Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kysteiini biologia on tärkeää kemosensitiivisyys syöpäsoluja. Tutkimuksemme on keskittynyt epigeneettiset hiljentäminen kysteiinin dioksigenaasin tyypin 1 (CDO1) kolorektaalisyövässä (CRC). Tässä tutkimuksessa kuvaamme havaitseminen

CDO1

metylaation plasmassa CRC käyttävistä potilaista metylaatiospesifisen PCR (Q-MSP) ja laaja analyysi PCR-reaktion.

Methods

DNA uutettiin plasmasta ja analysoitiin metylaation

CDO1

geeni käyttäen Q-MSP. Havaitseminen nopeus

CDO1

geenin metylaatio laskettiin ja verrattiin laimennettua DNA: ta ”positiivisena kontrollina” DLD1 soluja.

CDO1

geenin metylaatio plasmassa 40 CRC potilaista, jotka clinicopathologically analysoitiin sen jälkeen määritettiin.

Tulokset

(1) kloonattiin sekvenssianalyysi havaittu 93,3% metylaation promoottori CpG-saarekkeiden ja

CDO1

geenin positiivisen kontrollin DLD1 soluja ja 4,7% metylaation negatiivisen kontrollin HepG2

CDO1

geenin. (2) DLD1

CDO1

DNA ei voitu havaita tässä määrityksessä, jos uutettua DNA: ta laimennettiin ~1000 kertaiseksi. Mitä enemmän DNA, jota käytettiin PCR-reaktiossa, sitä tehokkaammin monistettiin Q-MSP. (3) lisäämällä DNA: n määrä käyttää, metyloitu

CDO1

voitiin selvästi havaita plasmassa 8 (20%), CRC potilailla. Kuitenkin prosenttiosuus CRC potilailla havaitaan metyloitu

CDO1

plasmassa oli pienempi kuin havaittu CEA (35,9%) tai CA19-9 (23,1%) on ennen leikkausta seerumissa. Yhdistelmä CEA /CA19-9 plus plasma metyloitu

CDO1

voisi lisätä nopeutta havaitsemisen parannettavissa CRC potilasta (39,3%) verrattuna CEA /CA19-9 (25%).

johtopäätös

Olemme kuvanneet havaitseminen

CDO1

metylaation plasmassa CRC potilailla. Vaikka

CDO1

metylaatio ei havaittu niin usein kuin tavanomaiset kasvainmerkkiaineet, analyysi plasman

CDO1

metylaatio yhdessä CEA /CA19-9 tasoilla lisää havaitsemismäärä parannettavissa CRC potilaista.

Citation: Yamashita K, Waraya M, Kim MS, Sidransky D, Katada N, Sato T, et al. (2014) havaitseminen Metyloidut

CDO1

Plasma kolorektaalisyövän; PCR Study. PLoS ONE 9 (12): e113546. doi: 10,1371 /journal.pone.0113546

Editor: Diego Calvisi, University of Medicine, Greifswaldin, Saksa

vastaanotettu: 7. kesäkuuta, 2014; Hyväksytty: 25 lokakuu 2014; Julkaistu: 3. joulukuuta 2014

Copyright: © 2014 Yamashita et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

sytosiini DNA: n metylaatio on promoottorialueen tuumorisuppressorigeeneille on yleisin syöpä ilmiö [1], [2], ja se voisi tarjota hyvä ehdokas biomarkkereita havaitsemiseksi minimaalinen jäljellä tautia metylaatiospesifisen PCR-monistus [3], [4]. DNA: n metylaatio muutokset eroavat genomista muutokset kuten mutaatioita että metylaatio heikkenemistä esiintyy tarpeeksi usein levitettäväksi kliininen diagnoosi [5]. Esimerkiksi olemme tunnistaneet

N-metyyli-D-aspartaatin reseptorin tyypin 2A

(

NMDAR2A-

) [6],

kuurous, autosomaalinen hallitseva 5

(

DFNA5

) [7],

onkostatiini M reseptori

β (

OSMR

) [8], ja

kysteiini dioksygenaasi 1

(

CDO1

) [9] syövän altis usein metyloituja geenien peräsuolen syöpä (CRC) käyttäen farmakologisia paljastumista mikrosiruja [1], [2]. Näistä geeneistä, syöpä-altis geenit oli useimmin metyloitavaa ensisijainen CRC oli

