Krooninen sairaus

tiivistelmä

vähentynyt herkkyys eturauhassyöpä (PC) solut sädehoito aiheuttaa merkittäviä haasteita klinikalla. Aktivointi epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), tyypin 1 insuliinin kaltaisen kasvutekijän reseptori (IGF1 R), ja ylikuuluminen näiden kahden signalointireittejä ovat sekaantuneet kehittämiseen säteilyn kestävyys PC. Tässä tutkimuksessa arvioitiin vaikutuksia kohdistaminen Molempien reseptorien sääntelystä radio-herkkyyden PC soluissa. Spesifiset inhibiittorit EGFR ja IGF1 R, erlotinibi ja AG1024, sekä siRNA kohdistaminen EGFR ja IGF1 R, käytettiin radio-herkistää PC-soluja. Tuloksemme osoittivat, että yhteistyössä estävä Molempien reseptorien merkittävästi vaimensi solujen kasvuun ja DNA-vaurioiden korjaus, ja lisääntynyt radio-herkkyyttä PC soluissa. Nämä vaikutukset olivat toteutetaan synergistinen inhibitio homologisen rekombinaation-suunnattu DNA korjaukseen (HRR), mutta ei estämällä ei-homologisen lopussa liittymällä (NHEJ). Lisäksi vaarantunut HRR kapasiteettia johtui vähensi fosforylaatio insuliinin reseptorin alustan 1 (insuliinireseptorisubstraatti 1) ja sen myöhemmissä vuorovaikutusta Rad51. Synergistisen vaikutuksen EGFR ja IGF1 R estäjien vahvistettiin myös paljaan hiiren ksenograftin määrityksessä. Tämä on ensimmäinen tutkimus, testaus yhteistyössä EGFR ja IGF1 R signalointi yhteydessä radio-herkkyyden PC, ja se voi tarjota lupaavaa adjuvantti terapeuttinen lähestymistapa parantaa tulosten PC potilaiden sädehoitoa.

Citation: Wang Y, Yuan JL, Zhang YT, Ma JJ, Xu P, Shi CH, et al. (2013) esto Sekä EGFR ja IGF1 R herkistettyyn syöpäsolujen jotta Säteily Synergistisellä Suppression DNA Homologinen rekombinaatio korjaus. PLoS ONE 8 (8): e68784. doi: 10,1371 /journal.pone.0068784

Toimittaja: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 joulukuu 2012; Hyväksytty: 2 kesäkuu 2013; Julkaistu: 12 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoittajat avustusta National Natural Science Foundation of China (nro 30100185, No. 81250036, No. 30973000, No. 30872583, nro 81072116) ja Natural Science Foundation of Shaan’xi Province (2009JQ4003). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PC) on yleisin maligniteetti ja toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien joukossa miespotilaiden [1]. Aikana syövän etenemisessä, alkuperäisen kasvu PC-solujen on androgeeniriippuvaisissa, ja nämä solut läpikäyvät apoptoosin kun androgen ehtyminen. Tämän seurauksena androgeeniablaatio pidettiin tavanomaista hoitoa PC yli 50 vuotta [2]. Monet potilaat lopulta kehittyi hormoni tulenkestävät aiheuttaman taudin kasvun androgen-tulenkestävien syöpäsoluja, mikä johtaa epäonnistumiseen androgeeniablaatio hoidon ja jättää potilailla, joilla on vähemmän hoitovaihtoehtojen [3], [4]. Yhdistelmä lopullinen paikallisia hoitoja, kuten eturauhasen yhdessä adjuvantin sädehoidon, on osoitettu parantaa selviytymisen PC potilaiden [5], [6]. Tällainen hoito kiistää resistenssin kasvainsoluissa. Sen vuoksi on äärimmäisen tärkeää kehittää uusia terapeuttisia strategioita voittamiseksi radioresistance ja parantaa radio-herkkyyttä kohdistamalla molekyylien koneiden androgeeni-riippumaton PC soluja.

kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja insuliinin kaltaisen kasvutekijän reseptoria (IGF1 R), kaksi tärkeintä tyrosiinikinaasireseptorit, kriittisiä rooleja syövän kehittymisen ja etenemisen kautta asetus soluproliferaatioon, apoptoosin, ankkurointi riippumattoman kasvun, invaasio, angiogeneesi, syövän koskemattomuus ja vastustuskykyä kemo- ja /tai sädehoidon [7]. Nämä kaksi reseptorit ovat usein yli-ilmennetään erilaisissa ihmisen syövissä, mukaan lukien PC [8], [9], [10], ja sen vuoksi voidaan käyttää ehdokkaita kohdennettuja syövän hoidossa. Todellakin, inhibiittorit EGFR ja toisen EGFR perheenjäsen Her2, kuten erlotinibi, Lapatinibin, Setuksimabia, ja Gefitinibi, ovat menestyksekkäin vaihtoehdot nykyisessä kliinisessä hoidossa ihmisen erilaisten syöpien, odotetusti kuitenkin kehittämään

