Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät geenien ilmentymistä kohdennetulla tukahduttaminen transkription ja translaation. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että miRNA-23b (miR-23b) toimii tuumorisuppressori virtsarakon syöpä. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että miR-23b on olennaisesti säädellä vähentävästi virtsarakon syöpä solulinjoissa ja kasvaimen kudokset verrattuna ei-pahanlaatuisia soluja, ja normaali kudosnäytteistä. Osoitamme myös, että miR-23b ilme on potentiaalia olla ja ennustavia biomarkkereiden virtsarakon syöpään. Korkea miR-23b ilmentyminen korreloi positiivisesti korkeamman eloonjäämisaste virtsarakon syövän potilaiden paljastui Kaplan-Meier-analyysi. ROC-analyysi osoitti, että miR-23b ilmaisu voi erottaa normaalin ja virtsarakon syöpä kudoksiin. Edelleen me selvitetty biologista merkitystä miR-23b virtsarakon syöpään. Yli-ilmentyminen miR-23b virtsarakon syöpäsoluissa estivät solujen proliferaatiota ja heikentynyt pesäkkeiden muodostumista. Fluoresenssi solulajittelu- (FACS) analyysi paljasti, että uudelleen ilmentäminen miR-23b virtsarakon syövän soluissa indusoi G0 /G1 solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin, samalla kun estetään solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Lusiferaasireporttiterilla analyysit osoittivat, että Zeb1, ratkaiseva säädin epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), on suora kohteena miR-23b virtsarakon syöpään. Nämä tulokset osoittavat, että menetys miR-23b antaa proliferatiivisen edun ja edistää virtsarakon syövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Lisäksi uudelleen ilmentyminen miR-23b voi olla hyödyllinen terapeuttinen strategia hoitoa varten ihmisen virtsarakon syövän.

Citation: Majid S, Riad AA, Saini S, Deng G, Chang I, Greene K, et al. (2013) MicroRNA-23b toiminnot tuumorisuppressorina säätelemällä Zeb1 sisään virtsarakon syövän. PLoS ONE 8 (7): e67686. doi: 10,1371 /journal.pone.0067686

Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu 17. maaliskuuta 2013 Hyväksytty: 20 toukokuu 2013; Julkaistu: 02 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Majid et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Center for Research Resources National Institutes of Health kautta lupanumeroita RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, I01BX001123, VA Merit Review ja VA Program Project. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on neljänneksi yleisin maligniteetti Yhdysvalloissa ja yksi kalliimpia kliinisesti hallintaan [1]. Yli 90% virtsarakon kasvaimet muodostuvat siirtymäkauden cell carcinoma (TCC), joka syntyy siirtymäkauden epiteeli [2]. Virtsarakon kasvaimet luokitellaan kahteen luokkaan: ei-lihas- ja lihasten invasiivisia virtsarakon syöpä [3], [4]. Useimmat kasvaimet (75-80%) läsnä matala-asteista papillaarinen ei-invasiivisia kasvain, joka harvoin edetä tulla tappava, mutta lähes aina toistu. Tämän tyyppinen syöpä on nimeltään ”pinnallinen” virtsarakon syöpä ja vaatii kalliita pitkän aikavälin hallintaan. Loput ovat korkealaatuisia lihaksen invasiivisia kasvain (-15%), joka voi nopeasti edetä tulla metastaattisen ja johtaa kuolemaan [4]. Etiologisista tekijöitä virtsarakon syövän synnyn jäävät tunnistamatta, ja tehokkaiden molekyylitason markkereita taudin ovat rajalliset.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät geenien ilmentymistä kohdennetulla tukahduttaminen transkription ja translaation. Useat tutkimukset ovat tehneet globaalin analyysin miRNA ilmentymisen ihmisen solulinjoissa ja todettu kudosten ja tautikohtaista ilmentymismalleja [5], [6]. On myös yhä enemmän todisteita siitä, että miRNA ekspressioprofiileja saattavat viitata sairauden riskin ja taakka. Siten miRNA ovat arvioidaan mahdollisia biomarkkereita auttamaan diagnoosin ja ennusteen erityyppisten syöpien [7], [8]. Useat ihmisen miRNA on osoitettu olevan väärin säädellystä virtsarakon syöpä, mukaan lukien miR-1280, miR-203, miR-125b ja miR-133a [9], [10], [11], [12] ja edistää ja sairauden etenemistä. Kirjoittajat raportoivat, että miR-23b on merkittävästi alassäädetty virtsarakon syövän kudoksissa ja solulinjoissa ja että korkea ilmentymistaso miR-23b positiivisesti korreloi korkeamman eloonjäämisaste potilaiden leikkauksen jälkeen. Lisäksi tutkimme toiminnallinen merkitys miR-23b ja tunnistettu Zeb1 välittömänä kohteena miR-23b virtsarakon syöpään. Ensimmäistä kertaa tämä tutkimus osoittaa, että miR-23b on potentiaalinen biomarkkereiden ja tuumorisuppressori virtsarakon syövän suoraan suunnattu onkogeenin Zeb1.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja Cell Culture