CDO1

[9].

kysteiini biologia on viime aikoina saanut huomiota kannalta tuumoribiologiassa koska siihen liittyy reaktiivinen happi (ROS) tuotanto ja vaikutteita, niin kemosensitiivisyys syöpäsolujen kautta CD44-XCT (syöpä kantasolun markkeri-kysteiini transporter) akselilla [10], [11]. CDO1 vaikuttaa sytosiini metabolian, mikä johtaa reaktiivisten happiradikaalien (ROS) ja vähentämällä solujen elinkelpoisuuden ja kasvun [12], [13]. Näin ollen,

CDO1

uskotaan olevan kriittinen kasvainsuppressorigeenin, ja se voisi olla merkkiaine kemiallis-vastus syöpäsoluja.

Koska DNA: n metylaatio oli ensimmäinen havaittu plasmassa ruokatorven syöpäpotilailla [14], metyloitua DNA: ta on toistuvasti havaittu plasmassa erilaisten syöpien, mukaan lukien CRC-[15].

SEPT9

promoottori pidettiin lupaavimpia tuumorimarkkeri koska 69%: n ensisijaisen CRC kudokset olivat positiivisia tämän metyloinnin, kun se ei ole havaittu 86%: n valvontaa. Lisävalidointia tutkimukset osoittivat, että plasman

SEPT9

metylaatiomääritystä voisi havaita CRC suurella herkkyydellä [16], [17].

Tässä tutkimuksessa selvitimme jäljellä

CDO1

hypermetylaation joka havaittiin ensisijaisen CRC kudoksissa: 91% kasvaimen kudokset olivat positiivisia

CDO1

metylaatio, kun se ei ole havaittu 93%: n valvonnan [9]. Kuvaamme havaitseminen CDO1 metylaation plasmassa CRC potilaiden ja laaja analyysi PCR-reaktion.

Methods

Solulinjat ja plasmanäytteiden

CRC solulinja DLD1 oli ystävällisesti Cell Resource Centre for Biomedical Research, Institute of Development, ikääntymisen ja syövän yhteys, Tohoku University (Sendai, Japani). Hepatosellulaarisia kohdunkaulan HepG2 ostettiin RIKEN Bioresource Centre (Ibaraki, Japani). DLD1 soluja kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (GIBCO, Carlsbad, CA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS). HepG2-soluja kasvatettiin DMEM-alustassa (GIBCO), johon oli lisätty 10% FBS.

Plasma 20 (Alustava tutkimus) ja 40 (varten validointitutkimuksessa) primaarisessa CRC kerättiin ennen potilaalle tehtiin kirurginen resektio on Kitasato yliopistollisen sairaalan 1. syyskuuta 2009 30. kesäkuuta 2011. Tässä tutkimuksessa hyväksyi eettisen komitean Kitasato yliopistosta. Osallistujat jos niiden kirjallinen suostumus osallistumiseen tähän tutkimukseen ennen leikkausta.

CRC vaiheessa luokiteltiin mukaan TNM luokittelu, 7

painos Unionin International Cancer ohjaus (UICC) ja 7

th painos japani luokittelu peräsuolen syövän (JCCC) lavastus järjestelmä. Potilaiden ominaisuudet esitetään taulukossa 1.

DNA: n eristämiseksi

Vapaasti kelluva kiertävä DNA uutettiin plasmasta käyttäen Magna Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I (Roche Applied Science, Mannhein, Saksa) ja Rochen Magna Pure laitteeseen. Plasma (400 ui: pieniä määriä, ja 1. 2,5 ml: suuria määriä) jaettiin Magna Pure kaivoja ja olivat uutetaan jälkeen kitin. Genomi-DNA eluoitiin 100 ul: n. Ja genomista DNA: ta solulinjoista eristettiin käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Sciences, Hilden).

