Krooninen sairaus

tiivistelmä

yksittäisinä aineina, ABT-263 ja ABT-737 (ABT), molekyyli- antagonistit Bcl-2-perheen, sitoutuvat tiukasti Bcl-2, Bcl-x L ja Bcl-w, mutta ei MCL-1 ja indusoida apoptoosia vain rajoitetusti solutyypeissä. Yhdiste 2-deoksiglukoosi (2DG), sen sijaan, osittain estää glykolyysi, hidastaa solukasvua, mutta harvoin aiheuttaa solukuoleman. Injektoidaan eläimeen, 2DG kertyy pääasiassa kasvaimia, mutta ei vahingoita muita kudoksia. Kuitenkin, kun solut, jotka olivat erittäin resistenttejä ABT oli esikäsitelty 2DG 3 tuntia, ABT tuli indusoi apoptoosin, nopeasti vapauttava sytokromi c päässä mitokondrioita ja aktivoimalla kaspaasien on submikromo- laarisena pitoisuuksissa Bak /Bax-riippuvaisella tavalla. Bak normaalisti erottautuvat komplekseja Mcl-1 ja Bcl-xL. 2DG pohjustaa solut häiritsemällä Bak-Mcl-1 yhdistys, mikä helpottaa ABT erottaa Bak mistä Bcl-x L, mikä vapauttaa Bak apoptoosin. Erittäin aktiivinen glukoositransportterin ja Bid, asiamiehenä mitokondrion apoptoottisten signaalin vahvistus silmukka, ovat välttämättömiä tehokkaan apoptoosin induktio tässä järjestelmässä. Tämä yhdistelmä syövän kantavien hiirten oli erittäin tehokas -tuumoriksenografti hormoni-riippumattomat erittäin etäpesäkkeitä kemiallis-resistentti ihmisen eturauhasen syöpäsolujen, mikä viittaa siihen, että yhdistelmähoito voidaan aikaansaada turvallinen ja tehokas vaihtoehto genotoxin perustuva syövän hoitomuotoja.

Citation: Yamaguchi R, Janssen E, Perkins G, Ellisman M, Kitada S, Reed JC (2011) Tehokas poistamista syöpäsolujen deoksiglukoosilla-ABT-263/737 Combination Therapy. PLoS ONE 6 (9): e24102. doi: 10,1371 /journal.pone.0024102

Editor: Andrei L. Gartel, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 31 heinäkuu 2011; Julkaistu: 19 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Yamaguchi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: EJ vastaanotettu National Institutes of Health (NIH) /National Cancer Institute Grant CA138617, ME sai NIH myöntää P41RR004050, ja JCR sai CA113318, CA055164, ja CA081534. Osa työstä on kuvattu tässä suoritettiin käyttäen tilat National Center for Microscopy ja Imaging Research, University of California San Diego, tukee NIH NCRR kautta lupanumeroon P41RR004050 MINULLE. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

2-deoksi-D-glukoosi on glukoosin molekyyli, joka on 2-hydroksyyliryhmä korvataan vedyllä. 2DG kuljetetaan solukalvon läpi, jonka glukoosin kuljettajan [1]. Kun sytosoliin, 2DG fosforyloituu heksokinaasin II ja sen tuote, 2-deoksiglukoosi-6-fosfaatti, loukkuun sytosoliin ja tulee estäjä heksokinaasista, kuten glukoosi tulee glukoosi-6-fosfaatti ja tulee estäjä heksokinaasista. Koska glukoosi-6-fosfaatti hydrolysoidaan glukoosi-6-fosfataasi hyvin nopeasti, tuottaa NADPH ja tuottaa energiaa, sen vastine, 2-deoksiglukoosi 6-fosfaatti, on huonompi substraatti glukoosi-6-fosfataasi. Näin ollen 2-deoksiglukoosi-6-fosfaattia kerääntyy sytosoliin, estämällä heksokinaasista ja laskemalla solujen energian tasoilla. On arvioitu, että solunsisäinen puoliintumisaika 2-deoksiglukoosi-6-phsophate on noin 50 min syöpäsoluissa [2]. Näin 2DG toimii estäjänä glykolyyttisen reitin.

hitaampi hydrolyysinopeudet 2-deoksiglukoosi-6-phsophate mahdollistaa glukoosin sisäänottoa voidaan mitata elävän eläinten

18F-fluori-2-deoksiglukoosi perustuva positroniemissiotomografia (FDG-PET). Viimeaikaiset edistysaskeleet FDG-PET on selvästi osoittanut huomattavasti korkeampia glukoositransportterin toimintaa in vivo, lähes kaikkien kiinteiden kasvainten verrattiin terveisiin kudoksiin, mikä vahvistaa Warburg Effect [1]. FDG-PET on myös tullut erittäin herkkä tapa havaita kasvaimia jo hyvin varhaisessa vaiheessa, esimerkiksi alkuvaiheessa oireeton haimasyöpä. Koska 2DG kertyy pääasiassa syöpäsoluissa ja osittain estää paljon käyttämätöntä Glykolyysivaiheen näissä soluissa, anto 2DG on turvallinen ja tehokas tapa hidastaa syövän kasvua [1]. Kuitenkin sytostaattinen aktiivisuus 2DG on yleensä lyhytikäinen, kestävät vain noin viikon [3]. Näin 2DG on kokeiltu yhdessä muiden kemoterapeuttisten, mutta jälleen vaihtelevin tuloksin. Joissakin tapauksissa se voi alentaa tehoa muiden hoitojen [4]. Yksi syy laski tehoa näillä yhdistelmä hoitoja voi olla, että joissakin soluissa, 2DG aktivoi insuliinin kaltaisen kasvutekijän reseptori (IGFR), joka voisi aktivoida PI3K-mTOR-AKT pro-selviytymisreittiin [5], [6].

