Krooninen sairaus

tiivistelmä

Galiellalactone on tehokas ja spesifinen estäjä STAT3 signalointia, joka on osoitettu olevan kasvua inhiboivia vaikutuksia eturauhassyövän soluissa, jotka ekspressoivat aktiivista STAT3. Tässä tutkimuksessa pyrittiin vaikutuksen tutkimiseksi galiellalactone eturauhassyövän kantasolun kaltaisia ​​soluja. Olemme tutkineet ilmentymisen aldehydidehydrogenaasin (ALDH) markkerina syövän kantasolun kaltaisia ​​soluja eri ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja vaikutukset galiellalactone on ALDH ilmentävät (ALDH +) syöpäsolujen. ALDH + alapopulaatioiden havaittiin ja eristettiin ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa DU145 ja pitkän aikavälin IL-6 stimuloitujen LNCaP-soluissa käyttäen ALDEFLUOR® määritystä ja virtaussytometrialla. Toisin kuin ALDH- soluihin, ALDH + eturauhassyövän solut osoittivat syövän kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia, kuten lisääntynyt itseuudistuvien ja pesäkkeitä muodostavien kapasiteettia ja kasvainten muodostumiseen. Lisäksi ALDH + solut osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä otaksuttu eturauhassyövän kantasolujen merkkiaineita (CD44 ja integriini α2β1). Lisäksi ALDH + solut ilmensivät fosforyloitua STST3. Galiellalactone käsittely laski osuus ALDH + eturauhassyövän soluissa ja indusoi apoptoosia ALDH + -solujen. Geeniekspressiota

ALDH1A1

säädeltiin vähentävästi in vivo galiellalactone käsiteltiin DU145 ksenografteja. Nämä havainnot korostavat, että kohdistettu STAT3-reaktiotien eturauhassyövän soluissa, mukaan lukien eturauhassyöpä kantasolun kaltaisia ​​soluja, on lupaava terapeuttinen lähestymistapa, ja että galiellalactone on mielenkiintoinen yhdiste kehittämiseen tulevaisuudessa eturauhassyövän lääkkeitä.

Johdanto-osan : Hellsten R, Johansson M, Dahlman A, Sterner O, Bjartell A (2011) Galiellalactone Estää Stem Cell-Like ALDH-Positive Eturauhassyöpä Cells. PLoS ONE 6 (7): e22118. doi: 10,1371 /journal.pone.0022118

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 22 joulukuu 2010; Hyväksytty: 17 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 11 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Hellsten ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Ruotsin Cancer Society, The Swedish Research Council, MAS Cancer Foundation, Holger Knud Christensens lahjoitus, Percy Falck Foundation ja Gunnar Nilsson Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

eturauhassyöpä on yleisimmin diagnosoitu kasvain miehillä että on olemassa suuri tarve uusien hoitomuotojen vastaan ​​kastraatio resistenttejä eturauhassyöpää [1]. Mukaan syövän kantasolujen teoria, vain pieni joukko syövän solut kykenevät kasvaimen kasvun ja uusiutumisen [2], [3]. Eturauhassyöpä kantasolujen näyttävät olevan vastustuskykyisiä tavanomaisten syövän hoitoon ja voi siten olla mukana edenneen eturauhassyövän kasvaimia ja aiheuttaa uusiutuminen ja etäpesäkkeiden [4], [5]. Eturauhasen kasvaimet käsittävät vain 0,1% kantasoluista, mutta epäonnistuminen hävittää tämän solun väestöryhmästä saattaa uudistumista kasvain ja lääkeresistenssin ja jotta toistumisen estämiseksi on tärkeää kohdistaa kaikkiin solutyyppejä kasvaimen [5], [6 ], [7], [8]. Novel kohdennetut hoidot kohdistuvat eturauhassyövän kantasolun kaltaisia ​​soluja ovat erittäin perusteltuja.

etsittäessä spesifisten syövän kantasoluja, aldehydi (ALDH) on osoittanut lupauksen sellaisenaan markkerina eri syöpiä, kuten virtsarakon syöpä [9], keuhkosyöpä [10], pään ja kaulan okasolusyöpä [11], rintasyövän [12] ja eturauhassyövän [13], [14]. Suuri ilmaus ALDH eturauhassyövässä kantasoluja on osoitettu olevan positiivinen korrelaatio Gleason pisteet ja korreloi käänteisesti elossaololuku eturauhassyöpäpotilailla [13]. Korkea ALDH aktiivisuus on onnistuneesti käytetty tunnistamaan kasvaimen aloittamista syöpäsolujen ja etäpesäkkeitä [14].

