Krooninen sairaus

tiivistelmä

p53 ja kalsiumin signalointi ovat toisistaan ​​riippuvaisia ​​ja tiedetään näyttää sekä synergistisiä ja antagonistisia vaikutuksia toisiinsa solun ympäristössä. Ei kuitenkaan molekyylimekanismin tai solun reitin tunnetaan joka osoittaa suoraa sääntelyä näiden tärkeisiin solun signalointi molekyylejä. Tässä olemme osoittaneet, että syöpäsoluissa käsitelty antineoplastisten huumeiden GAQ

3, p53, on kasvu solunsisäisen kalsiumin tasoa transkription säätely uusi kalsiumkanavan geenin TRPC6. p53 sitoutuu suoraan 22 bp vaste-elementtiin TRPC6-geenin promoottorin ja lisätä sen mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen. Yli-ilmentyminen TRPC6 johtaa kalsiumista riippuvaisen apoptoottisen kuoleman ja aktivointi apoptoottisten geenien erilaisia ​​syöpäsoluja. Tämä tutkimustyö osoittaa, että p53: n ja sen transkriptionaalinen aktiivisuus on kriittinen säätelemällä kalsiumia signaloinnin ja kasvu solunsisäisen kalsiumin tasoa voi olla yksi syövän strategioita apoptoosin syöpäsoluissa.

Citation: Madan E, Gogna R, Keppler B, Pati U (2013) p53 Lisäykset sisäiset Cellular Kalsium vapautuminen transkription säätelyyn kalsiumkanavan TRPC6 in GAQ

3-Treated syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (8): e71016. doi: 10,1371 /journal.pone.0071016

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 30 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 16 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Madan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Swiss Syöpä League, Josheph Steiner avustusten myöntämistä ja Intian neuvoston Mecical Research (ICMR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

gallium ja sen orgaaniset johdannaiset ovat osoittaneet korkea johdonmukaisuuden ja tehokkuuden kuin syöpälääkkeet [1] – [5]. Olemme hiljattain perustettu uusi orgaaninen johdannainen gallium ”GAQ

3″ [tris (8-kinolinolaatto) gallium (III)] (KP46) tehokkaana syöpälääke syöpäsoluissa kanssa Wt-p53 tai Mt-p53 proteiini [6]. Havaitsimme, että GAQ

3 indusoi kalsiumin signalointi syöpäsoluissa lisäämällä solunsisäisen kalsiumin tasoa. Kasvu solu Ca

2 + aktivoi p53-proteiinin ja lisää p53 solun tasolla. GAQ

3-indusoidun solunsisäisen kalsiumin vapautuminen oli huomattavasti korkeampi syöpäsolujen villityypin p53 kuin syöpäsolut mutantti p53 tai p53-geenin deleetio [6]. Mielenkiintoista, havaittiin, että nousu solunsisäisen Ca

2 + julkaisu oli p53-riippuvainen ja estämällä p53 transkriptionaalisen aktiivisuuden avulla pifithrin-α poisti solunsisäistä Ca

2+ julkaisu. Tämä havainto viittasi siihen, että p53 voisi kopiointia säädellä solunsisäistä Ca

2+ vapautumista ja Ca

2 + signalointi GAQ

3-käsiteltyjen syöpäsolujen. p53 ja kalsium tiedetään toimivan synergiassa, mutta ei ole suoraa kytköstä välille on luotu p53 aktivaation ja p53-riippuvaista säätelemällä kalsiumia signalointi solutasolla, biokemiallisten tai molekyylitasolla. Tietyissä raportoi Ca

2 + indusoimaa signaaleja, kuten Ca

2 + aktivoitujen RAF /MEK /ERK teille, joita välittävät p53-riippumattoman apoptoosin [7]. On myös ennustettu, että p53 toimii läheisessä suhteessa solun kalsiumin signalointi, koska solunsisäinen kalsiumin vapautuminen on tärkeä rooli indusoinnissa Bcl-2, ROS ja mitokondrioiden koulutusjakson apoptoosin [8]. Ei kuitenkaan molekyyli- mekanismin tai reitin p53-medited sääntely solunsisäisen kalsiumin vapautumisen tiedetään.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että solun kalsiumin signalointi ja solunsisäisen kalsiumin vapautuminen ovat transkriptionaalisen säätelyn alaisena p53-proteiinin. p53 kopiointia säätelee uudenlainen kalsiumkanavan TRPC6 suoraan sitoutumalla 22 emäsparin p53-RE hetkellä 400 emäsparia ylävirtaan +1 transkription aloituspaikan (TSS) on TRPC6 promoottori. Havaitsimme, että GAQ

3 indusoi apoptoosin kautta p53-riippuvaista säätelyä TRPC6 geenin syöpäsoluissa kanssa Wt p53. Yli-ilmentyminen TRPC6 johtaa merkittäviin apoptoosin syöpäsoluissa. Lisäksi TRPC6 ilmaisu käynnistää kalsiumista riippuvaisen säätelyn liittyvien geenien ekspressiota apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

MCF-7, U2OS, HCT A -431, PC3 ja H1299-solut hankittiin National Center for Cell Science, Pune (Intia) ja ylläpidettiin DMEM. Soluja viljeltiin yksikerrosviljelminä DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia ja antibiootteja, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2 Kaikki transfektiot suoritettiin käyttäen EFFECTENEä transfektioreagenssia (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sillä aikaa kurssin analyysi 5 petrimaljoille kunakin ajankohtana käytettiin.

