Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset tutkimukset soveltamalla suurikapasiteettisten sekvensointiteknologioihin ovat tunnistaneet useita toistuvasti mutatoitunut geenejä ja reittejä useiden syöpä genomit. Kuitenkin transkription seuraukset näistä genomisesta muutoksia syövän genomin jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa, suoritimme integroitu ja vertailevia analyysejä koko genomien ja transcriptomes 22 hepatiitti B -viruksen (HBV) liittyviä maksasolukarsinoomat (HCCs) ja niiden verrokkiin. Vertailu koko genomin (WGS) ja RNA-Seq paljasti paljon todisteita siitä, että eri geenimutaatioiden laukaista erilaisia ​​transkription muutoksia. Paitsi liitos-mutaatiot, mutta myös hiljaisia ​​mutaatioita koodaavat alueet, syvä introni- mutaatiot ja rakenteellisten muutosten aiheuttamia liittämiseen poikkeavuuksia. HBV integraatiot syntyy monipuolinen malleja virusten ihmisen fuusio transkriptien riippuen vaikuttaa geenin, kuten

TERT

,

CDK15

,

FN1

ja

MLL4

. Rakenteelliset vaihtelut voivat ajaa yli-geenien ilmentymistä, kuten WNT ligandeja, joissa /luomatta geenifuusioissa. Lisäksi ottamalla huomioon perimän mutaatioista aiheuttavat transkription poikkeamia, voisimme parantaa herkkyyttä vahingollisia mutaation havaitseminen tunnetuissa syöpää kuljettajan geenejä (

TP53, AXIN1, ARID2, RPS6KA3

), ja tunnistettiin toistuvia häiriöitä otaksuttu syöpä kuljettaja geenejä, kuten

HNF4A

,

CPS1

,

TSC1

ja

THRAP3

in HCCs. Nämä havainnot osoittavat, genomista muutoksia syöpä genomissa on monipuolinen transcriptomic vaikutuksia, ja integroitu analysointi WGS ja RNA-Seq voi helpottaa tulkintaa suuri määrä genomista muutoksia havaittu syövän genomin.

Citation: Shiraishi Y, Fujimoto A, Furuta M, Tanaka H, ​​Chiba Ki, Boroevich KA, et ai. (2014) Integroitu analyysi koko genomin ja transcriptome Sequencing paljastaa Diverse Transcriptomic Aberrations ajamana Somaattiset Perimän muutokset maksasyöpien. PLoS ONE 9 (12): e114263. doi: 10,1371 /journal.pone.0114263

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 28, 2014; Hyväksytty: 5. marraskuuta 2014; Julkaistu: 19 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Shiraishi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Somaattiset mutaatiot tiedot on talletettu ICGC tietokantaan (https://dcc.icgc.org/), joka on vapaasti saatavilla. Sequence raaka tiedostoihin WGS ja RNA-Seq on talletettu Euroopan Genome-Phenome Archive alle liittymisen koodia EGAD00001001035, ja niiden pääsyä ohjataan ICGC DACO.

Rahoitus: Rahoitusta tähän työhön tuli RIKEN presidentin Fund 2011 prinsessa Takamatsu Cancer Research Fund, Takeda Science Foundation, Grand-in tuki tieteellisen tutkimuksen innovatiivisia Areas (Integrative Systems ymmärtäminen Cancer for Advanced Diagnosis, Therapy and Prevention), ja Grant-in-Aid nuorten tutkijoiden ( B) 24700272. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Joka vuosi yli puoli miljoonaa ihmistä maailmassa on diagnosoitu maksasolusyövän (HCC), viides ja seitsemäs yleisin syöpä miehillä ja naisilla, vastaavasti [1]. Useimmissa tapauksissa HCCs kehittyvän hepatiitin tai kirroosi aiheuttama hepatiitti B -viruksen (HBV) infektio, hepatiitti C-infektio, alkoholismi, tai metabolista sairauksia, joiden HBV on kaikkein tärkein tekijä, erityisesti Kaakkois-Aasiassa ja Saharan eteläpuolisessa Afrikassa [1]. Vaikka erilaisia ​​geneettisiä alternations on havaittu HCCs, kuten mutaatiot

TP53

ja

CTNNB1

koodaa β-kateniinin [2], tarkemmin karakterisointi maksasyövän genomin vaaditaan tunnistamiseksi biomarkkereita personoidun lääketieteen ja tehokkaampi terapeuttinen lääkekehityksessä.