Signal anturin ja aktivaattori transkription 3 (STAT3) on tärkeä transkriptiotekijä monissa syöpätyypeissä, ja se on osoitettu olla mukana lääkeresistenssin ja saada antiapoptooppinen vaikutuksia eturauhassyövän soluissa. Konstitutiivisesti aktiivinen STAT3 myötävaikuttaa onkogeneesiin kautta säätelyä koodaavien geenien anti-apoptoottisia proteiineja, solusyklin sääntelyviranomaisten ja angiogeneesiä yllykkeet, mikä lisää selviytymisen ja hallitsematon kasvu syöpäsolujen [15]. STAT3 ilmaus ehdotetaan korreloida pahanlaatuinen potentiaalia ja metastaattinen käytös eturauhassyövässä [16], [17]. Lisäksi geeni-ilmentymisen analyysi eturauhassyövän kantasolujen on paljastanut tulehdusta fenotyypin ja että JAK /STAT3-signalointireitin on aktiivinen tässä solupopulaatiossa [18]. Useat tutkimukset osoittavat STAT3 pätevänä tavoite kehittää uusia lääkkeitä eturauhassyövän ja muiden pahanlaatuisten kasvainten [19], [20], [21]. Olemme osoittaneet, sekä

in vivo

ja

in vitro

, että STAT3 estäjä galiellalactone hallussaan kasvua estäviä vaikutuksia eturauhassyövän soluissa, jotka ekspressoivat aktiivista, fosforyloitu STAT3 [22]. Galiellalactone on metaboliitti -sienen tuottamien

Galiella rufa

, ja se on valmistettu synteettisesti, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Galiellalactone on erittäin tehokas ja selektiivinen IL-6 signaloinnin kautta STAT3, ja sen uskotaan estävän STAT3 signaloinnin estämällä sitova aktivoitujen STAT3 DNA [24].

Tässä tutkimuksessa pyrittiin tutkimaan ilmaus ALDH markkerina syövän kantasolun kaltaisia ​​soluja eri ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja vaikutukset STAT3 inhibiittorin galiellalactone on ALDH ilmentävien syöpäsolujen.

Materiaalit ja menetelmät

soluviljely

ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa DU145, LNCaP (American Type Culture Collection, [ATCC]) ja pitkän aikavälin interleukiini-6 (IL-6) stimuloivat LNCaP-soluja (LNCaP-IL6-solut) [25] käytettiin. Soluja viljeltiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. LNCaP-IL6-soluja ylläpidettiin edellä väliaineessa, jota oli täydennetty IL-6 (5 ng /ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Kaikki solut inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 95% O

2 ja 5% CO

2. Soluja käytetään vähän kohtia eikä viljeltiin yli kaksi kolme kuukautta. Solut testattiin rutiininomaisesti mycoplasma ja todettu mykoplasmaa. Cell identiteetti ei ollut todennettu kirjoittajien. Galiellalactone valmistettiin synteesin aikaisemmin kuvatulla [23].

ALDEFLUOR määritys ja solujen lajittelu

Eturauhassyöpä soluja (DU145, LNCaP ja LNCaP-IL6) tehtiin ALDEFLUOR® määritys (StemCell Technologies , Aldagen, Inc., Durham, NC) ja sen jälkeen virtaussytometrialla havaitsemaan soluja, joilla on suuri aktiivisuus ALDH (ALDH +). Aktiivinen reagenssi Bodipy®-aminoasetaldehydi lisättiin solut, jotka oli muunnettu ALDH fluoresoivaan Bodipy®-aminoasetaatti. ALDH-inhibiittoria diethylaminobenzaldehyde (DEAB) käytettiin negatiivisena kontrollina. DU145 ja LNCaP-IL6-soluja käsiteltiin 0-50 uM galiellalactone 24 tuntia ja osuus ALDH + analysoitiin ALDEFLUOR® määrityksessä. DU145 ja LNCaP-IL6 solut altistettiin solun lajittelu perustuu ALDH aktiivisuus käyttämällä ALDEFLUOR® määritystä. ALDH + ja ALDH- solut lajiteltiin käyttämällä BD FACSAria solulajitteluanalyysi (BD Biosciences, San Jose, CA). Ei-elävät solut ulkopuolelle käyttäen 7-amino-aktinomysiini D: värjäystä. ALDH + ja ALDH- -alapopulaatioiksi päässä DU145 ja LNCaP-IL6 solut uudelleen pinnoitettu lajittelun jälkeen ja analysoitiin ALDEFLUOR® määrityksessä viikon kuluttua viljelmässä selvittääkseen niiden itseuudistuvien kapasiteettia.

