistä epäsäännöllinen morfologia, niiden muotokerroin pienentyi 0,9 ± 0,1 on 1 kPa 0,5 ± 0,2 on 20 kPa alueilla, tässä järjestyksessä (Kuva. 1 g). On väli jäykkyys alueet, eli 5 kPa, 10 kPa ja 15 kPa alueiden muoto tekijät yksittäisen MKF solut ovat 0,7 ± 0,3, 0,6 ± 0,3 ja 0,5 ± 0,3, tässä järjestyksessä. Heikko tartunta välillä HCT-8 R soluissa ja alustan sekä riippumattomuuden R solumorfologian alustasta jäykkyys, viittaavat vahvasti siihen, että R solut menettävät kiinnittymisestä riippuvuus ja viestintää niiden mekaaniset mikroympäristön. Tämä ankkurointi itsenäisyyttä voidaan mahdollisesti edistää T-solujen selviytymistä suspensiossa, joka on olennainen tunnusmerkki

in vivo

etäpesäke syöpäsolujen [2], [3], [4], [16], [22] .

2. HCT-8 R soluissa näkyy heikko solu-soluadheesion

jäykkyys-kaltevuus alustoille, sekä HCT-8 E solut ja MKF soluilla solujen pesäkkeiden muodostumista, erityisesti jäykempi alueille (osoitettu keltaiset nuolet kuvassa. 1b ja 1c). Siirtomaa koko korreloi positiivisesti alustan jäykkyyttä. Alustasta jäykkyys 1 kPa, 5 kPa, 10 kPa, 15 kPa ja 20 kPa geeliytyy solun siirtomaa koot HCT-8 E solut ovat 2962,2 ± 1000,5 um

2, 3662,1 ± 1105,3 um

2, 4249,5 ± 919,5 um

2, 9736,5 ± 4032,7 um

2 ja 11748,7 ± 2144,9 um

2, tässä järjestyksessä (Kuva. 1f). Sillä HCT-8 R solujen samalla jäykkyys substraattien, yhdyskunnan koot ovat huomattavasti pienempiä kuin E kollegansa vaikka R-solut ovat kosketuksissa viereisten solujen ja 3 päivää (Fig. 1a). Alustasta jäykkyydet 1 kPa, 5 kPa, 10 kPa, 15 kPa ja 20 kPa, R solun pesäkkeitä koot ovat, 1087,4 ± 338,3 um

2, 1449,8 ± 343,4 um

2, 3062,2 ± 1326,9 um

2, 3849,6 ± 919,1 um

2 ja 3912,1 ± 1183,8 um

2, tässä järjestyksessä (Kuva. 1f). Havaitsimme myös, että sisällä R solun pesäkkeitä, solu-solu kontaktipinta ei ole yhtä laaja kuin E solupesäkkeiden. R-solut näyttävät olevan vain koskettavat toisiaan pisteessä-yhteyksiä (Fig. 1a). Nämä tulokset viittaavat siihen, R solu-soluadheesion ei riitä heitä muodostamaan yhtenäinen pesäkkeitä tai solun saarilla samoin E ja MKF soluja.

Lisäksi on mielenkiintoista huomata, että kun HCT-8 E soluja tai MKF soluja läpikäyvät homotyyppisessä solu-soluadheesion, niiden yksittäisen solun alueita ja solun muotokerroin tullut huomattavasti vähemmän alustan jäykkyyttä riippuvia (Fig. 1b ja 1 c, merkitty keltaiset nuolet). Yksittäisen solun alueita ja muoto tekijät yhden HCT-8 E solujen sisälle soluun saaria 1 kPa geelit ovat 785,6 ± 299,4 um

2 ja 0,7 ± 0,1, tässä järjestyksessä, joka on samanlainen kuin 20 kPa geelit, 892,8 ± 322,1 um

2 ja 0,6 ± 0,1 (Fig. 1 e ja 1 h). Samat ominaisuudet havaittiin väli- jäykkyys, solun alueella ja muotokerroin yksittäisten HCT-8 E sisällä saaret ovat 526,7 ± 187,0 um

2 ja 0,8 ± 0,1 5 kPa geelit, 633,9 ± 421,4 um

2 ja 0,6 ± 0,2 10 kPa geelit, ja 723,1 ± 515,2 um

2 ja 0,6 ± 0,2 15 kPa geelejä. Yksittäisten MKF solujen sisällä saaria, niiden solujen alue ja muotokerroin on 928,5 ± 374,0 um