de novo

vastus on ihmisellä havaittu pitkäaikaisen näiden lääkkeiden käyttöön, mikä viittaa olemassaolo ohituksen mekanismit kasvainsolujen [11]. Mekanistinen tutkimuksia solu- ja molekyylitason tapahtumia paljasti, että laaja ylikuulumisen EGFR ja IGF1 R signalointi tapahtuu eri tasoilla, ja että tukos EGFR signaali johtaa parannettu vastauksia IGF1 R ligandiin, IGF [12], [13]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kohteena sekä reseptoreihin samalla voitaisiin tarjota parempaa tehoa syövän hoidossa ja poistaa kasvainten vastustuskyvyn yksittäisen estäjä, kun taas herkkyyden parantamiseksi yksittäisen inhibiittoreita syövän hoidossa. Johdonmukaisesti, tutkimukset ovat osoittaneet, että kaksi kohdentaminen Molempien reseptorien lohkojen niiden vastavuoroinen hyperfosforilointi, estää proliferaatiota ja indusoi apoptoosia useita syöpäsoluissa kuten PC ja peräsuolen syöpä [14], [15].

Tässä tutkimuksessa olemme arvioi vaikutukset kohdistuvat sekä EGFR ja IGF1 R signalointi vastauksissa PC solujen y-säteilytys. Tuloksemme osoittivat tehoa kohteena sekä reittejä moduloinnissa käyttäytymistä PC solujen sädehoidon ja paljasti taustalla mekanismeja. Tämä on uraauurtava tutkimus, joka edelleen perusteltua kombinatorisista käytön estäjien EGFR ja IGF1 R reittejä hoidossa PC.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja käsittely

ihmisen androgeenista riippumaton PC soluja DU145, PC3, ARCaP

E ja ARCaP

M ja ihmisen normaalia eturauhasen epiteelin solulinjaa PrEC ostettiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). R503 oli peräisin Experimental Animal Center of neljännen Military Medical University. Solut käsiteltiin dimetyylisulfoksidin (DMSO, kuten ajoneuvon ohjaus), 10 uM erlotinibi (EGFR inhbibitor, Eton Bioscience, San Diego, CA) ja /tai 10 uM AG1024 (IGF1 R-estäjä, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) (koe-ryhmät) 1 h. Soluja säteilytettiin, kuten on kuvattu Liu et ai [16]. Joissakin kokeissa solut transfektoitiin myös insuliinireseptorisubstraatti 1 tai ei-äänenvaimennusjärjestelmien ohjaus (NSC) siRNA (50 nM, Invitrogen, Shanghai, Kiina) mukaan valmistajan protokollaa.

Muodosta säteilytys sietävien alalinjoja, PC-solut säteilytettiin 2 Gy päivässä, 5 päivää viikossa on FCC-8000C

60Co säteilyttäjällä. Kuuden kuukauden alalinjoja DU145 jotka selvisivät ionisoitu säteilytys perustettiin ja nimettiin DU145-IIRR. Nämä alalinjoja alistettiin sitten lääkehoitoa ja edelleen kokeita.

klonogeeninen määritys

synergistinen pesäkkeiden muodostumisen jälkeen yhdistettynä hoidon EGFR ja IGF1 estäjien ja säteilytyksen tutkittiin yksikerroksinen klonogeenisten määrityksissä. Soluja seerumipuutteinen yössä. Viisi tuhatta solua ympättiin 10-cm halkaisijaltaan kudosviljelylautasiin 10 ml väliainetta. Solut käsiteltiin AG1024 tai erlotinibi 1 h ja säteilytettiin ilmoitetuilla annostuksen jälkeen, kun ne oli kiinnitetty ruokia. Pesäkkeenmuodostusta määritettiin kristalliviolettiliuokseen värjäyksen käyttämällä Coulter hiukkanen laskuri 10. päivänä sen jälkeen, kun solu kylvö. Eloonjääntifraktio määriteltiin kloonaus tehokkuutta käsiteltyjen solujen jaettuna, että ohjaus- soluja. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

Virtaussytometria määrityksessä

analysoimiseksi solujen apoptoosin, soluja (1 x 10

4 /kuoppa) maljattiin 6-kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua solut seerumia 24 tuntia ja käsiteltiin sitten joko AG1024 tai erlotinibi 1 tunti. Sitten solut säteilytettiin annostuksella 2 Gy. 4 h säteilytyksen jälkeen, solut kerättiin trypsinoimalla, kiinnitettiin 70% etanolilla 4 ° C: ssa 2 h ja pestiin 5 ml: aan PBS: ää. Sitten solut värjättiin 1 ml propidiumjodidia (PI) liuosta (0,2 mg RNAasi A, 0,02 mg PI, ja 1 ml: lla Triton X-100). DNA sisältöä eri solusyklin vaiheisiin määritettiin FACS virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA). Havaitsemiseksi apoptoottisen nopeuden käsitellyissä soluissa, solut värjättiin anneksiini V: n ja PI, ja sitten alistettiin virtaussytometria, kuten on kuvattu [16]. Anneksiini V-positiivisia ja PI-negatiivisia soluja läpi aikaisen apoptoosin laskettiin kuten apoptoottisia soluja. Kaikki kokeet tehtiin kaksoiskappaleet ja esitetyt tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Proteiinin uutto ja Western blotting

