Krooninen sairaus

tiivistelmä

Surviviinispesifisiä on osa kromosomin matkustaja kompleksi (CPC), joka on välttämätön tarkkaan kromosomi eriytymistä. Häiritsee toiminta surviviinin mitoosin johtaa kromosomi eriytymistä virheet ja vialliset sytokineesiin. Surviviinispesifisiä sisältää bakulovirus IAP Repeat (ROP) ja siksi alun perin luokiteltu estäjänä apopotosis proteiinin (IAP), mutta sen rooli apoptoosin jälkeen solustressiä vielä tunneta laajalti. Osoitamme tässä, että surviviinin pääasiassa estää anoikis, muoto ohjelmoidun solukuoleman aiheuttama menetys soluadheesion soluväliaineen. Mielenkiintoista, solut ektooppisesti yli-ilmentävät EGFP-Surviviinispesifisiä osoitti menetyksen jälkeen solu-matriisi-vuorovaikutukseen vähentynyt ilmentyminen lKB-α. Myöhemmät subsellulaariset proteiinin fraktiointi ja immunosaostuskokeet paljastivat, että XIAP vuorovaikutuksessa pesuaineen liukeneva surviviini jonka tiedetään yhteistoiminnallisesti aktivoida NF-KB: n signalointia. Tutkiminen ekspressiotasoja pesuainetta liukoisen surviviinia peräsuolen syövän solulinjoissa ja peräsuolen syöpäkudokset paljasti, että pesuaine liukoista sytoplasmista Surviviinin tasot korreloivat käänteisesti anoikis alttius kolorektaalisyövässä. Siksi pesuaine liukeneva sytoplasman Surviviinispesifisiä voisi olla lupaava ennustavan biomarkkeri imusolmuke ja etäispesäkkeitä kolorektaalisyövän. Voimme päätellä, että anti-apoptoottisen funktion detergentti-liukoisen surviviinia interfaasivaiheessa soluissa esiintyy anoikis välittyy ainakin kautta XIAP /IKB-α /NF-KB: n signalointia.

Citation: Hori M, Miki T, Okamoto M , Yazama F, Konishi H, Kaneko H, et al. (2013) Pesuaine-Soluble Sytoplasmiset Pool surviviinin vaimentaa Anoikis ja sen ilmentyminen liittyy etäpesäkkeitä Ihmisen paksusuolen syövän. PLoS ONE 8 (2): e55710. doi: 10,1371 /journal.pone.0055710

Toimittaja: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, Intia

vastaanotettu: 20 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 29 joulukuu 2012; Julkaistu: 06 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Hori et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Japanin Society for Promotion of Science (KAKENHI nro 21591730 varten Masaaki Tatsuka) ja Prefectural University of Hiroshima (Tärkeää Research Project, GAKUNAI Kyodo Kenkyu H-24 Masaaki Tatsuka, Hiroaki Konishin, ja Fumio Shimamoto), ja Prefectural University of Hiroshima Graduate School of Comprehensive tieteellisen tutkimuksen Mayumi Okamoto ja Guangying Qi (Research Associate Grant H-24). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aikana syövän kehitystä, metastasoitunut solut irtoavat naapurina kasvainsoluja, hankkia solun liikkuvuus, hyökätä ja kirjoita imusuoniston tai verenkiertoa, hengissä ja muodostavat etäpesäkeleesioita. Nämä vaiheet sisältävät monien geenien ja polkuja, mutta nämä biologiset prosessit ovat huonosti tunnettuja huolimatta monet tieteelliset lähestymistavat [1]. Tunnistaminen etäpesäkekasvainten-kohdennusmolekyylejä diagnosointi- ja hoitotoimenpiteitä on edelleen tarpeen.

Surviviinispesifisiä kuuluu kromosomin matkustaja proteiinikompleksi (CPC), joka on keskeinen säätelijä mitoosin. Surviviinispesifisiä ja muut CPC komponentteja, Aurora-B, sisempi sentromeeriantigeenin proteiini (INCENP), ja Borealin (Dasra B) ovat välttämättömiä CPC toimintoja kuten Kinetokori kiinnitys virheiden korjauksia ja valmistumisen sytokineesiin [2]. Surviviini edistää mitoosi lokalisointi CPC ja on kuvattu parantaa Aurora-B-kinaasiaktiivisuuden esitetyn

Xenopus laevis

ja

S. pombe

[3], [4]. Alkuvuodesta mitoosia, fosforylaatio histoni H3 treoniini 3 välittyy Haspin ja myöhemmin sitoutumisen surviviinin tällä sivustolla on kriittinen kokoamiseksi CPC on Kinetokori [5], [6], [7].

