Krooninen sairaus

tiivistelmä

CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) saadaan näkyviin selvä osajoukko peräsuolen syöpiä tiheä DNA hypermetylaation tietyssä ryhmässä CpG-saarekkeiden. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että aktivoiva mutaatio

BRAF

(BRAF

V600E) on tiiviisti liittyy CIMP, herättää kysymyksen siitä, BRAF

V600E näyttelee kausaalinen rooli kehityksessä CIMP vai CIMP tarjoaa suotuisan ympäristön hankintaan BRAF

V600E. Meillä työskentelee Illumina GoldenGate DNA: n metylaatio tekniikkaa, joka tekee kyselyn 1505 CpG sivustoja 807 eri geenejä, lisätutkimuksia tätä yhdistystä. Ensin tutki ilmaus BRAF

V600E aiheuttaa DNA hypermetylaation mukaan ilmentävät stabiilisti BRAF

V600E vuonna CIMP-negatiivinen,

BRAF

villityypin COLO 320DM peräsuolen syövän solulinja. Määritimme 100 CIMP liittyvä CpG sivustoja ja tutkitaan muutoksia DNA: n metylaation kahdeksassa stabiilisti transfektoidut kloonit usean kohtia. Huomasimme, että BRAF

V600E ei riitä aiheuttamaan CIMP järjestelmässämme. Toiseksi, kun otetaan huomioon vaihtoehtoinen mahdollisuus, tunnistimme geenejä, joiden DNA hypermetylaation liittyi läheisesti BRAF

V600E ja CIMP 235 ensisijainen Kolorektaalituumorien. Mielenkiintoista, geenit, jotka osoittivat eniten merkittävä yhteys sisältyvät ne, jotka välittävät eri signalointireittejä sekaantuneet peräsuolen kasvainten synnyssä, kuten

BMP3

ja

BMP6

(BMP signalointi),

EPHA3

KIT

, ja

FLT1

(reseptorityrosiinikinaaseilla) ja

SMO

(Hedgehog signalointi). Lisäksi tunnistimme CIMP-riippuvaisen DNA-hypermetylaatiota

IGFBP7

, joka on osoitettu välittävän BRAF

V600E aiheuttamaa solujen vanhenemista ja apoptoosia. Promoottori-DNA: hypermetylaatiota

IGFBP7

liittyi hiljentäminen geenin. CIMP-erityinen poistoa BRAF

V600E aiheuttamaa vanhenemista ja apoptoosia väylät

IGFBP7

DNA hypermetylaation voisi luoda suotuisat kontekstin hankkimiseen BRAF

V600E vuonna CIMP + peräsuolen syöpä. Tuloksemme on hyötyä tulevissa tutkimuksissa kohti ymmärrystä CIMP kolorektaalisyövässä ja saada oivalluksia rooliin poikkeavien DNA hypermetylaation peräsuolen kasvaimien syntyyn.

Citation: Hinoue T, WEISENBERGER DJ, Pan F, Campan M, Kim M Young J, et al. (2009) analyysi yhdistyksen välillä CIMP ja BRAF

V600E kolorektaalisyövässä DNA Metylointi Profilointi. PLoS ONE 4 (12): e8357. doi: 10,1371 /journal.pone.0008357

Editor: Chun Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 06 syyskuu 2009; Hyväksytty: 20 marraskuu 2009; Julkaistu: 21 joulukuu 2009

Copyright: © 2009 Hinoue et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: National Institutes of Health (NIH) avustukset R01 CA118699-02 (PW Laird), R01 CA075090-09 (PW Laird). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Peter Laird on konsultti Epigenomics AG ja Celgene Corporation. Toinen Kirjoittajat ilmennyt mitään mahdollisia kilpailevia kiinnostusta. Tätä työtä ei tue myöskään Epigenomics AG tai Celgene Corporation. Nämä yritykset ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Johdanto

Aberrant DNA metylaatio CpG-saarekkeiden on laajalti havaittu syöpä. Promoottori-CpG-saarekkeen hypermetylaation liittyy inaktivaatio valittujen tuumorisuppressorigeeneille näyttää olevan kriittinen kasvaimia alusta kautta ylläpitoon kasvaimen fenotyypin [1]. Distinct alaryhmiä useita erilaisia ​​ihmisen syövissä on ehdotettu olevan CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP), jossa on poikkeuksellisen korkea taajuus syöpä-spesifisen DNA hypermetylaation on havaittu [2], [3]. Vaikka tämä käsite on kiistanalainen [4], olemme vahvistaneet olemassaolon CIMP peräsuolen syövän laajamittainen kattava tutkimus [5].