Plasmidit ja reagenssit

p53-TRPC6 täyspitkä promoottori, p53-TRPC6 minimaalisen promoottorin ja p53-TRPC6 mutantti minimaalisen promoottorin ovat kloonattiin pGL3 sivektorissa. p53 si-RNA käytettiin myös aiemmin kuvanneet [9] – [11].

määritys Ca

2 + mobilisointi

Ca

2+ mitattiin käyttämällä solun läpäisevä Ca

2 + herkkä fluoresoivalla Fluo- 3 asetoksimetyyliesteriä. Milloin on osoitettu, BAPTA asetoksimetyyliesteri (10 uM) lisättiin elatusaineeseen solujen 10-cm muovi kudosviljelylevyissä 1-h altistuksen ennen lastauksen menettelyn Fluo-3 asetoksimetyyliesteri. Elatusaine poistettiin kudosviljelylevyihin ja korvattiin 4 uM Fluo-3 asetoksimetyyliesteri laimennettiin Krebs-Ringer-puskuriin (KRB) (10 mM D-glukoosia, 120 mM NaCl, 4,5 mM KCI, 0,7 mM Na2HPO4, 1,5 mM NaH2PO4 ja 0,5 mM MgCl2: a (pH 7,4 37 ° C: ssa)) (Sigma) 20 minuutin ajan. Astiat pestiin kerran 5 ml: lla KRB poistaa jäljellä väriainetta. Solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin 5 ml: aan Ca

2 + PBS: llä 37 ° C: ssa, pelletoitiin sentrifugoimalla, suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan Ca

2 + PBS: llä 37 ° C: ssa, ja analysoidaan välittömästi Fluo-3 fluoresenssin voimakkuus virtaussytometrialla.

katso tiedosto S1 täydellinen kuvaus aineisto ja menetelmät.

tulokset

GAQ

3 indusoi TRPC6 geenien ilmentyminen syöpäsoluissa villityypin p53

Olimme aiemmin havaittu, että GAQ

3 indusoi korkean solunsisäisen kalsiumin vapautumista valikoivasti syöpäsoluissa villityypin p53-proteiini [6]. Vaiennettu p53-geenin avulla p53 siRNA ja estämällä p53 transkriptionaalisen aktiivisuuden avulla pifithrin-α sekä poisti GAQ

3 aiheuttama nousu solunsisäisessä kalsiumin vapautuminen [6]. Tämä tiedot osoittivat, että solunsisäistä nousu kalsiumpitoisuuksia syöpäsoluissa säädeltiin p53 ja oli riippuvainen p53 transkriptioaktiivisuuden. Kuitenkin mekanismi säätelyyn osallistuvan tämän havaittua ilmiötä ei tunneta [6]. Koska GAQ

3 aiheuttama lisääntynyt merkittävästi kalsiumin sisäänoton käyttäen qPCR olemme analysoineet ilmentymisen suuri määrä tunnettuja kalsiumkanavien GAQ

3-käsitellyn MCF-7-soluissa. Havaitsimme merkittävän suuri ilmentyminen TRPC6 geenin GAQ

3 käsiteltyjä soluja. Koska ilmaus TRPC6 kalsiuminestäjien oli korkea, kysyimme TRPC6 saattaa liittyä kasvu solun kalsiumin tasot GAQ

3-käsiteltyjen syöpäsolujen. Ilmaus TRPC6 mRNA: ta ja proteiinia havaittiin GAQ

3-käsitellyn MCF-7, H1299 ja PC3-solut (kuvio 1 A). QPCR-analyysi osoittaa, että TRPC6 mRNA oli merkittävästi lisääntynyt GAQ

3-käsitellyn MCF-7 (p53 Wt) soluja (kuvio 1A). Lisäys p53 mRNA-tasolla ei havaittu H1299 (p53 null) ja PC3 (p53 mut) soluja (Bars 3-6; kuvio 1A). Samoin p53-proteiinin taso analysoitiin edellä mainitussa syöpäsoluja ja vain MCF-7 osoittivat merkittävää lisääntymistä p53-proteiinin tasoa, kun GAQ

3 hoitoa (kuvio 1A). Tämä tiedot osoittivat, että p53 pelataan tärkeä rooli GAQ

3-välitteistä säätelyä TRPC6. Lisäksi suhde p53 ilmentymistä ja TRPC6 ilmentymistä havaitaan. Aika-kurssi analyysi TRPC6 mRNA-tasolla (reaaliaikainen PCR) in GAQ