Various lääkkeitä, jotka kohdistuvat Bcl-2 ja Mcl-1 on testattu kykynsä indusoida apoptoosin syöpäsoluissa [7]. Näkyvin joukossa ovat Bcl- 2 antagonistit ABT-737 ja ABT-263 [8], [9]. ABT-737 sitoutuu spesifisesti ja suurella affiniteetilla Bcl-2-perheen proteiinien, mukaan lukien Bcl-2, Bcl-x L ja Bcl-w, mutta ei Mcl-1. ABT-737 muutettiin kolmella auttaakseen luoda ABT-263 parantaa hyötyosuus suun kautta ilman affiniteetti Bcl-2-perheen proteiinien [9]. Ainoana lääkkeenä kuitenkin ABT-263/737 (ABT) indusoi apoptoosia vain rajoitetusti kasvaintyypeissä, kuten lymfoomat ja jotkut pienisoluisen keuhkosyövän [8], [9], [10]. Syynä vaihteli herkkyydet ABT ei ole täysin selvä.

Apoptoosi etenee tyypillisesti joko sisäisen reaktiotien, jossa sytokromi c vapautuu mitokondriot on Bax /Bak-riippuvaisella tavalla, aktivoimalla apoptosomes sytosoliin, tai ulkoinen tie, jossa kaspaaseiksi aktivoidaan suoraan alavirtaan kuolemareseptorien (tarkastelleet Salvesenin Riedl [11]). Usein on cross-talk näiden kahden reittejä. Koska ABT sitoo mitokondrion proteiinit, ABT aiheuttama apoptoosin ajatellaan tapahtua sisäisellä reitillä, mutta emme tiedä, miten tämä tehdään.

kriittinen vaihe sisäisen reaktiotien apoptoosin on kun sytokromi c on vapautetaan mitokondriot, koska kun sytokromi c vapautuu sytosoliin, se stimuloi apoptosomes, kuoleman executioner. Tästä syystä sytokromi c release kutsutaan usein josta ei ole paluuta [12]. Vasta useita vuosia sitten ajateltiin, että kalsium-aktivoitujen mitokondriot läpäisevyyttä siirtyminen huokoset (MPTP) voidaan tarvita sytokromin c vapautumisen aikana sisäisen reaktiotien apoptoosin. Kuitenkin on osoitettu, että tBid aiheuttama sytokromi c release ja myöhemmät apoptoosin voisi tapahtua ilman VDAC [13] ja syklofiliinistä D [14], [15], kaksi keskeistä tekijää, MPTP (tarkistetaan Yamaguchi Perkins [16]). Sen sijaan vallitseva dogmi, että sytokromi c release tapahtuu läpi mitokondrioiden outermembrane huokoset (MOMPs). Vaikka MOMP on vakiintunut käsite, sen olemassaolo on edelleen hypoteettinen, koska toisin tumahuokonen tai MPTP ei ole EM kuvia MOMPs. Samoin, MOMPs ei ole eristettiin biologinen kokonaisuus. Niinpä ei tiedetä, ovatko Bak tai Bax asuvat MOMPs. Kaikkein yksityiskohtainen analyysi MOMP muodostumisen apoptoosin aikana, tuli tutkimalla lipidirakkuloihin koottu mitokondrioiden outermembrane proteiineja. Näissä tutkimuksissa tBid-aktivoitua Bax käytettiin stimuloimaan MOMP kokoonpano on rakkulat [17], stimuloimalla vapauttaa proteiineja yhtä suuri kuin 2000 kDa [18] kautta huokoset, joiden läpimitta on 25-100 nm [19]. Jos MOMPs on mitokondriot ovat suunnilleen samankokoisia, voisi odottaa nähdä niitä käyttämällä elektronimikroskoopilla (EM), mutta niitä ei ole mittausta. Siten olemassaolo MOMPs edelleen hypoteettinen. Oli miten oli, mekanistinen näkökulmasta olemassaolo MOMPs koostuu kokonaan tai osittain Bax ja Bak järkevää.