Viimeaikaiset edistysaskeleet suurikapasiteettisten sekvensointiteknologioihin voimme kattava havaitseminen somaattisten mutaatioiden syövän genomien [3] ja suurikapasiteettisten sekvensointi HCC genomien on paljastanut useita uusia syöpä kuljettaja geenejä, kuten kromatiinin sääntelyviranomaiset [4], [5] ja toistuva virus integraatiot klo

TERT-

ja

MLL4

loci [4], [6] – [8]. Nykyinen genomista tutkimukset keskittyvät pääasiassa mutaatioiden koodaavat alueet, ja muita mutaatioita, kuten emässubstituutioiden tai indeleitä ei-koodaavat alueet, ja rakenteelliset vaihtelut (SV) ohitetaan yleensä, koska niiden vaikutus syövän kehitykseen on vaikea arvioida ja tulkita niin kaukana. Yksi lähestymistapa arvioimiseksi deleteriousness Näiden mutaatioiden on tarkistaa transkription seurauksia näillä genomista muutoksia. Tätä tarkoitusta varten, laajempi käsityksiä suhteita geenimutaatioiden ja transkription poikkeamat syövän genomin ovat tarpeen. Useita esimerkkejä liitos poikkeavuuksien [9], [10] ja geenifuusioissa [11] aiheuttamien geenimutaatioiden tunnetaan, ja joissa käytettiin viime suuren läpimenon sekvenointitulosten tunnistettu syöpää erityisiä transkription poikkeavuuksia useissa syöpätyypeissä [12], [13 ]. On kuitenkin olemassa vielä muutamia tutkimuksia, jotka systemaattisesti vertailla geenimutaatioiden ja transkription poikkeamia kokonaisista Genomikartoituksen (WGS) ja transcriptome sekvensointi (RNA-sekvenssi) data. Sinänsä meillä on vielä vähän tietoa maisemaan syöpä transcriptome ja sen suhteita somaattisista mutaatioista.

Aiemmin sekvensoimme ja analysoitiin WGS 27 monentyyppisiä maksasyöpien [4], mutta vaikutukset suuri osa monipuolista somaattisista mutaatioista, myös ei-koodaavat mutaatioita ja SV, oli tuskin tulkita ainoastaan ​​WGS tiedot. Siksi tässä tutkimuksessa lisäsimme enemmän WGS ja niitä vastaavat RNA-Seq tietoja, täysin 22 HBV liittyvistä HCC näytteitä, määrittää geneettisiä muutoksia ja niiden transkription seuraus. ja suoritimme vertailevia ja integroituja analyysejä niiden WGS ja RNA-Seq data (ks. 1A varten yleiskuvan tutkimus). Ensin todettiin useita somaattisen genomista tapahtumia, kuten pistemutaatioita, lyhyt indeleitä, SV ja HBV integraatiot välillä WGS tiedot. Sitten, kun systemaattisesti kuvaavat syöpäspesifisessä transcriptomic poikkeavuuksien, kuten erilaiset liitos muutoksia (eksoni hyppii, liitos-site luistaa, pseudo-eksoni sulkeumat ja introni pidätysten, ks. 1 B), geenifuusiot joihin kuuluvat myös HBV-sekvenssit, yli -ilmaisu tapahtumia ja nukleotidin muutoksia RNA tasolla, tutkimme suhteet havaitaan genomista ja transcriptomic muutoksia. Lopuksi, joka tarjoaa profiili geenimutaatioiden ja transkription poikkeamia, keskustelemme edut integroidun analyysin WGS ja WTS herkille syövän havaitseminen kuljettajan geenejä.

(A) Ensin havaitsimme erilaisia ​​genomista ja transcriptomic muutokset RNA-Seq data 22 HCCs. Karakterisoitujen muutokset havaitaan kutakin analyysiä verrattiin paljastaa vaikutukset somaattisen genomista muutoksia transcriptomic poikkeavuuksia. (B) neljä tyyppiä silmukoinnin poikkeamia määritelty tässä tutkimuksessa. Green linjat ja nuolet osoittavat normaalia transkriptio taas punaiset viivat ja nuolet osoittavat poikkeava transkriptioiden.

Tulokset

Somaattiset tapahtumia havaitaan WGS

uutettu DNA 22 jäädytetty HBV liittyviä HCC kudokset ja niiden vastaaviin normaaleihin lymfosyyttien ja sekvensoitiin niiden koko genomit massiivinen rinnakkaissekvensointijärjestelmät. Kliiniset ja patologiset tiedot on esitetty taulukossa S1 S1 File. Keskimääräinen sekvensointi syvyydessä syövän ja ohjaus (lymfosyytit) genomit olivat 36,8 × ja 29.9x vastaavasti poistamisen jälkeen PCR päällekkäisyyksien (taulukko S2 S1 File). Kaikkiaan 209055 (3,597-19,063) somaattiset substituutioita havaittiin (taulukko S4 S1 File). Niistä, 1096 missense, 32 nonsense ja 35 silmukointi-site mutaatioita proteiinia koodaavat alueet, havaittiin, jossa liitos-mutaatiot määriteltiin olevan sellaisia, jotka vaikuttavat akseptorisilmukointikohtien ja luovuttajan sivustoja sijaitsee ensimmäisessä ja kaksi viimeistä emästä intronin sekvenssi (olennainen liitos-sivustoja). Niistä 5725 indeleitä tunnistettu koko genomit, 105 sijaitsivat proteiinia koodaavat alueet ja 6 vaikuttavat olennaiset jatkos-sivustoja. Päätellä kuljettaja geenit järjestyksessä tilastollisen merkityksen uusiutumisen oli