surviviinia on määräajoin ilmaisi solusyklin aikana korkeimmillaan mitoosissa [8]. Previou tutkimukset ovat osoittaneet, että surviviini ilmentyminen on alentunut p53, ja menetys p53-toiminto, joka on usein havaittu syöpäsoluissa, lisää sen transkription [9], [10]. Itse useimmat syöpäsolut analysoidaan niin syvällä säännellä Surviviinispesifisiä [11], [12] verrattuna normaaleihin soluihin tai viereisten kudosten. Lisäksi monissa ihmisen syövässä tapauksissa, surviviini on havaittu edes interphase [13], [14]. Surviviinin yli-ilmentyminen on usein löytyy peräsuolen syöpä [15], [16], [17]. Tässä kohonnut surviviinin on kuvattu korreloivan huonon ennusteen [18], [19], mutta ristiriitaisia ​​tietoja julkaistaan ​​tästä [20]. Sen lisäksi CPC tehtävät Surviviinispesifisiä uskotaan olla useita rooleja apoptoottisen asetuksessa [21], [22], [23]. Kuitenkin sisällä N-pään surviviinin, on vain yksi bakuloviruskantoja apoptoosi-inhibiittori toista (BIR) domain. Myös Surviviinivasteita ei sisällä C-terminaalista RING finger domain joka on yhteinen jäsenten IAP perhe [11], [24]. Vaikka Surviviinivasteita alunperin luokiteltu estäjä apoptoosin (BIR) se on nyt tunnustettu, että sen tärkeimmät molekyyli- toiminnot liittyvät kehräkokoonpano tarkistuspisteen ja sytokineesiin. Nykyään antiapoptoottinen toiminnot surviviinin ovat kyseenalaiseksi, koska useimmissa kokeissa joka esti Surviviinispesifisiä toiminta johti kehitystä mitoosi vikoja, jotka saattavat häiritä tarkan analyysin sen IAP toiminta [25], [26], [27], [28 ]. Eräässä aikaisemmassa tutkimuksessa ablaatio surviviinin kanan B-lymfosyyttien DT40 oli tappava puutteen vuoksi sekä CPC toimintoja ja ylimääräisiä muut soluproliferatiivisen kyvyt [29]. Kuitenkin nämä solut näytetään normaali herkkyys etoposidi-indusoitua apoptoosia verrattuna kontrollisoluihin.

Tutkimuksessamme osoitamme ensimmäistä kertaa, että pesuaine-liukoinen surviviinia estää anoikis in kiinnittymisestä riippuvaisten solujen, muodossa ohjelmoitu indusoimaa solukuolemaa tarttumisen menetyksestä ympäröivän soluväliaineen. Subsellulaarifraktiointikokeet esittänyt todisteita siitä, että pesuaine liukoinen Surviviinispesifisiä on solusooli vastuussa tukahduttamaan anoikis. Mekanismi anoikis tukahduttaminen käsittää aktivaation XIAP /lKB-α /NF-KB-signaloinnin ja inaktivoitumisen c-Jun. Toinen tärkeä havainto tässä tutkimuksessa on, että pesuaine-liukoinen surviviini korreloi invasiivisen fenotyypin paksusuolen syöpäsoluja. Siksi pesuaine liukeneva Surviviinispesifisiä saattaa olla kliinistä arvoa, koska se todennäköisesti ennakoi imusolmuke ja kaukaisia ​​etäpesäkkeitä peräsuolen syöpäpotilailla.

Tulokset

yli-ilmentyminen surviviinin suojaa soluja anoikis

Alustavissa tutkimuksissa pyrimme selvittämään, miten surviviinin yli-ilmentymisen p53-puutosta kiinalaisen hamsterin alkion diploidi fibroblasteja (CHE solut) ja isogeenisistä CHE -solut villityypin p53. Seurantaa transfektiota käytimme tehostettua vihreää fluoresoivaa proteiinia-tagged Surviviinispesifisiä (EGFP-surviviinin). Silti ektooppinen yliekspressio EGFP-surviviinin ei ollut vaikutusta apoptoosin CHE-p53 + /+ soluja käsiteltiin DNA vahingoittamatta ionisoivan säteilyn (IR) ja UV-C verrattuna CHE-p53 + /+ – EGFP-soluja (kuvio 1A), kuten mitattuna anneksiini V värjäys ja terminaalin deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) -välitteisen dUTP nick end merkinnät (TUNEL) määritys. Sitten käänsimme huomiota CHE solujen viallinen p53 status (CHE-p53 – /- solut). Silmiinpistävän, CHE-p53 – /- solut ektooppiseen yli-ilmentymisen EGFP-surviviinin tuotettu metastasoitunut keuhkokasvaimia kun ihonalaisesti immunologiseen hiirillä taas mitään keuhkoetäpesäkkeet havaittu jälkeen ksenografti CHE-p53 – /- solut, jotka ilmentävät EGFP (taulukko S1). Testaus apoptoosin sen jälkeen, kun IR tai UV-C osoitti, että CHE-p53 – /- solut oli merkittävästi suurempi osa apoptoosin-positiivisten solujen verrattuna CHE soluihin, joilla villityypin p53 [30], [31], [32] (kuvio 1A ). Tämä havainto on sopusoinnussa raportteja jyrsijän alkion fibroblasteista osoittaa, vähemmän alttius IR- ja UV-C kuin ne solut, joilta puuttuu toimiva p53, solusyklin Checkpoint ohjaus. Kiinnostavaa kyllä, myös ei löytänyt suojaava vaikutus yli-ilmentynyt surviviinia CHE-p53 – /- solut verrattuna CHE soluihin ektooppiseen ilmaus EGFP (kuvio 1A).