BH3 vain proteiineja, kuten tBid, Bims kutsutaan ”aktivaattoreita”, koska ne suoraan vuorovaikutuksessa Bax tai Bak, muuttamalla niiden rakenne ja asiakkuutta oligomerisaatioaste toisin sanoen ”aktivoimalla” niitä, jotka johtavat sytokromi c release ja apoptoosin. Uudemmat havainnot kuitenkin ehdottaa toista skenaario, jossa apoptoosin tapahtuu ilman aktivaattoriproteiineja. Ensimmäinen, Huang ja kollegat osoittivat, että Bak normaalisti sekvestroida Mcl-1: n ja Bcl-xL, ja Bak on vapautettava sekä ennen kuin se voi muodostaa oligomeerejä [20]. Ajatus siitä, että inaktivoimalla joitakin anti-apoptoottiset proteiinit ilman apua joidenkin aktivaattori voi indusoida apoptoosia, ei ole ilman ristiriitoja [21], [22]. Suosimme idea, koska Huang ja työtovereiden totesi, että inaktivoimalla sekä Bcl-xL ja Mcl-1 riitti aiheuttamaan apoptoosin Bid ja Bim Knockout MEF [23], ja Hayashi ja työtovereiden löysi sama Bid ja Bim puutteellinen verihiutaleiden solujen [24 ].

Olettaen, että Bim ja Bid eivät osallistu ABT: n indusoiman apoptoosin, voimme spekuloida syitä vaihteli herkkyyksiä ABT-737. Koska ABT-737 sitoutuu Bcl-x L, inaktivoivan, mutta se ei sitoudu Mcl-1, jos on vähemmän Mcl-1-proteiinien läsnä, tehoa ABT-737, on lisättävä. Todellakin, Huang ja työtovereiden totesi, että kuluttamalla Mcl-1 HeLa-soluista siRNA, heistä tuli herkkä ABT-737 [25]. Myös monet ryhmät raportoitu käänteistä korrelaatioita syöpäsolujen herkkyyttä ABT-737 ja Mcl-1 ekspressiotasot monissa syövän tyypit (katso Information S1). On kuitenkin olemassa poikkeuksia; HL-60 ihmisen promyerlocytic leukemia-solut ekspressoivat suhteellisen suuria määriä Mcl-1, mutta ne ovat kuitenkin herkkiä ABT-737 [26]. Näin kuinka ABT-737 indusoi apoptoosia joissakin syöpäsoluissa ja toisilla ei, edelleen huonosti.

aloitti tämän projektin, jotta etsiä aineita, jotka voivat lisätä tehoa ABT. Kun co-käsitellyn ihmisen kasvaimen solulinjojen ABT ja lääkkeet, jotka häiritsevät syöpä erityisten solun aineenvaihdunnan, olemme huomanneet, että 2DG esikäsittely huomattavasti parantunut tehokkuus ABT vahingoittamatta terveitä soluja. Osoitamme, että 2DG-ABT indusoi apoptoosin muuttamatta Mcl-1 tasot ABT-resistentit solut. Kun syöpäsolujen resistenttejä ABT esikäsitellään kanssa 2DG, proteiinin tasot Mcl-1 pysyy samana, mutta Bak-Mcl-1 yhdistys on kadonnut, herkistävät soluja ABT: n indusoiman apoptoosin. Miten 2DG syövän solujen häiritsee Bak-Mcl-1 ei ole tiedossa. Täten syöpäsolujen herkkyyttä ABT näyttää ratkaistun paitsi proteiini tasot Mcl-1, vaan myös kuinka paljon Bak on sekvestroida sen yhdessä Mcl-1.

Tulokset

2DG-ABT tehokkaasti indusoi apoptoosia syöpäsolujen

Applied ainoana lääkkeenä, 30 nM ABT-737 tappoi 90% RS (4; 11) non-Hodgkin-B-solulymfooma soluja 9 tuntia ( kuva 1 a). Kuitenkin 1 tunnin esi-inkuboinnin RS (4; 11) soluja 5-10 mM 2DG elatusaineessa, joka sisälsi 10 mM glukoosia tehosti ABT dramaattisesti, tappaen 90% soluista vain 3 nM ABT-737. 2DG yksinään ei aiheuttanut solukuolemaa aikana 10 tunnin inkubaation. Kun testasimme kaspaasi aktivointia, on havaittu, että niinkin vähän kuin 1 nM ABT-737 voi aktivoida kaspaasit 3 tuntia niin kauan kuin solut esi-inkuboitiin 2DG 3 tuntia. Ei kaspaasin aktivaatio kuin tausta havaittiin soluissa, jotka inkuboitiin 2DG yksin. Näin ollen voidaan päätellä, että 2DG herkistää RS (4; 11), solujen ABT: n indusoiman apoptoosin. Me toisti kokeen käyttämällä erilaisia ​​pitoisuuksia ABT-263 ja laskettiin solut trypan sinisen väriaineen pääsi kuolleet solut 24 tunnin kuluttua ABT lisäksi (Kuva. S1a). Tuloksena oli myös synergistinen 2DG ja ABT.

a, RS (4; 11) soluja esikäsiteltiin 20 mM fruktoosia tai 0-10 mM 2-deoksi-D-glukoosin säännöllisesti RPMI joka sisälsi 12 mM glukoosia, 1 tunnin ajan ennen kuin siihen lisättiin ABT-737 on ilmoitettuina pitoisuuksina. 9 tuntia myöhemmin solut analysoitiin FACS: lla anneksiini V-positiivisuus. Chi Square riippumattomuustestiin kaksi muuttujaa, 2DG ja ABT, oli P (x ~