eri ryhmien solut hajotettiin 1% SDS lyysipuskuria (Beyotime Inc., Peking, Kiina). Ydin- proteiinin uuttamalla, solut pestiin hypotonisella lyysipuskurilla (Teknova, Peking, Kiina), ja dounced solussa douncer (Wheaton Ltd, Millville, NJ). Ydin- komponentit erotettiin sitten sytosolin otteita sentrifugoimalla, jota seurasi lyysi RIPA puskuriin (Pierce Inc., Peking, Kiina).

Immunosaostaminen ja Western-blot-määritys suoritettiin, kuten ovat kuvanneet Liu et al [17 ]. Seuraavat vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling: anti-γH2AX, anti-insuliinireseptorisubstraatti 1, anti-fosfo insuliinireseptorisubstraatti 1 (pY612), anti-IGF1 R, anti-fosfo IGF1 R, anti-EGFR-, anti-fosfo-EGFR (Y1068), anti-β-tubuliinia , anti-ERK, anti-fosfo-ERK, anti-AKT, anti-fosfo AKT (S473), anti-DNA-PK, anti-Ku70, anti-Ku80, ja anti-XRCC4. Anti-Lamin vasta-aine oli peräisin Abnova (Shanghai, Kiina). Anti-HP-1α-vasta oli Milliporesta (Shanghai, Kiina). β-tubuliinia, Lamin ja HP-1α käytettiin lastaus valvontaa.

Immunofluoresenssikoe

γH2AX ja Rad51 pesäkkeet muodostus tutkittiin mukaan Barber et ai [18]. Immunofluoresenssivärjäystä varten γH2AX ja Rad51, solut kiinnitettiin 1% paraformaldehydissä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen 70%: sta etanolia 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen PBS: llä, joka sisälsi 0,1% Triton 10 minuuttia, solut tehtiin läpäiseviksi 0,5% Triton PBS: ssä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kolmen pesun jälkeen PBS: ssä, solut estettiin 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) PBS: ssä 60 min. Sitten anti-γH2AX (Trevigen, Gaithersburg, MD, 1:2000) tai anti-Rad51-vasta-ainetta (Oncogene tutkimus, 1:300) lisättiin 5% BSA: ta PBS: ssä ja inkuboitiin solujen kanssa 4 ° C: ssa yön yli varovasti ravistellen. Neljän pesun jälkeen PBS: ssä, soluja inkuboitiin pimeässä FITC-leimatun sekundaarisen vasta-aineen 5% BSA: ta laimennoksella 1:2000 varten γH2AX ja 1:200 anti-Rad51 tunnistus 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Seuraavat neljä pesua PBS: llä, tumat värjättiin pimeässä 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (1 ug /ml, Invitrogen) PBS: ssä 5 minuutin ajan, ja peitinlasit asennettu Fluoromount G ( Southern Biotech., Birmingham, AL). Objektilasit tutkittiin Leica fluoresenssimikroskooppi, jossa otetut kuvat CCD-kamera ja tuodaan Advanced SPOT Kuva-analyysi-ohjelmisto (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI). Kutakin käsittelyä varten kunnossa, γH2AX tai Rad51 signaalit määritettiin vähintään 50 solua. Kaikki havainnot validoitu vähintään kolmen erillisen kokeen.

Kokeita HR-suunnatun DNA korjaus (HRR) ja ei-homologisen end liittymällä (NHEJ) B

kvantitatiivinen

in vitro

homologinen rekombinaatio (HR) määritys tehtiin käyttäen PDR-GFP rekombinaatiolla reportteri-järjestelmän [19]. Lyhyesti, PDR-GFP-plasmidi ilmaistaan ​​kaksi funktionaalinen GFP-geenit transfektoitiin stabiilisti DU145-soluissa. Toinen plasmidi, joka koodaa restriktioentsyymillä I Sce-I ja kolmasosa ekspressoivan plasmidin punainen fluoresoiva proteiini (RFP), jossa on mitokondriaalisen lokalisointi signaali osoittaa transfektiotehokkuuden transfektoitiin transientisti DU145, jotka sisältävät PDR-GFP-plasmidin. Kun I-Scel ilmaistiin, se tuotti DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t) sisällä SceGFP fragmentti ja kannustanut HRR palauttaa ehjä GFP-geeni. DNA korjaamiseen HRR arvioitiin laskemalla solut sekä ydin- GFP-signaalin ja mitokondrioiden RFP signaalia vs. kaikki positiivisesti transfektoituja soluja, eli suhde solujen sekä punainen ja vihreä signaaleja joilla on vain punainen signaalit.