TP53

,

ARID2

,

BRD7

,

HNF4A

ja

RPS6KA3

(

P

-arvo 0,001, taulukko S5 S1 File). Lisäksi, 2254 SV (15-577 per kasvain) havaittiin, 1168 ja joka vaikutti selityksin proteiinia koodaavan geenejä. Lisäksi 86 (0-12 per kasvain) HBV integraatiot tunnistettiin 2 ja 5 toistuva integraatiot klo

TERT-

ja

MLL4

loci, vastaavasti, mikä on sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten [4] [6], [7], [8].

Jatkaminen harhautumista liittyvät geenimutaatioiden

Yhteensä-RNA: t uutetaan jäädytetty 22 HCCs ja niiden vieressä ei-syöpä maksakudoksissa joutuivat RNA-Seq, ja sen yhteenveto on esitetty taulukossa S3 S1 File.

ensin selvitettiin tilan selostukset noin olennaista jatkos-mutaatiot manuaalisesti tarkistamalla rinnastuksia sekvenssin lukee. Kun jätetään selostukset ilman ilmaisua, havaitsimme yhden tai useampia liitos poikkeavuuksien 19 pois loput 24 olennainen liitos-mutaatiot (3 jatkos-site luistaa, 6 eksonin hyppää, ja 13 intronia pidätysten, kuva S1 S2 File, Table S6 S1 File), mikä osoittaa, että somaattiset mutaatiot olennainen liitos-sivustojen näkyi voimakas vaikutus liitos poikkeavuuksia odotetusti. Vaikuttavat geenien mukana toistuvasti mutatoituja geenejä WGS analyysi (

TP53, ARID2, HNF4A

ja

RPS6KA3

) sekä

AXIN1

.

Jotta kattavan luettelon syöpää erityisiä liittämiseen aberraatioita, me järjestelmällisesti havaita neljänlaisia ​​liitos poikkeamia (jatkos-site slip, eksonin ohitus, pseudo-eksonin osallisuutta ja introni säilyttäminen, Fig. 1 B) käyttäen sisäisesti kehitetty algoritmeja (katso materiaalit ja menetelmät ). Kaiken kaikkiaan 292 liittämiseen poikkeamia tapahtumia (26 jatkos-site luistaa, 41 eksonin hyppii, 77 pseudo-eksonin sulkeumat ja 148 introni pidätykset) havaittiin (taulukko S7 S1 File). Koska me suoritetaan ei-suunnatulla RNA-Seq erottelee välillä intronin retention ja syövän-spesifisten antisense transkription oli vaikeaa, ja siten tulokset intronin pidätysten on huolellisesti tulkittava. Tämä luettelo sisältyy poikkeavuus tapahtumista vastaavat 10 olennainen liitos-sivustoja tutkittiin edellä. PCR ja Sanger sekvensoinnilla validoitu 154 erittäin syöpää erityisiä silmukointitapahtumilla ulos 239 havaittu. 72 tapahtumia, varmistimme tavoite liitos poikkeavuuksien sekä syövän ja ei-syöpä maksakudoksissa.

Lisäksi olennaista jatkos-mutaatiot tunnistimme erilaisia ​​mutaatioita ja lyhyitä indeleitä jotka näyttävät olevan välittömän syyn havaitun silmukoinnin poikkeavuuksien kautta muuttamalla muokata etäisyydet liitos tai -akseptori motiiveja. Kolme mutaatiota kohteen eksoni-introni-liitoskohtien ( 10 bp), mutta ei välttämätöntä silmukointi-site aiheutti silmukoinnin poikkeamia (Fig. 2A, B ja C). Kolme mutaatiot koodaavat alueet, jotka todennäköisesti syntyy uusia silmukointi-site luovuttajan kuviot, aiheutti liitos päällä liukuu (Fig. 2D, E ja F). Yksi mutaatio vaikuttaa

LAMB2

geeni oli synonyymi. Kaksi pseudo-eksonin osallisuuden joka vaikuttaa

THRAP3

ja

TSC1

näytti laukaista somaattiset mutaatiot syvälle introneja proksimaalisesti uuden liittämiseen risteysasemana (Fig. 2G ja H). Lisäksi seitsemän eksonin hyppii, jonka kyseinen geenit sisälsi useita tuumorisuppressorigeeneille kuten