1

2 193,35) = 0,000000. Koska yhdistelmä oli selvästi parempi kuin odotusarvot, tilastotieto osoittaa synergistisen vuorovaikutuksen 2DG ja ABT-737. b, HeLa-soluja esikäsiteltiin 1 tunnin ajan joko kanssa tai ilman 10 mM deoksiglukoosia DMEM: ssä, joka sisälsi 12 mM glukoosia, ennen kuin lisättiin ABT-737. Kuusi tuntia myöhemmin solut analysoitiin FACS: lla anneksiini-V-värjäyksellä. c, HeLa-solut esikäsitellään 3 tuntia 2DG, ennen kuin lisättiin ABT-737. Solut analysoitiin kaspaasiaktiivisuus 3 tunnin kuluttua ABT-737 lisäksi. d, HeLa, PPC-1 ja MCF-7-soluja käsiteltiin 10 mM 2DG 3 tuntia, ennen kuin lisättiin 1 uM ABT-263 inkuboimalla yön yli. Trypaanisininen-negatiivinen (elinkelpoinen) solut laskettiin ja piirretään (keskiarvo ± std dev; n = 3). e, Yhdistelmähoito vähentää klonogeeniset selviytymistä PPC-1-soluissa. PPC-1-soluja käsiteltiin vain kerran 24 tunnin 5 mM 2DG, 1 uM ABT-263, molemmat, tai jätettiin hoitamatta. 250-1000 solua maljattiin per 30 mm malja, ja 12 päivää myöhemmin, elossa solun pesäkkeet värjättiin.

Seuraavaksi testasimme 2DG voi herkistää ABT-resistenttien kasvainsolujen ABT-737 tai ABT -263. Ensimmäinen koe suoritettiin käyttäen HeLa kohdunkaulan syövän soluja. HeLa-soluja esikäsitellään 1 tunnin ajan 2DG ennen lisäämistä ABT-737. Yhdeksän tunnin kuluttua lisäämällä 1 uM ABT-737, noin 35%: HeLa-solujen, jotka oli aiemmin käsitelty 2DG, oli anneksiini V-positiivisia (Fig. 1b). Tämä määrä solukuolema oli verrattavissa nähdään käsittelyn jälkeen HeLa-solujen kanssa 1 uM staurosporiini (STS), tunnettu apoptoosin indusoija HeLa-soluissa toisessa koesarjassa, kun HeLa-soluja esi-käsiteltiin 3 tuntia 10 mM 2DG alustassa, joka sisälsi 25 mM glukoosia, vankka kaspaasin aktivaatio havaittiin 3 tunnin kuluessa pitoisuuksina ABT-737 niinkin alhainen kuin 0,1 uM (Fig. 1 c). Ilman 2DG esikäsittelyä, jopa 10 uM ABT-737 ei aktivoi caspases samana aikana. Tämä koe toistettiin myös käyttämällä ABT-263 ja pisteytys kuolleita soluja trypan-sinistä väriainetta sisällyttäminen (Fig. S1B). Uudelleen, se osoitti synergistisen vaikutuksen ABT-263 ja 2DG. ABT-737 ja ABT-263 verrattiin side-by-side käyttäen kolmen tunnin 2DG-esikäsittelyn HeLa soluja. ABT-263 oli hieman parempi kuin ABT-737 apoptoosin (Fig. S2a).

ehdot 2DG-ABT aiheuttaman apoptoosin

Kinetic ja annos-vaste-tutkimuksia HeLa-solujen kanssa osoitti seuraavat : (i) läsnä ollessa glukoosi on tarpeen 2DG-ABT aiheuttamaa apoptoosia (kuvio. S2b), ja optimaalinen moolisuhde apoptoosin induktion 2DG: glukoosi on noin 0,4-1,0; (Ii) 2DG olisi lisättävä 3-4 tuntia ennen kuin lisättiin ABT (Fig. S2C d); ja (iii): n vapautumisen havaitaan 3 tunnin kuluessa ABT lisäksi. Nämä olosuhteet voivat heijastaa vakautta ABT-263/737 liuoksessa (noin 4 tuntia [9]), samoin kuin luonnon solujen välisen tuottamien signaalien 2DG; sen on otettava 3-4 tuntia 2DG tuottamaan riittävän vahva signaali on tehokas. Näissä olosuhteissa vähennys solujen ATP-pitoisuus on hyvin pieni (Fig. 5a), mikä viittaa siihen, että ATP vajaatoiminta ei tarjoavat selityksen parannettua herkkyyttä ABT-737 ja ABT-263.