soluvapaa NHEJ määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [20] kanssa tumauutteiden 1 x 10

7 DU145-soluissa.

In vivo

kasvaimen sädehoidon

eläin kokeet hyväksynyt Etniset komitean neljännen Military Medical University (Xi’an, Kiina). 5 x 10

6 DU145 soluja esisekoitetaan matrigeelin (BD Biosciences) ihonalaisen pistoksen kylkeen 10-viikkoisen naaras-nude-hiiriin. Kaksikymmentä kaksi päivää myöhemmin (päivä 0), hiiret jaettiin satunnaisesti 5 ryhmään, 5 hiirtä ryhmää kohti, joka perustuu hoidot ne saisivat: eli ryhmä, kontrolli, ei ole käsitelty; IR ryhmä sai γ-säteilytys erilaisia ​​annoksia päivinä 3, 6, 8, ja 10, tässä järjestyksessä; IR + Erlotinibi ryhmä sai γ-säteilytys kuin säteilytys ryhmä, plus 100 mg /kg /vrk suun kautta Erlotinibi 10 päivän ajan; IR + AG1024 ryhmä sai γ-säteilytys, plus100 mg /kg /vrk suun kautta AG1024 on 10 päivää; IR + AG1024 ja erlotinibi sai γ-säteilytys, ja 100 mg /kg /vrk sekä lääkkeitä 10 päivää. Kasvaimen tilavuus (V) seurattiin joka kolmas päivä seitsemän viikon mittaamalla pituus (L) ja leveys (W), ja lasketaan V = 0,5 × P × L

2. Tulos ilmaistiin leviämisen indeksi (PI, PI = V hoito /V ohjaus).

Tilastollinen

vaikutus Erlotinibi ja AG1024 estoon solujen lisääntymisen, ksenografti kasvu, klonogeeniset selviytyminen ja kaspaasi aktivointi analysoitiin tilastollisesti käyttämällä paritonta kaksitahoiset Opiskelijan

t

testiä. Laatua koskevat tiedot esitettiin keskiarvona ± SD vähintään kolmen erillisen kokeen varten

in vitro

kokeita tai kaikista eläimistä ryhmän sisällä varten

in vivo

kokeita. P-arvo on ≤0.05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. * Ja ** on merkitty P 0,05 ja P 0,01 vastaavasti, verrattuna kontrollisoluihin kaikissa kuvioissa.

Tulokset

vähentäminen kasvaimen solujen elinkyvyn ja apoptoosin induktio kohdistaminen EGFR ja /tai IGF1 R ennen sädehoitoa

tässä tutkimuksessa ensin arvioi aiheuttamaa herkkyys eri syöpäsolujen säteilylle

in vitro

. Olemme kasvoi ja käsiteltiin eri syöpäsolulinjoissa kanssa erlotinibi (10 uM) ja /tai AG1024 (10 uM) 1 tunti ja sitten säteilytetään niitä 2 Gy. Tuloksemme osoittivat, että kasvainsolujen elinkelpoisuuden väheni merkittävästi ja tuumorisolujen apoptoosin parantaa säteilyttämällä eston sekä EGFR ja IGF1 R, verrattuna säteilytyksen yksin tai säteilyttämällä ja esto joko reseptorin (kuvio 1A, B). Erityisesti, verrattuna vehikkelillä käsiteltyyn kontrolliryhmään soluja, joko AG1024 tai erlotinibi merkittävästi vähentää kasvainsolujen elinkelpoisuuden epiteeli- PC-solulinjojen (P 0,05), mutta vahvin kasvua estävä vaikutus säteilyttämällä saavutettiin soveltaa samanaikaisesti estäjien (P 0,05, verrattuna AG1024 tai Erlotinibi hoitoa DU145, PC3 ja ARCaP

E-solut) (kuvio 1A). Sen sijaan, AG1024 ja /tai erlotinibi ei radio-herkistä normaalin eturauhasen epiteelissä solulinja PrEC (kuvio 1A). Tuloksemme osoittivat myös, että molemmissa DU145 ja PC3-solut, AG1024 vähensi merkitsevästi fosforylaatiota IGF1 R, kun taas Erlotinibi dramaattisesti esti fosforylaatiota EGFR, eikä osoittaa rajat aktiivisuus toisaalta reseptoriin osoittaa, että molemmat inhibiittorit toimivat voimakkaasti ja erityisesti (kuva S1).