Cytospin ja immunohistokemia

ALDH + ja ALDH- solut lajiteltiin DU145 ja LNCaP-IL6 solut altistettiin suoraan Cytospin tai uudelleenmaljataan ja käsitelty galiellalactone trypsinoituja ja pestiin PBS: ssä ennen altistetaan sytospin. Solususpensio sijoitettiin cytospin suppilon kiinnitetään lasilevylle ja pyöritettiin nopeudella 800 rpm 2 minuuttia. Objektilasit kuivattiin ilmassa, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan ja tehtiin läpäiseviksi 1% Triton-x Tris-puskurissa, pH 7,6 1 tunnin ajan. Levyt altistettiin immunohistokemiallisesti käyttäen Dako Autostaineriin Plus ja EnVision ™ + Kit (Dako). Käytetyt vasta-aineet olivat CD44 (BD Pharmingen), integriini α2β1 (Abcam), CD133, (c-PARP), p-STAT3 ja p-NF-KB: n p65: n (Cell Signaling Technology).

apoptoottiset solut

Lajiteltu ALDH + ja ALDH- solujen DU145 ja LNCaP-IL6-soluja käsiteltiin 25 uM galiellalactone 24 tuntia, suoritettiin Cytospin ja värjättiin apoptoottisen markkeri c-PARP. Vähintään 500 solua laskettiin kaksi erillistä koetta ja useita leimatun c-PARP-solut lasketaan suhteessa kokonaismäärään soluissa. Määrä apoptoottisten solujen ilmaistiin osa kokonaismäärästä soluja.

WST-1-solujen lisääntymisen määrityksessä

WST-1 proliferaation määritys suoritettiin tutkimaan vaikutusta galiellalactone jakautumiseen ja elinkelpoisuus ALDH + ja ALDH- solut lajiteltiin DU145 ja LNCaP-IL6 soluissa. ALDH + ja ALDH- soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä tiheydellä 2 000 solua /kuoppa 200 ul: ssa väliainetta. Solujen annettiin kovettua 24 tuntia. Solut käsiteltiin 0-50 uM galiellalactone 24 tuntia. Näytteet tehtiin kolmena kappaleena. 20 ui WST-1 liuosta (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa) lisättiin kuoppaa kohti ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Absorbanssi kunkin kuopan mitattiin käyttäen skannauksen usean hyvin spektrofotometrillä, ELISA-lukijalla aallonpituudella 450 nm ja viite aallonpituudella 690 nm. Tulokset on esitetty prosenttia käsittelemättömän verrokin solut.

Kloonaus tehokkuuden analyysi

ALDH + ja ALDH- solut lajitellaan DU145 ja LNCaP-IL6-soluja viljeltiin 24-kuoppalevyillä tiheydellä 200 solua kuoppaa kohti. Pesäkkeiden muodostuminen mitattiin viikon kuluttua. Kloonit visualisoitiin Crystal Violet värjäys ja laskettiin. Kloonauspai- tehokkuus laskettiin prosenttia päällystetty soluja.

eturauhasen ksenograftimallissa

Kuudesta kahdeksaan viikon ikäisiä nude NMR1 hiiriä, jota pidetään 12 tunnin valo-pimeä sykli pääsy ruoka ja vesi

halun

. Kokeelliset menettelyt hyväksyttiin ja suoritettiin ohjeiden mukaisesti asettamat Malmö-Lund eettisen lautakunnan käyttöä ja hoitoa koe-eläimiä. Nude-hiirten ihon alle DU145 eturauhasen syöpäsolun ksenografteissa (1 x 10

6 DU145 soluja) altistettiin päivittäin i.p. injektiot galiellalactone (1 mg /kg) tai vehikkelillä kolmen viikon ajan [22]. 21 päivän kuluttua hiiret tapettiin ketamiinia injektiolla (50 mg /kg) ja sen jälkeen taittamalla niskasta ja ksenograftit leikeltiin pois ja välittömästi jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes se jatkokäsiteltiin. Kokonais-RNA eristettiin jäädytetyistä DU145 ksenograftien käsittelemättömien-hiiriä (n = 6) ja hiiret, joita käsiteltiin 1 mg /kg galiellalactone päivässä kolmen viikon ajan (n = 3).

tuumorigeenisyyden määrityksessä

Tuore lajiteltu ALDH + ja ALDH- populaatioiden DU145 ja LNCaP-IL6 solut suspendoitiin seerumivapaassa /matrigeelin (BD Biosciences) seosta (01:01 tilavuus). Kuudesta kahdeksaan viikkoa vanhoja nude NMR1 hiiriä (n = 5) annettiin pistoksena ALDH + tai ALDH- soluja ihon alle oikeaan ja vasempaan kylkeen hiiren vastaavasti pitoisuuksina 10 000 tai 100 000 solua per pistoskohdan. Kasvaimen kasvua seurattiin koko kokeen. Tuumorin koko mitattiin kuuden viikon kuluttua käyttäen paksuus ja kasvaimen tilavuus (ui) laskettiin kaavalla pituus (mm) x leveys x korkeus x 0,5632. Hiiret lopetettiin isofluraanilla ja niskanmurrolla jälkeen 6 viikkoa.