CIMP kolorektaalisyövässä aiheuttamista selvä polku peräisin tietyistä alatyyppiä sahalaitaiset polyyppien [6] ja havaitaan noin 15% kaikista peräsuolen syövän tapauksissa [5], [7]. Piirteitä liittyy CIMP peräsuolen syöpä ovat sukupuoli (nainen), proksimaalinen sijainti, ja huonosti eriytetty tai mucinous histologian [3], [5], [7], [8]. Tutkimuksemme käyttäen äskettäin kehitetty CIMP merkki paneeli kolorektaalisyövissä osoitti, että satunnainen mikrosatelliittien epävakaus (MSI +) esiintyy seurauksena CIMP liittyvien

MLH1

DNA hypermetylaation [5]. Lisäksi löysimme vahva yhdistys CIMP kanssa, kun läsnä on aktivoitua mutantti muoto

BRAF

(BRAF

V600E) [5]. Sekä CIMP ja

BRAF

mutaatioita on raportoitu alkuvaiheista peräsuolen kasvain: CIMP in normaalisti limakalvossa alttiita potilaita useita sahalaitaiset polyyppien [9] ja

BRAF

mutaatioita poikkeavaan crypt pesäkkeitä [10].

RAS-RAF-MEK-ERK signalointireitin usein hyperactivated kolorektaalisyövässä.

KRAS

mutaatioita esiintyy yleisimmin 30-40% kaikista paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [11] ja

BRAF

mutaatiot ovat läsnä taajuudella 5-22%, jossa konstitutiivisesti aktivoitua BRAF

V600E variantti osuus ~90% kaikista

BRAF

mutaatioita [12]. Mutaatiot

KRAS

ja

BRAF

ovat yleensä toisensa poissulkevia, mikä vastaa alavirran vaikutuksia kasvainten synnyssä [13]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että mutaatiot näiden geenien voisi olla erilliset tehtävät kasvaimen aloittamista ja /tai huolto [10], [14].

erittäin tiukka yhdistyksen välillä BRAF

V600E ja CIMP nostaa kysymys siitä, BRAF

V600E näyttelee kausaalinen rooli kehityksessä CIMP vai CIMP liittyvä promoottori hypermetylaation tarjoaa suotuisan puitteet hankintaan BRAF

V600E. Tässä tutkimuksessa etsittiin mahdollisia molekyylitason selityksiä yhdistyksen välillä BRAF

V600E ja CIMP käyttämällä Illumina GoldenGate DNA: n metylaatio alustan, jossa tarkastellaan DNA metylaatiostatuksen 1505 CpG sivustoja sijaitsevat 807 geenejä. GoldenGate DNA metylaatiomääritystä on käytetty laajalti erilaisia ​​tutkimuksia ja on nyt vakiomenetelmä DNA metylointianalyysi [15] – [24]. Havainnot on saatu kaupallisesti saatavilla ”GoldenGate Metylointi Syöpä Panel I”, erityisesti, on validoitu käyttämällä erilaisia ​​muita tekniikoita [15] – [17], [22], [23], joten se luotettavana lähteenä DNA: n metylaatio mittauksia kaikkialla 1505 loci. Emme pystyneet osoittamaan syy-osuus BRAF

V600E jotta CIMP meidän soluviljelmäjärjestelmässä. Olemme kuitenkin tunnistettu geenejä, joiden DNA hypermetylaation merkitsevästi yhteydessä BRAF

V600E perusterveydenhuollossa Kolorektaalituumorien. Inaktivointi Näiden geenien yhteydessä CIMP voisi ajaa hankinta BRAF

V600E vuonna CIMP + Kolorektaalituumorien.

Tulokset

karakterisointi 21 paksu- ja peräsuolisyövän Cell Lines

ensin pyrittiin määrittämään, onko ilmaus BRAF

V600E aiheuttaisivat DNA hypermetylaation at CpG sivustoja liittyy CIMP käytettäessä

in vitro

soluviljelmäjärjestelmässä. Koska ensisijainen paksusuolen epiteelisolut eivät ole helposti saatavilla, me seulotaan ja peräsuolen syövän solulinjat, joilla ei ole merkittävää DNA: n metylaatio klo CIMP-määrittelyssä loci ja kuljettaa villityypin muodot sekä

BRAF

ja

KRAS

. Tällaisia ​​solulinjoja toimisi sopivia järjestelmiä käyttöön BRAF

V600E. Valitsimme 21 peräsuolen syövän solulinjoissa, tunnettu DNA metylaatio profiileja, ja määritettiin niiden

BRAF

ja

KRAS

mutaatiostatus (kuvio 1). Käytimme MethyLight arvioida DNA metylaatiostatuksen viiden CIMP-määrittelyssä markkereita aiemmin tunnistettu laboratoriossamme [5]. Käyttäen PMR (prosenttia metyloitu viite) ja ≥10 kynnykseksi positiivinen metylaation, olemme määritelleet kuusi solulinjoja, joista puuttui DNA: n metylaatio kaikkien viiden CIMP-markkereita (kuvio 1). Testata hypoteesia, me aluksi valitsimme

BRAF

ja

KRAS

villityypin Caco-2 ja COLO 320DM solulinjoja helppoudesta viljelemällä ja transfektio. Kuitenkin jäljempänä kuvattu tutkimus on rajoitettu COLO 320DM soluihin, koska emme pystyneet eristämään mitään stabiilisti transfektoitu Caco-2-kloonit, jotka osoittivat havaittavissa oleva määrä BRAF

V600E ilmaisu (tuloksia ei ole esitetty).