bisulfiittikäsittelyn DNA: ta ja Sequencing Analysis

DNA: ta denaturoivalla, DNA uutettiin plasmasta CRC potilailla (lopullinen tilavuus 100 ui) tai 2 ug genomista DNA: ta saatiin solulinjoista, inkuboitiin 5 ug lohen sperman DNA: ta 0,3 mol /l NaOH: ta 20 minuutin ajan 50 ° C: ssa. DNA-näyte laimennettiin sitten 500 ui 2,5 mol /l natriummetabisulfiitilla (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l hydrokinonia (Sigma) /0.4 mol /l vesiliuosta, ja ne on sijoitettava 70 ° C: ssa 1,5 tuntia. Näyte seuraavaksi pylvääseen, (Wizard DNA Clean-UP System, Promega Inc., Madison, WI), inkuboitiin 0,3 mol /l NaOH: ta 10 minuutin ajan, ja käsiteltiin sitten 3 mol /l ammoniumasetaattia 5 min. Näyte saostettiin 100% etanolia, ja DNA suspendoitiin uudelleen 25 tai 50 ui LOTE koostuu 10 uM Tris-HCI, pH 8, ja 2,5 uM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), pH 8: DNA-solulinjoista oli myöhemmin monistettiin käyttäen polymeraasiketjureaktiota (PCR). Bisulfiitti käsittely johtaa kemialliseen modifiointiin metyloitumattoman, mutta ei metyloidut, sytosiinit urasiilit, jolloin ero metyloituneiden ja metyloitumattomien genomista DNA: ta. Alukesekvenssit kiinnostavat geenit oli suunniteltu tunnistamaan nämä DNA muutokset (taulukko S1). Aluke tuotteet sekvensoitiin käyttämällä Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).

analyysi kloonattujen sekvenssien, PCR-tuotteet insertoitiin pCR4-TOPO-vektoriin käyttämällä TOPO TA -kloonaustarvikesarjaa sekvensointia varten (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Valittiin kymmenen kloonia, kullekin näytteelle, jotka sitten sekvensoitiin käyttäen semi-sisäkkäisiä alukkeita (taulukko S1).

Quantitative-Metylaatiospesifinen PCR (Q-MSP) B

TaqMan metylaatiospesifisen PCR ( Q-MSP) suoritettiin kolmena kappaleena käyttäen iQ Supermixiä (Bio-Rad), ja iCycler iQ Real-Time PCR Detection järjestelmän (Bio-Rad). PCR-olosuhteet ja alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1. Sarjalaimennoksia bisulfiitin muunnetun DNA DLD1 käytettiin metylointi positiivisena kontrollina rakentaa kalibrointikäyrän kullekin levylle, ja muunnetun DNA: HepG2-soluja käytettiin negatiivisena kontrollina.

Tilastollinen analyysi

kategorisia muuttujia arvioitiin Fisherin testiä. Survival laskettiin Kaplan-Meier-menetelmää. Univariate analyysit ennustavat tekijät etenemistä elinaika (PFS) suoritettiin käyttäen log-rank menetelmällä. PFS määriteltiin aika leikkauksesta etenemiseen (uusiutumisen tai R1 /2 toiminta) tai kuolemia mistä tahansa syistä, ja tietoja elossa olevien potilaiden sensuroitiin viimeisessä seurannassa. Mediaani seuranta-aika oli 46 kuukautta (vaihteluväli: 0-55 kuukautta).

Tulokset

Promoottori DNA hypermetylaatiota

CDO1

geenin analyysi kloonattu sekvenssi ihmisen syöpäsolun linjat perustamiseen positiivisten ja negatiivisten kontrollien kvantitatiivinen metylointianalyysi

Vaikka

CDO1

on selvästi hypermetyloitunut syöpäsolulinjoissa [9], aste

CDO1

promoottori hypermetylaatiota kloonattiin

CDO1

promoottorisekvenssit ei ole määritetty. Käyttäen bisulfiittikäsittelyn DNA seurasi sekvenssianalyysi, olemme analysoineet metylaation tason

CDO1

promoottorisekvenssi kloonattiin PCR: llä monistettu genomisesta DNA: sta DLD1 (metylaatio positiivinen) ja HepG2 (metylaatio negatiivinen) soluja. Tämä määritys osoitti metyloinnin 93% ja 4,7%: n CpG-sivustoja

CDO1

promoottorialueen DLD1 ja HepG2-soluissa, vastaavasti (Fig. 1a). Siksi katsotaan, että DLD1 ja HepG2 solulinjat olivat sopivia käytettäväksi positiiviset ja negatiiviset kontrollit, vastaavasti,

CDO1

metylointianalyysi.