3-käsitellyn MCF-7, H1299 ja PC3-solut osoittavat TRPC6 mRNA oli merkittävästi suuri p53 (+ /+) MCF-7-solut ( Kuva 1B, musta viiva). Time-kurssi analyysi osoittaa, että GAQ

3 indusoi ilmaus TRPC6 kuluessa 6 tuntia sen inkuboinnin ja TRPC6 ilmaisun kasvaa 6

th 24

th hr vastaavassa rakenteessa, jossa p53 ilmentymistä kasvu GAQ

3-käsitellyistä soluista [6] Tuomari ei nyt sijoitettu. Nämä tiedot viittaavat siihen, että p53 ja TRPC6 osoittaa ajallisesti yhteydessä niiden mRNA: n ilmentymisen profilointiin. Suora rooli p53 ilmentymisen TRPC6 in GAQ

3-käsitellyn MCF-7-solujen havaitaan hiljentäminen p53-geenin GAQ

3-käsitellyn MCF-7-soluissa (kuvio 1C). Tulokset osoittavat, että TRPC6 proteiinin ilmentyminen oli huomattavasti korkealla, kun GAQ

3 käsittelyä (kaista 2); mutta tämä GAQ

3 aiheuttama nousu TRPC6 oli täysin päinvastainen, kun p53 hiljentäminen (kaista 3). Nämä tiedot viittaavat siihen, että p53 on tärkeä rooli säätelyssä TRPC6 geenin. Olemme edelleen analysoineet tehokkuuden TRPC6 siRNA ja TRPC6 cDNA (2 uM) MCF-7-soluissa.

) vaikutus GAQ

3 yhteydessä ilmaus TRPC6 mRNA p53 (+ /+) MCF-7, p53 (- /-) H1299 ja p53 (mt /mt) PC3-soluja, havaitaan käyttäen qPCR. Tulokset osoittavat, että GAQ

3 voivat aiheuttaa säätely ylöspäin TRPC6 vain MCF-7-solujen Wt p53 (kaista 2). Samoin GAQ

3 voi indusoida TRPC6 proteiinin ainoastaan ​​MCF-7-soluissa (n = 5). B) Reaaliaikainen PCR osoittaa ajallinen analysointi TRPC6 mRNA: n ekspression GaQ3 saaneilla MCF-7 (musta viiva), H1299 (vihreä viiva) ja PC3 (punainen viiva) soluja. Tulokset osoittavat, että TRPC6 mRNA ylössäädellään vain MCF-7-solujen eikä H1299 ja PC3-soluissa. Edelleen, nousu TRPC6 mRNA on havaittu 6

th h GaQ3 inkuboinnin. Nousu TRPC6 mRNA ajallisesti sidoksissa nousu p53 mRNA GaQ3 saaneilla MCF-7-solut (* (punainen) edustaa merkittävää eroa tulosten välillä punaisen, vihreän ja mustan linjan 9

th hr aikapisteen , p 0,028), n = 5, Anova, virhepylväät edustavat SD). C) rooli p53 GAQ

3 aiheuttama säätelyä TRPC6 havaitaan. p53-geenin hiljentäminen käyttäen p53 siRNA GAQ

3-käsitellyistä soluista kääntää kasvu TRPC6 proteiinin taso (kaista 3) (* (punainen) edustaa merkittävää eroa tulosten välillä kaista 1 2, p 0,036 ja kaista 2 3, p 0,042). Tehokkuus TRPC6 siRNA ja TRPC6 cDNA esitetään kaista 4 ja 5.

p53 kopiointia aktivoi TRPC6 promoottori

TRPC6 (kromosomissa 11q22.1, käänteisjuoste) ja p53 osoitti ajallinen suhteet niiden ilmaisun profiili GAQ

3-käsiteltyjen syöpäsolujen, siksi se oli kiinnostavaa määrittää rooli p53 säätelyssä TRPC6. TRPC6 promoottorialue tunnistettiin 650 emäsparin DNA-sekvenssin ylävirtaan +1 transkription aloituskohdasta, matrix tulitikut määräytyy Mat tarkastaja (Genomatix). TRPC6 promoottori edellyttäen locus ID GXP_193240 jonka Mat tarkastaja. Tämä alue sijaitsee alueiden välillä 101,374,672-101,375,321 (TSS viite pistettä edustaa Mat tarkastaja on 101374772) ja edustaa ENST00000527240 ja AK027769. Bioinformatiikan analyysi TRPC6 promoottorin avulla Mat tarkastaja moduuli Genomatix tietokannan osoittivat oletetun p53 DNA sitoutumiskohdan (matriisi sim; pisteet 0,9) (kuvio 2A), viittaa siihen, että p53 voisi olla potentiaalinen TRPC6 säädin. Tämän selvittämiseksi, me kloonattu 0,65 kb otaksuttu TRPC6 promoottori kuljettaa p53-vaste-elementin (p53RE) osaksi pGL3 perus vektori tuottaa pTRPC6p-luc1. PTRPC6p-luc1 transfektoitiin käsittelemättömän ja GAQ