. Taajuus apoptoosin CHE soluissa (p53 + /+ ja p53 – /-) transfektoitu pEGFP tyhjä ja pEGFP-Surviviinispesifisiä hoidon jälkeen X-säteilytys (10 Gy) ja UV-C (10 J /m

2) . Transfektoidut solut altistettiin IR tai UV-C 24 h transfektion jälkeen. Transfektio taajuudet olivat 80-90%, ja EGFP-positiiviset solut laskettiin anneksiini V-positiivisia tai -negatiivisilla soluja (

yläpaneeli

) ja TUNEL määritys-positiivinen tai -negatiivinen soluja (

alempi paneeli

). X-säteilytetty CHE-p53 – /- solut oli merkittävästi suurempi osa apoptoosin-positiivisten solujen verrattuna X-säteilytetty CHE-p53 + /+ solut (

P

0,03 anneksiini V-värjäys ja

P

0,08 TUNEL-määritys), ja UV-C säteilytetään CHE-p53 – /- solut oli merkittävästi suurempi osa apoptoosin-positiivisten solujen verrattuna UV-C säteilytetyn CHE-p53 + /+ solut (

P

0,001 anneksiini V värjäystä ja

P

0,02 TUNEL määritystä). Apoptosis-positiivisia soluja ei merkittävästi vähentynyt pEGFP-Surviviinispesifiset transfektoiduissa soluissa verrattuna pEGFP-transfektoituja soluja kussakin tapauksessa (

P

0,4 anneksiini V-värjäys ja

P

0,4 TUNEL määritystä). Arvot osoittavat keinoja ± S.D. (N = 3). B. korottaminen kertyminen keuhkoihin suonensisäisen injektion jälkeen EGFP- tai EGFP-Surviviinispesifiset ilmentäviä soluja. Eloonjääneiden CHE-p53 – /- solujen keuhkojen oli merkittävästi lisääntynyt verrattuna Eloonjääneiden ohjaus soluja, jotka ilmentävät EGFP. Arvot osoittavat keinoja ± S.D. jossa oli kuusi hiirtä. * Merkittävä ero (

P

0,005). C. kaspaasi-3-aktivaation CHE-p53 – /- solut transfektoitu pEGFP tyhjä ja pEGFP-Surviviinispesifisiä jälkeen anoikis induktion. Transfektoidut solut irrotettiin soluväliaineen ja samanaikaisesti seerumin puutteessa aiheuttaa anoikis 24 h transfektion jälkeen. Solut suspendoitiin seerumittomaan väliaineessa 6-36 h, kerättiin ja lyysattiin Laemmlin SDS-näytepuskuriin immunoblot-analyysi anti-aktivoitu kaspaasi-3-vasta-aine. Transfektio taajuudet tarkistettiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa ja vahvistettu olevan 80-90%. D. kaspaasi-3-aktivaation CHE-p53 – /- solut transfektoitu pEGFP tyhjä ja pEGFP-Surviviinispesifisiä hoidon jälkeen UV-C (10 J /m

2). Transfektoidut solut altistettiin UV-C 24 h transfektion jälkeen. Soluja viljeltiin 24 tuntia, kerättiin, ja lyysattiin Laemmlin SDS-näytepuskuriin immunoblot-analyysi anti-aktivoitu kaspaasi-3-vasta-aine. Transfektio taajuudet tarkistettiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa ja vahvistettu olevan 80-90%.

Toistaiseksi transfektointi pEGFP-surviviinin ei estä säteilyn aiheuttamista apoptoosin CHE-soluissa riippumatta p53 asemasta ja ekspressiotasot surviviinin, mutta toisaalta vain CHE-p53 – /- solut yli-ilmentävät EGFP-surviviinin aiheuttanut etäpesäkkeitä hiirissä. Siksi arveltu, että surviviinin yli-ilmentyminen saattaa lisätä selviytymisen CHE-p53 – /- -EGFP-Surviviinispesifisiä solujen stressiolosuhteissa joka todennäköisesti enemmän muistuttaa

in vivo

fysiologiset olosuhteet levittää kasvainsolujen kuten kiinnittymisestä riippumaton tilanne ja ravinteiden nälkään.

