Krooninen sairaus

tiivistelmä

Arf tuumorisuppressorin toimii anturin onkogeenisten signaaleja, torjumaan poikkeava proliferaatio suuri osa aktivoimalla p53 transkription ohjelman, vaikka määrä p53-riippumattoman toiminnot on kuvattu. Asennus viittaavat siihen, että, lisäksi edistää tuumorigeneesiä kautta häiriöitä homeostatic tasapainoa solujen lisääntymisen ja apoptoosin ilmeisestä syöpäsolujen, geneettiset muutokset johtavat tuumorisuppressoriproteiinia lakkaa toimimasta tai onkogeeni voitto toiminto voidaan myös yllyttää kasvainten kehittymiseen kautta vaikutuksia kasvaimen microenvironment. Siirtogeenisessä hiirimallissa monivaiheisen haiman neuroendokriinisten syövän synnyn (PNET) ohjaavat estämällä kanoninen p53 ja Rb tuumorisuppressoreita SV40 suuri T-antigeeni (Tag), stokastinen eteneminen kasvaimia on rajoitettu osittain vaatimus aloittamisen angiogeenisen kytkin. Huolimatta estäminen p53 Tag tässä hiiri PNET mallissa, samanaikainen häiriintyminen Arf kautta geneettinen Knockout johti merkittävästi kiihtynyt väylän kasvaimen muodostumisen, joka yllättäen ei ohjaa muutoksiin kasvainsoluproliferaation tai apoptoosin, vaan kautta aikaisemmin aktivointi angiogeenisen vaihtaa. Asettamisessa perustuslaillisen p53-geenin tyrmäyksellä, menetys Arf kiihtyi kasvainten kehittymiseen, vaikkakin vähäisemmässä määrin. Nämä havainnot osoittavat, että Arf menetys toiminto voidaan edistää kasvaimen kehittymisen kautta helpottaa angiogeneesin, ainakin osittain, kautta p53-riippumattomien mekanismien.

Citation: Ulanet DB, Hanahan D (2010) menetys p19

Arf Helpottaa angiogeenisten Switch ja kasvaimen vihkimyksen monivaiheisessa Cancer malli kautta p53-riippuvaiset ja Independent mekanismit. PLoS ONE 5 (8): e12454. doi: 10,1371 /journal.pone.0012454

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 02 kesäkuu 2010; Hyväksytty: 03 elokuu 2010; Julkaistu: 27 elokuu 2010

Copyright: © 2010 Ulanet, Hanahan. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta National Cancer Institute (DH, R01CA45234) ja AP Giannini Foundation for Medical Research (DBU; https://www.apgianninifoundation.org/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ARF (vaihtoehtoinen lukukehys; p14

ARF ihmisen, p19

Arf hiiren) tuumorisuppressorin toimii anturi hyper-proliferatiivisia signaaleja, jolloin p53-riippuvaisen kasvun pysähtymiseen ja apoptoosiin [1], [2], [3]. Vaikka ARF ei ilmaistu tuntuva tasolle useimmissa normaaleissa kudoksissa, onkogeenin aktivaatio laukaisee sen ilme [4], jolloin estämällä MDM2 ubikitiinipromoottori ligaasilla ja vakauttamiseen p53 [5]. Inhibition p53-reitin, yleisimmin kautta mutaatiot

p53

itse inaktivaatio

ARF

, tai monistus

MDM2

on ajateltu olevan kriittinen vaihe synnyssä useimmat ihmisen syövistä [6]. Vaikka mutaation

p53

ja

ARF

kasvaimissa ovat suurimmaksi osaksi toisensa poissulkevia tapahtumia [7], asennus todisteet viittaavat siihen, että suhde p53 ja ARF ei ole tiukasti lineaarista ja pisteitä p53 riippumattaman tuumorisuppressori toiminnot ARF [8], [9]. Alkuperäinen in vivo todisteita mahdollisesta irrota välillä ARF ja p53 tuli siihen toteamukseen, että yhdistetty

p19

Arf

ja

p53

puute hiirillä johtaa syntymistä kasvain kirjo koostuu laajemman kasvaintyypeissä kuin joilta puuttuu joko geeniä [9]. Myöhemmin tehdyssä tutkimuksessa DMBA /TPA kaksivaiheinen hiiren ihon syövän synnyn malli paljasti nopeutettua kasvuvauhti syyliä on

p19

Arf

vajausta verrattuna

p53

vajausta geneettinen tausta [10]. Vastaavasti

p19

Arf

mutta ei

p53

puute helpottaa melanooma kehitystä siirtogeenisen hiiren mallia kautta helpotusta p53-riippumattoman vanhenemista polku [11]. Uudemmassa tutkimuksessa todettiin kontekstiton riippuvuus tuloksista

p19

Arf

menetys aikana oncogenesis asettamisessa

PTEN

-puutos, että

p19

Arf

menetys opetetaan osittainen estävä toiminto aikana eturauhasen syövän synnyn, mutta poisti vanhenemista ja edistänyt hyperproliferaation ja transformaatio hiiren alkion fibroblasteissa. Molemmissa asetukset tasauspyörästön tulos

p19

Arf

katoaminen tapahtui ilman vaikutuksia p53 toimintaa [12].