MethyLight käytettiin arvioimaan DNA metylaatiostatuksen viiden CIMP-määrittelyssä markkereita. PMR on ≥10 käytettiin kynnykseksi positiivinen metylaation. Mustat laatikot osoittavat PMR ≥10 ja valkoiset laatikot osoittavat PMR 10. DNA: n metylaatio taajuudet viiden CIMP markkereita kasvaa ylhäältä alaspäin. Mikrosatelliittimarkkereita epävakaus asema jokaiselle solulinjaa on listattu microsatellite vakaa (MSS) tai kätkeminen epävakaus (MSI). Mutaatio tila

BRAF

eksonin 15 ja

KRAS

eksoni 2 on listattu.

Stable transfektio BRAF

V600E vuonna COLO 320DM Cells

Transfektoimme COLO 320DM solujen HA-koodattu BRAF

V600E cDNA ja eristetty G418-resistenttejä klooneja. Ilmentymistaso BRAF

V600E määritettiin western-blottauksella käyttämällä vasta-ainetta vastaan, HA-epitooppia (kuvio 2A). Aktiivisuus BRAF

V600E vahvistettiin tutkimalla aktivoituminen ERK1 /2 käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​fosforyloidun ERK1 /2 (kuvio 2A). Kahdeksan stabiilisti transfektoidut kloonit, joilla korkean ilmentymisen BRAF

V600E, sekä vahvaa aktivointi ERK1 /2, yksitellen kasvatetaan viljelmässä, ja genominen DNA eristettiin eri kanavien (välillä 2 ja 27) näistä klooneista. Neljä tyhjää vektori transfektoidut kloonit (EVCs) kasvatettiin samoissa olosuhteissa ja käytettiin kontrolleina.

(A) ilmentyminen BRAF

V600E ja ERK1 /2 fosforylaatiota pysyvästi transfektoitu COLO 320DM soluja. Blotit anti-HA-vasta-aineita HA-BRAF

V600E, anti-fosfo-ERK1 /2, ja anti-ERK1. Tähdet osoittavat kahdeksan BRAF

V600E transfektoidut kloonit, jotka alistettiin DNA metylointianalyysi eri solujakojen. (B) DNA: n metylaatio profiilit transfektoimattomiin COLO 320DM soluja, tyhjällä vektorilla ja BRAF

V600E transfektoidut COLO 320DM kloonit, määritettynä Illumina GoldenGate DNA: n metylaation määrityksessä. DNA-metylaatio tiedot pisteytettiin β-arvot kuten edellä on määritelty. [16] Kukin rivi vastaa yksittäistä CpG rataa, ja tiedot lajiteltiin keskimääräinen β-arvo kaikissa näytteissä. Jokainen klooni tilataan vasemmalta oikealle määrän kasvattamisessa kohtia. EVC: tyhjä vektori transfektoidut kloonit.

DNA metyloituvuutta BRAF

V600E Transfektoituja COLO 320DM kloonit

vieressä määritetty DNA metylaatiostatuksen 1505 CpG sivustoja sijaitsevat 807 eri geenien kunkin kahdeksan BRAF

V600E klooneista ja neljä EVCs käyttäen Illumina GoldenGate metylointi Cancer paneelin 1 alustan (kuvio 2B). Huomasimme, että DNA metylaatio β-arvoja kaikissa 1505 CpG sivustoja BRAF

V600E transfektoidut kloonit (riippumatta BRAF

V600E ilmentymistaso) olivat hyvin samanlaisia ​​kuin tyhjän vektorin ohjaus klooneja ja melko vakaana aika. Tämä viittaa siihen, ettei yleinen kasvu DNA hypermetylaation in BRAF

V600E transfektoitujen kloonien CpG tavoitteet analysoitiin (kuvio 2B).

vieressä selvitettävä, stabiilin ilmentymisen BRAF

V600E nimenomaan lisääntynyt DNA metylointi vain CIMP liittyvien merkkiaineiden 1505 kuulusteli CpG sivustoja. Nämä sivustot määritettiin seulomalla 58 ensisijaisen peräsuolen kasvain näytteet käyttäen Illumina GoldenGate DNA metylaatio alustan (Dataset S1). Mutaatio tila