Itse asiassa, käyttämällä

iv

kasvainsolujen injektion hiirillä olemme paljasti, että määrä elossa CHE-p53 – /- solujen keuhkojen oli merkittävästi lisääntynyt verrattuna määrän elossa ohjaus solut, jotka ekspressoivat EGFP (kuvio 1 B).

tutkia edelleen hypoteesia, testasimme onko yliekspressio EGFP-surviviinin siirrettävä vähensi anoikis-alttius, nimittäin resistenssiä seerumin starvation- ja suspension kulttuuri- aiheuttama apoptoosin, vuonna CHE soluissa. Kuten kuviossa 2A kävi ilmi, että yli-ilmentyminen EGFP-surviviinin merkittävästi tukahdutetaan anoikis verrattuna CHE-p53 – /- ohjaus soluja, mitattuna anneksiini V värjäys ja myös TUNEL määritys, CHE-p53 – /- solut . Muihin immunoblot-analyysi havaitsemiseksi käsiteltyjen executor kaspaasi-3 vahvisti, että yli-ilmentynyt EGFP-surviviinin suojattu anoikis (kuvio 1C), koska CHE-p53 – /- solujen ektooppinen ilmentyminen EGFP-surviviinin osoitti heikompaa lisääntyy asteittain jalostettuja kaspaasi-3: aikana havaittu ajan. Toisaalta, yliekspressio EGFP-surviviinin ei tukahduttaa kaspaasi-3-aktivaation in UV-C: n indusoiman apoptoosin (kuvio 1 D).

. Taajuus anoikis in CHE-p53 – /- solut transfektoitu pEGFP tyhjä ja pEGFP-surviviinin. Transfektoidut solut irrotettiin soluväliaineen ja samanaikaisesti seerumin puutteessa aiheuttaa anoikis 24 h transfektion jälkeen. Transfektio taajuudet olivat 80-90%, ja EGFP-positiiviset solut laskettiin anoikis-positiivinen tai -negatiivinen soluja. Yliekspressio EGFP-surviviinin suppressoi merkittävästi anoikis verrattuna CHE-p53 – /- kontrollisoluihin. Arvot osoittavat keinoja ± S.D. (N = 3). * Merkittävä ero (

P

0,08). ** Merkittävä ero (

P

0,04). B. kaspaasi-3-aktivaation EGFP- ja EGFP-Surviviinispesifiset ilmentävien solujen jälkeen seerumistarvaatio alle kiinnitetään tai irrotetaan viljelyolosuhteet. Koejärjestely kuvassa S1. Transfektio taajuudet tarkistettiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa ja vahvistettu olevan 80-90%. Soluja pidettiin seerumivapaassa väliaineessa 24-72 h, kerättiin ja lyysattiin Laemmlin SDS-näytepuskuriin immunoblot-analyysi anti-GFP, anti-surviviinia, anti-aktivoitu kaspaasi-3-vasta-aine, anti-LC3B, ja anti- -α-tubuliinia. C. Surviviinispesifiset aiheuttaman apoptoosin tukahduttaminen korko verrataan EGFP-ilmentäviä soluja ja EGFP-Surviviinispesifiset ilmentäviä soluja. Tasot aktivoitu kaspaasi-3-proteiinin arvioitiin immunoblot-analyysillä. Tukahduttaminen hinnat ilmaistiin suhteessa aktivoitujen kaspaasi-3-proteiinin tason EGFP-surviviinia ilmentäviä soluja tasoa EGFP-ilmentävissä soluissa. Arvot osoittavat keinoja ± S.D. (N = 3). * Merkittävä ero (

P

0,04). ** Merkittävä ero (

P

0,02). *** Merkittävä ero (

P

0,007). D. DNA pirstoutuminen analyysi EGFP ilmentävien solujen ja EGFP-Surviviinispesifiset ilmentäviä soluja. Transfektoidut solut irrotettiin soluväliaineen ja samanaikaisesti seerumin puutteessa aiheuttaa anoikis 24 h transfektion jälkeen. Solut suspendoitiin 24 h, ja kerättiin. Genominen DNA uutettiin ja elektroforeesilla agaroosigeeleillä. E. Edustavia kuvia EGFP-ilmentävien solujen ja EGFP-surviviinia ilmentäviä soluja käyttäen laser konfokaalimikroskopialla. Transfektoidut solut suspendoitiin seerumittomassa väliaineessa 24, ja kuvantaa Nomarski ero häiriöitä kontrasti (

kaista DIC

), jonka rodamiinifalloidiinia värjäytymistä (

kaista F-aktiini

), jonka EGFP fluoresenssi (

kaista EGFP

), ja DAPI-värjäyksellä (

kaista DAPI

). Rodamiinifalloidiinia värjäys ja DAPI värjäys tyypillisesti osoitti, että EGFP-ilmentävien solujen tehtiin anoikis, mutta EGFP-Surviviinispesifiset ilmentäviä soluja ei. F. Solujen elinkelpoisuuden WST-1 määrityksessä. Transfektoidut solut suspendoitiin seerumittomassa väliaineessa 24 tunnin ajan, ja sitten solujen elinkelpoisuus EGFP-ilmentävien solujen ja EGFP-surviviinia ilmentäviä soluja arvioitiin. Arvot osoittavat keinoja ± S.D. (N = 3). * Merkittävä ero (

P

0,04).