, Radio-herkkyyden määritys käsiteltyjen solujen EGFR ja IGF1 R estäjiä. Syöpäsolut eri ryhmien käsiteltiin ilman (kontrolli) tai AG1024 (10 uM), erlotinibi (10 uM) tai molemmat 1 tunti ja käsiteltiin sitten radio-herkkyyden klonogeenisten määrityksessä. Jälkeen 10 päivää, kloonit kiinnitettiin ja värjättiin. Eloonjääntifraktio laskettiin mukaan pesäkkeiden lukumäärästä ja pinnoitus tehokkuutta. B, Radio-herkkyyden määritys käsiteltyjen solujen EGFR ja IGF1 R siRNA. Soluja eri ryhmien transfektoitiin ei-hiljentäminen ohjaus siRNA (NSC-siRNA), EGFR ja /tai IGF1 R siRNA, ja altistettiin sitten radio-herkkyyden klonogeenisten määritys, kuten on kuvattu paneelissa A. C, Apoptosis käsiteltyjen solujen EGFR ja IGF1 R estäjiä. Eturauhassyövän solulinjoja esikäsiteltiin AG1024 tai erlotinibi on ilmoitettuina pitoisuuksina 1 h, ja sitten säteilytettiin 2 Gy. 4 tunnin kuluttua, ne värjättiin anneksiini V ja propidiumjodidilla ja virtaussytometria määrittämiseksi prosentteina apoptoottisten solujen. D, Apoptosis eturauhassyövän solulinjoissa, jotka on transfektoitu EGFR ja /tai IGF1 R siRNA. Soluja eri transfektoitiin ohimenevästi NSC siRNA, IGF1 R siRNA tai EGFR siRNA: ssa 24 tuntia, ja sitten säteilytettiin 2 Gy. Apoptoosi analysoitiin kuten paneelissa C. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** P 0,01 verrattuna kontrolliin soluihin.

Lisäksi epiteelisolujen PC soluja, myös arvioi vaikutukset kohdistuvat sekä EGFR ja IGF1 R signalointi radio-herkistymistä vaste mesenkymaalisten-kuten PC-soluissa. Tätä tarkoitusta varten käytimme ARCaP

M, mesenkymaaliset vastine ARCaP

E kehittäneet Graham et ai [21]. Molemmat solulinjat osoittavat minimaalisia ilmaus androgeenireseptorin [22]. Yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen Buck et al [14] yhdistettynä hoito EGFR ja IGF1 R estäjien voinut synergistisesti estää mesenkymaalisten solujen kasvua vastauksena säteilytys, kuten se teki epiteelin kasvua (kuvio 1A).

Jotta epäspesifisen liittyviä vaikutuksia pienimolekyylisiä estäjiä, myös toisti kokeen kuviossa 1A käyttämällä siRNA spesifisiä EGFR ja IGF1 R (kuvio 1 B). Kuten kuvassa S2, sekä siRNA toimi tehokkaasti kaatamalla IGF1 R ja EGFR, vastaavasti. Jossa yhden tai kahden knockdovvn EGFR ja /tai IGF1 R siRNA, saimme samanlaisia ​​tuloksia kuin kuviossa 1A (kuvio 1 B).

Seuraavaksi tunnettu mahdollisia apoptoottisen vaikutuksia näiden kahden estäjien käyttämällä virtaussytometria määritystä. Kuten kuviossa 1C on esitetty, DU145, PC3 ja ARCaP

E-solut osoittivat parannettu radio-herkkyyden seuraavan kasvavia annoksia AG1024 ja /tai erlotinibi, kun ARCaP

M oli vain herkkä AG1024, mutta ei erlotinibi. Yhdistetty hoito Erlotinibi ja AG1024 synergistisesti radio-herkistää DU145, PC3 ja ARCaP

E soluja, mutta ei ARCaP

M-soluissa. Verrattaessa DU145 solujen PC3 soluihin, huomasimme, että entiset ovat herkempiä Erlotinibi kuin jälkimmäinen, koska 10pM erlotinibi aiheuttama vankka apoptoottisen vasteen yli 1 uM erlotinibin DU145 soluissa, vaikka ei paljon apoptoosin lisääntyminen havaittiin PC3 solut samalla annoksia Erlotinibi. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös siRNA kohdistamista EGFR ja /tai IGF1 R (kuvio 1 D).

Enhancement radio-herkkyyttä EGFR ja IGF1 R-estäjien avulla heikentyvän DNA: n DSB korjaus