Kaikki seuraavat kokeet suoritettiin käyttäen seuraavia olosuhteita: Lisää 5-10 mM 2DG on soluviljelmässä. Kolme tuntia myöhemmin lisätä 1-3 uM ABT. Määritys kaspaasiaktiivisuus ja sytokromi c vapautumista mitokondrioiden kolmen tunnin kuluttua ABT-hoidon. Kuusi tuntia ABT-hoidon, määritys anneksiini V värjäystä. 24 tuntia myöhemmin, lasketaan elinkelpoisia soluja trypaanisinivärin syrjäytymisen määrityksessä. Vastaus protokollan vaihteli solulinjan solulinjaan. Niistä syöpäsolut vastannut hyvin olivat rintasyöpä MCF-7 ja hormoni kestävä eturauhassyövän solulinjaa PPC-1. Molemmissa tapauksissa yli 95% soluista poistettiin 24 tunnin yhdistelmähoitoa (Fig. 1 d). Yksi agentti soveltaminen 2DG aiheutti kuoleman (31,3% varten HeLa, mikään havaittu MCF-7, ja 21,5% PPC-1). Koska kaikki solut ovat vaihtelevia määriä glykogeenin tallennettu glukoosin lähde, määrien solukuoleman 2DG oli pitkälti riippuvainen aiempi viljeltyjen olosuhteissa. Viljeltyjen solujen normaalisti voittaa 2DG aiheuttama kasvua pidätys ja alkaa kasvaa 24-48 tuntia (dataa ei esitetty). Lisäksi, kun 2DG injektoitiin syöpää kantavia hiiriä, se ei aiheuttanut kasvaimen regressiota, mutta viivästynyt kasvaimen kasvua 5-6 päivää. Tämän lyhyen viiveen, kasvaimet alkoivat kasvaa. Muut ryhmät olivat tehneet samanlaisia ​​havaintoja [4]. Syynä on kehittynyt vastustuskyky 2DG ei tiedetä. Ainoana lääkkeenä, vaikutus ABT-263 oli myös marginaalinen (13,7% varten HeLa, 3,1% MCF-7 ja 36,7% PPC-1). Vaikutukset 2DG-ABT yhdistelmä ylitti lisäaineen vaikutuksia 2DG ja ABT kaikissa kolmessa solulinjoissa (HeLa odotetaan eläviä soluja 59%, havaittiin 25%, MCF7 odotetaan eläviä soluja 115%, havaittiin 3,8%, ja PPC1 odotetaan elävää solua 49,7 %, havaittiin 3,9%). Klonogeeninen Cell Survival määritys osoitti myös, että yli 95% PPC-1-solut eliminoitu vain yksi kohtelustaan ​​monoterapiana sovellusten ABT tai 2DG olivat yleensä tehotonta (Fig. 1 e). Ottaen huomioon, että p53 on inaktiivinen joitakin erittäin kasvainsolujen alueisiin, mukaan lukien PPC-1 [27], [28], [29], voimme päätellä, että yhdistelmä-indusoitua apoptoosia on p53-riippumatonta. Mahdollisia syitä monipuolinen vastaukset käsitellään myöhemmin.

Jotta ymmärtää, mitä molekyylitason tapahtumia kun ABT lisätään 2DG käsiteltyjä soluja, päätimme ensin tutkia minkälaista apoptoosin on indusoi yhdistelmä 2DG ja ABT.

Yhdistelmähoito kanssa 2DG ja ABT indusoi apoptoosin kautta sisäisen reaktiotien

on raportoitu, että hakemus on 10 nM ABT-737 vain 2 tunnin ajan johtaa mitokondrioiden ulomman kalvon murtumaan kroonisen lymfaattisen leukemian (CLL) solut [30]. Tämä ei ole normaali ilmiö apoptoosin. Sytokromi c yleensä purkautuvaa mitokondrioiden outermembrane huokosten hyvässä järjestyksessä [31]. Tuhoaminen mitokondrioita tapahtuu pitkän ajan kuluttua sytokromin c vapautumisen toimintaa täysin aktivoitu solukuoleman koneistoja. Kun tutkimme HeLa-soluja käsiteltiin 2DG-ABT yhdistelmä käyttäen EM, repeämä mitokondrioiden ulkomembraanit ei havaittu (kuvio. 2a). In ABT-käsiteltyjä soluja, mutta hieman lyhentää mitokondrioita havaittiin (Fig. 2b c); alkaen 0,717 +/- 0,05 um käsittelemättöminä 0,530 +/- 0,05 um ABT vain, 0,553 +/- 0,06 um 2DG + ABT, ja lievä pitkittymiseen mitokondrioiden 2DG käsiteltyjä soluja 0,844 +/- 0,05 um. Me spekuloida, että koska Bcl-x L- ja Bcl-w tiedetään olevan osallisena mitokondrioiden fuusio /fissio [32], ABT ehkä esti toimintaansa. Mitä pidentäminen mitokondrioiden alle 2DG, se voi olla luotu kysynnän kasvuun mitokondrioiden hengitystä, ja tavata että taakka, mitokondriot voivat ovat pidentyneet. Vaikka 2DG ja ABT oli vastakkainen vaikutus pituudesta mitokondrioita, ne molemmat vaikuttivat fysiologioiden mitokondrioita. Vaikka jotkut spekuloi, että mitokondriot fuusio /fissio koneet voivat myös olla rooli apoptoosin, ajatus on edelleen kiistanalainen [33].