3-käsitellyn MCF-7, H1299 ja PC3-soluissa. GAQ

3 indusoi 5-kertainen TRPC6 promoottorin aktiivisuuden MCF-7-soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio 2B, tangon 2 ja 3). Kasvu TRPC6 promoottorin aktiivisuus oli p53-riippuvaista, koska p53-geenien käyttäen p53 siRNA päinvastaiseksi GAQ

3-indusoitu kasvu TRPC6 promoottorin aktiivisuutta. GAQ

3 hoitoa ei kyennyt indusoimaan TRPC6 promoottorin aktiivisuutta H1299 ja PC3-solut (bar 5, 6, 8 9). TRPC6 promoottori aktivoitiin GAQ

3-käsiteltyjen H1299-solut, jotka transfektoitiin p53-cDNA (bar 7). Nämä tiedot osoittivat, että TRPC6 säädeltiin p53 GAQ

3 käsiteltyjä soluja. Edelleen vahvistaa roolia p53RE p53-välitteinen säätely TRPC6 promoottorin, alueen välillä emäsparien -74–99 (viitaten TSS seq (101374772) ja TRPC6 promoottorin kuljettaa p53RE kloonattiin pGL3-vektorin tuottaa minimaalinen pTRPC6p-luc2. Tämä TRPC6 minimaalinen promoottori indusoituu GaQ3-hoidon MCF-7-solut ja p53 hiljentäminen lakkautetaan kasvun perusteella promoottorin aktiivisuutta (kuvio 2C, bar 2-4). jotta voitaisiin määrittää roolia hiljattain tunnistettu p53RE p53-välitteinen säätely TRPC6 geenin p53RE sekvenssi mutatoitunut ja kloonattiin PGL3 vektori tuottaa mutantti minimaalinen mmpTRPC63p-luc2. transfektio mmpTRPC63p-luc2 in GAQ

3-käsitellyn MCF-7, PC3 ja H1299-solut eivät osoittaneet lisäystä TRPC6 promoottorin aktiivisuutta (kuvio 2D). Nämä tiedot vahvistetaan, että p53 transkriptionaalisesti säätelee TRPC6 in GAQ

3-käsiteltyjen syöpäsolujen.

A) otaksuttu p53 sitoutumiskohta on havaittu TRPC6 promoottori käyttäen Genomatix, Matlnspector moduuli. TRPC6-p53RE välissä -422–400 emäsparin on 0,6 kb TRPC6 promoottori. DNA seuraavien artiklojen TRPC6 promoottorin yhdessä sijainnin p53 RE (näkyy punaisena) on kaavamaisesti. B) pTRPC6p-luc1 (TRPC6 0,6 kb promoottorilusiferaasivektorissa konstrukti) transfektoidaan GAQ

3-käsitellyn MCF-7-soluissa ja vaikutus p53 mitataan lusiferaasiaktiivisuus. GAQ

3-indusoitua p53-geenin aktivaatio indusoi 8-kertainen pTRPC6p-luc1 lusiferaasiaktiivisuutta (pylväs 3). p53-geenin hiljentäminen käyttäen p53 siRNA kumoaa tämän vaikutuksen ja TRPC6 promoottoriaktivoinnilla lakkautetaan (bar 4). Transfektio pTRPC6p-luc1 in H1299 ja PC3-solujen läsnä ollessa tai ilman GAQ

3 ei ole vaikutusta aktiivisuuteen TRPC6 promoottori. Kun eksogeeninen Wt p53-cDNA: n GAQ

3-käsiteltyjen H1299-soluissa TRPC6 promoottori osoittaa 9-kertainen lusiferaasiaktiivisuus (bar 7). Nämä tiedot osoittavat, että p53 säätelee TRPC6 promoottori kopiointia. (C) pTRPC63p-luc2 The TRPC6-p53RE (-422–400) kloonattiin sivektorissa transfektoidaan GAQ

3-käsitellyn MCF-7-soluissa. Tulokset osoittavat, että p53 indusoi 6-kertainen kasvu TRPC6-p53RE lusiferaasiaktiivisuutta (pylväs 3). p53-geenin hiljentäminen käyttäen p53 siRNA poistetaan lisääntyminen lusiferaasiaktiivisuudessa (bar 4). Lisääntyminen TRPC6 promoottori aktiivisuus puuttuu H1299 ja PC3-soluissa. Tiedot osoittavat, että p53 säätelee TRPC6 promoottorin kautta TRPC6-p53RE. (D) mmpTRPC6p-luc2 -rakenne mutatoitunut sekvenssi TRPC6-p53RE transfektoidaan GAQ

3-käsitellyn MCF-7-soluissa. Lisääntymistä ei lusiferaasiaktiivisuutta havaitaan, osoittaa spesifisyyttä TRPC6-p53RE. Kuviota 2b-2d, (* (punainen) edustaa merkittävää eroa tulokset kaikkien arvojen p 0,05), n = 7, Anova, virhepylväät edustavat SD).