Quantitative real-time PCR

geeniekspressiota CD44, CD133, integriinin α2 ja ALDH1A1 tutkittiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (q-PCR). Solut otettiin talteen sentrifugoimalla lyhyen aikaa välittömästi sen jälkeen, kun solujen lajittelun tai hoidon jälkeen galiellalactone, ja pelletit säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA: n eristämistä. Kokonais-RNA eristettiin käyttäen QIAshredder spin sarakkeita, ja edelleen mRNA rikastamiseen ja lisäksi pesu suoritettiin käyttäen RNeasy (Qiagen Sciences). Jos haluat sulkea pois DNA-kontaminaation, näytteet DNAasi käsiteltiin 30 min käyttäen RQ1 RNAasi-vapaa DNAse (Promega). Täydentävä DNA (cDNA) syntetisoitiin käyttämällä satunnaisia ​​heksameerejä ja käänteistranskriptaasia Superscript II (Invitrogen). Kokonais-RNA eristettiin DU145 ksenografteja käyttämällä Trizol (Invitrogen). Viisi mikrogrammaa kokonais-RNA: ta saatiin cDNA-synteesi käyttäen HPLC-puhdistettiin Oligo dTprimer kanssa T7-sekvenssin.

Quantitative real-time PCR suoritettiin käyttäen 6-20 ng cDNA: ta, 250 nM eteenpäin ja taaksepäin aluketta 2 x SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) on 25 ui reaktiota. Pyöräily olosuhteet olivat: 10 min 95 ° C: ssa aktivoida entsyymi, sitten 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 60 sekunnin ajan. Suhteellinen ekspressiotasoja kvantitoitiin vertaileva Ct menetelmä [26] ja normalisoidaan ilmaus kolmen vakain sisäisen valvonnan geenejä (

HPRT

,

UBC

, ja

YWHAZ

), valitaan geNorm ohjelmisto analyysin vakain viittaus geenejä. Alukkeita sekvenssit olivat aiemmin raportoitu:

HPRT

,

UBC

ja

YWHAZ

[26],

ALDH1A1

[27], CD133 [28], CD44 [29], ja integriini α2 [30]. Kaikki alukkeet syntetisoitiin Invitrogen ja tarkastetaan spesifisyyden ennen käyttöä.

Tilastot

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Tilastollisessa analyysissä suoritettiin Dunnettin testillä tai Studentin t-testiä käyttäen JMP-ohjelmiston (SAS Institute Inc., Cary, NC). Tuloksia pidettiin tilastollisesti merkitsevä p 0,05.

Tulokset

ALDH ilmentyminen eturauhassyöpäsolulinjoissa

DU145, LNCaP ja LNCaP-IL6 soluja tutkittiin niiden ALDH aktiivisuus käyttämällä ALDEFLUOR® määritystä ja virtaussytometria. Vuonna DU145-soluissa 2,62 ± 0,23%: n solut ekspressoivat korkean ALDH aktiivisuus (ALDH +), 2,84 ± 0,5%: n LNCaP-IL6 solut ALDH + ja LNCaP-soluissa 0,57 ± 0,34% soluista osoitti ALDH aktiivisuus (n = 3-4) (kuva 1).

DU145, LNCaP ja LNCaP-IL6 solut altistettiin ALDEFLUOR® määritys, jotta voidaan määrittää solujen korkea ALDH ilme (ALDH +). ALDH-inhibiittoria DEAB käytettiin negatiivisena kontrollina (vasen paneeli). Solut ilman inhibiittoria siirretään oikealle katsottiin ALDH + solut (oikea paneeli).

Characterization eristettyjen ALDH + solujen

ominaisuudet ALDH + ja ALDH- solupopulaatioiden eristetty DU145 ja LNCaP-IL6 solut tutkittiin suhteessa itseuudistuvien ja pesäkkeitä muodostavat kapasiteetin ja kasvainten muodostumiseen.

lajitellaan ALDH + ja ALDH- -alapopulaatioiksi päässä DU145 ja LNCaP-IL6 solut uudelleen pinnoitettu lajittelun jälkeen ja analysoitiin ALDEFLUOR ® määrityksessä yhden viikon kuluttua viljelmässä selvittääkseen niiden itseuudistuvien kapasiteettia. Viikon kuluttua viljelmässä pienissä populaatioissa ALDH + solujen havaittiin keskuudessa ALDH- DU145 ja ALDH- LNCaP-IL6 soluja (0,26 ± 0,24% ja 0,36 ± 0,05%: lla, n = 2). Kuitenkin yhden viikon jälkeen viljelmässä lajittelun jälkeen ALDH + LNCaP-IL6 ja ALDH + DU145 soluviljelmissä uudelleen käyttöön niiden vanhempien fenotyyppi ja muodosti populaatio, joka muistuttaa alkuperäistä emosolulinjassa kanssa 2,24 ± 1,23% ja 1,24 ± 0,14% ALDH + soluista , vastaavasti (n = 2).