SV-HUC-1, T24 ja J82-solut ostettiin American Type Culture Collection (ATCC), ja niitä kasvatettiin mukaisesti ATCC-protokollia. Nämä ihmisperäinen solulinjat todistaa oikeaksi DNA lyhyen tandem repeat analyysi ATCC. Kokeet solulinjoilla suoritettiin 6 kuukauden kuluessa niiden hankinnan /elvytys. SV-HUC-1-soluja viljeltiin F-12K Medium (ATCC), jossa oli 10% FBS: ää. T24-soluja viljeltiin McCoyn 5A-väliaine, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja J82-soluja viljeltiin Minimal Essential Media (MEM), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Soluja pidettiin inkubaattorissa kanssa kosteutetussa ympäristössä, 95% ilmaa ja 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Plasmidit, lähtöaineita ja transfektio

Taqman ja esiasteita HSA -miR-23b ja negatiivinen kontrolli ennalta miR hankittiin Applied Biosystems (Foster City, CA). pmir-GLO Dual-Luciferase miRNA Target ilmentämisvektori hankittiin Promega. microRNA-23b, ohjaus-microRNA ja siRNA: ita käytettiin 50 nM konsentraatio ja Lipofectamine 2000 (Invitrogen) käytettiin kaikkiin transfektioiden.

RNA uuttaminen

miRNA ja kokonais-RNA uutettiin solulinjoista käyttämällä miRNeasy Mini Kit ja RNeasy Mini Kit (Qiagen). miRNA kliinisistä näytteistä uutettiin käyttäen laser kaapata mikrodissektion tekniikoita, joiden on miRNeasy FFPE (Qiagen).

Ihmisillä tehdyt kliiniset näytteet

Kliiniset näytteet on saatu San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center . Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja tutkimuksen hyväksyi UCSF komitean Human Research (Hyväksyntänumero: H9058-35751-01).

Quantitative Reaaliaikainen PCR

Kypsät miRNA määritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA Analyysit mukaisesti valmistajan ohjeiden (Applied Biosystems). Kaikki RT reaktiot, mukaan lukien ei-templaattikontrollien ja RT miinus valvonta, ajettiin 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). RNA-pitoisuudet määritettiin kanssa NanoDrop (Thermo Scientific, Rockford, IL). Näytteet normalisoitiin RNU48 (Applied Biosystems). Geenien ilmentyminen kvantitoitiin käyttäen 7500 Fast Real Time Sequence tunnistusjärjestelmä Software (Applied Biosystems). Vertaileva reaaliaikainen PCR suoritettiin kolmena kappaleena, mukaan lukien ei-templaattikontrollien. Suhteellinen ekspressio laskettiin käyttäen vertailevaa Ct.

elinkykyyn ja Clonability Analyysit

Solujen elinkyky määritettiin 24, 48 ja 72 h käyttämällä CellTiter 96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay -kittiä ( Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan protokollaa. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä käyttämällä SpectraMAX 190 (Molecular Devices). Data esitetään keskiarvo ja rinnakkaisessa kokeessa verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Pesäkkeiden muodostumista määrityksessä, solut ympättiin alhaisen tiheyden (1000 solua /levy) ja annettiin kasvaa, kunnes näkyvissä pesäkkeitä ilmaantui. Sitten solut värjättiin Giemsa ja pesäkkeet laskettiin.