BRAF

ja

KRAS

näistä näytteistä oli määritetty aiemmin [5] (taulukko S1). Valvomatta kaksiulotteinen klusterin analyysi DNA: n metylaation β-arvot paljasti erillisen klusterin 11 tuumorinäytteet, joista suurin osa sisälsi BRAF

V600E ja osoittivat usein DNA: n metylaatio tunnettujen CIMP liittyviä markkereita, mukaan lukien

CDKN2A, IGF2

, ja

MLH1

(tuloksia ei ole esitetty). Määrittelimme tämän alakonsernin CIMP-positiivisia kasvaimia (kuva 3). Sitten tunnistettiin yhteensä 100 CpG sivustoja, jotka ovat huomattavasti korkeampi DNA-metylaation CIMP-positiivisten (CIMP +) vs. CIMP-negatiivinen (CIMP-) kasvaimet (

P

0,001 korjauksen jälkeen monivertailuja, katso Materiaalit ja menetelmät -osiossa) (taulukko S2). On huomattava, että reaktiot kolme MethyLightT-pohjainen CIMP markkereita (

CACNA1G

,

NEUROG1

, ja

SOCS1

) aikaisemmin tunnistettu laboratoriossamme eivät sisälly Illumina GoldenGate metylointi Cancer paneelin 1 alustalla.

RUNX3

Illumina GoldenGate reaktiot eivät osoittaneet CIMP-erityinen käyttäytyminen. Yksi mahdollinen selitys tälle ero voisi olla, että nämä reaktiot ovat suunniteltu noin transkription aloituskohdasta on

RUNX3

isoformin 1, kun taas meidän CIMP erityisiä

RUNX3

MethyLightTM reaktio on suunniteltu klo promoottori CpG-saarekkeen on

RUNX3

isoformia 2 [5]. Näimme mitään ilmeistä eroa DNA: n metylaatio välillä BRAF

V600E transfektoidut kloonit ja EVCs näitä CIMP liittyvä CpG sivustoja (kuva 3). Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että keskimääräinen DNA-metylaatio β-arvo 100 CIMP-spesifisten lokusten kasvoi funktiona solun kanavan (kuvio 4A ja 4B). Kasvu oli kuitenkin ei korreloinut tasojen BRAF

V600E ilmaisun ja havaittiin myös soluissa, jotka oli transfektoitu kontrollivektorilla (kuva 4B). Tämä yleinen kasvu keskimääräisen β-arvo on spesifinen CIMP liittyviä lokusten, koska keskimääräinen β-arvo useista sarjaa 100 satunnaisesti valitun CpG sivustot eivät osoittaneet samanlaista suuntausta (kuvio 4C ja 4D). Siksi me päätellä, että vaikka CIMP liittyvä CpG-saarekkeiden saattavat olla alttiimpia hankkia DNA metylaatio tietyissä viljelyolosuhteissa, BRAF

V600E ei erityisesti indusoivat CIMP in COLO 320DM soluissa.

CIMP + kasvaimia ja CIMP -associated loci 58 primaarikasvaimen näytteet on määritelty, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Kukin rivi vastaa yksittäistä lokuksen 100 lokuksen paneeli, ja tiedot on lajiteltu keskimääräinen β-arvo kunkin lokuksen kaikkien 58 primaarikasvaimen näytteitä. Jokainen BRAF

V600E transfektoitu klooni ja EVC tilataan vasemmalta oikealle määrän kasvattamisessa kohtia. Kasvaimista

BRAF

ja

KRAS

mutaatiot on merkitty ympyrä ja kolmio, vastaavasti. X: mutaatio ei ole saatavana. Jokainen BRAF

V600E transfektoitu klooni ja EVC tilataan vasemmalta oikealle määrän kasvattamisessa kohtia. ”P” ilmaisee DNA metylaatio profiilit vanhemman transfektoimattomilla COLO 320DM soluja.

mustat viivat osoittavat BRAF

V600E ilmentävien kloonien ja harmaat viivat edustavat tyhjä vektori transfektoidut ohjaus klooneja. Jokainen piirtäminen piste edustaa keskiarvo β-arvoja yli osoitti CpG sivustoja Illumina GoldenGate DNA metylaatiomääritystä eri kohtiin kunkin kloonin. (A) Kaikki 1505 CpG loci päässä Illumina GoldenGate määrityksessä. (B) Vain 100 CIMP liittyviä lokuksen on profiloitu. (C) Sata satunnaisesti valittu CpG loci. (D) Sata kuin CIMP lokusten, jotka osoittavat tarkoittaa β-arvot samanlainen 100 CIMP liittyvän loci.

tunnistaminen geenit, jotka ovat merkittävästi metyloitavaa Kolorektaalituumorien kätkeminen BRAF

V600E

Pidimme myös vaihtoehtoinen hypoteesi, että promoottori metylaatio erityisten geenikohteet tarjoaa suotuisan puitteet hankintaan