2 ja 0,5 ± 0,3 1 kPa geelit, 892,8 ± 415,7 um

2 ja 0,5 ± 0,3 5 kPa geelit, 1098,1 ± 564,6 um

2 ja 0,5 ± 0,2 10 kPa geelit, 1008,8 ± 223,7 um

2 ja 0,3 ± 0,2 15 kPa: geelit, ja 1160,6 ± 429,7 um

2 ja 0,4 ± 0,1 20 kPa geelit ( Fig. 1 e ja 1 h). Kun nämä solut perustaa solu-solu kontakteja, E ja MKF soluilla solujen levittää hyvin pehmeä 1 kPa geelit, mikä viittaa solu-solu signaaleja hukuttaa solu-alustan signaalien (vasemmalla alue kuvassa. 1b ja 1 c, merkitty keltaisella nuolet). Valtaosa HCT-8 R soluissa; kuitenkin edelleen pyöristetty, jossa sama näennäinen solun alueella ja muotokerroin kuin eristetty R soluja, vaikka kosketuksissa naapurisolujen (Fig. 1a, merkitty keltaiset nuolet). Tämä R solujen fenotyyppi johtaa yleensä pienempiä R solun pesäkkeitä ala verrattuna E soluun saaria koostuu vastaavien solujen määrä (Fig. 1f). Yksittäiset solu- alueet ja muoto tekijät yhden R solujen sisälle R solun pesäkkeet 1 kPa geelit ovat 151,8 ± 33,4 um

2 ja 1,0 ± 0,1, tässä järjestyksessä, ja on samanlainen kuin 20 kPa geelit (169,6 ± 30,5 nm

2 ja 0,9 ± 0,2), tässä järjestyksessä, samoin kuin yhden R soluilla ilman solu-kontaktien (Fig. 1 e ja 1 h). 5 kPa, 10 kPa ja 15 kPa geelit, solun alueella ja muotokerroin yksittäisten HCT-8 R solujen sisällä saaret ovat 156,2 ± 52,3 um

2 ja 0,8 ± 0,1, 142,8 ± 47,2 um

2 ja 0,9 ± 0,0 ja 160,7 ± 33,4 um

2 ja 0,8 ± 0,2, tässä järjestyksessä. Tämä ainutlaatuinen fenotyyppi ei poistu R soluja viljellään hyvin jäykkä polystyreeni alustoille (3 GPa) pitkitettyä kulttuuri kertaa (kk); taaskin kertoo heikko solu-soluadheesion joukossa R soluissa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että aikana tai sen jälkeen E-to-R siirtyminen, R solut hankkia solu autonomia, joka on ominaista merkittävästi alentunut solu-solu- ja solu-alustan liiman yhteyksiä.

3. R solut ovat vähentäneet homotyyppisessä solu-solu liima aktiivisuuden

lisäksi arvioimalla solu-soluadheesion laadullisesti perustuu heidän yhteystietonsa morfologit, olemme edelleen käyttäneet coulter määritys kvantitatiivisesti tutkia toiminnallinen menetys HCT-8 solu-solu tarttuvuus seuraava E-to-R siirtyminen. Vantaan laskuri mittaa nopeuden ja asteen soluadheesiota kvantitatiivista lukumäärän väheneminen yksittäisten solujen suspensiona soluaggregaatteja muodostua ajan funktiona [1], [29], [30]. Kinetiikka erityinen homotyyppisessä solu-soluadheesion varten syöpä- epiteelin HCT-8 E ja R solut mitattiin ja verrattiin. Normaali (ei syöpä) MA104 epiteelin soluja käytettiin kontrollina. Huomasimme, että erottaa toisistaan ​​HCT-8 R solut (korjattu 21 kPa PA substraatteja) osoitti selvästi alhaisempi ja laajuus solu-soluadheesion verrattuna alkuperäiseen HCT-8 E soluja viljeltiin kovilla polystyreeniä alustoille (Kuva. 2). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kun 120 minuutin inkuboinnin, 84,8 ± 4,0%: n HCT-8 R solujen pysyi yksittäisinä soluina, toisin kuin 37,6 ± 6,1% alkuperäisestä HCT-8 E-solut ja 5,2 ± 0,7%: iin normaalista MA104-soluja [1]. Tämä merkittävä tulos viittaa vahvasti siihen, että solu-solu liima aktiivisuus HCT-8 R soluissa on lähes täysin kadonnut, kun ne poistaa osoitteen E solusta saarista. Tämä tulos on yhdenmukainen meidän toteamisen alentunut E-kadheriiniekspressiota T-soluissa [1], [24]. Vähentäminen solun pinnan tarttuvuuden havaittiin myös silloin, kun ei-spesifinen adheesio väliset voimat HCT-8 pinnat ja SiO