IQGAP2

,

ST7

ja

TP53

, oli pitkä poistot välisen liitoskohdassa (Fig. 2I, J, ja K). Lisäksi kahdeksan intronin pidätykset oli uudelleenjärjestelyjä sisällä vastaavaa intronit, esimerkiksi

RB1 ​​

(Fig. 2 I). Ne osoittavat, että eri liitos poikkeavuuksien usein ohjaavat ole tärkeää vain jatkos-mutaatiot, mutta myös mutaatiot koodaavat alueet, mukaan lukien synonyymi hiljaiset mutaatiot, syvä introni- mutaatioita, ja SV. Toisaalta, suuri osa liitos poikkeamia (239/292 = 81,8%) ei ollut proksimaalisen mutaatioita (alle 1 kb) tai SV (500 kb). Jotkut näistä ovat todennäköisesti tuntui johtuvan epigeneettisellä muutokset [14], tai ilmaisulliset muutokset anti-sense selostukset kuten edellä mainittiin.

eksoni ja intronisekvenssit on nimetty isot ja pienet kirjaimet, vastaavasti. Punaiset sekvenssit ovat somaattiset mutaatiot HCCs. Sininen ja vihreä numerot puolella sekvenssit ovat muokkaa etäisyydet silmukoinnin luovuttaja-motiivin (AG | GTRAGT, [38]) ja silmukoitumisen akseptori-motiivin (YYYYNCAG | G), vastaavasti. Useimmat somaattiset mutaatiot muuttaneet muokata etäisyys liittämiseen luovuttajan motiiveja jolloin vastaava muutos voidaan parantaa.

Fusion selostukset liittyy genomisen SV

havaitsemiseksi geeni fuusioita annotoimaton selostukset ja /tai virus-sekvenssit, kuten HBV, käytimme Genomon-fuusio (katso materiaalit ja menetelmät). Olemme havainneet 245 ehdokasta ihmisen ihmisen fuusio transkriptit ja 192 geenifuusioissa jälkeen poistamalla ylimääräisiä silmukointivariantit (kuva S2 S2 File ja taulukossa S8 S1 File), 66 johon osallistui selostukset ilman geeni merkintä (UCSC tunnettujen geenien, RefSeq, Ensemble) , ja 21, jotka olivat un saumattu fuusio transkriptien jakavat raja-arvot niiden vastaavien genomista SV (kuva S3 S2 File). RT-PCR seurasi Sangerin sekvensoinnilla validoitu 113 (71,9%) 157 fuusio selostukset.

kautta verrattuna WGS data, 83 geenifuusiota todettiin tuettava somaattisten SV vastaavissa genomista sijainnit (kuva S4 S2 File). Vaikka jotkut geenifuusiosarjan ilman havaittu vastaavaa SV voidaan katsoa johtuvan joko vääriä positiivisia varten geenifuusioista RNA-Seq analyysiä tai vääriä negatiivisia varten SV WGS analyysi, suhteet ilmaisun arvojen fuusion selostukset että päätös vaikuttaa vähäinen osa-kloonien kanssa huomaamaton liittyvien SV (kuva S5 S2 File). Olemme myös havainneet 147 geenifuusioista ei-kasvain maksan kudoksissa (taulukko S9 S1 File), joista monet mukana geenien erittäin korkea ilmaisun arvot maksan kudoksissa, kuten

ALB

,

HP

, ja

TF

, mikä viittaa siihen, että havaitut fuusio selostukset voivat myös olla peräisin SV kanna sisällä vähäinen osa-klonaalisia maksasolut (kuva S5 S2 File).

niistä

NBEAP1

(

BCL-8

) fuusio transkriptit toistuvasti havaittu ja validoitu kaksi HCCs, yli-ilmentyminen ominaisia ​​kumpaankin näytteeseen (Fig. 3 ja kuva S6 S2 File). Uudelleenjärjestelyt johon

BCL-8

lokuksen yli-ilmentyminen oli raportoitu esiintyvän noin 4% diffuusi suuri-solulymfooman [15]. Monet fuusio selostukset vaikuttavat kromatiinin muutos reitin geenien (

CHD4

,

CTCF

,

KDM4C

ja

HDAC4

) havaittiin, ja fuusio selostukset, joiden tiedetään kasvain synnyssä (

TSC1

ja

SUFU

), komponentti keskeinen NF-KB-modulaattorin (

IKBKB

), ja keskeinen meditoija että WNT signalointireitin (

TCF7L1

) on myös validoitu [16]. Vaikka mitään erityistä yli-ilmentyminen johti näiden geenifuusioissa, me spekuloida useat niistä ovat menettämisestä toiminnon luonteen vaikka menetys fysiologisesti tärkeitä verkkotunnuksia (Kuva S7 S2 File).

sininen ja punainen palkit näytettävä FKPMs varten HCCs ja vastaavat ei-syöpä maksassa, vastaavasti, jotka on laskettu RNA-Seq tietoja. Punaiset ympyrät osoittavat näytteitä HBV integraatiot annetun lokusten yli-ilmennetty geenejä. Vihreä ympyrä osoittaa ne, joilla geenifuusioissa ja /tai SV, joka voi ajaa geeni yli-ilmentyminen.