pesäkkeitä muodostavien tehokkuus oli merkittävästi suurempi ALDH + -soluissa verrattuna ALDH- solut molemmista LNCaP-IL6 ja DU145-soluissa (kuvio 2A). ALDH + kloonit muodostivat olivat näkyvästi suuremmat kuin ALDH- klooneja. Tuumorigeenisyyden ALDH + ja ALDH- solujen tuoreita lajitellaan DU145 ja LNCaP-IL6 solut tutkittiin ruiskuttamalla 10 000 tai 100 000 solua ihon alle kylkeen nude-hiirten (n = 5) ja kasvaimen kasvua seurattiin viikoittain. ALDH + solut osoittivat suurempaa kasvaimen muodostavan kapasiteetin verrattuna ALDH- soluja sekä DU145 ja LNCaP-IL6-soluihin ja löytö palpoitavissa kasvainten viivästyi ALDH- soluissa (kuvio 2B). ALDH + kasvaimet olivat merkittävästi suurempia kuin ALDH- kasvaimia kuuden viikon kuluttua (kuvio 2C).

ALDH + soluilla kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia lisääntymisen suhteen pesäkkeitä muodostavien kapasiteettia ja kasvainten muodostumiseen. A. klonogeeninen määritys. 200 solua /kuoppa ympättiin ja pesäkkeet laskettiin 1 viikon kuluttua. Kyky muodostaa klooneja laskettiin prosenttia muodostuneiden pesäkkeiden suhteessa soluihin ympätään (n = 2; p 0,05). B. kasvainten muodostumiseen määritys. Kasvain ottaa ihon alle injektiona 10 000 tai 100 000 solua tuoreeltaan lajitellaan ALDH + ja ALDH- solujen DU145 ja LNCaP-IL6 (n = 5). C. Kasvaimen koko ALDH + ja ALDH- solun ksenografteissa jälkeen 6 viikkoa (n = 5). ALDH + kasvaimet 100 000 solua injektoitiin ihon alle oli merkittävästi suurempi kuin ALDH- kasvaimet sekä DU145-solujen (p = 0,0002) ja LNCaP-IL6-solujen (p = 0,0077).

Expression eri biomarkkerit liittyvät kantasoluja

ilmentyminen eri biomarkkereiden oletettavasti liittyvät syöpään kantasoluja tutkittiin juuri järjestetty ALDH + ja ALDH- jakeet DU145 ja LNCaP-IL6-soluja (kuvio 3). CD44 havaittiin immunohistokemialla sekä ALDH + ja ALDH- solut lajitellaan DU145-soluihin ja ilmentyminen oli voimakasta ALDH + -soluissa verrattuna ALDH- soluja (kuvio 3A). CD44 immunovärjäys havaittiin useimmissa ALDH + LNCaP-IL6 solujen toisin ALDH- LNCaP-IL6-solut, joissa on vähemmän solut värjättiin CD44. Integriini α2β1 ilmaistiin sekä ALDH + ja ALDH- solut lajiteltiin DU145 soluista ja ilmaisu oli voimakasta ALDH + soluissa verrattuna ALDH- soluihin. Integriini α2β1 oli ilmaistu ALDH + solujen LNCaP-IL mutta vain harvat solut ilmensivät integriini α2β1, että ALDH- soluissa. CD133 ei ollut havaittavissa ALDH + ja ALDH- solut molemmista DU145 ja LNCaP-IL6 soluissa. Ilmaus aktiivisen STAT3 ja NF-KB: n tutkittiin ALDH + ja ALDH- jakeet DU145 ja LNCaP-IL6-soluja (kuvio 3A). Lisääntynyt p-STAT3 ilmentymistä havaittiin ALDH + soluissa verrattuna ALDH- solut molemmista solulinjoista. P-NF-KB p65 havaittiin ALDH + DU145 soluissa, mutta ei ALDH- DU145, ALDH + LNCaP-IL6 tai ALDH- LNCaP-IL6 soluissa.