2-päällystetty BioMEMS koettimet mitattiin.

(a) Vertailu solu-solu-adheesion hinnat alkuperäisestä HCT-8 E soluja (koskaan altistu 21 kPa PA geelit), erottaa toisistaan ​​HCT-8 R kerättyjä soluja 21 kPa PA geelit, ja normaali ei-syöpä epiteelisolujen MA104 soluja. HCT8 R soluilla on alhaisin solu-soluadheesion. Kukin tietopiste on 3 kaksoiskappaleet, ja kukin kahtena koostuu 5 x 10

5 solua vastaavien solutyyppejä.

4. Cell jäykkyys muutokset heijastavat mechanosensitivity

Lisäksi alustaan ​​jäykkyys riippuvaista solujen morfologia muuttuu, HCT-8 E solut osoittivat myös vaihtelevaa solujen jäykkyys riippuu viljelyalustasta jäykkyyttä. Käyttämällä atomivoimamikroskooppi (AFM), solu jäykkyyttä HCT-8 E soluja kasvatettiin jäykkyyteen-kaltevuus alustoille määritetään sisennys pii-nitridi ulokkeet jousella vakio 148,14 PN /nm (johdonmukainen cell painuman nopeus 0,1 pm /s). Hertz teorian (katso materiaalit ja menetelmät) käytettiin poimia kimmomoduuli sisennetty soluja. Vertailun helpottamiseksi eri solujen samaan alustaan ​​jäykkyys, me nimetty 5 yhtäläiset-tila alueilla koko jäykkyys alue, jossa alue 1 toistavan jäykkyys 1-4 kPa, alueet 5 ja jäykkyys 5-8 kPa, 9-12 kPa , 13-16 kPa, 17-20 kPa vastaavasti (Fig. 3a). Käyttämällä AFM, löysimme HCT-8 E solut lisäävät solun jäykkyys alustat tulevat jäykempi. Vuodesta alue 1 alue 5, HCT-8 E solujen jäykkyys vähitellen kasvoi 1,4 ± 0,9 kPa 1,9 ± 0,8 kPa, 2,1 ± 1,4 kPa, 2,2 ± 1,3 kPa ja 3,8 ± 2,0 kPa, vastaavasti (n = 6 -10 kunkin alueen, Fig. 3b). Erityisesti on syytä huomata, että gradientti solun jäykkyyden lisäys (Fig. 3a) näyttää vastaamaan kaltevuuden geelin alustan jäykkyyttä lisäys. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiemmin raportoitujen [25], ja ehdottaa, että HCT-8 E solut ovat erittäin herkkiä herkkää vaihtelu niiden microenvironmental mekaanisia signaaleja. Jäykkyys HCT-8 R soluissa; kuitenkin kaikissa eri jäykkyys alustoille, näyttää muuttumaton 0,5 ± 0,4 kPa, mikä osoittaa, että R-solut ovat hyvin vähän tai ei lainkaan vuorovaikutusta niiden mekaaniset mikroympäristön. AFM Tutkimus osoitti myös, että R-solut ovat mekaanisesti pehmeämpiä kuin E soluja, jotka voivat mahdollisesti parantaa muokattavuus mahdollistaa tehokkaamman hyökkäystä kohdekudoksissa seuraavista

in vivo

etäpesäkkeitä.