Muuttoliike ja Invasion Analyysit

Cytoselect 24 kuopan solumigraation ja invaasiomääritys sarjat (Cell Biolabs, Inc.) käytettiin muuttoliikkeen ja invaasio määrityksissä mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, T24 ja J82-solut transfektoitiin Pre-miR miRNA prekursori- tai negatiivinen kontrolli kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen ja suspendoitiin uudelleen seerumittomassa Opti-MEM. Solut (10 x 10

4 per 300 ui media ilman seerumia) lisättiin ylempään kammioon, ja alempi kammio täytettiin 500 ui väliainetta, joka sisälsi 10% FBS. Soluja inkuboitiin 16 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. 16 tunnin kuluttua ei-siirretyn /ei-tunkeutuvat solut poistettiin yläpuolen laajuisten hyvin kalvosuodatin insertit käyttämällä pumpulipuikolla moppi. Siirtynyt /tunkeutuneet solujen alapinnan puolella värjättiin ja absorbanssi luettiin 560 nm: ssä mukaan, valmistajan protokollan.

immunoblottauksella

Proteiini eristettiin konfluentteja (70-80%) levyjen viljeltyjen solujen käyttämällä M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Pierce Biotechnology, Rockfield, IL) noudattaen valmistajan ohjeita. Proteiinipitoisuudet määritettiin Bradfordin menetelmällä. Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin 4-20% natriumdodekyylisulfaattia (SDS)-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle jännitegradientti siirtoa. Saatu blotteja estettiin 5% rasvatonta maitoa ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden. Sitten blotit inkuboitiin asianmukaisten peroksidaasikonjugoidulla toissijaisen vasta-aineita ja visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

ehtyminen Zeb1 käyttäminen Sirna (siRNA) B

T24 virtsarakon syöpä solut maljattiin 24 tuntia ennen transfektiota. Klo 40-50% konfluenssiin, solut transfektoitiin käyttäen lipofektamiini-2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja siRNA dupleksoi spesifinen ihmisen Zeb1 (SR304746; Origene Technology, Rockville, MD) tai kontrolli-ei-hiljentäminen (NS) siRNA 72 tuntia . Aluksi kahta eri siRNA-dupleksien testattiin arvioimaan kohdespesifisyyttä ja pudotus tehokkuutta. Yksi siRNA duplex käytettiin vielä kokeissa 50 nM konsentraatio.

Luciferase Reporter Assay

pmirGLO Dual-Luciferase miRNA tavoite ekspressiovektoria käytettiin 3′-UTR Lusiferaasimäärityksiä (Promega, Madison , WI). Tavoitteena onkogeeni on miRNA-23b valittiin perusteella verkossa mikroRNA kohdetietokantaan https://www.microrna.org/microrna/home.do. Alukesekvensseissä villityypin 3’UTR olivat: Forward 5 ’CGCGGCCGCTAGTATTATGTTTTTTAAAATGTGAGT 3’ ja Reverse 5 ’CTAGACTCACATTTTAAAAAACATAATACTAGCGGCCGCGAGCT 3’. Sillä mutantti 3’UTR, alukesekvensseissä olivat: Eteenpäin 5 ’CGCGGCCGCTAGTATCGTGCGCACTAAGGCTCACTT 3’ ja reverse 5 ’CTAGAAGTGAGCCTTAGTGCGCACGATACTAGCGGCCGCGAGCT 3’. Sillä lucifease määritystä, T24 ja J82-solut kotransfektoitiin HSA-miR-23b ja pmirGLO Dual-Luciferase miRNA tavoite ekspressiovektorit villityypin tai mutantti-kohdesekvenssin käyttäen Lipofectamine 2000 Firefly lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Assay (Promega, Madison, WI) 18 tuntia transfektion jälkeen ja tulokset normalisoitiin kanssa Renilla lusiferaasin. Kukin toimittaja transfektoitiin vähintään kolme kertaa (eri päivinä), ja kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism 5 ja MedCalc versio 10.3.2 . Kaikki määrälliset tiedot edustaa keskimäärin vähintään kolmesta näytteestä tai yleisesti. Virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa keskiarvosta. Kaikki kokeet suoritettiin kaksi pyrstö ja

p-

arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Vastaanotin toimii käyrät (ROC) laskettiin määrittämiseksi potentiaali miR-23b syrjiä pahanlaatuiset ja ei-pahanlaatuiset näytteitä. Hengissä analyysi, Kaplan-Meier (log-rank-testi) analyysi suoritettiin.