. Juuri järjestetty ALDH + ja ALDH- solujen DU145 ja LNCaP-IL6 solut altistettiin Cytospin ja värjättiin CD44, integriinin α2β1, p-STAT3 ja p-NF-KB: n p65. B. suhteellinen mRNA ilmentymisen CD44 ja integriini α2 on ALDH + ja ALDH- solut juuri lajitellaan DU1145 ja LNCaP-IL6-soluja.

geenin ilmentymisen CD44, integriini α2 ja CD133, tutkittiin kvantitatiivinen -PCR. (Kuvio 3B). mRNA ekspressiotasot CD44 ja integriini α2 nostettiin ALDH + soluissa verrattuna ALDH- soluja LNCaP-IL6 soluissa. Ei ollut eroa mRNA taso CD44 ja integriini α2 vuonna ALDH + ja ALDH- solujen DU145. mRNA-tasot on CD133 ei ollut havaittavissa ALDH + ja ALDH- soluja sekä DU145 ja LNCaP-IL6-soluja.

Galiellalactone vähentää osuus ALDH + -solujen

DU145 ja LNCaP-IL6 soluja käsiteltiin galiellalactone (5, 10, 25 tai 50 uM) 24 tunnin ajan ja altistettiin ALDEFLUOR® määritys, jotta vaikutuksen tutkimiseksi galiellalactone osuudesta ALDH + -solujen verrattuna vehikkeliin. Galiellalactone vähentynyt osuus ALDH + -solujen sekä DU145 ja LNCaP-IL6-solujen annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 4A). Inkubointi galiellalactone 25 uM 24 tuntia merkittävästi vähentynyt osuus ALDH + DU145 solujen 51% (p = 0,0013) ja osuus ALDH + LNCaP-IL6 soluissa 75% (p = 0,0441).

. DU145 ja LNCaP-IL6-soluja käsiteltiin galiellalactone (5-50 uM) 24 tunnin ajan ja altistettiin ALDEFLUOR® määritystä. Osuus ALDH + -solujen merkittävästi vähentynyt johtuen galiellalactone hoitoa annoksesta riippuvaisella tavalla. Osuus ALDH + -solujen ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (n = 2-4). Osuus ALDH + DU145 solut merkitsevästi väheni galiellalactone pitoisuuksina 10 uM (p = 0,0060), 25 uM (p = 0,0013) ja 50 uM galiellalactone (p 0,0001). Osuus ALDH + LNCaP-IL6 solujen väheni merkittävästi galiellalactone pitoisuuksina 25 uM (p = 0,0441) ja 50 uM (p = 0,0445). B. suhteellinen mRNA: n ilmentymisen on ALDH1A1 in DU145 hiirissä käsiteltiin 1 mg /kg /vrk galiellalactone kolmen viikon ajan. Kontrollihiiret saivat ajoneuvoon. Suhteellinen mRNA ilmentymistä ALDH1A1 pienennettiin galiellalactone käsitellyissä hiirissä kontrolliin verrattuna (0,139 ± 0,107 ja 0,644 ± 0,161, vastaavasti, p = 0,07, n = 3-6).

Galiellalactone vähentää ALDH1A1 mRNA: n ekspression DU145 ksenografteissa

Hiiret DU145 -ksenografteja vehikkeliä tai 1 mg /kg galiellalactone päivittäin kolmen viikon ajan, kasvaimet kerättiin ja geenin ilmentyminen analysoitiin. MRNA: n ilmentyminen

ALDH1A1

oli 4,6 kertaa pienempi galiellalactone käsitelty ksenografteissa verrattuna kontrolleihin (kuvio 4B).

Galiellalactone estää proliferaatiota ja indusoi apoptoosia ALDH + -solujen

Lajiteltu ALDH + ja ALDH- soluja DU145 ja LNCaP-IL6-soluja käsiteltiin 25 uM galiellalactone 24 tuntia ja immunovärjättiin apoptoottisen markkeri c-PARP (kuvio 5A). Lisääntynyt määrä c-PARP positiivisia soluja havaittiin galiellalactone käsiteltiin ALDH + ja ALDH- soluja käsittelemättömiin soluihin verrattuna (kuvio 5A). Apoptoottisen vasteen ALDH + ja ALDH- solut lajitellaan DU145 ja LNCaP-IL6-soluja käsiteltiin 25 uM galiellalactone 24 tuntia kvantifioitiin laskemalla c-PARP ilmentäviä soluja (kuvio 5B). Hoito galiellalactone merkittävästi lisääntynyt määrä C-PARP ilmentävien solujen ALDH + DU145, ALDH + LNCaP-IL6 ja ALDH- LNCaP-IL6 solujen verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. ALDH + solut osoittivat suurempaa apoptoottista vastaus galiellalactone verrattuna ALDH- soluihin mitattuna c-PARP ilmentymistä. Kuitenkin, tämä ero ei ollut merkittävä (p = 0,059 ja DU145-soluja ja p = 0,119 varten LNCaP-IL6-solut, n = 2). Vaikutus galiellalactone elinkelpoisuuteen ja leviämisen ALDH + ja ALDH- soluja tutkittiin (kuvio 5C). Galiellalactone laski proliferaatiota sekä ALDH + ja ALDH- eristetyt solut DU145 ja LNCaP-IL6-solujen annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 5C). ALDH + solut olivat huomattavasti herkempiä galiellalactone hoitoon kuin ALDH- solut lajitellaan DU145-soluissa. Kuitenkin, ei ollut merkittävää eroa herkkyys galiellalactone välillä ALDH + ja ALDH- LNCaP-IL6-soluja.