siirtogeeninen hiirimallissa monivaiheisen haiman neuroendokriinisten syövän synnyn (PNET) , RIP-Tag2, ilmentymä SV-40 T-antigeeni (Tag) haiman β-soluissa johtaa estyminen tuumorisuppressorien p53 ja Rb, edistämällä ajallisesti vielä määritelty stokastinen monivaiheisen reitin kasvaimien syntyyn. Huolimatta onkogeenin ilmentyminen kaikissa ~400 hiiren haiman saarekkeiden, toissijainen tapahtumia tarvitaan eteneminen kunkin vaiheen polku kasvaimiin [13], [14]. Suurin osa, mutta eivät kaikki normaalit saarekkeet kehittyä hyperplastic /dysplastic vaurioiden koko suunnilleen 14 viikkoa elinikää RIP-Tag2 hiirillä. Samoin vain osa (~15-20%) hyperplastisten saarekesolujen vaurioiden käytävä angiogeenisten kytkin, ja vain murto-osa (-25%) näistä angiogeenisten saarekkeet myöhemmin edetä kiinteitä kasvaimia. Edistäminen hyperplastista kytkimen arvellaan olevan osittain välittyy kasvu /eloonjäämisen tekijä, IGF-II, koska sen ilmentyminen indusoidaan samanaikainen puhkeamista β-solujen hyper-lisääntymistä [15]. Uudemmassa tutkimuksessa on tunnistettu yhdistyksen välillä microRNA ilmaisun allekirjoituksia eri RIP-Tag2 tumorigeneesin vaiheita, mistä seurasi, että muutokset ilmaus näiden miRNA voitaisiin pelissä rooli ajo nämä ”kytkimet” [16].

Haimme tässä tutkimuksessa onko Arf oli p53-riippumatonta toiminnot tukahduttamaan syövän etenemisen RIP-Tag2 PNET mallin kautta ristejä hiirille kantaen geneettistä knock-out

Arf.

aiempi tutkimus osoitti, että geneettinen tyrmäys

p53

tässä mallissa ei johtanut nopeutetussa polku kasvaimen muodostumisen, ja itse asiassa, beta kasvainsoluproliferaation vähennettiin, todennäköisesti seurauksena epävakauden SV-40 iso T antigeeni-onkogeenin, johon se sitoutuu [17]. Sen sijaan osoitamme tässä, että menetys

Arf

merkittävästi kiihdyttää kasvaimen muodostumisen kautta helpottaa angiogeenisen kytkin. Nämä tutkimukset tarjoavat

in vivo

näyttöä p53-riippumatonta toimintoja Arf ja ehdottaa uutta roolia Arf koska vaimennin kasvaimen angiogeneesiä.

Tulokset

Knockout on

Arf

kiihdyttää RIP-Tag2 syövän etenemisen ilman merkittäviä vaikutuksia tuumorisolujen apoptoosiin /lisääntymiseen

yhdenmukainen tunnetun induktion p19

Arf vastauksena kasvaimia signaalit [4],

Arf

mRNA ilmentyminen havaittiin indusoituvan SV-40 Tag ilmentävien hyperproliferatiivisia saarekkeiden verrattuna normaaliin saarekkeet, joissa on vielä enemmän kuin eteneminen angiogeenisten vaurioiden ja kiinteitä kasvaimia RIP-Tag2 hiiret (kuvio 1). Sen määrittämiseksi, ovatko Arf voidaan tukahduttaa kasvainten synnyssä asettamisessa p53 eston, arvioimme vaikutuksia geneettisen tyrmäys

Arf

tämän reitin. Merkillistä, menetys Arf johti erittäin merkittävä, lähes 5-kertainen kasvaintaakkaa (kuvio 2A, p 0,0001); oli lisäksi 1,8-kertainen kasvaimen numero (kuvio 2B, p = 0,002). Heterotsygoottinen menetys Arf johti myös merkittävään kasvuun kasvaintaakkaa (p 0,001) ja kasvaimen numero (p = 0,02) verrattuna

Arf

villin tyypin RIP-Tag2 hiirillä. Menetys villityypin

Arf

alleelin ei tapahtunut missään

Arf

+/-

kasvaimet tutkittiin (kuva S1).

mRNA-tasot on

Arf

arvioitiin käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR: llä cDNA tuotettu RNA altaat normaalien ei-transgeenisten luotoa, ja hyperplastinen saarekkeet, angiogeenisen saarekkeita (eristetty saarekkeita 5-10 hiiristä yhdistettiin) ja kasvaimet (yhtäläiset RNA-määrien eristettiin 10 kasvaimia vähintään 5 hiirtä yhdistettiin) RIP-Tag2 hiirillä. Geenien ilmentyminen normalisoitu ja piirrettiin suhteessa MGUS ilmaisua.