WT p53 sitoutuu suoraan vastineensa elementti on TRPC6 promoottori

sitoutuminen p53 klo 22 emäsparin alue on TRPC6 promoottori analysoitiin alle

in vitro

olosuhteissa käyttäen EMSA (kuvio 3A). Tiedot osoittivat sitoutuminen p53 on TRPC6-p53-RE-sekvenssin selvää siirtymistä ja super-shift-kompleksin havaittiin (kaista 2). Sitova välillä p53 ja sen elementin katosi kun lämpöä denaturointi p53-proteiini (kaista 3). Sitova välillä p53 ja sen elementin oli hyvin erityinen, koska mutaatio 22 emäsparin p53 RE järjestyksessä poisti välinen sitoutuminen p53 ja sen RE (kaista 5-8). Sitova välillä p53 ja sen vaste-elementti on p21 5 ’promoottorin elementti toimii positiivisena kontrollina (kaista 9-12). Määritellä tarkemmin rooli TRPC6-p53RE p53-välitteisen TRPC6 induktio kohdassa

in-vivo

olosuhteissa, teimme kromatiinin immunosaostuksella (ChIP) määrityksissä GAQ

3-käsitellyn MCF-7-soluissa. Yhdenmukainen lusiferaasin tuloksia, havaitsimme yksi erityinen PCR-tuote on peräisin TRPC6-p53RE (kuvio 3B, yläpaneeli). Input toimii kontrollina, puuttuessa GAQ

3 hoitoa p53 ei osoittanut sitoutumalla p53RE klo TRPC6 promoottori. Kun hoito MCF-7-solujen GAQ

3, p53 osoittaa sitoutumisen RE klo TRPC6 promoottori, PCR salattu alukkeilla toimii negatiivisena kontrollina. Toisaalta ei ole sitovaa välillä p53 ja p53RE on TRPC6 promoottori on havaittu H1299 ja PC3-soluja (kuvio 3B, alempi paneeli). Nämä tulokset osoittivat, että TRPC6-p53RE vastasi p53-välitteisen induktion TRPC6 promoottorin aktiivisuutta ja että p53 kopiointia indusoi TRPC6 kautta promoottori sitoo GAQ

3 käsiteltyjä soluja. Koska GAQ

3 indusoi räjähdysmäinen kasvu solunsisäisen kalsiumin vapautumista syöpäsolut Wt p53 ja p53 on nyt osoitettu transkriptionaalisesti säädellä kalsiumkanavan TRPC6 että GAQ

3-käsitellyistä soluista, rooli TRPC6 vuonna p53-välitteinen kalsiumin vapautuminen havaitaan. Flow-sytometrinen analyysi solunsisäisen kalsiumin vapautuminen osoittaa GAQ

3 hoitoa indusoi räjähdysmäisen kasvun vapautumisen solunsisäisen kalsiumin klo 8

th hr sen inkuboinnin (kuvio 3D, punainen viiva), kun vaientaminen TRPC6 geeni käyttämällä TRPC6 siRNA havaitsimme, että 8 tunnin räjähdysmäinen kasvu solunsisäisen kalsiumin tasoa purettiin ja kasvu kalsiumpitoisuus tuli lineaarinen kuten aiemmin havaittu p53 null (H1299) ja p53-mutantin (PC3) soluja. Tämä data osoittaa, että GAQ

3-indusoidun ja p53-välitteisen nousu solunsisäisen kalsiumin vapautuminen johtuu p53-riippuvaisen transkription säätely ylöspäin TRPC6 proteiinia käsitellyssä syöpäsoluja.

A) EMSA johdetaan tutkia välisen sitoutumisen p53 ja sen vaste-elementti on TRPC6 promoottori alle

in vitro

olosuhteissa. Siirtyminen ja super-shift p53, p53AB ja p53-RE havaitaan kaistalla 2. välistä sitoutumista p53 ja sen RE katoaa jälkeen mutantti p53 RE merkkiyhdistelmä tarkoittaa EMSA, joka osoittaa korkea spesifisyys tämän vuorovaikutuksen ( kaista 6), Sidonta välillä p53 ja sen tunnetun p215’RE käytetään kontrollina (kaista 9-12). (B) Kromatiini immunosaostuksella suoritetaan GAQ

3-käsitellyn MCF-7-solujen vahvista

in vivo

sitoutumisen p53 p53RE klo TRPC6 promoottori. p53 näyttää positiiviset TRPC6-p53RE sitova yksinomaan GAQ

3 käsiteltyjä soluja. Input toimii positiivisena kontrollina, ja salattu alukkeet PCR käytettiin negatiivisena kontrollina (n = 5). (C) välinen sitoutuminen TRPC6 ja p53 RE ei havaita H1299 ja PC3-soluissa jopa läsnäollessa GAQ

3 (n = 5). (D) ajan funktiona analyysi solunsisäisen kalsiumin vapautumisen havaitaan GAQ