HBV integraatiota ja sen vaikutukset transkription

Kaiken 33 HBV-ihmisen fuusiot havaittiin mukaan lukien vaikuttavat

TERT

(2 näytettä) ja

MLL4

(5 näytettä), ja WGS voitaisiin selvittää liittyy HBV integrointi sivustoja näistä 23 33 fuusioiden (taulukko S10 S1 File). HBV integraatiot liittyvän geenin fuusiot yleensä on breakpoints keskittyneet uran HBx geenien (1770 ep-1830 bp) positiiviseen suuntaan (kuva S8 S2 File), kuten on raportoitu aiemmin [8].

Mielenkiintoista , 7 diskreetti HBV

-tert

fuusio transkriptit havaittiin yhdessä näytteessä (RK010), joka näytti olevan peräisin yhdestä HBV integraation päällä (Fig. 4A). 4 ulos 7 variantit ovat päätelty olevan kehyksen. RK166 oli HBV integraation juuri ennen transkription aloituspaikat

TERT

, joka syntyy koko

TERT

transkriptio liitetty suoraan HBV-sekvenssin (kuvio S9 S2 File). Molemmat näytteet osoittivat merkitty yli-ilmentyminen

TERT

verrattuna muihin näytteisiin (Fig. 3). HBV

-CDK15

geeni fuusio havaitaan RK050 oli myös useita fuusio selostukset joista yksi in frame fuusio aiheutti

CDK15

yli-ilmentyminen (kuva S10 S2 File). Raja-arvot on saumattu HBV-ihmisen fuusio transkriptit keskitettiin HBV-genomin koordinaatin 458bp. Me kutsumme tätä kantaa HBV fuusio liitoksen hotspot.

(A) Seitsemän

HBV-TERT

fuusio transkriptit havaittiin RK010. Yksi transkriptio oli un-saumattu transkriptin jolla on sama murtuessa kuin genomisen integraation murtuessa. Muut olemassa liitettyjä muotoja ja GT-AG silmukoinnin motiiveja olivat näkyvissä raja-arvot on kaikki paitsi yksi. Sen lisäksi HBV fuusio liittämiseen hotspot (458 emäsparia), 3 fuusio transkriptit saumattu klo koordinaatti 1634 emäsparin koordinaatit HBV sekvenssit. Yksi fuusio transkriptio mukana vastikään luotu 87 emäsparin pseudo-eksonisekvenssissä sekä alasekvenssi eksonisekvenssit. (B) HBV integraatiot

MLL4

loci ja niiden tuloksena fuusio transkriptien viisi näytettä. Vihreä kolmiota genomin osoittaa HBV integraatio sivustoja. Useimmat fuusio selostukset jaettu breakpoints kanssa genomi HBV yhdentymisen koordinaatit molemmille puolille, ja siten ne näyttävät olemassa YK-liitettyjä muotoja. Fuusio selostukset RK141 ja RK159 todensi voidaan ketjuttaa (kuva S11). (C)

HBV-FN1

fuusio selostukset 7 viereisen ei-syöpä maksassa näytteitä. Lähes kaikki fuusio selostukset oli keskeytyskohdan HBV fuusio liittämiseen hotspot. Toinen fuusio selostukset joka oli raja-arvot on introni alueet näyttävät olevan YK-saumattu transkriptien ympärillä integrointi sivustoja.

Toisaalta, geenifuusiot joissa

MLL4

osoitti erilaisia ​​kuvioita. Vaikka useimmat havaittu geenin fuusio sisälsi HBV on 5′-päässä havaitsimme kaksi HBV-

MLL4

geenifuusiot: ne, joilla on HBV-5′-puolella ja ne, joilla on HBV-3′-puolella (kuva. 4B). PCR myöhempien Sangerin sekvensointia validoitu että nämä olivat osat ketjutettujen silmukoitumattoman fuusio selostukset

MLL4-

HBV

-MLL4

vähintään kaksi näytettä (kuva S11 S2 File). Ei ole todisteita liitos saatiin näiden fuusio selostukset paitsi yksi RK141. Vaikka hieman lisääntyneen ilmentymisen

MLL4

havaittiin HCC näytteissä, nämä out-of-frame HBV

-MLL4

fuusio selostukset viittaavat siihen, että HBV integraatiot on

MLL4

loci saattaa johtaa menetykseen-of-toiminto.

ei-syöpä maksakudoksissa, 161 HBV-ihmisen fuusio transkriptit havaittiin (kuva S12 S2 File ja taulukossa S11 S1 File). Erityisesti HBV

FN1

fuusiogeenit toistuvasti havaittu 7 ei-syöpä maksakudoksissa, ja suurin osa niistä oli useita liitoksen variantit mukaan lukien in frame fuusio transkriptien kanssa HBV fuusio liitoksen hotspot kuin HBV

TERT

fuusio (Fig. 4C).