Ymmärtää molekyylitasolla mekanismeista parannettu radio-herkkyyden syöpäsolujen vastauksena AG1024 ja /tai erlotinibi hoitoon, määritimme kapasiteettia DNA double-lohkon murtuma (DSB) in DU145 ja PC3-soluissa, koska DSB kohdistaa kaikkein vaarallisin vaikutus soluihin aiheuttama γ y-säteilyä. Seuraamalla tasoa histoni proteiinin H2AX fosforylaatio C-terminaalisen seriinin 139 jäännös, joka tunnetaan myös nimellä γH2AX, tunnettu ja herkkä DSB markkeri, osoitimme, että oli nopea ja kestävä fosforylaation H2AX 1 h kuluttua säteilytyksen molemmat apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään DU145 ja PC3-solut (kuvio 2A), joka nopeasti laski 4 tunnin ja palasi perustasolle 24 tunnin, mikä suorittaminen DSB korjaus. Sitä vastoin kasvainsolujen esikäsitelty AG1024, erlotinibi tai molemmat osoittivat viivästynyt H2AX fosforylaatio huippu 4 tuntia, ja jatkuva H2AX fosforylaatio till 24 h säteilytyksen jälkeen, mikä viittaa siihen, heikentynyt DSB korjaus jälkeen AG1024 ja erlotinibi hoitoon (kuvio 2A, B ). Lisäksi oli merkittävä ero AG1024 + Erlotinibi ryhmä ja AG1024 tai Erlotinibi ryhmä (5 ja 10 Gy, P 0,01), mikä osoittaa additiivista vaikutusta yhteistyön inhibtion DSB korjausprosessin (kuvio 2B).

A, DSB markkeri γH2AX ilmentyminen ajan funktiona sen jälkeen, kun säteilytys: Solut seerumia yli yön, sitten sitä käsiteltiin 10 uM AG1024 ja /tai 10 uM erlotinibi. Western-blot-soluja säteilytetään annos 2 Gy, ja kerättiin osoitetuissa aikapisteissä. HP-1α-proteiinia käytettiin latauskontrollina. Sitten aineisto kvantifioitiin Image J ohjelmisto ja ilmaistiin prosentteina valvonnan. B, Immunofluoresenssikoe havaitseminen γH2AX pesäkkeitä muodostumisen jälkeen säteilytyksen. Soluja käsiteltiin tai ei AG1024 ja /tai erlotinibi 1 h, ja säteilytettiin erilaisilla annoksilla. Soluja kiinnitettiin 24 tunnin kuluttua. Sisäkkeet osoittavat edustavat kuvat vihreitä γH2AX signaali ja sininen DAPI tumavärjäystä. C, DSB korjaus määritys HRR. Seerumin puutteessa DU145-solujen puuttuessa tai läsnä ollessa AG1024 (10 uM) tai erlotinibi (10 uM) transfektoitiin ohimenevästi kaksi vektoria, joista toinen ilmentävät l-Scel-cDNA tuottaa DSB: ihin GFP cDNA, ja toinen ekspressoi punainen fluoresoiva proteiini, jolla on mitokondrioon lokalisaatiosignaaliin osoittaa transfektion tehokkuutta. DNA korjaamiseen HRR arvioitiin suhde solujen sekä punainen ja vihreä signaaleja joilla on vain punainen signaalit. Sisäkkeet osoittavat edustavat kuvat soluista positiivisia ja negatiivisia HRR. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD n positiivisten solujen prosenttiosuus DNA: n korjaamiseen HRR kolmesta itsenäisestä kokeesta. D, DSB korjaus määritys NHEJ. DU145-soluja esikäsiteltiin kanssa tai ilman AG1024 (10 uM), erlotinibi (10 uM) tai molempia. Vastaavat tumauutteita inkuboitiin linearisoidun plasmidin pBluscript KS (+) solussa-free järjestelmä mitata NHEJ. Linearisoidun plasmidin DNA-hoitoa ydinvoiman uutteita (DNA vain) ja ydinvoiman ote kontrollisolujen ilman plasmidia (tumaekstrakti vain) käytettiin negatiivisena kontrollina. Nuclear ote R503 fibroblastien käytettiin positiivisena kontrollina. Nuolet osoittavat kannat linearisoidun plasmidin ja dimeerit. E, Western-blot-määritys havaitsemiseksi NHEJ liittyvää proteiinia. DU145-soluja esikäsiteltiin kanssa tai ilman AG1024 (10 uM), erlotinibi (10 uM) tai molempia, ja sen jälkeen säteilytettiin NHEJ liittyvien tumaproteiini (DNAPK, K70 /80, XRCC4: n). Lamin käytettiin latauskontrollina. * P 0,05, ** P 0,01 verrattuna kontrolliin soluihin.

Vaikutukset EGFR ja IGF1 R estäjien heikentynyt DSB korjaus estämällä HRR, mutta ei NHEJ

erottamaan onko alentunut DSB korjaus johtui vika HRR tai NHEJ, kaksi suurta väyliä DSB korjaus, me kvantitatiivisesti HRR käyttäen PDR-GFP rekombinaatio toimittaja ja tarkasteltiin NHEJ käyttämällä

in vitro

soluvapaa koe [20]. Kuten kuviossa 2C on esitetty, ja DU145-soluja, yhdistettynä hoidon AG1024 ja erlotinibi voimakkaasti vähentää HRR tasolla verrattuna ajoneuvon ohjaus- tai kunkin aineen yksinään (P 0,05). Sen sijaan, tumauutteen käsiteltiin yksittäisten estäjän tai molemmat eivät voineet muuttaa