3-käsitellyn MCF-7-solut (punainen viiva) ja GAQ

3-käsitellyn MCF-7-soluihin, joissa TRPC6 geeni vaimennettu käyttämällä TRPC6 siRNA ( musta viiva). Tulokset osoittavat, että GAQ

3 indusoi jyrkkä kasvu solunsisäisen kalsiumin vapautumista p53 (+ /+) MCF-7-soluihin 6

th hr sen inkuboinnin. Äänenvaimennusjärjestelmä on TRPC6 lakkauttaa tämän 6

th hr kasvu solunsisäisen kalsiumin vapautuminen (* (punainen) edustaa merkittävää eroa tulosten välillä punainen ja musta viiva klo 8

nnen tunnin aikapisteessä, p 0,029) , n = 5, Anova, virhepylväät edustavat SD).

TRPC6 indusoi kalsiumista riippuvaisen apoptoosin syöpäsoluissa

edelleen analysoineet fysiologinen merkitys tämän p53-riippuvainen säätely TRPC6 ilmaisun ja solunsisäisen kalsiumin tasoa. Koska p53 on keskeinen toimija säätelevät solujen apoptoottisen strategioita syöpäsoluissa. Oletimme, että p53-riippuvaista ekspressiota TRPC6 voisi olla toinen solu polku, jonka kautta p53 saattaa aiheuttaa apoptoosin syöpäsoluissa. Siten vaikutus TRPC6 ilmentymisen solun apoptoosi analysoitiin p53 villityypin soluissa (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), p53-mutantti-soluja (A-43, PC3) ja p53-tyhjä (H1299) solut . Nämä solulinjat ektooppisesti ilmaistaan ​​TRPC6 cDNA: n (kuvio 4a), ja solujen apoptoosi kontrolliin verrattuna (un-transfektoitujen solujen) soluja käyttämällä anneksiini-V-värjäyksellä ja virtaussytometrialla. Tulokset osoittivat merkittävää kasvua apoptoottisen osa TRPC6 yli-ilmentäviä syöpäsoluja, asemasta riippumatta p53-geenin. Seuraavaksi havaitsimme roolin solunsisäisen kalsiumin TRPC6 välittämää apoptoosia pysäyttämällä solunsisäisen kalsiumin vapautumisen kautta TMB-8. Tulokset osoittivat, että vaimeneminen ja solunsisäisen kalsiumin vapautumisen kautta TMB-8 poistetaan TRPC6-välitteistä apoptoosia syöpäsoluissa. Tämä data viittasi siihen, että TRPC6 riippuva kasvu solunsisäisen kalsiumin vapautuminen oli ratkaiseva apoptoosin, joten p53-riippuvainen kasvu TRPC6 ilmentymistä syöpäsoluissa voisi olla strategia apoptoosin kautta kalsium-välitteisen reittejä. Tämä saattaa olla toinen solu polku hyväksymiä p53 herättää apoptoottisen vasteen ja toimivat ensisijaisena tuumorisuppressori molekyyli syöpäsoluissa. Tämä data vahvistetaan TRPC6 mahdollisena apoptoottista proteiinia, joka tulevaisuudessa saattaa kylvää potentiaalia toimia syövän geeni-terapia-molekyylin. Jotta ymmärtää TRPC6 aiheuttaman apoptoosin tiedot havaitsimme aktivointia ja tukahduttaminen joukko keskeisiä 84 geenien (SA-Bio tieteiden, PAHS012) mukana sekä induktion apoptoosin. MRNA: n ilmentymisen analyysi näiden geenien tehtiin p53 villityypin soluissa (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), p53-mutantti-soluja (A-43, PC3) ja p53-tyhjä (H1299) soluja (kuvio 4b). Kokeellisessa määrittää nämä solut yli-ilmentyy apoptoottisten TRPC6 cDNA. Tulokset olivat yhdenmukaisia ​​kaikissa solulinjoissa ja osoitti, että TRPC6 yli-ilmentyminen johti downregulation geenien mukana apoptoosin estämiseen ja voimistunut osallistuvia geenejä indusoimaan solujen apoptoosin (kuvio 4b (kaista 1, 5, 7, 8, 11 12)). Mielenkiintoista on, että kun ektooppinen ilmentyminen TRPC6 cDNA syöpäsoluissa, joissa solunsisäisen kalsiumin sammutettiin läpi TMB-8 hoitoa, geeniekspressiomalli muutettiin ja ilmauksia osallistuvien geenien solujen apoptoosin oli jatkuvasti alhainen (kuvio 4b (kaista 17, 18 , 19, 20, 22 24)). Doksorubisiinin kanssa, käytettiin positiivisena kontrollina, johti säätelyä osallistuvien geenien apoptoosin (kuvio 4b (kaista 2, 3, 4, 6, 9 10)). Hoitamaton syöpäsolut toimivat kontrolleina (kuvio 4b (kaista 13, 14, 15, 16, 21 23)). Nämä tiedot viittaavat siihen, että TRPC6 indusoi apoptoosin kautta solunsisäisen kalsiumin tasoa ja sitä kautta reitin se muuttaa liittyvien geenien ekspressiota apoptoosin, mikä viittaa siihen, että TRPC6 on mahdollinen ehdokas pro-apoptoottisen anti-cancer strategioita. Tämä uusi molekyyli polku, jonka kautta p53 aktivoitaessa GAQ