Seuraavaksi määritetään, suojaava vaikutus ilmentynyt EGFP-Surviviinispesifisiä on kaspaasi-3 aktivaatio oli anoikis erityisiä, käyttämällä anoikis määritys-protokolla (kaavamaisesti kuvassa S1). Immunoblot analyysit osoittivat, että estävä vaikutus oli voimakkaampi irrallaan kulttuurin kunnossa kuin liitteenä kulttuuri kunnossa (kuvio 2B). Huomionarvoista, autophagy, toinen tyyppi solukuoleman aiheuttama catabolic prosessin hajoamista solun komponenttien lysosomifuusio, ei ollut mukana vaikutusta (kuvio 2B,

IB: anti-LC3B

). Määrälliset tiedot osoittivat tehokasta tukahduttaminen suspensioviljelmässä aiheuttaman anoikis in EGFP-surviviinia ilmentäviä soluja verrattuna valvoa soluja, jotka ekspressoivat EGFP (kuvio 2C). Tämän mukaisesti havainnon, yli-ilmentyminen EGFP-surviviinin tukahdutetaan DNA pirstoutuminen (kuvio 2D ja E) ja säilytetään solujen elinkelpoisuuden (kuvio 2F) oli erillisissä viljelyolosuhdetta.

surviviinin yli-ilmentyminen säätelee apoptoosin liittyviin transkriptiotekijöitä

seuraava kysyttiin mikä signalointipolkujen voisivat olla mukana anoikis-tukahduttaminen in EGFP-Surviviinispesifiset ilmentävien CHE-p53 – /- solut. Surviviini on kuvattu estävän pro-apoptoottisten Bcl-2-liittyvät X-proteiinia (BAX) indusoidun apoptoosin [33]. Silti ekspressiotasot BAX ei muutettu induktion jälkeen anoikis in EGFP-Survivin- sekä EGFP ilmentävien CHE-p53 – /- solut (kuva 3,

Bax

). Sitten keskittynyt toisen mitokondrioiden johdettu aktivaattori kaspaasi /suora estäjä apoptoosin sitovan proteiinin, joilla on alhainen pl (smac /DIABLO), joka on osoitettu sitoutuvan Surviviinin [34], [35]. Kuitenkin Smac /DIABLO ollut mitattavia määriä irrottaa kulttuuri kunnossa (kuva 3,

Smac /DIABLO

). Toinen IAP perheenjäsen, X-sidottu estäjä apoptoosin proteiinia (XIAP) on raportoitu muodostavan heterodimeerejä Surviviinispesifisiä [36]. Jotkut tekijät osoittavat, että tämä heterodimeerin pystyy aktivoimaan anti-apoptoottisen NF-KB-signaloinnin kautta fosforylaation ja myöhempää hajoamista mole- estäjä kappa B-α (IKB-α) [37]. Mielenkiintoista, me havaitsivat ylössäätely IKB-α proteiini tasot irrallaan kulttuuri kunnon valvonta CHE-p53 – /- solut taas IKB-α ekspressiotasot pysyneet hyvin matalina EGFP-Surviviinispesifiset ilmentäviä soluja (kuvio 3,

XIAP, IKB-α, ja NF-KB

). Samanaikaisesti, augmentation fosforylaation pro-apoptoottisen transkriptiotekijä, c-Jun, vaimeni yliekspressio EGFP-surviviinia irrottaa viljelyolosuhteissa (kuvio 3,

JNK, c-Jun-P (S73), ja c-Jun

). Nämä tiedot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen EGFP-surviviinin vähentää IKB-α tasolla irrotettuja soluja ja myöhemmin johtaa aktivoinnin NF-KB ja samalla vaimennusta c-Jun-välitteisen transkription. Emme kuitenkaan ole löytänyt osuus fokaalisen adheesion kinaasin (FAK) ja anoikis suppression tässä solussa järjestelmässä vaikka FAK auto-fosforylaatiota sivuilla osoitteessa Y397 on raportoitu olevan tärkeä anti-apoptoottisen aktiivisuuden FAK [38], [39] .

Koejärjestely kuvassa S1. Transfektio taajuudet tarkistettiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa ja vahvistettu olevan 80-90%. Soluja pidettiin seerumivapaassa väliaineessa 24-72 h, kerättiin ja lyysattiin Laemmlin SDS-näytepuskuriin immunoblot-analyysi anti-β-aktiini, anti-Bax, anti-Smac /DIABLO, anti-XIAP, anti- IKB-α, anti-NF-KB: n, anti-JNK, anti-c-Jun-P (S73), anti-c-Jun, anti-FAK-P (Y397), ja anti-FAK.