in vitro

ligaatiolla pBluescript KS (+), verrattuna tumauutteen ajoneuvon ohjaus soluja (kuvio 2D). Tätä analyysiä varten ydin- ote R503 soluista käytettiin positiivisena kontrollina, kuten on osoitettu Yang et al. [23] Lisäksi, ekspression NHEJ liittyvien DNA korjaukseen proteiineja, mukaan lukien DNA-PK, Ku70, Ku80 ja XRCC4: n, ei vaikuttanut AG1024, erlotinibi tai molemmat DU145-soluissa (kuvio 2E), mikä viittaa siihen, että inhibitio näiden kahden signalointireittien ei heikentää NHEJ-aloitetaan DNA: n DSB korjaus, yksi yleisimpiä muotoja DSB korjaus nisäkässoluissa.

vastustamisesta ylikuulumisen eri tasoilla estämällä sekä EGFR ja IGF1 R

Aikaisemmat tutkimukset paljastivat laajoja välinen ylikuuluminen EGFR ja IGF1 R signalointireitin eri tasoilla [14]. Tuloksemme edellä ovat osoittaneet, että co-EGFR ja IGF1 R voi additiivisesti radio-herkistää PC solujen kautta heikentyvän HRR DSB korjaus. Tutkia tarkemmin, miten vuorovaikutus kahden reseptorin vaikuttaa DSB korjaus, suoritimme immunosaostus-Western-blot tarkastelemaan fyysistä vuorovaikutusta EGFR ja IGF1 R in DU145 ja PC3-soluissa γ-säteilytys. Tuloksemme osoittivat, että ilman säteilytystä, nämä kaksi reseptorit vuorovaikutuksessa toistensa kanssa sekä kasvainsolulinjoissa ja että tämä yhdistys ei muuttunut merkittävästi 24 tunnin säteilytyksen jälkeen (kuvio 3A). Lisäksi olemme määrittäneet alavirtaan signaalitransduktion yhden reseptorin vasteena ligandin muiden reseptoriin. Kuten on esitetty kuviossa 3B, ja DU145 ja PC3-solujen fosforylaatio EGFR kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla IGF-I kohtelu sekä soluissa, mutta oli merkittävästi vähentynyt, kun yhtäaikainen käsittely EGFR-inhibiittorin, erlotinibi. Samoin, fosforylaatiota insuliinireseptorisubstraatti 1, suuret IGF1 R signalointimolekyylin, on parannettu käsittelyn jälkeen kasvavien pitoisuuksien EGF, mutta estyi lisäämisen jälkeen AG1024 (kuvio 3C). Lisäksi olemme havainneet, että ligandi kunkin reseptorin, eli IGF-I: n ja EGF: n, oli riittävä aktivoimaan nämä kohdegeenien DU145 ja PC3-soluissa. Kuitenkin vahvin aktivaatio saavutettiin yhteistyössä hoidon sekä IGF-I ja EGF, kun taas tukos näiden reseptorien signalointia joko AG1024 tai Erlotinibi pystyi vähentämään aktivoituminen näiden kohdegeenien, mutta tehokkain väheneminen havaittiin DU145 ja PC3-solut esikäsitellään molemmat estäjiä (kuvio 3D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että yhtäaikainen käsittely EGFR ja IGF1 R-inhibiittorit pystyi tukahduttaa niiden ylikuulumisen ja vuorostaan ​​estää niiden alavirran signalointia, kuten PI3K /AKT-reitin ja MAPK-reitin.

, immunosaostus havaitsemiseksi EGFR /IGF1 R vuorovaikutusta. DU145 ja PC3-solut säteilytettiin annoksella 2 Gy. Sitten solun proteiinit uutettiin, ja ne alistettiin immunosaostukselle määrityksessä havaita EGFR ja IGF1 R vuorovaikutusta. B, IGF-I aktivoi EGFR DU145 ja PC3-soluissa. Solut seerumin puutteessa yön yli, ja käsiteltiin sitten IGF-I stimulaatiota 30 min. EGFR fosforylaatio havaittiin Western blot. C, EGF aktivoi insuliinireseptorisubstraatti 1, avaintekijä IGF1 R-signaalin väylän DU145 ja PC3-soluissa. Soluja seerumin puutteessa yli yön, ja sitten suoritettiin EGF stimulaatio 30 min. Insuliinireseptorisubstraatti 1 fosforylaatio havaittiin Western blot. D, MAPK tai AKT aktivointia jälkeen EGFR ja IGF1 R simulointi eston. DU145 ja PC3-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman AG1024 (10 uM), erlotinibi (10 uM), AG1024 ja erlotinibi; IGF (50 ng /ml), EGF (50 ng /ml) tai EGF: n ja IGF: ssa 30 minuuttia. Sitten ERK1 /2 ilmaisun ja phosphrylation, AKT ilme ja phosphrylation, insuliinireseptorisubstraatti 1 ilme ja phosphrylation määritettiin Western blotting. β-tubuliinia käytettiin latauskontrollina.