(A, B) Vaikutukset heterotsygoottisten ja homotsygoottisia tyrmäys

Arf

kasvaintaakkaa (A; * p 0,001, * * p 0,0001 verrattuna

Arf + /+

; eroa

Arf +/-

ja

Arf – /-

hiirillä ei ollut tilastollisesti merkitsevä) ja kasvaimen numero (B ; * p = 0,02, ** p = 0,002) 12 viikon ikäistä RIP-Tag2 hiirillä. Keskiarvot +/- SEM 15 (

Arf + /+

), 17 (

Arf +/-

) tai 20 (

Arf – /-

) hiirtä /ryhmä on osoitettu. Mann-Whitney testi tilastollista merkittävyyttä. (C) Apoptosis, määritettynä TUNEL merkintöjä hyperplastic saarekkeiden (Hyp), angiogeeninen saarekkeiden (Ang), ja kasvaimet (Tum) kohteesta

Arf

+ /+

tai

Arf

– /-

RIP-Tag2 hiirillä. Keskiarvot +/- SEM porrastettu leesiot 6-7 Yksittäisten hiirien jokaisen genotyypin on merkitty. Kokonaismäärän leesioiden analysoitiin jokaisen genotyypin /vaurion vaiheessa ovat seuraavat:

Arf + /+

(Hyp: n = 27; Ang: n = 33; Tum: n = 14);

Arf – /-

(Hyp: n = 18; Ang: n = 25: Tum: n = 22). (D) leviämisen, mitattuna% solujen BrdU eri vaiheissa saarekkeen vaurioiden 4 yksittäisten

Arf + /+

(Hyp: n = 21; Ang: n = 24, Tum: n = 12) ja

Arf – /-

(Hyp: n = 18; Ang: n = 22, Tum: n = 24) RIP-Tag2 hiirillä.

Koska aiemmin osoittanut kykyä ARF aiheuttaa solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin riippumatta p53 [9], [18], [19], [20], [21], tarkastelimme muutoksia apoptoosin ja leviämisen arvioimana TUNEL merkintöjen ja BrdU vastaavasti pre-neoplastisia ja tuumorileesioissa välillä

RIP-Tag2; Arf

+ /+

ja

Arf

– /-

hiirillä. Yllättäen emme kyenneet havaitsemaan mitään merkittävää vaikutusta menetyksen Arf joko näiden parametrien missä tahansa RIP-Tag2 vaiheissa (kuvio 2C, D). Sen varmistamiseksi, että emme unohtaa hienovaraisia ​​vaikutuksia solukierron säätelyssä /lisääntymistä, lisäksi BrdU, joka mittaa prosenttiosuus solujen S-vaiheen, me arvioi myös proliferatiivinen indeksi immunovärjäyksellä varten fosfo-histoni H3, joka on markkeri soluille M-vaiheessa. Kanssa BrdU-inkorporaatio määrityksessä, ei ole merkittävää eroa solujen prosenttiosuus M-vaiheessa havaittiin, kun menetys Arf (kuva S2). Lisäksi vakaa knockdovvn

Arf

käyttämällä

Arf

kohdistaminen shRNA solulinjassa johdettu villin tyypin RIP-Tag2 kasvain ei ollut vaikutusta kasvuun syöpäsolujen in vitro (kuvio 3).

Tuumorisolut transdusoitu stabiilisti ei-hiljentäminen (NS) tai

Arf

hiljentäminen shRNA. (A) knockdovvn Arf proteiinin ilmentymisen

Arf

kohdistaminen shRNA. β-aktiini-proteiinin tasot ilmoitetaan kontrollina proteiinin kuorman. (B) vaikutus

Arf

Knockdown kasvainsolujen kasvuun

in vitro

. Keskiarvot +/- SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena osoitetaan.