Tulokset

miR-23b Expression on köyhdytetty rakkokasvaimista ja syöpäsolulinjat

Alustava microRNA microarray data paljasti, että miR-23b oli erittäin vaimentua virtsarakon syövän solulinjoissa verrattuna ei-pahanlaatuinen SV-HUC1 solulinjassa. Olemme validoitu microarray tietojen miRNA-kvantitatiivinen RT-PCR: llä (miR qRT-PCR) analyysi ja tulokset vahvistivat, että miR-23b on vaimentua virtsarakon syövän solulinjoissa J82, T24 verrattuna ei-pahanlaatuisen solulinjan SV-HUC1 (kuvio 1A) . Tutkia biologinen merkitystä miR-23b, sen ilmentyminen analysoitiin laser jää microdissected (LCM) ihmisen virtsarakon kasvain kudosten ja verrattuna normaaliin Hyväksytty kontrollisilkkipaperia. Ekspression miR-23b havaittiin olevan huomattavasti alassäädetty kaikissa tuumorinäytteissä verrattuna niiden vastaaviin normaaleihin näytteistä (kuvio 1A). Edistää ilmentymistä miR-23b normaaleissa kudoksissa korreloi ei-pahanlaatuisten solulinja, ja että kasvaimen korreloi syöpäsolulinjoissa (kuvio 1A), mikä osoittaa, että nämä syöpäsolulinjoissa edustavat mallia järjestelmän analysoida miR-23b-toiminto virtsarakon syöpä. Nämä tulokset viittaavat myös siihen, oletetun tuumorisuppressoriproteiinia roolia miR-23b virtsarakon syöpään.

A) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi miR-23b solulinjoissa ja Hyväksytty laser-jää mikropaloitelluista kudosnäytteistä. B) Leviämisen J82 ja T24-solujen jälkeen miR-23b transfektio oli merkittävästi vähentynyt verrattuna jatkuu-miR. C) miR-23b over-ilmentyminen estää merkittävästi pesäkkeenmuodostuskyvyn virtsarakon syöpäsoluja.

MicroRNA-23b Säätelee virtsarakon syövän Cell Proliferation ja Colony Formation

määrittämiseksi toiminnallinen merkitys miR-23b yli ilmentymistä virtsarakon syövän, me transfektoitu virtsarakon syöpä solulinjoja J82 ja T24 kanssa miR-23b esiasteita. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-23b laski merkittävästi solujen lisääntymistä verrattuna soluihin, jotka ilmentävät jatkuu-miR (kuvio 1 B). miR-23b transfektoiduissa soluissa oli matala pesäkkeiden muodostumisen mahdollisuuden, koska määrä pesäkkeiden miR-23b ilmentävien solujen väheni verrattuna jatk-miR transfektoiduissa soluissa (kuvio 1C). Nämä tulokset osoittavat antiproliferatiivista vaikutusta miR-23b virtsarakon syöpään.

miR-23b Triggers solusyklin pysähtymiseen ja indusoi apoptoosia virtsarakon syövän solut

FACS (fluoresenssi soluerottelun) analyysi paljasti että uudelleen ilmentyminen miR-23b johti merkittävään lisääntymiseen solujen G0 /G1 vaiheen solusyklin (59%: sta 67%), kun taas S-faasin määrän väheneminen 18%: sta 9% J82 solut (kuvio 2A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin T24-solujen kasvuun G0 /G1-solupopulaation (70%: sta 84%) ja väheneminen S-vaiheen väestöstä (15%: sta 5%) (kuvio 2B). Niinpä viittaa siihen, että miR-23b laukaisee G0 /G1 pidätys miR-23b transfektoiduissa soluissa verrattuna jatkuu-miR. FACS-analyysi apoptoosin suoritettiin käyttäen anneksiini-V-FITC-7-AAD väriainetta. Prosenttiosuus koko apoptoottisten solujen (varhainen apoptoottiset + apoptoottinen) lisääntyi merkitsevästi (4%: sta 19%) vastauksena miR-23b over-ilmentyminen verrattuna jatk-miR vastaavalla 14%: n lasku elävien solujen väestön J82 soluissa (kuvio 2C). In T24-soluissa, ja se kasvoi (4% 9%) on apoptoottisia soluja havaittiin miR-23b yli-ilmentymisen verrattuna jatkuu-miR (kuvio 2D). Nämä tulokset osoittavat tuumorisuppressorina rooli miR-23b virtsarakon syöpään.