BRAF

mutaatio CIMP + kolorektaalisyövissä. Olemme aikaisemmin tunnistaneet CIMP tila ja

BRAF

mutaatio aseman 235 ensisijainen peräsuolen kasvain näytteet [5]. Löysimme BRAF

V600E 33 kasvaimissa (14,0%); 31 näistä luokiteltiin CIMP + ja vain 2 as CIMP-. Suoritimme Illumina GoldenGate DNA metylaatiomääritystä näitä näytteitä, ja tunnistettiin 60 geenejä, jota edustaa 89 CpG sivustoja, jotka ovat merkittävästi metyloitu (

P

0,001) 33 BRAF

V600E-positiivisia kasvaimia (Taulukko S3). Nämä geenit ovat ehdokkaita CIMP-erityinen poistoa, mikä voi tiiviisti synergisesti BRAF

V600E edistää kasvaimien syntyyn.

validoimiseksi tuotetut tiedot käyttämällä GoldenGate DNA: n metylaatio alusta, olemme analysoineet DNA metylaatiostatuksen neljä CIMP-geenit (

Calca

,

EPHA3

,

KIT

, ja

SLC5A8

) osajoukossa neljän CIMP-positiivisia ja 16 CIMP -negatiivinen kasvaimia Illumina Infinium DNA metylaatio alustalla. Nämä neljä geenit valittiin, koska sekä analyyttisen alustoille kuulustella DNA metylaatiostatuksen sama CpG. Sitten tutki konkordanssin DNA metylaatio kaikissa näissä loci näiden alustojen välillä, ja löysi suuren korrelaatiokertoimen kaikissa tapauksissa (

Calca

: 0,94,

EPHA3

: 0,95,

KIT

: 0,95,

SLC5A8

: 0,86), lainaa lisätukea alunperin GoldenGate perustuva DNA: n metylaatio näytöllä.

vahvisti äskettäin havaittu yhdistysten välillä DNA hypermetylaatiota

BMP3

ja

MCC

kanssa CIMP + ja BRAF

V600E kolorektaalisyövässä [25], [26]. Olemme myös todettu CIMP-spesifisen DNA: n hypermetylaatiota

BMP6.

Samanaikaisesti epigeneettisellä inaktivaatio

BMP3

ja

BMP6

osoitettiin liittyvän aktivoitumisen RAS-RAF -MEK-ERK signalointireitin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [27]. Lisäksi löysimme yhdistys

SLC5A8

ja

TIMP-3

DNA metylaatio BRAF

V600E meidän peräsuolen kasvain näytteet, kuten oli aiemmin raportoitu papillaarinen kilpirauhasen karsinoomat [28]. Toiminnallinen seurauksena DNA hypermetylaatiota kuten tuumorisuppressorigeeneille liittyy CIMP + ja BRAF

V600E edelleen spekulatiivisia [25] – [28].

Lisäksi olemme havainneet, että DNA: n metylaatio on

SMO

, komponentti Hedgehog (Hh) signalointi, oli tiukasti sidoksissa Kolorektaalituumorien kanssa BRAF

V600E (taulukko S3). Kiinnostavaa, se on viime aikoina raportoitu, että lisääntyneen ilmentymisen

SMO

edistää peräsuolen kasvaimien syntyyn [29]. Kuitenkin Arimura et ai. osoittivat myös, että peräsuolen syövän solulinjat kätkeminen BRAF

V600E, kuten COLO 205, HT-29 ja RKO, ei ilmeisesti osoittaa ilmentymisen

SMO

[29]. Tuloksemme osoittavat, että CIMP-promoottori DNA hypermetylaation saattaa olla mukana tukahduttamisessa

SMO

vuonna Kolorektaalituumorien kuljettavat BRAF

V600E (taulukko S3).

Promoottori DNA hypermetylaation ja transkription Silencing on

IGFBP7

in

BRAF

Mutant CIMP + peräsuolen syövän

tunnistaneet

IGFBP7

promoottori CpG-saarekkeen tavoitteeksi DNA-metylaation Kolorektaalituumorien kätkeminen BRAF

V600E (

P

arvo = 3,1 × 10

-9, Odds ratio = 12). BRAF

V600E on osoitettu indusoivan solun vanhenemista [30] – [32]. Oncogene aiheuttama vanhenemista (OIS) on tunnustettu tärkeäksi tuumorisuppressoriproteiinia mekanismi [33]. Taustalla molekyylitason mekanismi BRAF

V600E aiheuttamaa vanhenemista ja apoptoosia on selvitetty tuoreessa tutkimuksessa [34]. On osoitettu, että ilmaus

IGFBP7

on sekä tarpeellinen että riittävä aiheuttamaan vanhenemista ja apoptoosia välittävät BRAF

V600E. Kiehtovan,

IGFBP7

osoitettiin epigeneettiseltä vaiennetaan CpG-saarekkeen promoottori hypermetylaation erityisesti primäärisen melanooman näytteissä kuljettavat BRAF

V600E, mikä osoittaa, että menetys

IGFBP7

ilme on kriittinen kehittämisessä BRAF

V600E–positiivisia melanoomasoluja [34].