(a) sekvenssianalyysi kloonatun

CDO1

promoottori. Taajuus metyloituneiden CpG-saarekkeiden on kloonattu

CDO1

promoottori positiivisena kontrollina, DLD1 soluja, ja negatiivinen kontrolli, HepG2-soluissa. (B) Q-MSP tehoa PCR-monistuksessa

CDO1

ja β-aktiini oli erinomainen. (C) herkkyys

CDO1

metylaatio havaitseminen käyttäen Q-MSP analysoinnissa käytettiin 2-kertaisia ​​(100-+3,125 ng /PCR) kloonattujen

CDO1

promoottorit DLD1 ja HepG2-soluissa. (D) Q-MSP on

CDO1

metylaatio sisään DLD1 soluissa käyttäen 10-kertaisia ​​(100, 10, 1, 0,1, ja 0,01 ng /PCR) kloonatun

CDO1

promoottori . Keskittymä niinkin alhainen kuin 1 ng /PCR-reaktiossa positiivisen kontrollin DLD1 solun DNA voidaan selvästi havaita. Kuitenkin DNA 1000 kertainen laimennus (0,1 ng /PCR) voidaan tuskin havaita. Huomaa, että havaitseminen on vähemmän herkkä, kun pienempiä määriä DNA: ta käytetään.

Q-MSP on metyloitu CpG sivustoja

CDO1

geenin selvästi monistettu tietyn signaalin positiivinen kontrolli, DLD1, mutta ei negatiivisen kontrollin, HepG2

seuraava määrällisesti denaturoidulla

CDO1

jälkeen bisulfiitti DNA hoitoon käytetään Q-MSP kanssa samoja alukkeita ja koetinta, joka on aikaisemmin raportoitu [9] . Käyttämällä tätä menetelmää, vahvistettuja signaaleja voidaan selvästi tunnistaa. Tehoa PCR-monistus metyloitu

CDO1

oli erinomainen, ja sen havaittiin olevan verrattavissa β-aktiinin monistaminen tehoa (Fig. 1b). Q-MSP on

CDO1

methyaltion osoitti, että metylaatio on selvästi havaittu, kun DNA-templaatin välillä DLD1 soluista käytettiin pitoisuuksina 100, 50, 25, 12,5, 6,25 ja 3,125 ng /PCR-reaktiossa, kun taas mitään metylaatio lainkaan ei voitu havaita negatiivisten kontrolli HepG2 DNA-templaattien (Fig. 1 c). Käytimme fluoresenssi 0,35 kynnyksenä linja tässä määrityksessä, koska negatiivinen kontrolli on aina alle tämän raja-arvon. Kun DNA-templaatti laimennettiin edelleen pitoisuuksina 100, 10, 1, 0,1, ja 0,01 ng /PCR-reaktiossa analysoitiin, Q-MSP on

CDO1

DNA DLD1 havaittu metylaatio PCR-reaktioissa, käyttäen 100, 10, tai 1 ng /reaktio, kun se tuskin havaita metylaatio PCR-reaktioissa käyttäen 0,1 tai 0,01 ng /reaktio. Ei metylaatio havaittiin tahansa DNA-pitoisuus reaktiot käyttämällä HepG2 negatiivinen kontrolli-DNA (Fig. 1 d). Nämä havainnot ehdottivat, että jopa tiheä

CDO1

metylaation kuten todettua DLD1 solut voidaan tuskin havaita käyttämällä Q-MSP kun DNA laimennetaan noin 1000-kertaisesti, ja että havaitseminen on vähemmän herkkä kun vähemmän DNA on sovellettu. Näin ollen, jotta voidaan havaita minimaalisesti jäljellä sairaus syöpä kehon nesteissä, olisi parempi pystyä käyttämään suurempia määriä DNA kuin yleensä käytetään kvantitatiivista analyysiä DNA: n metylaatio.

Detection metylaation CpG saari sekvenssi

CDO1

geeni plasmassa CRC potilaiden Q-MSP käyttäen pieni määrä templaatti-DNA

tutki herkkyyttä havaita

CDO1

metyloitu DNA plasmassa 20 CRC potilaista. Tässä alustavassa kokeessa poimimamme DNA 400 ui CRC potilaiden plasman. Puolet uutettua DNA: ta on sovellettu kolmeen rinnakkai- määrityksiä sekä

CDO1

ja β-aktiini. Siten plasman tilavuus kunkin määrityksessä oli 33,3 ui, joka on nimetty 1 mallia tilavuus.