HeLa hoidettiin joko 10 mM 2DG 6 tuntia, 1 uM ABT-263 3 tuntia, tai 2DG 3 tuntia ennen kuin lisättiin ABT-263: ssa vielä 3 tunnin ajan, tai ne jätetään hoitamatta. a, Solut kiinnitettiin elektronimikroskoopilla (katso menetelmä). Kolme solua kustakin hoitoryhmässä tutkittiin tarkasti pituuden mitokondrioita. Emme havainneet vain kertaalleen revennyt mitokondrioiden outermembranes. b, kustakin solusta, joka on vähintään 12 mitokondrioita valittiin satunnaisesti mittausta varten. c, Keskimääräinen pituudet mitokondrioita lyheni hoitoja sisältävä ABT-263 (keskiarvo +/- Keskihajonta). Koska ABT-263/737 sitoutuu Bcl-2-perheen jäsentä, joiden tiedetään olevan mukana mitokondrioiden fuusio /fissio, ABT voinut muuttaa tasapainoa mitokondrioiden fuusio /fissio että fissio puolelle (p = 0,0001, 95%: n luottamusväli tämän eron: 14,5407-37,2513; pariton t-testi).

Sen määrittämiseksi, onko 2DG-ABT: n indusoiman apoptoosin kautta sisäisen reaktiotien, käytimme villityypin (wt) hiiren alkion fibroblasteissa (MEF) ja Bax /Bak kaksoispoistuma (DKO) MEF. Nämä DKO solut, joilta puuttuu luontainen polku. Villityypin MEF esikäsitelty 2DG, kaspaasin aktivaatio indusoitiin 3 tunnin kuluessa ABT lisäksi (Fig. 3a). Kuitenkin, ei ollut nopea kaspaasin aktivaatio Bak /Bax DKO MEF. Siksi, päättelimme, että 2DG-ABT aiheuttama apoptoosin tapahtuu Bak /Bax-riippuvaisen sisäisen reaktiotien (katso myös kuvio. S5a).

a, Wt, ja Bax /Bak DKO MEF hoidettiin 10 mM 2DG 3 tuntia, ennen kuin lisättiin 3 uM ABT-263: ssa 3 tuntia. 3 tuntia myöhemmin, solut kerättiin kaspaasiaktiivisuus määrityksissä. (Katso myös kuva. S5a). b, HT1080-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 2DG 3 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin joko 1 uM STS tai anti-Fas (CD95) vasta-ainetta ilmoitettuina pitoisuuksina (pg /ml). Solut kerättiin talteen 3 tunnin kuluttua, ja niistä määritettiin kaspaasiaktiivisuus. Mielenkiintoista on, 2DG näyttää häirinnyt Fas-indusoitua apoptoosia. Toistuvissa kokeissa havaitsimme jatkuvasti alhaisempi kaspaasin aktivaation 2DG esikäsitellyt solut, mutta astetta inhibitorinen aktiivisuus vaihteli kokeesta kokeeseen. Emme ole varma sen syyn. c, ensimmäistä 3 tuntia, HeLa-soluja joko käsiteltiin 10 mM 2DG tai jätetään käsittelemättä, ja käsiteltiin sitten 10 uM z-VAD, 1 uM ABT-737, molemmat tai kumpikaan 3 tuntia. Solut kiinnitettiin ja värjättiin DNA (punainen) ja sytokromi c: n (vihreä) ja tutkittiin menetys sytokromi c: n värjäystä, kuten on kuvattu menetelmät. Palkki osoittaa 100 pm. Edustaja kuvat on esitetty kuvassa. S3. Tämä kaavio näyttää prosentteina solujen menetyksen sytokromi c: värjäystä. Yhdistelmä hoito oli korkeampi solujen julkaissut sytokromi c (p = 0,008 by pariton t-testi). d, solut käsiteltiin kuten c fraktioitiin ja sytosolin fraktiot analysoitiin Western blot.

Sen testaamiseksi, 2DG myös herkistää kasvainsoluja ulkoinen tie apoptoosin, käytimme HT1080-solut, joissa on ei ole rajat puhua välillä ulkoisen ja sisäisen reittejä [34]. Esikäsittely HT1080-solujen 2DG 3 tuntia ei tehostanut Fas-indusoitua apoptoosia, mutta alensi kaspaasin aktivaatio (Fig. 3b). Siten 2DG ei lisännyt ulkoinen tie.

2DG-ABT indusoi sytokromi c release kautta kaspaasiriippuvaisen mekanismi

kriittinen vaihe sisäisellä reitillä on vapauttaa sytokromi C mitokondrioita . Kun 1 uM ABT-737 pantiin HeLa-solut, jotka oli esikäsitelty 2DG 3 tuntia, havaitsimme vapauttamista sytokromi c: n yli 30% soluista seuraavan 3 tunnin ajan mutta ei käsittelemättömissä soluissa tai soluissa hoidettiin joko 2DG tai ABT yksinään (Fig. 3c ja kuvio. S3).