Illumina GoldenGate metylointi Cancer paneelin 1 alusta sisältää kaksi

IGFBP7

koettimia (IGFBP7_P297_F ja IGFBP7_P371_F), joka kysellä DNA metylaatiostatuksen kaksi erillistä CpG dinukleotideissä

IGFBP7

promoottori CpG-saarekkeen (kuvio 5A). Olemme havainneet, että nämä kaksi CpG sivustoja

IGFBP7

promoottori ovat syövän nimenomaan metyloitu (kuvio 5B) ja liittyy vahvasti sekä BRAF

V600E (Wilcoxonin-summa testi,

P

arvo = 2,0 × 10

-10) ja CIMP (

P

arvo = 3,6 × 10

-9) (kuvio 5C). On raportoitu, että peräsuolen kasvainten

KRAS

mutaatioita osoittavat myös DNA hypermetylaation at CIMP liittyviä markkereita, vaikkakin alhaisella taajuudella, ja on korkea DNA: n metylaatio geenien tehdään ikään liittyvä DNA hypermetylaation. Nämä kasvaimet on kuvattu CIMP matalia tai CIMP2 [35], [36]. Emme löytäneet yhdistyksen välillä

IGFBP7

DNA hypermetylaation ja

KRAS

mutaatiot kun ulkopuolelle kasvaimista mutantti

BRAF

(

P

arvo = 0,85) . Suostumuksella näiden havaintojen, huomasimme, että DNA hypermetylaatiota

IGFBP7

on enimmäkseen läsnä peräsuolen syövän solulinjoissa, jotka tarjoavat sataman BRAF

V600E ja näyttää usein DNA: n metylaatio viiden geenin CIMP markkeri paneeli aiemmin on kuvattu (kuvio 6). Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi paksusuolisyövän solulinjoja osoitti, että

IGFBP7

-mRNA kääntäen verrannollinen DNA hypermetylaation, kuten solulinjoissa

IGFBP7

hypermetylaation ilmeni vähän tai ei lainkaan

IGFBP7

geenin ilmentymistä (kuvio 6). Niistä CIMP- solut selvitimme, vain COLO 320DM osoitti DNA hypermetylaatiota

IGFBP7

CpG-saarekkeen promoottori minimaalisella ilmentymistaso. Jälkeenpäin tämä ainutlaatuinen ominaisuus COLO 320DM solujen verrattuna muihin CIMP- solulinjat olisivat voineet mahdollistaa näiden solujen sietämään mutantti

BRAF

yliekspressio, ja se voi selittää vaikeuksia saada BRAF

V600E ilmentäviä klooneja muut kolorektaalisyöpä solulinja, kuten Caco-2.

(A) perimän kartta

IGFBP7

promoottori liittyvä CpG-saarekkeen, transkription aloituskohdasta (TSS) ja eksonin 1 perustuu UCSC genomissa selain (maaliskuu 2006 kokoonpano). Sijainti CpG sivustoja kuulusteli Illumina GoldenGate DNA metylaatiomääritystä on osoitettu pystysuorilla nuolilla. (B) DNA metylaatiotasoilla kahden CpG dinucelotides

IGFBP7

promoottori CpG-saarekkeen. β-arvot kunkin CpG sivuston 10 kasvaimet (viisi CIMP- kasvaimia villiin

BRAF

ja viisi CIMP + kasvaimista mutantti

BRAF

, mustat palkit) ja viereisen ei-tuumorikudoksia ( harmaat palkit) on lueteltu. (C)

IGFBP7

promoottori DNA: n metylaatio rasiakuvaajien 235 ihmisen Kolorektaalituumorien ositettu

BRAF

mutaatiostatus (vasemmalla) ja CIMP + tila (oikealla) on

IGFBP7

P371 lokukseen. Vuonna rasiakuvaajien, päät box ovat 25. ja 75. kvartiileja. Viiva laatikon sisällä tunnistaa mediaani β-arvo. Viikset ylä- ja alapuolella laatikon ulottua korkeintaan 1,5 kertaa IQR. CIMP tilan kunkin kolorektaalisen kasvaimen näytteestä määritetään, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät jaksossa.

Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi

IGFBP7

ilmaisua.

IGFBP7

ekspressiotasot esitetään suhteessa

PCNA

ilme. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan teknisten kolmena kappaleena mittauksia. Määrä denaturoidulla lokusten joukossa viisi CIMP markkereita ja mutaatio asema

BRAF

ja

KRAS

listattu kuviossa 1 esitetään.