Yli-ilmentymisen aiheuttaman somaattiset SV

on useita dokumentoituja esimerkkejä kromosomaalisia SV johtaa ektooppinen ilmentyminen loppupään onkogeenien kanssa ja ilman muodostumista geenifuusioiden [11]. Tässä me tutkimme suhteita somaattisten SV ja yli-geenien ilmentymistä vieressä raja-arvot. Kautta iteratiivinen soveltaminen Grubbs-Smirnov testi tunnistimme 3735 yli-ilmentyminen tapahtumia 3017 geenejä 22 HBV liittyvissä HCCs. Luettelo yli-ilmentymisen tapahtumia olivat

TERT-

ja

CDK15

yli-ilmentyminen ohjaavat HBV yhdentymistä. Proksimaalinen SV ja HBV integraatiot (vajaan geenialueisiin tai 500 kb ajan virran transkription aloituspaikkoja) voisi liittyä 63 ja 5 yli-ilmentyminen tapahtumia (taulukko S12 S1 File). Näiden raja-arvot, 44 tapahtumia promoottorissa alueita, mikä viittaa siihen, mekanismit yli-ilmentymisen muita kuin geenin fuusiot ovat yleinen ilmiö. Vaikka on vaikea vahvistaa jokainen havainnoitu yli-ilmentyminen tapahtuma on todella seurausta tunnistettu SV, tilastollisen merkittävyyden mukaan permutaatio testi (

P

-arvo 0,0001, kuva S13 S2 File) osoittaa monet yli- ilmentävät tapahtumia voitaisiin ajaa somaattisen SVS.

Mielenkiintoista, yli-ilmentyminen tapahtumista WNT ligandit toistuvasti havaittu kaksi HCCs. Yli-ilmentyminen

WNT1

ja

WNT10B

(Fig. 3) in RK107 oli liittynyt SV. Vaikka geeni fuusio liittyy

WNT10B

havaittiin, tämä ei näytä olevan suora syy yli-ilmentymisen, koska

WNT10B

oli tulopuolen fuusion selostukset (kuva S14 S2 File) . Sillä

WNT3A

yli-ilmentymisen RK010 (Fig. 3), havaitsimme fuusio selostukset joissa

WNT3A

ja muutama tukeva lukea paria heille WGS data viittaa siihen, monimutkainen uudelleenjärjestelyjä ympäri

WNT3A

locus voi ajaa sen yli-ilmentyminen. Lisäksi yli-ilmentyminen

c-KIT

liittyvine SV voitiin havaita RK092 (Fig. 3). Edellä esitetyt havainnot osoittavat, että SV voi olla tärkeä rooli yli-ilmentyminen onkogeenien ja molekyylikohteena geenejä.

Täydentävät havaitseminen somaattisten mutaatioiden ja syövän-RNA-editointi tapahtumien

Tutkimme syövän erityisiä SNVs (yhden nukleotidin muunnos) ja lyhyet indeleitä RNA-Seq tietoja käyttämällä EBCall algoritmia [17], ja havaitaan 6024 ehdokkaiden RNA-tasot, mukaan lukien 1205 nonsynonymous tai jatkos-mutaatiot. Niistä WGS analyysi integroitu RNA-Seq data (katso materiaalit ja menetelmät) osoitti todisteita 1912 somaattisista mutaatioista (545 nonsynonymous tai jatkos-sivustoja). On tietty taso korrelaatio alleelifrekvenssien somaattisten mutaatioiden havaittu olevan erittäin luottaa WGS ja RNA-Seq (korrelaatio tehokkuus = 0,466,

P

arvo = 2,2 × 10

-16 by Pearsonin tuote-hetki korrelaatio, kuva S15 S2 File), mutta määrä korrelaatio ei ole kovin vahva. Tämä voi johtua muutoksista posttranskriptionaalisella prosesseissa, kuten ei-sense lääkkeitä hajoamisen tai mRNA stabilointi tuomat somaattiset mutaatiot. Näistä 417 (112 nonsynonymous tai jatkos-sivustot) ei kutsuttiin somaattiset mutaatiot alkuperäisessä WGS analyysi pohtimatta RNA-Seq data, mukaan lukien useita tunnettuja kuljettaja geenejä, kuten

CTNNB1

ja

TSC2

. Monet somaattiset mutaatiot havaita tällä integroiva analyysi vahvisti Sangerin sekvensoinnilla syövän DNA: ita (74/83 = 89,1%), ja jotkut vahvistamaton mutaatiot voivat olla alle määritysrajan Sanger sekvensoinnin koska niiden alhaisen klonaalisia osuus. Siksi jotkut väärien negatiivisten somaattisia mutaatioita, jotka ovat seurausta alhaisesta sekvensointi kattavuus WGS analyysi voidaan pelastaa täydentävä RNA-sekvenssi analyysi.