. ALDH + ja ALDH- solut lajitellaan DU145 ja LNCaP-IL6-soluja käsiteltiin 25 uM galiellalactone 24 tuntia. Apoptoottisia soluja havaittiin c-PARP värjäystä. B. kvantifiointi c-PARP värjättiin apoptoottisten solujen ALDH + ja ALDH- solut lajitellaan DU145 ja LNCaP-IL6 soluja ja käsiteltiin 25 uM galiellalactone 24 tuntia. Hoito galiellalactone merkittävästi lisääntynyt määrä C-PARP ilmentävien solujen ALDH + DU145, ALDH + LNCaP-IL6 ja ALDH- LNCaP-IL6 solujen verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (p = 0,019, 0,035 ja 0,009 vastaavasti; n = 2). Ero apoptoottisen vasteen välillä galiellalactone käsiteltiin ALDH + ja ALDH- solujen DU145 ja LNCaP-IL6-soluja ei ollut merkitsevä (p = 0,059 ja p = 0,119, vastaavasti; n = 2). C. Galiellalactone laski elinkelpoisuuden ALDH + ja ALDH- solut lajiteltiin DU145 ja LNCaP-IL6 soluissa. ALDH + DU145-solut olivat huomattavasti herkempiä galiellalactone verrattuna vastaavaan ALDH- solut 5 uM (p = 0,0017), 10 uM (p = 0,0010), 25 uM (p = 0,0019) ja 50 uM (p = 0,0025). Tulokset esitetään keskiarvona prosenttia käsittelemätön kontrolli (n = 2).

Keskustelu

Eturauhassyöpä kantasolut osoitettu olevan androgeenistä riippumaton ja puuttuu ilmentymistä toiminnallisen androgeenireseptorin [6], [18], joka tekee ne immuuneja androgeenien puute hoitoa (ADT). Hiirimallissa eturauhassyövän, lisääntyneen ekspression kantasolujen merkkiaineita jälkeen havaittiin ADT [31]. Lisäksi syövän kantasolut ovat resistenttejä nykyistä kemoterapiaa ja ALDH ilmentävien syövän kantasolut ovat osoittaneet kestävyys ja väkevöimisen paklitakselihoidolla [32]. Syöpä kantasolujen ominaisuuksia, kuten hidas kasvu, monilääkeresistenttisyyttä, tehostetut DNA-korjaus, korkea ilmentyminen Antiapoptoottisten proteiinit [33] ja eturauhassyövän puute vastaus ADT, jotta nämä solut erittäin vaikea kohdistaa tavanomaisilla eturauhasen syövän hoidossa. Uusi hoitomuotojen syystä on kehitettävä, jotta kilpailevat sekä kasvaimen suurin ja syövän kantasoluja.

Tässä tutkimuksessa tunnistimme syöpää kantasolun kaltaisia ​​alapopulaatiot viljellyissä eturauhassyövän solulinjoissa, jotka vastasivat hoitoon kanssa STAT3 estäjän galiellalactone. Pieni osa (2-4%) solulinjan populaatiot osoittivat korkea ALDH aktiivisuutta. Nämä ALDH + -solujen paljasti kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia, kuten lisääntynyt pesäkkeitä muodostavaa ja uudistuva ja suuri kapasiteetti tuumorigeenisyyden sekä ilmentymistä oletetun eturauhassyövän kantasolujen merkkiaineita. Nämä solut reagoivat hoitoon galiellalactone.