CPC komponentteja kuten Surviviinispesifisiä on taipumus yhdistää kromatiinin kanssa ja siksi usein tumassa ja ovat enimmäkseen pesuainetta liukenemattomia. Kuitenkin muiden solunsisäisten allas surviviinin on kuvattu sytosoliin tai liittyy mitokondrioita [40], [41]. Se oli erityisen kiinnostuksen miten Surviviinispesifisiä kumppaniaan XIAP solussa. Silloin ruokalajin kokeissa kaspaasi-3 aktivaation todettiin 6 tunnin kuluttua anoikis induktion (kuvio 1 C). Vastaavasti solut hetkellä 0, 3, ja 6 h seuraava anoikis induktion käytettiin subsellulaarifraktiointikokeet väärinkäsitysten välttämiseksi, joita voi syntyä käyttämällä kuolleita soluja aiheuttama anoikis. Immunoblot-analyysit Seuraavat subsellulaarifraktiointikokeet paljasti, että XIAP oli enimmäkseen löydetty pesuaine-liukoinen osa sytosoliin (kuvio 4A,

IB: anti-XIAP

). Kuitenkin suurin osa EGFP-surviviinin havaittiin pesuaineen liukenematon pelletti fraktio, joka sisälsi kromatiinin, mutta havaittiin myös vähemmässä määrin pesuaineen liukoinen ydin- ja solulimafraktiot (kuvio 4A,

IB: anti-surviviinia ja IB : anti-EGFP

). Siten vuorovaikutus XIAP ja surviviinin ilmeisesti oli rajoitettu pesuaineen liukoinen osa sytosoliin. Todellakin löysimme stabiilin proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen XIAP ja surviviinin soveltamalla immunosaostuskokeissa käyttäen pesuaineen liukenevan sytoplasmista osa CHE-p53 – /- solujen ektooppinen ilmentyminen EGFP-surviviinin (kuvio 4B). Lisäksi, ei-merkitty Surviviini on vähemmän tehokkaasti fraktioitiin pesuaine-liukoinen solulimafraktio ja anoikis ja kaspaasi-3-aktivaation myös vähemmän tehokkaasti vaimentaa ei-merkittyä Surviviinispesifiset yliekspressoituu CHE-p53 – /- soluja. Toisaalta, joka on Discosoma punainen fluoresoiva proteiini-merkitty Surviviini (Surviviinispesifiset DsRed) on tehokkaammin fraktioitiin pesuaine-liukoinen solulimafraktio ja anoikis ja kaspaasi-3 myös tehokkaammin vaimentaa Surviviinispesifiset DsRed-yli-ilmentyy CHE-p53- /- solut (meidän julkaisematon data).

. Subsellulaarifraktiointikokeet ja immunoblot-analyysi aktivoitu kaspaasi-3, surviviinia, ja XIAP. Transfektio taajuudet tarkistettiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa ja vahvistettu olevan 80-90%. Soluja pidettiin seerumivapaassa väliaineessa 3-6 h, kerättiin ja lyysattiin. Solulysaatti fraktioitiin pesuaine-liukoinen sytoplasmista (

C

), ja ydin (

N

) jakeet ja pesuaine liukenematon pelletti (

P

) fraktion immunoblot-analyysi anti-aktivoitu kaspaasi-3, anti-surviviinia, anti-GFP, anti-XIAP, anti-α-tubuliinin, anti-H3-histoni, ja anti-β-aktiini. B. Proteiini-proteiini vuorovaikutukset EGFP-Survivn ja XIAP. Solulysaattia pesuaine-liukoinen solulimafraktio immunosaostettiin anti-XIAP vasta-aine ja anti-GFP-vasta sittemmin immunoblotattu anti-GFP-vasta (

alempi paneeli

) ja anti-XIAP vasta-ainetta (

yläpaneeli

), vastaavasti. EGFP-Surviviinivasteita ja XIAP annettiin samanaikaisesti imunoprecipitated ainoastaan ​​solulysaatissa muodossa EGFP-Surviviinispesifiset ilmentävien solujen (

kaista 2

).

pesuaine liukeneva Sytoplasmiset surviviini on mukana metastaattisen etenemisen paksu- ja peräsuolisyövän

Olemme vihdoin käsitteli kysymystä siitä, pesuaine liukeneva sytoplasman surviviinia on löydetty ihmisen syövän ja on jotenkin liittyy kehittämiseen etäpesäkkeitä. Analysoimme kahdeksan peräsuolen syövän solulinjat, HeLa kohdunkaula karsinooman solulinjassa, ja 8505C throid masolulinjassa solun fraktioinnin ja immunoblottauksella. Kontrollina me mukana normaali alkion diploidi fibroblasti (NHDF). Niistä peräsuolen syövän solulinjat, surviviinia havaittiin pesuaineen liukoinen fraktiot vaikka ekspressiotasot vaihtelivat huomattavasti (kuvio 5A). Sen jälkeen, anoikis-herkkyys tutkittiin kaikissa syöpäsolulinjoissa (kuvio 5B). Vaikka suuruus osuus surviviinin jotta anoikis resistenttejä fenotyypin peräsuolen syöpäsoluissa on määrittelemätön, on suora korrelaatio korkeampia ekspressiotasoja pesuaineen-liukeneva sytoplasman Surviviinispesifisiä ja anoikis vastus erityisesti HCT116 ja HT29 kanssa korkein ilmentymä pesuainetta liukoinen osa sytoplasmaan. Huomionarvoista, NHDF, LoVo ja SW480-solut, joissa pesuainetta liukeneva Surviviinispesifisiä ei ollut havaittavissa, osoittivat massiivisen solukuoleman induktion jälkeen anoikis.