Lopuksi mitään todisteita tukemaan variantin lukee ei kasvain eikä normaali WGS data tunnistimme 464 syöpää RNA-tapahtumia, jotka ovat ehdolla RNA-muokkausta [18]. Vaikka on vaikea vahvistaa aitouden jokaisen editointi tapauksessa mutaatio profiili oli runsaasti A: T G: C kuvioita ja esiintyi 3 ’UTR alueilla, mikä osoittaa, että monet heistä ovat todennäköisesti aiheuttamaa RNA-muokkausta ADARs (adenosiinideaminaasi) post-transkription vaiheessa [18] (Fig. 5A). Lukumäärä ehdokas-RNA-editointi tapahtumiin vaihtelivat suuresti näytteitä. Löysimme merkittävä korrelaatio (

P

-arvo = 2,38 x 10

-7 Wilcoxonin rank sum test) välillä olevien A: T G: C tapahtumia ja

ADAR

ekspressiotasoja (Fig. 5B), mikä olemassaolo uuden syövän alatyyppejä määräytyy määrän somaattisen RNA-editointi.

(A) määrä syöpää RNA mutaatiotapahtumasta (RNA editointi ehdokasta) ja niiden substituutiomallien jokaisesta näytteestä. (B) sirontakuvaajan välillä olevien A: T G: C RNA-editointi tapahtumia ja

ADAR

lauseke arvo (FKPM) lasketaan koko transcriptome järjestyksessä tiedot. On olemassa merkittävä korrelaatio (

P

-arvo = 2,38 x 10

-7 Wilcoxonin rank sum test) välillä olevien A: T G: C tapahtumia ja

ADAR

ekspressiotasoja.

maisema genomista ja transcriptomic häiriöitä HBV: hen liittyvään HCCs

Ottaen huomioon, että monet transcriptomic aberraatioita johtuvat genomista muutosten havaitseminen transcriptomic muutokset, kuten liitos poikkeavuuksien fuusio selostukset, herättää suuri todennäköisyys olemassaolosta proksimaalisen genomista muuttuu. Tämän aspektin mukaan täydentävää käyttöä RNA-sekvenssi WGS analyysissa edelleen pelastettiin 64 yhdistelmiä geenimutaatioiden ja niihin liittyvät transkription poikkeamia (katso materiaalit ja menetelmät). Kaikkiaan 252 geenimutaatioiden aiheuttaa transkription poikkeamia (GMTAs) havaittiin.

Tämän integroidun analyysin WGS ja RNA-Seq, voisimme saada kattavaa profiilit genomista ja transcriptomic muutoksia, kuten pistemutaatiot, indeleitä, rakenteelliset muunnelmia, liittämiseen poikkeavuuksien geenifuusioissa antaa jokaista geeniä. Täällä, kriittinen ongelma on erottamaan syövän kuljettajia pelkästään matkustaja tapahtumista käyttämällä näitä profiileja. Itse asiassa, vaikka toistuva SV ( = 3 HCCs) esiintyi 12 geenejä (

C10orf11

,

CIT

,

CLTC

,

CNTNAP2

DSCAML1

,

eys

,

FHIT

,

SUURI

,

LRP1B

,

MACROD2

,

MAGI3

,

TTC28

), monet niistä sijaitsevat tai hyvin lähelle yhteinen hauras alueilla [19] ja itse ei havaittu olevan mitään vaikutusta transkriptio (kuva S 16a S2 File) , mikä useimmat niistä ovat matkustaja SV tapahtuneen epävakaa genomialuetta. Jotta voitaisiin poistaa matkustaja tapahtumia, me vain harkita SV osoituksena liittyvät transkription poikkeamia, mikä on myös hyödyllistä poistaa vääriä positiivisia löydöistä WGS analyysiin. Toisaalta, toistuva geenifuusiot ( = 3 HCCs) todettiin 6 geenien (

ALB, CES1, FGA, SEPP1, SERPINA1,

ja

TF

). WGS analyysi ei havainnut yhtään SV liittyvät näihin fuusiot (kuvio hammastuksen S 16b S2 File), mikä tarkoittaa, että nämä fuusiot näyttävät tulevan vähäinen osa-klonaalisia soluja tai esineitä, eikä niitä saa kohdistuvista paineista kloonilaajenemisen syöpäsoluja. Nämä havainnot tukevat myös tärkeää yhdistelmien transkription poikkeavuuksien liittyvään genomin mutaatioita.