kanoninen mitokondrioiden riippuva muotoja apoptoosin kuten staurosporine-, etoposide- tai UV-solukuolema, vapauttamaan sytokromi c: alkaen mitokondriot tapahtuu ylävirtaan kaspaasin aktivaatio ja voi edetä läsnä kaspaasin estäjät [35], [36]. Sitä vastoin aikana syöttämällä reseptori-indusoitua apoptoosia, kaspaasit aktivoida nämä reseptorit voivat myös pilkkomaan Bid-proteiinin, joka tuottaa katkaistun Bid (tBid), jossa tBid indusoimalla Bak /Bax oligomerointi ja huokosten muodostumisen on mitokondrion ulomman kalvot, joiden kautta sytokromi c pakenee. Siten yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä kuten z-VAD estää kuoleman reseptorin aiheuttaman sytokromi c vapautumista mitokondrioita. Olemme havainneet, että 2DG-ABT indusoi sytokromi c: n vapautuminen myös estetty z-VAD, kun lisätään synkronisesti ABT (Fig. 3c d, Fig. S2), mutta me osoitti, että 2DG-ABT: n indusoiman apoptoosin on Bax /leivonta- riippuvainen. Tämä arvoitus voitaisiin selittää Bid riippuva vahvistus silmukka, jossa pieni määrä sytokromi c vapauttaa ABT voi aktivoida lukuisiin kaspaasien (kuten caspases 9,3,6 ja 8) sytosoliin, lohkaisemalla Bid tuottaa tBid , jossa tBid puolestaan ​​aktivoivat Bak /Bax ja aiheuttaa edelleen vapautumista sytokromi c peräisin mitokondrioiden [37], [38].

vaikutukset Bid heikentymisen 2DG-ABT indusoiman apoptoosin

Me tutkimme, hypoteesin Bid-pohjainen vahvistus silmukka on rooli 2DG-ABT: n indusoiman apoptoosin. Ensin määritetään onko Bid lohkeaa aikana 2DG-ABT aiheuttamaa apoptoosia. Sekä HeLa ja PPC-1-solut, 2DG esikäsittely, jonka jälkeen lisättiin 1 uM ABT-263/737 indusoi sytokromi c: n vapautumisen mitokondrioista 3 tuntia. Molemmissa solutyypeissä, vapautuminen sytokromi c esti z-VAD-fmk. Kun PPC-1 rivi, lähes 100% soluista vapautuu sytokromi c, aiheuttaen lähes 100% apoptoosin. HeLa-solujen kanssa, solujen osuus näyttää sytokromi c: n vapautumisen ensimmäisen kolmen tunnin aikana oli noin 30% (Fig. 3c). Katkaistun tBid nähtiin 3 tuntia lisäämisen jälkeen ABT PPC-1 ja HeLa-solut (Fig. 4a, tuloksia ei ole esitetty). tBid oli poissa käsitellyissä soluissa 2DG yksin. Kun z-VAD-fmk lisättiin ABT, lohkaisu Bid oli tukossa.

a, Bid aktivoidaan 2DG-ABT aiheuttamaa apoptoosia. Western blotit PPC-1 solulysaateista käsiteltiin 10 mM 2DG 0-6 tuntia (vasen paneeli), jossa joko 1 uM ABT-263 yksin tai ABT-263 + 10 uM z-VAD viimeiset 3 tuntia (oikea paneeli) , koetettiin anti-tBid-vasta-ainetta (ylempi paneeli), anti-OPA1-vasta-ainetta (keskimmäinen paneeli), ja anti-alfa-tubuliinit (alempi paneeli). Huomautus: menetys Opa-1-L käytettiin markkerina uusittu mitokondrioiden kristat aikana sytokromin c vapautumista mitokondrioiden [34]. b, vaikutukset Bid heikentymisen 2DG-AB: n indusoiman apoptoosin. Aseta: western blotit PPC-1 solulysaateista, valetransfektoidut (vasemmalla kaistalla) tai transfektoitu Bid siRNA (oikea kaista). Bid (+) ja Bid (-) PPC-1-soluja käsiteltiin joko 2DG, ABT-263 (1 uM), jotka molemmat, 10 uM ABT-263, tai jätettiin käsittelemättä 24 tunnin ajan. Elinkelpoiset solut laskettiin ja lisäys /vähennys yli syöteluvut piirrettiin. c, PPC-1-soluja joko esikäsitellään 2DG 3 tuntia tai ilman esikäsittelyä, sitten 1 uM ABT-263 tai 1 uM STS lisättiin kolmen tunnin ajan, ja sytosolin fraktiot analysoitiin Western blot. Samanaikaisesti kokeissa Bid-köyhdytettyä PPC-1-soluja käsiteltiin yhdistelmällä 2DG ja ABT-263 tai STS ja analysoitu (nimetty Bid kd, 2 viimeistä rataa). Solut kerättiin 3 tunnin kuluttua ABT /STS hoitoa, ja solulimafraktioita analysoitiin western blots.

määrittämiseksi, mikä vaikutus, jos lainkaan, Bid on päällä 2DG-ABT: n indusoiman apoptoosin, me tyhjentynyt tarjouksen proteiinia siRNA. 2DG-ABT: n indusoiman apoptoosin pitkälti estetty Bid-köyhdytettyä PPC-1-soluissa. Tarjottu ehtyminen lisääntynyt prosenttiosuudet elinkelpoisten solujen ~8-kertaisesti (p 0,0077; pariton t-testi) (Fig. 4b). Määrät vapautetaan sytokromi c korreloi apoptoottisten hinnat (Fig. 4c). Siten Bid riippuva vahvistus silmukka tarvitaan tehokkaaseen 2DG-ABT aiheuttamaa apoptoosia. Tarjottu väheneminen oli samanlainen vaikutus indusoiman apoptoosin 10 uM ABT-263, mutta vaikutus oli vähemmän STS-indusoitua apoptoosia (tietoja ei ole esitetty, ja Fig. 4b c). Lopuksi Bid KO MEF näytetään myös alentunut herkkyys 2DG-ABT hoitoja (Fig. S5a). Olemme päätellä, että tarjous on merkittävä rooli 2DG-ABT: n indusoiman apoptoosin.