Menetys Arf helpottaa angiogeenisen kytkin

tutkimaan, miten tyrmäys

Arf

saattaa kiihdyttää kasvaimen kasvua ilman muutoksia β-solujen lisääntymisen tai apoptoosin, me arvioi menetys Arf voitaisiin vaikuttaa jokin luontainen esteitä, jotka rajoittavat siirtyminen onkogeenin ilmentävien β-solujen haiman saarekkeiden läpi eri vaiheet kasvainten muodostumiseen. Huolimatta ilmaus Tag onkogeenin kehitysmaissa haima alkaa alkion päivänä 9, on viivästynyt satunnaista aloittamisen saareke liikakasvuun useita viikkoja. Sen määrittämiseksi, onko menetys Arf voisi helpottaa aikaisemman aloittamisen hyperplastista kytkimen, tutkimme prosenttiosuus liikauudiskasvuisten luoto vaurioiden (määritettynä värjäämällä Ki67 leviämisen merkki) sekä 3- ja 5-viikon ikäisten

RIP -Tag2; Arf

+ /+

ja

Arf

– /-

hiirillä. Ei merkittävää eroa prosentteina hyperproliferatiivisen saarekkeiden havaittiin jompikumpi näistä vaiheista (kuvio 4A), vaikka 5-viikon iässä, saarekkeiden

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

hiiret olivat keskimäärin suurempia (kuva S3A, 1,5-kertainen lisäys; p = 0,007). Lisääntynyt leesion koko ei ollut lisääntyneen solun kokoa kuin solujen määrä /alue oli lähes identtinen näiden kahden ryhmän välillä (kuvio S3B).

(A) Vaikutukset hyperplastisten kytkin. Saarekkeita Ki67 leikkeitä 3- tai 5 viikon ikäisten hiirten pisteytettiin ”normaali” (ei liikakasvuun) tai hyperplastic. Arvot edustavat jakautuminen eri saarekesolujen alaluokkien sisällä ilmoitettu genotyypit. 3 viikon hiiriä, 60 (

Arf + /+

) ja 58 (

Arf – /-

) saarekesolujen pisteytettiin osuuksilla 3 hiirtä /ryhmä; 5 viikon ikäisten hiirten, 166 (

Arf + /+

) ja 231 (

Arf – /-

) saarekesolujen pisteytettiin osuuksilla 3-4 hiirtä /ryhmä. Jakauma saarekesolujen tyyppejä ei ollut merkitsevää eroa kahden genotyyppien joko ajankohtana (Fisherin testiä; 5 viikkoa ajankohta: p = 0,06). Edustavia Ki67-värjätty hyperplastic vaurioita (3 viikkoa vanha RIP-Tag2 hiiret) on ilmoitettu

Arf

genotyypit on esitetty oikealla. (B, C) Vaikutukset angiogeenisten kytkimen ja kasvaimen aloittamista. Määrä punaista, angiogeenisen leesioita (B) ja kasvaimet (C) laskettiin 11 (

Arf + /+

) tai 15 (

Arf – /-

) 8 viikon ikäisille RIP- Tag2 hiiret ilmoitettu genotyyppien. Keskiarvot ± SEM on esitetty. Mann-Whitney testi tilastollista merkittävyyttä; * P = 0,01, ** p 0,0001.

vieressä arvioi vaikutukset

Arf

Knockout taajuudella angiogeenisten kytkentä. Toisin kuin vähäinen vaikutus esiintyvyys saarekesolujen hyperplasia, määrä punainen, aivoverenvuotoon angiogeenisten saarekkeet lisääntyi merkittävästi (noin 30%) 8 viikon ikäistä

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

hiirissä verrattuna

RIP-Tag2

;

Arf

+ /+

poikuesisaruksia (kuva 4B; p = 0,01). Lisäksi vaikka ulkonäkö kiinteiden kasvainten oli hyvin harvinainen 8 viikkoa

RIP-Tag2

;

Arf

+ /+

hiirillä (kasvaimia läsnä 4/11 hiirillä, keskimäärin 1 kasvain /hiiri), pieniä kasvaimia havaittiin lähes kaikissa

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

hiirillä analysoitiin tässä iässä (keskimäärin ~2.5 kasvainten /hiiri; kuviossa 4C, p 0,0001). Huomattavaa on, että vuonna pisteytys hyperplastista vauriot 5 viikkoa ajankohtana, satunnainen saarekkeet näytteille tyypillinen hemorraginen ominaisuudet /veri saarilla angiogeenisten saarekkeiden [22], [23] havaittiin, kehityssuuntauksena korkeampi esiintyvyys

Arf

– /-

verrattuna

Arf

+ /+

hiirillä; mutta tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä tänä ajankohtana (kuvio S3C). Siten tässä monivaiheisen mallin menetys Arf kiihtyy kasvaimen muodostumisen, ainakin osittain, kautta helpottaa angiogeenisen kytkintä.