Käyttämällä Atomic Force Microscopy jäykkyys HCT-8 E-soluja viljeltiin gradientti substraatin määritetään. HCT-8 E solut lisäävät solun jäykkyys alustat tulevat jäykempi. Vertailun helpottamiseksi eri solujen samaan alustaan ​​jäykkyys, viidessä yhtä jakautunutta alueiden koko jäykkyys alue on nimetty: alue 1 kattaa 1-4 kPa, region 2 kattaa 5-8 kPa, alue 3 kattaa 9-12 kPa, alue 4 kattaa 13-16 kPa, ja alue 5 kattaa 17-20 kPa. (A) Valitse alue 1 alueeseen 5, E solun jäykkyys kasvaa progressiivisesti arvoilla 1,42 ± 0,85 kPa 1,90 ± 0,77 kPa, 2,06 ± 1,39 kPa, 2,15 ± 1,28 kPa, ja 3,82 ± 1,98 kPa, vastaavasti. Sen sijaan geelillä alustoille, joilla sama jäykkyys kaltevuus, post-metastasoitunut R solut näyttävät lähes muuttumaton solu jäykkyys. (B) vaihe-kontrastin kuvia HCT-8 E solujen kaltevuus PA alustoille.

5. E solu saarilla korkea epäspesifinen tarttuvuus verrattuna R soluihin

Pinta epäspesifistä kiinnikkeistä HCT-8 E soluja (4

päivänä kulttuurin PA geeli) ja R soluissa mitattiin käyttämällä mikro-valmistettu bio-MEMS voima-anturi (Fig. 4 ja Materiaalit ja menetelmät) [1], [30], [31]. Anturi koostuu microcantilever palkin kalibroitu voima-siirtymä suhteessa (katso materiaalit ja menetelmät). On taulu koetin (leveys 15 um ja syvyys 5 um) on kiinnitetty palkin, joka muodostaa liima-solujen kanssa kosketuksiin (Fig. 4a). Anturi on valmistettu yksikiteisen piin, ja on päällystetty ohuella kerroksella natiivin piioksidia (SiO

2). Koetin ja anturi eivät funktionalisoitu. Anturi on manipuloida x-y-z-pietso vaiheessa. Tasainen anturi tuodaan kosketuksiin E-cell saarten sivusuunnassa kupera pinta rajalla. Jokainen E-solu saari koostuu 100 s solujen useita soluja pinoaminen saaren reuna (Fig. 4b). Sen jälkeen 2 minuutin kontakti, voima-anturi vedetään pois vaakasuunnassa solusta saaren tasaisella nopeudella 2,1 ± 0,4 mikrometriä /s (Fig. 4c). Kontaktiaika valittiin 2 minuuttia, koska pitkäaikaista kosketusta kesto saattaa johtaa solujen kerrostuminen ECM anturin ja mutkistaa analyysiä. Johtuen solun koetin tarttuvuus, anturi säde deformoituu takaisinvedon aikana, eli solut soveltaa palautusvoima vasten irtoaminen. Lyhyt kosketus kesto välillä solun ja koetin estää aktivoinnin solujen integriinien ja muodostumista tahansa polttovälin tarttuvuus koetin (kestää 30 minuuttia, jolloin [32], [33]). Siksi vain epäspesifiset adheesiovuorovaikutuksia voidaan muodostaa solun pinnan ja SiO

2-pinnoitettu anturi.

(a) ei-funktionalisoitu mikro rakennusosien Si voima-anturi, jossa on tasainen anturi ja joilla tiedetään voima-taipuma suhteessa manipuloidaan korkean resoluution xyz Piezo-vaiheessa yhteyttä soluun saarten sivusuunnassa kupera pinta (on xy). (B) Konfokaalimikroskopia solun saarilla korkeus saarilla on suuruusluokkaa 30~50 um. Pystysuuntaisen korkeuden BioMEMS anturi on 5~10 um. (C) jälkeen 2 minuutin kontakti, voima-anturi on vaakatasossa vedetään pois tasaisella nopeudella 2,1 ± 0,4 mikrometriä /s. Vaikka soluadheesiota että antennin ja solun pinnan estää takaisinveto, tunnistin palkkien muotoaan mukaan δ, jossa voima F. Huomaa, että koetin ei funktionalisoitu. 2 minuutin kontakti anturin ja solujen estää aktivoinnin solujen integriinien ja muodostumista tahansa solu fokaalisen adheesion, joka vie 30 minuuttia muodostamiseksi.