Keskustelu

CIMP kolorektaalisyövässä tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden tutkia molekyylitason mekanismeja, jotka johtavat epigeneettiset muutokset syövän ja maksuja näiden muutosten sairauden kehittymiseen [3], [37]. Erillinen ominaisuuksia löytyy CIMP ovat tärkeitä vihjeitä ymmärtämään tämän fenotyypin [3], [5], [7], [8]. Erityisen merkille pantavaa on erittäin tiukka yhdistyksen välillä CIMP ja BRAF

V600E [5]. Mekanismeja, jotka kytkevät epigeneettiset (CIMP) ja geneettisen (

BRAF

mutaatio) tapahtumat ja ajallista, missä järjestyksessä nämä kaksi tapahtumia ovat herättäneet kiinnostusta [37].

Tässä tutkimuksessa käyttämällä suurikapasiteettisten Illumina GoldenGate DNA: n metylaatio alustan, tutkimme välinen yhteys CIMP ja BRAF

V600E kolorektaalisyövässä. Ensin testataan, onko ilmaus BRAF

V600E aiheuttaa DNA hypermetylaation mukaan ilmentävät stabiilisti BRAF

V600E vuonna CIMP-negatiivinen,

BRAF

villityypin COLO 320DM peräsuolen syövän solulinja. Olemme tutkineet DNA metylaatiomuutokset 100 CIMP liittyvien CpG sivustoja, ja totesi, että BRAF

V600E ei riitä aiheuttamaan DNA hypermetylaation näillä paikoilla. Yksi varoitus meidän järjestelmä on, että BRAF

V600E voisi olla rooli asiakkuutta DNA: n metylaation vain aikaisin peräsuolen kasvainten synnyssä, koska

BRAF

mutaatioita on kuvattu varhaisessa vaiheessa kasvaimen kehitystä [10], [ ,,,0],38], [39]. On mahdollista, että ainutlaatuinen joukko geneettisiä ja /tai epigeneettisiä muutoksia, jotka tapahtuivat COLO 320DM soluissa saattanut aiheutua epäedullisen ympäristön BRAF

V600E aiheuttavan DNA hypermetylaation. Kokeissa samanlaisia ​​kuin edellä on kuvattu käyttäen Caco-2-solut, jotka osoittavat myös CIMP- ja kuljettaa

BRAF

-wild tyyppi, eivät olleet onnistuneita. Emme voineet saada mitään stabiilisti transfektoidut kloonit, jotka osoittivat havaittavissa BRAF

V600E (tuloksia ei ole esitetty). Jatkuva BRAF

V600E ilmaisu saattaa olla ristiriidassa Caco-2-solujen lisääntymisen takia solujen vanhenemista tai indusoiman apoptoosin BRAF

V600E. On huomionarvoista, että RT-PCR-analyysi osoitti, että vahva ilmentyminen

IGFBP7

, välittäjänä BRAF

V600E aiheuttamaa vanhenemista tai apoptoosin, ja Caco-2-soluissa, toisin kuin COLO 320DM soluihin.

Aikaisemmin kuvasimme CIMP liittyvä metyloinnin

MLH1

kuin taustalla perustana mismatch korjaus puutos (MSI +) satunnaisissa peräsuolen syövän [5]. Minoo

et al.

Raportoitu

MLH1

DNA: n metylaatio, kun stabiili transfektio BRAF

V600E osaksi NCM460 solulinjaan [40]. Meidän järjestelmässä, emme havaita tällainen korotus

MLH1

DNA: n metylaatio (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi on 33 BRAF

V600E primaarikasvainten tarkastelimme vain 42% (14/33) oli

MLH1

DNA hypermetylaation. Siksi BRAF

V600E voi vaikuttaa DNA hypermetylaatiota

MLH1

mutta vain tietyissä olosuhteissa. Mielenkiintoista on, että ehdotettu sahalaitaiset polku CIMP + kasvaimia, sekä

BRAF

mutaatiot ja CIMP + on havaittu varhain esiasteleesioita, kun taas MSI + ei ole [6], [10], [41]. Näin ollen, inaktivointi

MLH1

saattaa esiintyä myöhemmässä vaiheessa kasvaimen kehittymisen. Minoo ja työtovereiden havaittu DNA hypermetylaatiota

CDKN2A

ja 15 muuta CIMP liittyviä markkereita (

IGFBP7

ei tutkittu) vanhempien NCM460 soluissa, mikä rajoitti niiden kyky tutkia tarkemmin roolia BRAF

V600E asiakkuutta CIMP niiden koejärjestelmässä [40].

Kiehtovaa, havaitsimme, että yleinen DNA metylaatio tasoa CIMP-erityinen lokusten meidän stabiilisti transfektoiduissa soluissa kasvaa funktiona solun kulkua. On mielenkiintoista huomata, että valinta lääke viljellyissä soluissa on kuvattu aiheuttavan muutoksia globaalissa kromatiinirakenteeseen [42], ja samanlainen prosessi voi liittyä havaintojemme täällä.