Arf tyrmäys ei aiheuta merkittäviä muutoksia verisuonten fenotyyppiin

tutkimaan edelleen koska korotetut angiogeeninen fenotyyppi

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

hiirillä, seuraavan kerran arvioidaan fenotyypin angiogeenisen verisuoniston. Vaikka lisääntynyt määrä angiogeenisten vaurioista

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

hiiret, tuloksena vaurioita ei merkittävästi poikkea verisuonitiheydessä tai morfologia (alus paksuus, haarautumisaste) (kuvio 5A ja tietoja ei ole esitetty), tai aste pericyte kattavuus (kuvio 5B). Koska edellinen havainnot osoittavat rooli MMP-9 ilmentävien neutrofiilejä edistämisessä angiogeenisen kytkin [24], myös tutki menetys Arf ilmaisun johti muutoksiin ilmaantuvuuden neutrofiilien rekrytointi ”pre-angiogeeninen” hyperplastic vaurioita. Molemmissa

RIP-Tag2

;

Arf

+ /+

ja

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

hiiret, kaksinkertainen immunovärjäyty- varten Ki67 leviämisen merkki ja 7/4 neutrofiilien merkki osoitti, että noin 25% hyperplastista vaurioiden tutki (5 viikon iässä) sisälsi infiltroituneen neutrofiilejä ( useimmissa tapauksissa enintään yhdellä 7/4 + solu /saareke; tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi mitään merkittäviä muutoksia määrän soluttautua MMP-9 ja 7/4 kaksinkertainen positiivisia soluja havaittiin angiogeenisten vaurioita 8-WK vanha

RIP-Tag2

;

Arf

+ /+

ja

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

hiirissä (tuloksia ei ole esitetty).

(A) visualisointi verisuonistossa angiogeenisten vaurioita 8 viikon ikäisille RIP-Tag2 hiirten genotyypin ollessa esitetyn mukaan immunovärjäyty- for Meca32 (punainen). Edustavia Meca32 /DAPI (sininen) yhdistettiin kuvia näytetään. Suonitiheys laskettiin mittaamalla pinta-ala Meca32 + alusten; arvot edustavat keskiarvoa ± SEM laskettiin analysoimalla 16-20 angiogeenisten vaurioita 4 yksittäisistä hiiristä jokaisen genotyypin. (B) Double immuunivärjäykseen Meca32 (endoteelisolujen, punainen) ja NG2 (perisyyteissä, vihreä) suoritettiin analysoimaan aste pericyte peitto angiogeeninen verisuonisto 8 viikon RIP-Tag2 hiiret ilmoitettu genotyyppien. Bars, 20 um.

valikoiva

Arf

tyrmäys strooman osastossa ei merkittävästi parantaa kasvaimen kehitystä

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että

Arf

– /-

hiiret ovat sokeita johtuvat vika involution että hyaloid verisuoniston silmässä kehityksen aikana, jotka johtuvat kertyminen Pdgrfrβ + verisuonia soluihin [25], [26]. Data osallinen sekä solu autonominen ja epäitsenäisten vaikutuksia menetyksen Arf tästä fenotyyppiin [27]. Koska

RIP-Tag2

;

Arf

– /-

hiirillä puuttuu Arf ilme koko kehon eikä vain kasvainsoluissa, me kyseenalaiseksi menetys Arf ei-β-solutyyppiä voi osittain olla helpottaa angiogeenisten kytkin ja kasvaimen muodostumisen. Alkaa tutkia tätä mahdollisuutta, ensin tutki voisimme havaita

Arf

ilmaisun strooman osastoon villityypin

RIP-Tag2

kasvaimia. Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi lajitellut solun osastoihin

RIP-Tag2

kasvaimia osoitti

Arf

ilme, odotetusti, että kasvain soluosastoon, mutta ei endoteelisoluilla (CD31 +) , immuunijärjestelmän solut (CD45 +), tai perisyyteissä (Pdgfrβ +) (kuvio 6A ja S4). Nämä tulokset ovat sopusoinnussa ajatus, että induktio Arf ilme on, että suurin osa, rajoittuu vastaus kasvaimia signaalit [4]; kuitenkin, tämä analyysi ei sulje pois mahdollisuutta ohimenevä induktion Arf ilmaisun strooman solutyypeissä analysoitu, eikä ilmaisun muihin luokkiin tuumoreihin tunkeutuvia soluja [esim. Pdgfrβ-negatiivinen perisyyteissä [28]].