A-B) edustaja kuvaa FACS osoittaa miR-23b over-ilmentyminen indusoi G0 /G1 solusyklin pysähtymisen J82 ja T24-solujen kanssa vastaava lasku S-vaiheessa olevien solujen. C-D) miR-23b over-ilmentyminen aiheuttaa apoptoosia J82 ja T24-solujen kanssa samanaikaisesti väheneminen elinkelpoisten solujen määrä. Tiedot on esitetty kolmesta rinnakkaisesta kokeita ± SD.

miR-23b vaimentaa virtsarakon syövän solujen vaeltamiseen ja Invasion

Yli-ilmentyminen miR-23b oli anti-muuttavien ja anti-invasiivisen vaikutukset virtsarakon syöpä solulinjoissa. Vähemmän absorbanssi havaittiin 560 nm: ssä miR-23b transfektoitujen virtsarakon syöpäsolujen verrattuna jatk-miR in migraatiokokeessa (kuvio 3A) ja miR-23b yliekspressio myös vähensi invasiivisuus virtsarakon syövän solujen (kuvio 3B).

A) Migration määrityksistä J82 ja T24 transfektoitujen solujen miR-23b. B) edustaja kuvaa migraatiokokeessa. C) Invasion määritykset osoittavat merkittävää väheneminen hyökkäävän J82 ja T24 transfektoitujen solujen miR-23b. D) edustaja kuvaa invaasiomääritys.

Oncogene Zeb1 on välittömänä kohteena miR-23b

Zeb1 on raportoitu olevan tärkeä molekyyli, joka ajaa virtsarakon syöpään solun liikkuvuus. Käyttämällä online microRNA kohdetietokannassa löysimme onkogeenin Zeb1 olla potentiaalinen kohde miR-23b täydentävä 3’UTR sitoutumiskohta siemenen sekvenssin miR-23b (kuvio 4A). Suoritimme Western-analyysi, jossa miR-23b transfektoiduissa soluissa ja havainneet, että miR-23b heikennetty ilmentymistä Zeb1 proteiinin verrattuna jatkuu-miR sekä J82 ja T24 virtsarakon syövän soluissa (kuvio 4B). Voit tarkistaa, onko suora vuorovaikutus on mukana välillä miR-23b ja sen kohde-onkogeeni Zeb1 teimme lusiferaasireportterilla määrityksiä. Olemme havainneet, että kotransfektoimalla miR-23b yhdessä villityypin 3’UTR Zeb1 aiheutti merkittävän lusiferaasiaktiivisuuden pienenemiseen verrattuna kontrolleihin (kuvio 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-23b suoraan suunnattu onkogeenin Zeb1.

A) sisältyvät miR-23b sitovia sekvenssejä Zeb1 3’UTR. B) Western blot-analyysi osoittaa, että miR-23b tukahduttaa käännös Zeb1 proteiinin J82 ja T24 virtsarakon syöpäsoluja. C) Lusiferaasimäärityksiä osoittaa vähentynyt reportteriaktiivisuutta kotransfektion jälkeen joko villityypin tai mutantti Zeb1-3’UTR kanssa miR-23b in J82 ja T24 soluja. Mut mutaation Zeb1 3’UTR järjestyksessä.

ehtyminen Zeb1 RNA Interference jäljittelee miR-23b Liuottaminen in virtsarakon syövän

Phenocopy suoritettiin myös siRNA estämällä Zeb1 (kuva 5). Olemme validoitu kaksi siRNA (Si-1 ja Si-2), joka johti merkittävästi knockdovvn Zeb1 on proteiinin taso (kuvio 5A) in T24 virtsarakon syövän solujen ja käyttää yhden siRNA duplex edelleen kokeissa 50 nM pitoisuus. Tuloksemme osoittivat, että siRNA esto Zeb1 aiheuttanut vähentynyt solujen elinkelpoisuuden (kuvio 5B), vaeltavia ja invasiivisia ominaisuus (kuvio 5C-D) T24 syöpäsoluja. Havaitsimme myös, että siRNA esto Zeb1 kasvoi noin 7% apoptoottisia osa solujen Zeb1 siRNA transfektoiduissa soluissa verrattuna 1% epäspesifinen kontrolli (kuvio 5E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että siRNA ehtyminen Zeb1 jäljittelee vaikutus miR-23b yli-ilmentymistä virtsarakon syöpä.