Vaikutukset EGFR ja IGF1 R estäjien tukahduttamisesta insuliinireseptorisubstraatti 1 /Rad51 välittämää homologisen rekombinaation

Nykyinen tiedot AG1024 ja Erlotinibi säännellä insuliinireseptorisubstraatti 1 fosforylaatio /aktivointi sekaantunut mahdollinen osallistuminen insuliinireseptorisubstraatti 1 /Rad51 välittämää HRR vastauksena y säteilytys PC-soluissa, kuten edellinen tutkimus osoitti myös [24]. Todellakin, meidän tiedot osoittivat, että insuliinireseptorisubstraatti 1 fosforylaatio indusoitiin γ-säteilytys huippu aktivointi saavutetaan 4 tunnin kuluttua γ-säteilytyksen DU145 ja PC3-soluissa, kun taas huippu insuliinireseptorisubstraatti 1 fosforylaation viivästyi 8 h kuluttua γ-säteilytyksen hoidon jälkeen AG1024 tai Erlotinibi yksin. Sen sijaan yhteistyössä hoito sekä AG1024 ja Erlotinibi vähensi insuliinireseptorisubstraatti 1 aktivointia ei pelkästään perustaso (0 h jälkeinen säteily), mutta myös koko ajan hetkinä aina 24 tuntia säteilytyksen jälkeen (kuvio 4A).

A, Western blot, joka osoittaa tason p-insuliinireseptorisubstraatti 1 eri ajankohtina sen jälkeen, kun 2 Gy γ-säteilytys DU145 ja PC3-soluja esikäsiteltiin kanssa tai ilman AG1024 (10 uM), erlotinibi (10 uM), tai molemmat 24 tuntia. β-tubuliinia käytettiin latauskontrollina. Edustaja geelikuva näkyy yläosassa ja määrän p-insuliinireseptorisubstraatti 1 /β-tubuliinin suhteen kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty pohjaan. B, immunosaostus osoittaa vuorovaikutus insuliinireseptorisubstraatti 1 ja Rad51 ydinvoiman ote DU145 ja PC3-soluissa. C, muodostuminen ydinvoiman Rad51 pesäkkeitä analysoituna immunofluoresenssivärjäyksen. DU145 ja PC3-soluja pidettiin kanssa tai ilman AG1024 (10 uM), Erlotinibi (10 uM) tai molempia (vasen neljä baaria), valetransfektoidun (pseudotreated), tai transfektoitu epäspesifinen ohjaus siRNA (NSC siRNA) tai insuliinireseptorisubstraatti 1 siRNA (oikea kolme baaria). Sisäkkeet osoittavat edustavat kuvat vihreitä Rad51 signaali ja sininen DAPI tumavärjäystä. Aineisto esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, verrattuna AG1024 /Erlotinib- käsitellään tai pseudotreated soluissa; ** P 0,01, verrattuna AG1024- tai erlotinibi käsiteltyjä soluja. D, Rad51 immunofluoresenssivärjäyksen of DU145 ja PC3-solut käsiteltiin LY292004, PD98059 tai Erlotinibi seurasi γ-säteilytys. Ydin- Rad51 pesäkkeet muodostuminen määritettiin sama kuin C. Upotekoristeinen kivi näyttää edustavat kuvat vihreitä Rad51 signaali ja sininen DAPI tumavärjäystä. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, verrattuna säteilytettyä vain solut.

Seuraavaksi määritetään fyysinen vuorovaikutus insuliinireseptorisubstraatti 1 ja Rad51 ydinvoiman osa solujen seurasi γ-säteilytys käyttäen immunosaostusta. Kuten on esitetty kuviossa 4B, vehikkelillä, AG1024, erlotinibi tai AG1024 ja erlotinibi ei merkittävästi muuta tasoa insuliinireseptorisubstraatti 1 tai Rad51 proteiinia, kun taas tasojen insuliinireseptorisubstraatti 1-liittyvä Rad51 oli vähentynyt huomattavasti käsitellyissä soluissa AG1024 plus Erlotinibi, joka on yhdenmukainen kanssa vähensi taso fosfo-insuliinireseptorisubstraatti 1 näissä soluissa. Nämä tiedot osoittivat, että AG1024 plus Erlotinibi hoito tukahdutti insuliinireseptorisubstraatti 1 vuorovaikutusta Rad51, mikä osoittaa EGFR ja IGF1 R yhteistyön eston voi estää DNA kaksinkertainen lohkon murtuma korjaus estämällä HRR.

Lisäksi olemme myös määrittivät solunosasijaintia Rad51 joka muodostaa ydinaseiden pesäkkeitä paikoissa DNA vaurioita. Tuloksemme osoittivat, että noin 15% apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään solut olivat positiivisia Rad51 ydin- pesäkkeitä altistumisen jälkeen y-säteilytys.