Havaitsimme, että aikana takaisinvedon bio-MEMS-anturi, E-cell saaria venyttää paikallisesti 15-20 um johtaen kartion muotoinen (katso molemmat Kaavio kuvassa. 4c ja vaihe-kontrastin kuvia kuvassa. 5). Huomaa tämä venytys eroaa johtuvat pelkästään kalvo lieka, joka koostuu venyttämällä vain fosfolipidin kaksoiskerroksen. Aikana koetin takaisinveto, kartio jatkuvasti venytetty yhä kosketuskulma θ, kun taas solu kosketuksiin anturia tipahtaa vaiheittain tavalla (Kuva. 5b-5d). Kasvu välillä voimassa solun ja koetin heijastuu asteittainen kasvu kuilu kiinteän viite ja koetin (D

0 D

1 ja D

2). Cell voima lasketaan muutoksen kuilu ja voima-muodonmuutos kalibrointia keväällä. Kriittisessä arvo voima, F

c, kartion yhtäkkiä irtoaa koetin (Fig. 5d-e). E-solut, F

c on suurin voima on voima-siirtymä käyriä. Pidämme F

c mittana solun koetin tarttumista. Mittasimme Fc 12 tällaista soluklusterien ja saanut F

c = 256,3 ± 33,7 nN (n = 12). Samanlaiset R solut näyttävät häviävän pieni solu-anturi tarttuvuus F

c = 1,14 ± 0,13 nN (n = 25; Fig. 6). Täten R soluilla on vähäinen ei-spesifinen adheesio verrattuna E soluihin ja siten näyttävät olla ”voideltu” valtio kenties jonka avulla ne voidaan sovittaa läpi verisuonten hius- aikana

in vivo

etäpesäkkeitä.

(a) adheesiovuoro- irrotusvoimamit- solun saaren MEMS anturi. Voima kasvaa monotonisesti venyttää kunnes irtoaminen. (B-e) Faasikontrasti- kuvia yhden tyypillisen tarttumisen koe. Voima lasketaan muodonmuutos anturin säteen

D

ja voima-muodonmuutos kalibrointikäyrä. Kriittinen irrotusvoimamit-, F

c, on suurin voima on voima-siirtymä käyriä. Venytyksen aikana, kosketuskulma θ välillä anturin ja solun saari kasvaa, mutta kontakti vyöhyke kooltaan anturin ja solun saaren pitää vähentää. Asteikko bar = 40 um.

(a) Liima voima R solujen MEMS koettimeen kuin koetin siirretään pois soluista 2 minuutin kuluttua kontakti (n = 25). (olla). Phase-kontrasti kuvia R solujen ja MEMS koetin kun ei-spesifinen adheesio niiden välillä mitataan. Suurin irrotusvoimamit- mitattu on 2,5 nN, kun solu muodonmuutos on tuskin havaittava. Mitta-asteikko: 40 um.

Keskustelu

Tietääksemme Tässä tutkimuksessa on ensimmäinen kuvata ja arvioida muutos mechanosensitivity ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa aikana etäpesäke kaltainen siirtymisen tuottama ainoastaan ​​muuttamalla mekaanisesti microenvironment aikana

in vitro

kulttuuriin. Aiemmassa artikkelissa raportoitu HCT-8 solua suorittamaan E-to-R transitio 21~40 kPa jäykkyys alustoille [1]. Tämä tutkimus tehokkaasti työllistää kombinatorinen määritysjärjestelmä lähestymistapaa käyttäen jäykkyys-kaltevuus alustoille, Coulter counter määritys, atomivoima microcopy (AFM) ja Bio-MEMS voima-anturit tutkia määrällistä mechanosensitivity muutos ihmisen paksusuolen HCT-8 epiteelisolujen E soluja kuin ne kauttakulkunsa pyöristetyn muodon R soluissa. Löysimme, laukaisee sopivan alustan jäykkyyttä vihjeitä, että HCT-8 R solut menettävät herkkyys sekä alustan microenvironment sekä niiden vuorovaikutus naapurimaiden R ja E soluja. Tämän seurauksena HCT-8 R soluissa hankkia autonomia selviytymistietoa kiinnittymisestä riippumaton, mobiili soluja, mikä on olennainen piirre varhaisen tapahtumien syöpäsolumetastaasi [3], [4], [5], [6], [16], [20], [30], [34], [35].