(A) ilmentyminen

Arf

eri osatekijän RIP-Tag2 kasvainsolutyypit. Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin mRNA eristetään, FACS-lajiteltu soluja RIP-Tag2 kasvaimia [EC (endoteelisolut), ICS (immuunijärjestelmän solut), T /OC (kasvain /muut solut)]. Ilmentymistasoja piirretään suhteessa L19 ilmaisua. (B) vaikutus

Arf

Knockout kasvaimen kehittymistä ortotooppisesti siirrettyjen syöpäsoluja. 1 x 10

5 kasvainsolujen peräisin

RIP-Tag2

;

Arf

+ /+

kasvain injisoitiin haimaan on

Arf

+ /+

tai

Arf

– /-

hiiret ja sallittu kasvaa 4 viikkoa. Arvot edustavat keskiarvoa kasvaimen tilavuus (+ SEM) lasketaan kasvainten eristetty 12 yksittäisistä hiiristä kunkin ilmoitettu genotyyppien. Ero arvojen ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä (Mann-Whitney testi; p = 0,1).

suoraan arvioida mahdollinen rooli

Arf

tyrmäys ei-kasvain soluosastoon vaikuttamisessa syövän etenemiseen, suoritimme potilaalle tehdä kokeita jossa kasvainsolut peräisin

RIP-Tag2

;

Arf

+ /+

kasvain injisoitiin haimaan immunokompetenttien

Arf

+ /+

tai

Arf

– /-

hiiriä, ja kasvaimen koko mitattiin neljä viikkoa myöhemmin. Ei ollut merkitsevää eroa keskimääräisessä kasvaimen koon välillä kasvainten muodostettu

Arf

+ /+

versus

Arf

– /-

hiirissä (kuvio 6B). Yhdistettynä kyvyttömyys havaita

Arf

ilmentymistä kasvain stroomasolulinja tyyppi, nämä tulokset viittaavat siihen, että tyrmäys

Arf

kasvaimen strooman osasto ei todennäköisesti hallitseva kuljettaja kiiruhtivat kasvaimen kasvua havaittiin, kun

Arf

tyrmäys RIP-Tag2 hiirillä. Koska on epäselvää mekanismi angiogeneesin induktion ortotooppisesti pistetään tuumorisoluissa noudattaa samanlaista koulutusjakson angiogeneesinä indusoituu endogeenisen pre-neoplastisia vaurioita, on mahdollista, että puute Havaittu vaikutus voitaisiin osittain huomioon tällaiset erot.

Knockout on

Arf

kiihdyttää kasvaimen muodostumisen kautta sekä p53-riippuvaisten ja riippumattomien mekanismien

Koska p53 on osoitettu kvantitatiivisesti sekvestroida SV-40 avainsanaa ja sen transaktivaation toiminta on todistettavasti lukittuna β-soluihin RIP-Tag2 hiirillä [17], me epäillään valtaosa havaittujen vaikutusten yhteydessä tyrmäys

Arf

olevan p53-riippumatonta. Olemme kuitenkin eteni tarkistaa p53-riippumattomuus

Arf

Knockout-fenotyyppi analysoimalla vaikutuksia

Arf

tyrmäys p53-null geneettistä taustaa. Kuten p53-villityypin taustaa

Arf

tyrmäys

RIP-Tag2; p53

– /-

hiirille johti huomattavasti (2,4-kertainen) kasvaintaakkaa 12 viikon iässä verrattuna

Arf

+ /+

poikuesisaruksia (kuvio 7A; p 0,001), samoin kuin huomattava 30% lisääntyminen angiogeenisten leesioita (kuvio 7C; p = 0,04) ja pieniä kasvaimia (kuvio 7D; p = 0,002), 8 viikon ikäisiä, vahvistetaan, että nämä vaikutukset ovat ainakin osa p53-riippumatonta. On kuitenkin syytä huomata, että suuruuden vaikutusta

Arf

ejektori kasvaintaakkaa (12 viikkoa) ja kasvaimen numero (8 viikkoa) ei ollut niin dramaattinen kuin

RIP-Tag2

;

p53

-wild-tyypin hiirissä (kuvio 2). Lisäksi, vaikka kasvain aloittamista tapahtunut aikaisemmin

RIP-Tag2; p53

– /-; Arf

– /-

verrattuna

RIP-Tag2; p53

– /-; Arf

+ /+

hiirillä, 12 viikon iässä, mitään eroa kasvaimen määrän havaittiin hiirien välillä näiden genotyyppien (kuvio 7B), mikä viittaa siihen, että sekä p53-riippuvaiset ja riippumattomat toiminnot ARF yhteistyötä tukahduttaa angiogeenisten kytkin ja syövän etenemisen tässä monivaiheisen syövän synty mallin.

(A, B)

Arf

tyrmäys

RIP-Tag2; p53

– /-

hiirissä johtaa kasvaneeseen kasvaintaakkaa (A; p 0,0001) vaikuttamatta kasvain numero (B) 12 viikon iässä. Keskiarvot +/- SEM 19 (

p53 – /-; Arf + /+

) tai 14 (

p53 – /-, Arf – /-

) hiirtä /ryhmä on merkitty. Mann-Whitney testi tilastollista merkittävyyttä. (C, D) Lisääntynyt angiogeenisten saarekesolujen numerot (C; p = 0,04) ja kasvaimet (D; p = 0,002) in

RIP-Tag2; p53

– /-

;

p19

Arf – /-

hiirillä 8 viikon iässä. Keskiarvot +/- SEM 15 (

p53 – /-; Arf + /+

) tai 13 (

p53 – /-, Arf – /-

) hiirtä /ryhmä on merkitty. Mann-Whitney testi tilastollista merkittävyyttä.