. Subsellulaariset ja immunoblottausanalyysillä surviviinin. Solulysaatista eksponentiaalisesti kasvavat solut fraktioitiin pesuaine liukeneva sytoplasman (

C

), ja ydinvoiman (

N

) murtolukuja ja pesuaine liukenematon pelletti (

P

) fraktion immunoblot-analyysi anti-surviviinia, anti-α-tubuliinin, anti-H3-histoni, ja anti-β-aktiini. Pesuaine liukeneva sytoplasman Surviviinispesifisiä taso arvioitiin immunoblot-analyysillä, ja ilmaistaan ​​prosentteina tason 8505C, joka on erilaistumaton kilpirauhaskarsinoomaa osoittaa anoikis vastus (+++, 80%, ++, 40-80%; +, 10-40%, -, 10%). B. Anoikis alttius peräsuolen syöpäsoluja. Solut suspendoitiin seerumittomassa elatusaineessa 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin WST-1-määritystä.

Mikä biologista käyttäytymistä peräsuolen syöpään liittyvät pesuaine liukeneva sytoplasman Surviviinispesifisiä on tärkeää diagnostiset ja terapeuttiset saatavuutta. Edellisessä immunohistokemiallinen analyysit kolorektaalisyövän kudosten puuttuminen ydin- surviviinin ja olemassaolon sytoplasmisen surviviinin on havaittu olevan merkittävä ennustavia kuolleisuus peräsuolen syöpäpotilailla [42]. Silti analyysi immunohistokemiallinen lokalisointi ja subsellulaarifraktiointikokeet havaitseminen ei ole sama. Viisi näytettä normaalista ja vastaavan ensisijaisen syöpäkudoksiin samasta potilaista tutkittiin subsellulaarifraktiointikokeet, mutta riippumatta tasot surviviinin yli-ilmentyminen, tapauksissa positiivinen havaitsemiseksi pesuaineen vesiliukoisen sytoplasminen surviviinin olivat potilaita, joilla imusolmuke ja muut etäiset etäpesäkkeitä. Täällä, muut neljäkymmentä tapausta tutkittiin. Ääriviivat ilmaisuun perustuvaa menetelmää kuvassa S2. Kuvio 6 esittää tyypilliset tulokset kahdelta potilaalta tai ilman pesuainetta liukeneva sytoplasman surviviinia ensisijainen syöpäkudokset (tapaus A on potilaaseen etäpesäke ja tapaus B on potilas, jolla etäpesäke). Kliinis merkitys pesuaine-liukoinen sytoplasmista Surviviinispesifisiä ilmentyminen määritettiin neljäkymmentä tapauksissa. Positiiviset tapaukset lisääntyivät merkitsevästi kasvaimen koon ( 0,005), ensisijainen peräsuolen syövän kanssa imusolmuke etäpesäke ( 0,001), ja ensisijainen peräsuolen syövän etäpesäkkeiden ( 0,01), verrattuna negatiiviseen tapauksissa (taulukko 1) .

oultline menetelmän on kuviossa S6. Normaali ja syöpäkudokset ihmisen peräsuolen syöpäpotilaiden ilman etäpesäkkeitä (

Tapaus A

) tai etäpesäkkeitä (

Case B

) hajotettiin. Solulysaatti fraktioitiin pesuaine-liukoinen sytoplasmista (

C

), ja ydin (

N

) jakeet ja pesuaine liukenematon pelletti (

P

) fraktion immunoblot-analyysi anti-surviviinia, anti-α-tubuliinin, anti-H3-histoni, ja anti-β-aktiini.

keskustelu

Nykyään on yksimielisesti hyväksyttyä, että Surviviinivasteita on olennainen osa CPC säännellä chromomal eriytymistä ja sytokineesiin [2], vaikka tarkkaa roolit surviviinin mitoosin eivät ole vielä täysin ymmärretty. Solut, joilla on heikentynyt toiminta surviviinin tai jonkin sen kumppaneiden ansiosta RNAi estoa tai ilmaus määräävän-negatiivisten mutanttien osoitti vertailukelpoisia fenotyypit (ts häiriintynyt kromosomien segregaatiota ja vialliset sytokineesiin) [25], [26], [28] , [43], [44], [45]. Lisäksi fenotyypit surviviinin knock-out mutantteja hiivojen [46], [47] ja