Tässä WGS analyysissä havaittiin, että GMTAs keskittyivät merkittävästi mutatoitunut geenejä (kolme

TP53

, kaksi

HNF4A

ja

RPS6KA3

, yksi

ARID2

), mikä osoittaa niiden vaikutusta syövän synnyssä (Fig. 6). Edellä mainittujen joukossa kahdeksan GMTAs, neljä oli SV ja ei voitu havaita ainoana tutkimus koodaavat alueet, mikä viittaa siihen, että yhdistelmä WGS ja RNA-sekvenssi-analyysi on tehokas havaitsemaan ehdokkaita kuljettajan geenejä. Siten

HNF4A

on todennäköisesti uusi kuljettajan geeni maksasyövän, sekä

ARID2

[4] ja

RPS6KA3

[20].

HNF4A

on kriittinen rooli säätelyssä useiden metaboliareitit maksassa sekä maksasolujen erilaistuminen, ja alas-säätely

HNF4A

on osoitettu liittyvän HCC [21] , [22]. Lisäksi avain geenien WNT signalointireitin (

APC, AXIN1, CTNNB1, TCF7L1, TCF7L2

ja WNT ligandit) on usein mutatoitunut (11 mutaatiota) yhdeksässä HCCs, joista kuusi vaikuttanut heidän transkription seurauksia GMTAs.

luettelo geenit uutettiin (1) merkittävästi mutatoituja geenejä WGS-analyysi, (2), jossa on vähintään 3 mutaatiota (pistemutaatioita tai indeleitä koodausalueilla tai GMTAs), (3), jossa ei ole alle 2 GMTAs ja rekisteröity syövän geeni väestönlaskenta [17]. (4) mukana WNT signalointireitillä, (5)

TERT

tai

MLL4

.

Keskustelut

Kautta vertaileva ja integroiva analyysi WGS ja RNA-Seq, saimme useita todisteita siitä, että genomista mutaatiot, mukaan lukien ei-koodaavat mutaatioita, SV ja virus integraatiot, voi aiheuttaa erilaisia ​​transcriptomic aberraatioita, kuten liittämiseen muutoksia, geenifuusiot ja yli-ilmaisuja. Huolimatta paljon näyttöä siitä, että synonyymi hiljainen mutaatiot koodaavat alueet ja syvä introni muutokset johtavat vakaviin sairauksiin häiritsemällä transkriptio [23] – [25], ne ovat usein huomiotta nykyisten syövän Genomikartoituksen tutkimuksia, ja sama pätee SV. Siksi suorittavat RNA-Seq yhdistettynä WGS on välttämätöntä tulkita seurauksia somaattisen muutoksia mukaan lukien ei-koodaavat alueet ja SV syövän genomeja. Lisäksi käyttämällä WGS ja RNA-Seq täydentäviä, emme pelasti paitsi useita muita somaattisten mutaatioiden lisäksi myös silmukoinnin aiheuttamia virheitä genomista mutaatioita, jotka suppeasti jäi kriteerit kutsutaan mukaan yhteen analyysiin.

vuonna maksasyövän genomin, HBV integraatiot havaittiin usein yhtenä SV ja tässä tutkimuksessa havaitsimme, että HBV integraatiot aiheuttanut erilaisia ​​transcrptic muutoksia kuten virus-ihmisen fuusioita. Kiinnostavaa kyllä, myös havaittu toistuvia HBV

FN1

fuusio tapahtumia kuin syövän maksan kudoksissa. Vaikka aikaisemmat tutkimukset osoittivat myös, että HBV integraatiot

FN1

loci voisi olla erityinen viereisiin ei-syöpä maksakudoksissa genomin tasolla [6], [7], he eivät havainneet tuloksena fuusio selostukset. Taajuus HBV

FN1

fuusio tässä tutkimuksessa (31,8% = 7/22) oli huomattavasti korkeampi kuin aiemmissa tutkimuksissa (5,6% (= 5/88) [6] ja 10,0% (= 4/40) [7]). Tämä pääasiassa näyttää olevan koska HBV integraatiot

FN1

lokuksessa usein päässeen vähäinen osa uniklonaalisten väestön ei-syöpä maksasoluja, jotka usein jäänyt alhainen perusteellinen Genomikartoituksen. Kuitenkin RNA-Seq analyysi mahdollistaa herkempiä ennustamiseen Saharan klonaalisia HBV integraatio tapahtumia, kun ne tuottavat riittävän suuri määrä poikkeavan selostukset. Paradoksaalisesti että HBV integraatiot

FN1

loci ei esiinny Tuumorinäytteissä merkitsee, että

FN1

ei ole pelkästään altis satunnainen HBV integraatiot; HBV

FN1

fuusio selostukset voi olla tärkeä rooli maksan fibroosi tai kirroosi, tai se voi parantaa syövän kehittymistä solujen lähelle niitä, joilla on HBV

FN1

fuusioista.