Etsi 2DG effektorit

Koska 2DG-ABT yhdistelmä aiheuttama apoptoosi Bax /Bak-riippuvainen, selvitimme vaikutukset 2DG on Bax ja Bak aikana kolmen tunnin esihaudonta. Jotkut solut viljeltiin hypoksisissa olosuhteissa tai glukoosi-tyhjennetty kasvualusta pitkiä aikoja, tulla herkistyneet apoptoosin [39], [40], [41]. Vaikka mitään yleispätevää markkeri olemassa solujen herkkyyttä apoptoosin, Bax tiedetään translokoituvat mitokondriot ennen apoptoosin ja nekroosin joissakin tapauksissa [41]. Bax translokaatio näyttää olevan selvä askel, eikä välttämättä samanaikainen sen aktivointi [42]. Kuitenkin, HeLa-solut, joita käsiteltiin 2DG yksin, Bax translokaatiota ei indusoitiin vähintään 16 tuntia (kuvio. S4a). Toisin kuin soluissa viljelty glukoosi-tyhjennetty kasvualusta, Bax translokaatio ei tapahdu aikana 2DG edeltävän itämisaika. Lisäksi Bax Knockout MEF vastasi 2DG-ABT-yhdistelmähoidon (Fig. S5a), viittaa siihen, että Bax ei saa olla ratkaiseva merkitys pohjustus syöpäsolujen 2DG. Tietenkin, ilman Bak, Bax on jo olevan mitokondrioissa roolissa Bak ja Bax voidaan aktivoida eri mekanismilla, kun se on mitokondriot [43].

Koska 2DG voi vaikuttaa glykosylaatio, 2DG-hoito saattaa aiheuttaa ER stressiä. Itse asiassa, ilmentyminen ER stressin markkeri, Grp74, havaittiin HeLa-soluissa, joita käsiteltiin 2DG ja 2-4 tuntia (Fig. 5b ja Fig. S4b). Oletimme, että jos 2DG toimii läpi ER stressiä, voisimme herkistää HeLa soluja ABT aiheuttaman apoptoosin esikäsittelemällä niitä muiden ER stressin indusoijat kuten thapsigargin. Kuitenkin tämä ei ollut (Kuva. S4c). Siten 2DG näyttää herkistää tuumorisoluja Bcl-2-antagonisteja mekanismien kautta, jotka eivät ole riippuvaisia ​​glukoosi-kulutukseen tai ER stressiä.

a, vaikutus 2DG solu- ATP-tasot. Määriä ATP mitattiin aikana HeLa soluviljelmä 10 mM 2DG läsnä ollessa 25 mM glukoosin DMEM 10% seerumia. b, Protein profiilit aikana 2DG inkuboimalla HeLa-soluissa. Näytteitä otettiin HeLa-soluista käsiteltiin kuten a, ja eri proteiinin sisällöstä pro- ja anti-apoptoottiset proteiinit analysoitiin Western-blotit. Tässä kokeessa, näemme kasvaa Bcl-xL ensimmäisen tunnin ajan. Kun me toisti kokeen kahdesti, Bcl-xL pysyivät samana. c, Mcl-1 tasot pysyivät muuttumattomina 2DG-ABT: n indusoiman apoptoosin. PPC-1 soluja käsiteltiin 10 mM 2DG 6 tuntia, 1 uM ABT-263: ssa 3 tuntia, tai 10 mM 2DG 6 tuntia, joista viimeiset 3 tuntia inkuboitiin 1 uM ABT-263. d, Bak ja Mcl-1 ei co-sakka 2DG käsitellyissä soluissa. PPC-1-solut käsiteltiin kuten c. Bak ja Mcl-1 immunosaostettiin erityisillä vasta konjugoitu proteiini G-Sepharose ja mukana saostuva proteiinit analysoitiin Western blotit. Vasen Ylä Paneelit, Bak co-saostumia, Oikea Upper Paneelit, Mcl-1 co-saostuu, ja vasen alempi Paneelit, Protein G-Sepharosea saostuu. Teknisistä syistä emme voineet immunosaostaa Bcl-xL: n ja analysoi sen sisällön.

2DG häiritsee Bak-Mcl-1 yhdistys, pohjustus soluja ABT indusoiman apoptoosin

Se on ollut raportoi, että soluja viljellään in glukoosi-köyhdytettyä väliaineessa tai läsnä 2DG pitkiä (24 tuntia tai kauemmin), voi heikentää solujen ATP-pitoisuuksien ja prime eri solujen apoptoosin [39], [40], [44].