Yrittäessään tunnistaa molekyylimekanismiksi lisääntyneen angiogeenisten kytkentätaajuus

Arf-

null RIP-Tag2 hiiriä, analysoitiin ilmaus joukko angiogeneesiin liittyvien geenien real-time PCR. Emme kuitenkaan tunnistamaan angiogeenisten säätelygeenit jotka vakuuttavasti muuttunut transkriptiotasolla kokonaan kasvaimia tai angiogeenisten saarekkeita hävitessä Arf (tuloksia ei ole esitetty ja kuviossa S5a). Viimeaikaisten tutkimusten osoittavat rooli Arf vuonna ribosomin biogeneesissä [29] ja transkription jälkeisiin valvonta VEGF ilmaisun [30], arvioimme mahdolliset muutokset VEGF-ilmentymisen proteiinin tason hävitessä Arf. Vaikka VEGF-proteiinin tasot olivat vaatimattomasti koholla RIP-Tag2 kasvaimia

p53

-null geneettinen tausta (35%: n lisäys, p = 0,02), huomasimme, että tässä geneettinen yhteydessä menetys

Arf

ei johtanut muuttunut veren kokonaiskolesterolia VEGF-proteiinin (kuvio S5B). Lisäksi immunovärjäyty- VEGF eivät paljastaneet mitään ilmeisiä muutoksia VEGF ilmaisun /lokalisointi eri preneoplasti- luoto vaurioista

Arf

-null RIP-Tag2 hiirissä (kuvio S5c). Näin ollen ei ole viitteitä siitä, että nopeutettu angiogeneesi johtuva menetys Arf liittyy muutoksen VEGF biosynteesissä.

Keskustelu

inaktivointi ARF /p53-reitti on kriittinen tapahtuma useimmissa ihmisen syöpiä, jotka palvelevat poistamaan rajoitteita kasvaimia synnyttävän signalointi [31]. Lisäksi kanoninen tuumorisuppressori toimintaa p53 välittämisessä solusyklin pysähtymiseen, apoptoosin ja vanhenemista, p53 voi toimia myös säilyttämään kasvaimen lepotilan kautta tukahduttaminen angiogeneesin [32]. Monen vaiheen syövän synty malli, jossa p53 on toiminnallisesti estyy SV-40 Tag me osoittavat, että p19

Arf voi myös moduloida angiogeneesiä ohjelma, ainakin osittain kautta p53-riippumattomien mekanismien. Geneettinen ablaatio

Arf

RIP-Tag2 hiirille johti merkittävään kiihtyvyys tumorigeneesin reitin, joka liittyi useammin saarekkeiden käynnissä angiogeenisen kytkin ja aikaisemmin kasvainten muodostumiseen. On huomattava, että hyperproliferatiivinen kytkin ei ollut vaikutusta, eikä olivat lisäkasvu /apoptoosi indeksit missään vaiheessa polku kasvaimen muodostumisen.

Huolimatta useammin angiogeenisten kytkentä, verisuonisto sisällä tuloksena angiogeenisten vaurioita ei merkittävästi poikkea fenotyypiltään välillä

RIP-Tag2; Arf

+ /+

ja

Arf

– /-

hiiriä, yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten tässä mallissa jossa muuttunut angiogeenisten kytkentätiheyksiä tapahtunut ilman samanaikaista muutoksia astiassa morfologian tai tuumorisolujen apoptoosin /leviämisen kun geneettinen tyrmäyksellä MMP-9 [33] tai neutrofiilien ablaatiota [24]. Puuttuminen globaali eroista aste neutrofiilien ennalta angiogeneesiä vaurioiden

RIP-Tag2; Arf

– /-

verrattuna

Arf

+ /+

hiirillä viittaavat siihen, että Arf voivat moduloida angiogeneesiä kautta vaihtoehtoinen mekanismi. Kuitenkin johtuen multifokaalinen ja stokastinen luonne kasvain malli, jossa vain noin 15-20% (perustuen yhteensä 400 saareketta /hiiri) hyperplastisten vauriot tulee ”angiogeeninen” (tämä taajuus on kasvanut vain muutama% vuonna

Arf

– /-

hiiret) on mahdollista, että havaitsematta ohimenevää muutoksia neutrofiilien pienessä määrässä vaurioita voitaisiin osuus lisääntyneestä angiogeenisen kytkennän.