3 transkriptionaalisesti säätelee ilmaus proapoptoottisten TRPC6 kalsiumkanavan, mikä puolestaan ​​aiheutetaan kalsium-välitteisen apoptoosin on mielenkiintoinen omaksuma p53 toimimaan tuumorisuppressorina. Edelleen tämän reitin voidaan hyödyntää saada syövän vastaista hyötyä tulevaisuudessa.

) vaikutus TRPC6 yli-ilmentyminen havaitaan heti solujen apoptoosin p53 villityypin soluissa (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), p53 mutantti soluja (A-431, PC3) ja p53 null-solut (H1299) käyttäen anneksiini-V värjäys ja virtaussytometrialla. Merkittävä lisäys apoptoottisen osa TRPC6 yli-ilmentäviä soluja nähdään riippumatta p53-geenin aseman. Solunsisäisen kalsiumin sammutusta kautta TMB-8 poistetaan TRPC6-välitteisen apoptoosin; käsittelemättömät solut toimii negatiivisena kontrollina, doksorubisiini toimii positiivisena kontrollina (* edustaa merkittävää eroa TRPC6 käsiteltyjä soluja ja TRPC6-käsitellyn ja TMB-8-käsiteltyjen solujen; kaikki p-arvot 0,05, n = 7; S.D, Anova). (B) TRPC6 indusoi apoptoottisen geenien syöpäsoluissa. PCR geenijärjestelyillä varten osallistuvien geenien säätelyyn solujen apoptoosin suoritetaan TRPC6 cDNA transfektoiduissa p53 villityypin soluissa (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), p53 mutantti soluja (A-431, PC3) ja p53 null-solut (H1299) soluja. Yli-ilmentyminen TRPC6 johtaa alas-säätely geenien estämällä apoptoosin ja ylössäätöä proapoptootti- geenejä (kaista 1, 5, 7, 8, 11 12). Solunsisäisen kalsiumin sammutukseen TRPC6 yli-ilmentävän solun johtaa inhibitioon apoptoottisen gens ja ekspression lisääntymisen anti-apoptoottisten geenien (kaista 17, 18, 19, 20, 22 24). Käsittelemättömät solut toimivat myös kontrolleihin (kaista 13, 14, 15, 16, 21 23); doksorubisiini hoito toimii positiivisena kontrollina, joka johtaa säätelyä osallistuvien geenien apoptoosin (kaista 2, 3, 4, 6, 9 10) (n = 10).

Keskustelu

tässä tutkimustyö olemme osoittaneet, että solunsisäisen kalsiumin vapautuminen on transkriptiokontrollin alaisuudessa p53 tuumorisuppressorin kautta p53-riippuvaisen transkription säätelyyn TRPC6 geenin. Genomin laaja analyysi p53 sitoutumiskohdat promoottorialueiden kalsiumkanavien osoitti läsnäolon p53 RE TRPC6 geenissä. Olemme osoittaneet, että GaQ3 indusoi ilmentymisen TRPC6 ainoastaan ​​syöpäsoluissa villityypin p53 ja p53 geenien kääntää GaQ3 aiheuttama kasvu TRPC6 ilmaisua. Nämä tiedot vahvistetaan myös, että TRPC6 on suora transkription kohteena p53 ja p53 sitoutuu vastineensa elementti TRPC6 promoottori. Olemme löytäneet p53 sitoutumiskohta on 0,6 Kb TRPC6 geenin promoottori, joka sijaitsee 400 emäsparia ylävirtaan +1 transkription aloituskohdasta. Äkillinen nousu solunsisäisen kalsiumin vapautumista ja kalsium-välitteisen solu- apoptoosin GAQ

3-käsiteltyjen syöpäsolujen johtuu p53-riippuvaisen transkription aktivaatio TRPC6 geenin. Tässä tutkimustyö olemme osoittaneet suoran yhteyden p53 transkription kyky ja kalsiumia signalointi.