fysikaaliset ominaisuudet kulttuurin substraattien havaitaan laajalti vaikuttaa fenotyyppien ja geeniekspression useiden normaalien ja syöpäsolujen [1], [17], [18], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44 ], [45], [46], [47], [48], [49], [50], [51], [52], [53], [54], [55]. Vastatakseen alustaan ​​ärsykkeisiin, solut kiinnittyvät ja levittää alustalle seuraa tunnistus ja käsittely sekä mekaanisia ja kemiallisia signaaleja [26], [37], [44], [46], [49], [53], [55 ], [56], [57], [58], [59], [60], [61]. Kuten olemme aikaisemmin osoittaneet [1], kun 7-päivän kulttuuri pehmeillä alustoille, HCT-8 solua käytävä E R siirtymisen ominaista R solut dissosioimalla vanhemman epiteelisolukerroksen tai solun saaria. Nämä liukenevat R solut osoittavat merkittävästi vähentynyt tarttuvuus (sekä erityiset ja epäspesifisiä [1], [24], [29]) verrattuna niiden E soluun kollegansa. Toisin E soluja, hajotettu HCT-8 R soluissa näkyy alustan-jäykkyys riippumaton solu-alustan vuorovaikutuksia. Niiden leviäminen ei heikennä heikko ankkurointi kulttuuriin alustaan ​​tai muihin soluihin (kuvio. 1). Ankkurointiriippumattomuudeksi on erottava piirre metastaattisen solujen [7], [21], [36]. Todellakin, meidän viime

in vitro

tyvikalvon soluinvaasiota määritykset osoittavat, että HCT-8 R solut ovat huomattavasti enemmän invasiivisia kuin E soluihin [24].

löytö E-to-R siirtyminen HCT-8 paksusuolen adenocarcimona soluja viittaa siihen, että sopivan substraatin mekaaninen pehmeys voi edistää tai tukea aloittamisen aikaisin tapahtumien syöpäsolumetastaasi, ja ironinen menetys mechanosensitivity, joka voisi tukea verisuonten levisi distaaliseen kudokseen kohde sivustoja. Tämä tutkimus osoittaa, että paksusuolen syövän solut voivat saavuttaa tämä piirre yksinomaan kulttuurin sopivasti pehmeä alustaan. Tällä hetkellä arvioidaan, onko R soluissa näyttää parannetun metastaattinen käytös eläinkokeissa verrattuna E soluihin. Jos E R siirtyminen korreloi hankintaan tehostetun metastaattisen aktiivisuuden, manipulointi mekaanisen microenvironment voi toimia houkutteleva

in vitro

malli tutkia varhaisen tapahtumien syöpäsolumetastaasi sekä seulontaan mahdollisten anti- metastaattinen terapeuttisia aineita.

Materiaalit ja menetelmät

1. Soluviljely, mikroskopia kuvantaminen ja PA geelit valmisteet

Ihmisen paksusuolen adenokarsinooman HCT-8-soluja (ATCC nro .: CCL-244) viljeltiin RPMI 1640: ssä (Gibco nro .: 23400-062), johon oli lisätty 2 g natriumbikarbonaatilla litrassa, jolloin lopulliset pitoisuudet 10% hevosen seerumia (Gibco nro .: 26050-088), 1 x antibioottia-antimykoottia (Gibco nro .: 15240-062) ja 1 mM natriumpyruvaattia (Gibco nro .: 11360) [1]. MA104-solut (alkion Afrikkalainen vihreän apinan munuainen) saatiin MA Bioproducts ja viljeltiin MEM (Gibco nro .: 41500-018), johon oli lisätty 2 g HEPES litrassa, 2,2 g natriumbikarbonaattia litraa kohti, 1 x antibiootti-antimykoottia, kuten edellä, ja 5% naudan sikiön seerumia (Gibco nro .: 16140). Apinan munuaisen fibroblastien (MKF) solulinja (CV-1, ATCC, Manassas, VA) viljeltiin väliaineessa, jossa on 90% DMEM (ATCC, Manassas, VA), 10% FBS: ää (ATCC, Manassas, VA) ja 1 x antibiootti-antimykootti (Gibco nro .: 15240-062). Solutiheys ennen pinnoitusta laskettiin standardin hemosytometrillä. Standard soluviljelmää yrityshautomo käytettiin antamaan viljelyolosuhdetta riittävästi kosteutta, 37 ° C lämpötilassa, ja 5% CO

2. (1).