Vaikka on epäselvää, mitä erityisiä signaali (t) ajaa alustava rekrytointi tulehdussolujen ja aloittamisen angiogeenisten kytkin, nykyinen paradigma viittaa siihen, että tasapainon häiriintyminen välillä endogeenisen pro- ja anti-angiogeenisten tekijöiden on kriittinen [34] . Erityisesti monista p53-riippumatonta toiminnot ARF jotka on kuvattu tähän mennessä [8], useat voidaan visioi mahdollisesti vaikuttaa angiogeenisten kytkin. Erityisesti NF-KB: n ja c-Myc, jotka molemmat ovat sekaantuneet säätelemään angiogeneesiä kautta niiden vaikutukset ilmentymisen pro-inflammatoristen välittäjien [35], [36], [37], on todettu p53-riippumattoman tavoitteet ARF [38], [39]. Lisäksi nucleolar sitomisen tärkeimmistä induktori angiogeneesin, HIF-1α by ARF on osoitettu säätelemään sen transkriptionaalista aktiivisuutta [40]. Lisäksi äskettäin täydentävä tutkimus Kawagishi et al. ehdotti p53-riippumattoman rooli ARF tukahduttamaan kasvaimen angiogeneesin kautta post-transkriptionaalisen säätelyn VEGF-A: n eks- [30]; kuitenkin, että RIP-Tag2 PNET kasvaimia, VEGF-proteiinin tasot eivät muuttuneet merkittävästi menetys Arf. Siten päättelemme, että lisääntynyt ekspressiotasot VEGF eivät aluskate aikaisempaa angiogeenisen kytkennän, vaikka emme voi sulkea pois mahdollisia muutoksia VEGF hyötyosuus, välittävät esimerkiksi lisääntynyt matriisi hajottavien proteolyyttistä aktiivisuutta.

mahdollinen rooli ARF vuonna prosessin vaskulogeneesin ja /tai angiogeneesin aiemmin oletettu [8], jotka johtuvat sen osoittaminen, että Arf voi säädellä verisuonten kehitystä hiiren silmään [25], joka on yksi ainoa kuvatut toiminnot ARF syrjään tuumorisuppressiogeeneksi. Mekanismi, menetys Arf parantaa PDGF signalointi, jolloin liiallinen leviämisen ja kertyminen Pdgfrβ + verisuonia solujen ehdotettiin selittää verisuonten vika johtaa sokeuteen

Arf

– /-

hiirillä. Vaikka ei ollut mitattavissa muutoksia pericyte kertymistä verisuonistossa on

RIP-Tag2; Arf

– /-

angiogeenisten vaurioita, on mahdollista, että alkuperäisen rekrytointi Pdgrβ + verisuonia solujen uudissuonittumisen voitaisiin tukea joko suoraan tai välillisesti (esimerkiksi kautta erittymisen vielä voidaan tunnistaa pro-angiogeeninen tekijä mistä Arf-null preneoplasti- /kasvainsoluja) menetys Arf.

Laaja kasvainten kehittymiseen /kasvu vaatii paitsi sääntelyn solujen kasvua ja selviytymistä signaaleja, mutta tuo mukanaan myös merkittäviä muutoksia alkava kasvain microenvironment. Erityisesti muodostumista verenkierto on kriittinen kasvaimen kasvu ja etäpesäke. Kehittyvät todisteet osoittavat, että onkogeenien ja tuumorisuppressoreita voivat vaikuttaa kasvainten kehittymiseen ei vain kautta solu-autonominen toimintojen säätelyssä leviämisen /apoptoosin, mutta myös suoralla angiogeneesin modulointi sääntelyviranomaisten. Myc-onkogeeni on osoitettu säätelevän angiogeneesiä suora induktion proinflammatoristen välittäjänä, IL-1β, joka edistää MMP aktivointi ja vapautuminen eristettyä VEGF peräisin soluväliaineen [41]. Ras, aktivoimalla Myc, voi aktivoida angiogeneesi kautta tukahduttamisen angiogeneesinestäjän, trombospondiini-1 [42]. Vastaavasti, tuumorisuppressori p53 on osoitettu positiivisesti säädellä trombospondiini-1 ilmentymisen [43], [44], samoin kuin tuotannon anti-angiogeeninen kollageeniperäistä fragmentit endostatiinin ja tumstatin [45]. Olemme tässä paljastaa rooli p19

Arf rajoittamisessa kasvain angiogeenisten kytkin, joka osoittaa, että menetys Arf ilmaisun edistää angiogeenisten kytkin ja nopeuttaa kasvainten kehittymiseen, kautta sekä p53-riippuvaisten ja riippumattomien mekanismien, mallissa on monivaiheinen syövän synnyn .