A) Zeb1 proteiinin tasot olivat merkittävästi vaimentaa 50 nM siRNA-dupleksit (Si) verrattuna ei-hiljentäminen siRNA duplex (Con) in T24-soluissa. B) Vaikutus soluproliferaatioon. C-D) Vaikutus maahanmuuttoa ja hyökkäys T24 virtsarakon syöpäsoluja. E) apoptoosimäärityksessä osoittavat apoptoosin induktion jälkeen Zeb1 Knockdown siRNA in T24-soluissa. * P 0,05.

ja ennustavia merkitys miR-23b in virtsarakon syövän

Voit selvittää miR-23b ilmentyminen voi syrjiä rakkokasvaimista ja normaaleissa kudoksissa, ja ennustaa potilaan selviytyminen, suoritimme ROC analyysi ja Kaplan-Meier-analyysi. Kliininen Väestörakenne potilaan kohortin on esitetty yhteenvetona kuviossa 6A. Alue ROC-käyrän alla (AUC) 0,885 (P 0,0001; 95% CI = 0,75-0,97) (kuvio 6B) ehdotti, että miR-23b ilmentyminen voi syrjiä pahanlaatuisten ja ei-pahanlaatuisten kudosten ja mahdollisesti voidaan käyttää diagnostisena merkkiaine virtsarakon syöpään. Sen määrittämiseksi, onko miR-23b on mitään ennustetekijöiden merkitystä, jaoimme potilaan kudosten matalan (lauseke T /N 1,2-kertainen) ja korkea (ilmaisun T /N 1,2 kertainen) miR-23b ryhmät ja suorittaa Kaplan-Meier selviytymisen analyysi. Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että korkea miR-23b oli merkittävästi korkeammat yleistä eloonjäämistä verrattuna matalan miR-23b ryhmä (logrank Test p 0,03, riskisuhde (HR) = 4,3, 95% CI = 2-14) ( kuvio 6C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-23b on potentiaalisesti ja ennustavia markkeri virtsarakon syövän vaikka tutkimuksia lisänäytteitä vahvistamiseksi tarvitaan näitä tuloksia.

A) kliinis ominaisuudet potilaan kohortin. B) ROC-käyrä analyysi osoittaa kykyä miR-23b ilmaus syrjiä pahanlaatuiset ja ei-pahanlaatuiset kudosnäytteistä. C) Kaplan-Meier-analyysi eloonjäämiseen perustuu miR-23b ilme.

Keskustelu

MikroRNA voi olla laajoja vaikutuksia säätelemällä ilmaus erilaisten geenien aikana nisäkkään kehitystä ja syövän syntymistä. Tämän seurauksena ymmärtämään mekanismeja ja toimintaa yksittäisten miRNA on herättänyt suurta mielenkiintoa. Huolimatta kertyy todisteita roolista eri miRNA syövän, hyvin vähän tietoa siitä, funktio miRNA virtsarakon syöpä, ja vain harvat miRNA tavoitteet on tunnistettu.

Kirjoittajat raportoivat, että miR-23b voidaan säädellä vähentävästi virtsarakon syöpä kudoksiin verrattuna normaaliin viereisiin kudoksiin ja tämä havaittiin myös virtsarakon syövän ja muiden pahanlaatuisten solulinjojen. Meidän data viittaa mahdolliseen diagnostinen /prognostisten roolia miR-23b ennustamisessa eloonjäämiseen ja erotteleva pahanlaatuiset normaaleista kudoksista ja osoittaa, että miR-23b on tuumorisuppressori virtsarakon syöpään.