Ymmärtäminen suhde kalsium signalointi ja p53 on tärkeä syövän näkökulmasta, koska nämä molemmat tekijät säätelevät solujen kasvua, erilaistumista, ikääntyminen , proliferaatioprosessi fysiologiset, solu- ja molekyylitason [12], [13]. Menneinä Ca

2 + -permeable TRPC kanava on osoitettu osallistumaan monipuolisista solutoiminnoille säätelemällä solunsisäistä Ca

2 + signalointi [14]. TRPC6-välitteisen Ca

2+ signalointi aktivoi solun lisääntymistä geenin, kuten kalmoduliinista riippuvan proteiinikinaasi ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi [15]. Rooli TRPC6 syövän kasvua ja kehitystä ei ole selvä; kuitenkin useita mekanismeja ovat mukana TRPC6 kanavan aktivointi ja sääntelyn syöpäsoluissa. Fysiologisia ja solutekijöiden osallisina syövän taudin etenemistä tunnetaan myös säätelemään solujen TRPC6 ilmaisun [16] – [20]. Solu tekijät, kuten kalvo reseptorin aktivoitumisen kautta TFN-α ja solujen Ca

2 + myymälän ehtyminen osallisina syövän etenemistä on tiedetään aiheuttavan TRPC6 ilmaisun [16] – [20]. Äskettäin rooli on tärkeä signalointimolekyylin ROS TRPC6 aktivointi havaitaan [18]. Koska ROS on mukana sekä syövän etenemiseen ja sen sääntely, joten on tärkeää tunnistaa roolin TRPC6 proteiinin syöpäsairaus kehitystä tai asetuksella. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että useat proapoptoottisten tekijöistä, mukaan lukien jäsenet Bcl-2-perheen proteiinien ja reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) säännellä Ca

2 + herkkyys sekä Ca

2+ vapauttaa kanavia ER ja mitokondriot [21]. Muita tietoja ei liittyviä välisestä suhteesta kasvaimen p53 ja säätelemällä kalsiumia signalointi transkription säätelyyn TRPC6 geeni syöpäsoluissa on käytettävissä. On tärkeää tunnistaa suhde p53 ja sen valvonta solunsisäisen kalsiumin vapautumista ja roolia TRPC6 geeni GAQ

3-käsiteltyjen syöpäsolujen. P53 ja TRPC6 indusoi sillä muutokset sytosolin pitoisuudet Ca

2+ voi aiheuttaa signalointireittejä, jotka säätelevät laajan valikoiman solutapahtumia, mukaan lukien merkittävä kasvainten synnyssä [21].

Lisäksi uusi suhde välillä solunsisäistä Ca

2+ vapautuminen ja p53 havaittiin jossa Ca

2+ julkaisu vakiintunut sitoutumisen p53 sen transkription koaktivaattoria p300 ja vakiintui sitoutuminen p53-p300 transkription monimutkainen p53-DNA sitoutumiskohta on p53-minimaalinen promoottori [22]. Tässä tutkimustyö olemme selvitetty läsnäolo solun rajat talk välillä p53 ja kalsium signalointi, jossa kalsium signalointi aktivoi p53 kopiointia [6] ja aktiivisen p53 lisäävät solunsisäisen kalsiumin vapautumisen transkriptionaalisesti säätelemällä promoottori TRPC6 geenin. Siten kalsium-riippuvaisen apoptoosin saattaa välittyä p53 ja kalsium signalointi voisi olla ratkaiseva merkitys p53-välitteisen apoptoosin. Äskettäin TRPC6 geeni on osoittanut keskeinen rooli patologinen sydämen hypertrofiaan ja remodeling vastauksena korostaa [23], [24]. Poistaminen TRPC6 estää stressin aiheuttama liioiteltu sydämen remontin ja yli-ilmentyminen TRPC6 kehittää spontaaneja sydämen hypertrofia hiirimallissa, mikä viittaa kohti mahdollisen yhteyden TRPC6 ilmaisun ja solukuolemaa ja jaon, koska sydämen remodeling liittyy sekä näitä prosesseja. TRPC6 ilmentyminen on myös tiedetään indusoivan podosyyttien solun tukirangan remodeling [25], ihmisen keratinosyyttien erilaistumisen [26], ja hippokampuksen neuroni erilaistumista [27]. Tärkeä tehtävä TRPC6 on myös havaittu haavan paranemisessa, jossa genomin laajakuva tunnistettu TRPC6 tärkeää myofibroblastin muutos ja TRPC6 geenin poistetaan hiiret osoittivat heikentynyttä ihon ja sydämen haavan paranemista loukkaantumisen jälkeen. Edelliset raportit viittaavat kohti yhteys TRPC6 ilmaisun ja säätely solujen jakautumista ja solukuolemaa liittyvien prosessien, tässä raportissa esitämme vahva rooli TRPC6 kuin p53-säänneltyjen pro-apoptoottisen proteiinin syöpä mallissa. Lopuksi tässä olemme selvitetty uuden roolin TRPC6 kalsiuminestäjien toimimaan p53 alavirtavaikuttajainhibiittorit proteiinia, joka indusoi apoptoosia säätelemällä solun kalsiumin tasot syöpäsoluissa. Tämä reitti näyttää olevan strategian hyväksymä p53-proteiini hyödyntää kalsiumia signalointi on tehokas pro-apoptoottisen anti-syöpä tarkoittaa transkriptionaalisesti säätelemällä TRPC6 kalsiumkanavan, käyttäen siten TRPC6 mahdolliseksi mekanismi toimii tuumorisuppressorina.

tukeminen Information

Tiedosto S1.

Oheismateriaali ja menetelmiä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0071016.s001

(DOC) B