kyky sekoittamalla heterogeeninen massa on määritelmä syövän kantasoluja, ja huomasimme, että yksittäisiä ALDH + eturauhassyövän solut kykenivät itseuudistumisen ja uudelleen perustaminen emosolulinjassa ja omisti suuren tuumorigeenisyystesti

in vivo

ja

in vitro

. ALDH + väestö LNCaP-IL6 soluissa oli korkea ilmaus oletetun eturauhassyövän kantasolujen merkkiaineita CD44 ja integriini α2β1 [34] verrattuna ALDH- väestölle. Emme kuitenkaan ei havaittu CD133 ilmentyminen ALDH + tai ALDH- syöpäsolujen. Tämä on yhtäpitävä tuore tutkimus Pfeiffer ja Schalken [35] viittaa siihen, että CD133 ei markkeri kantasolujen eturauhassyövän solulinjoissa. Lisääntynyt JAK /STAT3 ja NF-KB: n aktiivisuus ilmaistaan ​​kantasoluja ja kasvaimen aloittamista kantasolujen kaltaisia ​​soluja eturauhassyövässä [18], [36] ja havaintomme aktiivisen STAT3 ja NF-KB: ALDH + soluissa on tämän ehdotuksen . Yhdessä tuloksemme, ym [14], osoittavat, että ALDH ilmaisu voi olla keino tunnistaa syövän kantasolun kaltaisia ​​soluja eturauhassyövässä.

Syöpä kantasolun kaltainen ALDH + väestöstä oli suurempi pitkissä termi IL-6 stimuloitujen LNCaP-solujen verrattuna LNCaP solut, jotka tukevat sitä mieltä, että eturauhassyövän kantasolujen osoittavat tulehdusta fenotyyppi [18], [37]. Geeniekspressioprofilointi eturauhasen syövän kantasoluja osoittavat, että STAT3 signalointireitin yli-ilmennetään näissä soluissa [18] ja useita tutkimukset osoittavat STAT3 kuin kohde terapeuttiselle interventiolle kasvaimen kantasoluja [38], [39]. Tämä on linjassa havaintoon, että ALDH + kantasolu kaltaisia ​​soluja eturauhassyövän solulinjoissa ilmaisi aktiivinen STAT3 ja että nämä ALDH + solut vastasivat STAT3 estäjä galiellalactone, joka on aiemmin osoitettu indusoivan apoptoosia eturauhasen syöpäsolujen kanssa konstitutiivista ilmentämistä aktiivisen STAT3 [22]. Annos-vaste liittyviä lasku osuuden ALDH + solujen DU145 ja LNCaP-IL6 solupopulaatioiden ja apoptoosin induktion näiden solujen upon galiellalactone hoito viittaavat siihen, että nämä syöpää kantasolun kaltaisia ​​soluja ovat herkkiä STST3 esto. Noteably, DU145 ksenografteissa päässä galiellalactone käsitellyistä hiiristä oli vähentynyt geenin ilmentyminen

ALDH1A1

verrattuna hoitamattomiin DU145 ksenografteja osoittaa, että galiellalactone voi kohdistaa eturauhassyövän kantasolun kaltaisia ​​soluja myös

in vivo

. Olemme aiemmin osoittaneet, että ilmaus STAT3 liittyvien geenien

BCL2L1

ja

MCL1

olivat alas-säädellä galiellalactone edelleen vahvistaa STAT3 estävää vaikutusta lääkkeen

in vivo

[22].

Muut luonnolliset tuotteet lisäksi galiellalactone on osoitettu estävän syövän kantasoluja. Sesquiterpene laktoni Parthenolide ja kurkumiini ovat sytotoksisia syövän kantasoluja ja kohdentaa solujen inhiboimalla NF-KB: n ja STAT3 [40], [41]. Kohdistaminen STAT3 väylän eturauhassyövän kantasolun kaltaisia ​​soluja luonnontuote peräisin olevat yhdisteet voivat olla lupaava terapeuttinen lähestymistapa kehittämiseen eturauhassyövän huumeita.

Yhteenvetona eturauhassyöpäsolulinjoissa sisälsivät ALDH + osapopulaatioiden kara solu- ominaisuuksiltaan joka ilmaisi fosforyloitu STST3. Nämä osapopulaatioiden selvästi inhiboi STST3 estäjä galiellalactone. Nämä havainnot korostavat, että kohdistettu STST3 väylän eturauhassyövän soluissa, mukaan lukien eturauhassyöpä kantasolun kaltaisia ​​soluja, voi olla uusi voimakas hoitostrategia potilailla, joilla on edennyt eturauhassyöpä resistenttejä ADT ja sytotoksista hoitoa ja että galiellalactone on tärkeä yhdiste opiskeluun STAT3 signalointi eturauhassyövässä ja mahdollinen lähtökohta kehittämiselle tulevaisuudessa eturauhassyöpää huumeita.

Kiitokset

Tällä Kliinisen Sciences, Malmö, Lundin yliopisto, Skåne University Hospital, Malmö, Ruotsi haluamme kiittää Susan Evans Axelsson erinomaista apua eläinkokeissa, Elise Nilsson suorittamiseksi immunohistokemia ja Per-Anders Bertilsson erinomaista apua solujen lajittelu. Haluamme myös kiittää professori Zoran Culig laitoksella urologian, Innsbruck Medical University, Innsbruck, Itävalta antelias lahja LNCaP-IL6 soluissa.