määrittämiseksi biologisesta merkitystä miR -23b virtsarakon syövän, teimme funktionaalisissa määrityksissä. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-23b johtanut merkittävään soluproliferaation inhibointi, pesäkemuodostusta, muuttoliike /invaasion ja solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin virtsarakon syövän soluissa. Expression of miR-23b syövässä on hieman kiistanalainen, koska on havaittu olevan joko säädelty ja onkogeenisen munuaisten syöpään ja aiheutti translaation tukahduttamisesta tuumorisuppressorigeenin PTEN geeni [13] tai alassäädetty ja tuumorisuppressorina eturauhassyövässä jossa se suoraan suunnattu Src ja Akt oncogenes [14], kun taas meidän tutkimus osoittaa, se on tuumorisuppressorina virtsarakon syöpään. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että MikroRNA ovat erittäin kudosspesifisiä ja ne voivat toimia kasvaimia estävä tai onkogeenien [15], [16]. MikroRNA hallussaan useita ominaisuuksia, jotka tekevät niistä houkuttelevia ehdokkaita uusiksi prognostisia biomarkkereita ja tehokkaita työkaluja varhaiseen toteamiseen syöpä [17]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-23b oli ennustava kokonaiselinaika siten, että potilaat, joilla on korkeampi miR-23b ilme oli pidempi kokonaiselinaika verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen miR-23b ilme. MicroRNA-23b ilmentyminen oli myös pystyy erottamaan pahanlaatuinen normaaleista kudoksista osoittaa diagnostinen merkitys miR-23b virtsarakon syöpään vaikka lisätutkimuksia suuremmalla kohortin kudosnäytteitä tarvitaan.

Merkittävä este ymmärrystä miRNA toiminto on ollut suhteellisen niukasti kokeellisesti validoitu tavoitteita. Voit selvittää efektoreina miR-23b, in-silico algoritmeja ja toiminnallisia analyysejä tunnistettu Zeb1 tavoitteekseen. Olemme osoittaneet, että miR-23b suoraan kohdistuu 3’UTR Zeb1, sillä sen yli-ilmentyminen liittyi tukahduttaminen lusiferaasiaktiivisuuden. Lisäksi merkittävä alassäätöä tason Zeb1 proteiinia jälkeen havaittiin miR-23b yliekspressio, mikä osoittaa posttranskriptionaalisen sääntely Zeb1 kautta kohdistaminen sen 3’UTR. Funktionaaliset määritykset suoritetaan sen jälkeen Zeb1 ehtyminen siRNA transfektiolla jäljitteli saatuja tuloksia miR-23b yli-ilmentymisen. Nämä tulokset osoittavat, että vaikutukset miR-23b virtsarakon syöpä ovat osittain suoraan kohdentamalla Zeb1, vaikka muita tavoitteita voidaan myös olla mukana, koska MikroRNA voivat kohdistaa tuhansia geenejä. Zeb1 on yksi keskeinen sääntelyviranomaisten epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) [18] ja sen on osoitettu olevan tärkeä rooli invaasiota ja etäpesäkkeiden kasvaimia [19]. Merkitystä ZEB proteiinien kasvaimen etenemiseen on tutkittu useissa ihmisen syövissä. Expression of ZEB1 korreloi aggressiivista fenotyyppi eri histologisia tyyppejä kohtukarsinooma ja havaittiin sarcomatous osastoon kohdun limakalvon karsinosarkooma [20]. Paksusuolen syöpä, ZEB1 ilmaistiin leviämisrintamassa kasvaimia, yhdessä ohimenevä menetys tyvikalvoissa [21]. Vastavuoroisesti ilmentyminen ZEB1 ja E-kadheriinin on havaittu myös ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [22]. Suora korrelaatio ZEB1 immunoreaktiivisuus ja Gleason laatu on raportoitu ihmisen eturauhasen kasvaimissa [23] ja virtsarakon syövän, ZEB1 on raportoitu olevan yli-ilmentynyt ja vastaa tehostetun motiliteetin [18]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että yli-ilmentyminen miR-23b johti tukahduttaminen onkogeenin Zeb1 virtsarakon syövän solut viittaa siihen, että miR-23b voi välittää EMT, edustaen siten mahdollinen mekanismi, jonka kautta se vaikuttaa virtsarakon syöpä muuttoliikettä ja invaasiota.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että miR-23b on diagnostinen /prognostista merkitystä ja sitä on kohdistettu onkogeeninen Zeb1 virtsarakon syöpään. miR-23b over-ilmentyminen johti tukahduttaminen virtsarakon syövän solujen lisääntymistä ja invaasiota, aiheuttamaan apoptoosin, ja solusyklin pysähtymisen. Lopuksi, tämä tutkimus osoittaa, että miR-23b over-ilmentyminen voi olla terapeuttisesti käyttökelpoinen strategia hoitoon virtsarakon syöpään.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Roger Erickson hänen tuestaan ​​ja apua valmistelun käsikirjoituksen.