C. elegans

[48], [49] vahvistettiin rooli surviviinin kuin CPP. Selkärankaisilla, keskeistä roolia surviviinin aikana mitoosin on osoitettu

Xenopus laevis

[3] ja hiiret [50]. Toisaalta eri tutkimukset paljastivat, anti-apoptoottisen funktion surviviinin eri lajien ja solulinjat. Anti-apoptoottisia vaikutuksia surviviinin ja surviviinin kaltainen proteiini Deterin raportoitu hiivassa [51] ja

D. melanogaster

[52], tässä järjestyksessä. Silti, surviviinin yli-ilmentyminen voi toimia anti-apoptoottisen tekijän jopa ei-selkärankaisten tietyissä olosuhteissa, mutta näyttää siltä, ​​ajateltavissa, että surviviinin-knockout fenotyypit, jotka tulkittiin menetys anti-apoptoottisen funktion voitaisiin liittyy ensisijaisesti vapautettu mitoottisia prosesseja .

viljelty solu järjestelmiä, lisääntynyt apoptoottinen alttius, joka ilmestyi spontaanisti tai apoptoottisia aineita, Siirretään loss of-toiminto tai knock-down surviviinin. Surviviiniperäistä knock-out in T-solulinjan aiheuttama p53-riippuvaista fenotyyppejä, jolloin tymosyyttien kehitys- vika [53]. Tämä fenotyyppi ei voida pelastaa inaktivaation p53, viittaa siihen, että surviviini on todennäköisesti anti-apoptoottisen tekijän, riippumatta p53 status. Normaalissa ihmisen fibroblasteissa, surviviini knock-down myös aiheuttama p53 induktio, joka laukaisi solukierron pysähtymisen ilman välitöntä apoptoosin [54]. Tämä fenotyyppi pelastettiin inaktivaation p53, viittaa siihen, että Surviviinispesifisiä todennäköisesti työskentelemään kautta p53 alle kiinnittyvä kulttuuri kunnossa. Nämä erilaiset tulokset peittämättä tiedot ymmärtämiseksi Surviviinispesifiset aiheuttamaa suojaa apoptoosin. Eri solutyyppejä, kiinnittyneet solut ja tarttumattomat solut, ovat erilaiset p53-indusoidun fenotyyppejä. Tarttumattomat solut, joilla on normaali p53 altistaa solun stressistä johtuvaa välittömästi apoptoosin [55], niin kutsutut interphase solukuolemaa verrattuna kiinnittyneet solut, kun taas tarttuvien solujen kanssa p53 ensisijaisesti pidättämään solusyklin [56], [57]. Surviviiniperäistä knock-out indusoi p53 sekä pysyvä ja tarttumattomat solut siten ekspressoivat fenotyyppejä kullekin soluista. Meidän hypoteesi, joka tukee Tutkimuksemme, surviviini on edullisesti inhiboimaan anoikis soluissa suoritettiin kiinnittymisestä riippuvaisia ​​selviytymisen ja kasvun riippumatta p53 status.

Kun altistetaan DNA vaurioittavan aineen etoposidi, surviviinia tippuu ulos DT40 solut osoittivat normaali herkkyys tälle aineelle [29]. Tiedot ehdotti, että Surviviinispesifisiä ei ole universaali estäjä DNA-vaurioittava aine indusoiman apoptoosin. Täällä havaittiin normaali herkkyys IR- ja UV-C Surviviinispesifiset yliekspressoivia CHE-p53 – /- solut. Mielestämme Surviviinispesifisiä olisi tärkeitä rooleja anoikis vaimennus syövän kehitykseen (katso jäljempänä).

Aiempien raporttien, osoitamme tässä, että Surviviinispesifisiä säätelee kaspaasi-3: n aktiivisuuden. On raportoitu, että surviviinin estää kaspaasi-3-aktivaation fysiologisissa tilanteissa apoptoosin aikana, mutta tämä vaikutus ei todennäköisesti johtuu suoraan inhibitio kaspaasi-3: [58], [59], [60]. Näin ollen tarkka anti-apoptoottisen mekanismi surviviinin on edelleen haaste. Kaksi mekanismeja on ehdotettu selittämään eston mitokondrioiden-säänneltyjen apoptoosin seurauksena kaspaasi-3 aktivaation. Eniten tutkittu molekyyli tähän on pro-apoptoottista proteiinia Smac /DIABLO, johon Surviviinin sitoutuu suoraan [34]. Smac /DIABLO välittämä vuorovaikutus Surviviinispesifisiä tukahduttaa anoikis näyttää epätodennäköiseltä, koska meidän kokeellisen ympäristössä vain vähän tai ei ilmentymistä smac /DIABLO aikana anoikis Che-solujen havaittiin (kuva 3). Toinen mekanismi, miten Surviviinispesifisiä täyttää IAP funktio on suora sitoutuminen XIAP [36].