Lisäksi löysimme suhteellisen suuri inter-klonaalisia (eri kloonia) vaihtelua DNA metylaatiotasoilla meidän transfektiokokeissa (kuviot 2B ja 3), joiden keskimääräinen R

2 korrelaatio lasketaan neljä EVCs 0,88 ± 0,01 (± sd). Meidän keskimääräinen sisäinen klonaalisia (vajaan kloonit eri kohdissa) R

2 korrelaatio on 0,97 ± 0,01 ja R

2 korrelaatio tekninen toistolla Illumina GoldenGate DNA metylointianalyysi on 0,98 ± 0,02 [16]. Niinpä löysimme suuria eroja DNA: n metylaatio useissa loci jopa kesken ohjaus kloonien (kuviot 2B ja 3). Tämä korostaa käyttämällä useita klooneja tämäntyyppisen tutkimuksista.

Vaihtoehtoisesti vahvan yhteyden CIMP ja BRAF

V600E saattaa aiheutua, jos CIMP nimenomaan tarjoaa suotuisan cellular kontekstin BRAF

V600E kohteeseen edistää kasvaimien syntyyn. Toisessa koesarjassa, päätimme geenejä, joiden DNA hypermetylaation oli tiukasti sidoksissa BRAF

V600E ja CIMP + kolorektaalisyövässä. Kiinnostavaa, havaitsimme CIMP-riippuvaisen DNA-hypermetylaation ja transkription inaktivointi

IGFBP7

, joka on osoitettu välittävän BRAF

V600E aiheuttamaa solujen vanhenemista ja apoptoosia [34]. BRAF

V600E on osoitettu aiheuttavan solun vanhenemista viljellyissä ja primäärisistä ihmisen soluihin [30], [31], samoin kuin hiirimallissa [32]. Oncogene aiheuttama vanhenemista (OIS) on tunnustettu tärkeäksi tuumorisuppressoriproteiinia mekanismi [33]. Jotta BRAF

V600E edistää sen kasvaimia aiheuttavalle vaikutukselle, lisäosuus- tapahtumia tarvitaan ohittaa vanhenemista [33]. Äskettäin molekyylitasolla BRAF

V600E aiheuttamaa vanhenemista ja apoptoosia on tutkittu yksityiskohtaisesti. Wajapeyee et ai. tunnistettu

IGFBP7

välittäjänä BRAF

V600E aiheuttamaa vanhenemista ihmisen ensisijainen fibroblasteissa käyttäen genominlaajuisten shRNA näyttö. Niiden myöhempi havainnot viittaavat siihen, että

IGFBP7

ilme on sekä tarpeellinen että riittävä aiheuttamaan vanhenemista ja apoptoosia ihmisen ensisijainen melanosyyteissä ja melanooma, vastaavasti. Lisäksi he havaitsivat menetys

IGFBP7

perusterveydenhuollossa BRAF

V600E-positiivisten melanooman näytteiden ja päätteli, että hiljentäminen on

IGFBP7

ilme on kriittinen vaihe kehitettäessä melanoomaa kätkeminen BRAF

V600E [34].

promoottori liittyviä CpG-saarekkeen DNA hypermetylaatiota

IGFBP7

on raportoitu paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoissa samoin. DNA metylaatio estäjä 5-atsa-2′-deoksisytidiinin on osoitettu palauttamaan

IGFBP7

ilmaisun kolorektaalisyövässä solulinjoissa, mikä osoittaa, että DNA hypermetylaation on merkittävä rooli hiljentäminen Tämän geenin kolorektaalisyövässä [43 ]. Kuitenkin sen yhdessä

BRAF

mutaatio ja CIMP + tila ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä ei ole tutkittu. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että

IGFBP7

DNA hypermetylaation on kasvainspesifisiä ja tiiviisti liittyvä Kolorektaalituumorien kuljettavat BRAF

V600E ja näytteille CIMP. Lisäksi olemme havainneet, että

IGFBP7

DNA hypermetylaation liittyy menetys ilmaisun CIMP + peräsuolen syövän solulinjoissa. CIMP-erityinen poistoa BRAF

V600E aiheuttamaa vanhenemista ja apoptoosireitin mukaan

IGFBP7

DNA hypermetylaation voisi luoda suotuisat kontekstin hankkimiseen BRAF

V600E vuonna CIMP + peräsuolen syövän.

Tärkeää on,

IGFBP7

DNA hypermetylaation ei havaittu kaikissa

BRAF

mutantti Kolorektaalituumorien. Lin

et al

. tutkitaan DNA-sekvenssi promoottorin ja eksoni-alueiden

IGFBP7

kymmenen peräsuolen syövän solulinjat.