CDO1

metylaatio havaittiin vain 2 (10%) ja 20 CRC-potilailla, kun taas β-aktiini-metylaatio havaittiin kaikissa näytteissä (kuvio. 2). Kuva. 2a esittää

CDO1

positiivisia tapauksia; metylaatio

CDO1

-3 havaittiin selvästi, mutta se on

CDO1

-1 ja

CDO1

-2 oli marginaalinen, koska signaalit olivat alle raja-arvon. Kuitenkin tämän tason metylaatio saattaa olla voimassa, koska PCR 1/1000 laimennus positiivisen kontrollin osoitti samanlaista signaalia (Fig. 1 d). Sen sijaan

CDO1

negatiivinen tapauksissa koskaan näytteillä mitään signaalia ollenkaan monistettua

CDO1

metylaatio (Fig. 2b). Näitä kokeita varten, määrät DNA: ta alkuperäisestä 400 ui plasmaa keskimäärin 435 ng, jotka vaihtelevat 160 ng ja 2000 ng. Sen vuoksi DNA: n määrä soveltaa 1 PCR-reaktion vastasi vähintään 16,7 (1/6) ng /reaktio. Tämä DNA-määrä on ajateltu olevan riittävä Q-MSP, jos metyloituja alleeleja sisältyvät (ks. 1c). Kuitenkin Ct-arvo β-aktiini vaihteli 34-38, joka oli täysin erilainen kuin se, joka saavutetaan suorittamalla Q-PCR solulinjoja, joissa tavanomainen Ct-arvo β-aktiini on noin 28. Tämä tulos viittasi siihen, että havaitseminen plasman DNA oli vähemmän herkkä kuin DNA solulinjoista, mikä johtuu todennäköisesti DNA hajoamisen tai muista tuntemattomista syistä. Riittävä DNA PCR reaktio oli läsnä vain 1 2

6 (64 kertainen) 2

10 (1024-kertainen). Tämä tarkoitti, että alkuperäisen plasmatilavuutta käytetään DNA: n eristämiseksi olisi parasta lisätä 100-1000-kertaisesti (so 4-40 ml plasmaa) määritystä varten plasman DNA käyttäen Q-MSP. Siksi saada riittävästi plasmaa DNA havaita minimaalinen jäljellä tauti, enemmän DNA kuin käytettiin tässä alustavassa tutkimuksessa tarvittaisiin. Siten alkuperäistä esitutkimus ollut käyttänyt optimaaliset olosuhteet havaitsemiseksi

CDO1

metylaatio plasmassa.

(a) Edustava positiivinen tapaus näytettiin. Β-aktiini-geenin määritettiin sisäisenä kontrollina bisulfiitilla käsitellyn DNA: n. Jopa tämä myönteinen tapauksessa havaitseminen metyloiduksi

CDO1

ei ole vakaa, koska kaikki mallit eivät voittaa kynnystasoa. (B) Edustava negatiivinen tapaus on esitetty. Huomaa, että β-aktiini taso on odotettua alhaisempi.

havaitseminen metyloitu CpG-saarekkeen sekvenssi

CDO1

geenistä Q-MSP käyttäen suurempia määriä DNA plasmasta CRC-potilailla

tutkitaan sitten DNA: ta, joka vastaa 3 mallin määriä havaitsemiseksi

CDO1

metylaation plasmassa 20 CRC potilailla. Tämä määritys havaitsee 4 tapausta (20%), jotka olivat positiivisia metylaation

CDO1

plasmassa. Lisäksi selkeämpi signaalit saatiin kuin silloin, kun yhden mallin tilavuus on käytetty, viittaa siihen, että herkkyyttä voidaan suuresti täydennetty lisäämällä määrä plasmasta saadun DNA (Fig. 3).

(a) E -1-69 (b) E-2-10 (c) E-2-31 (d) E-2-32, jotka olivat positiivisia metylaation

CDO1

plasmassa, kun templaatti-DNA uutettiin suuremman määrän plasmaa.

jälkeen tutkittiin 40 itsenäistä CRC tapauksissa Q-MSP käyttämällä DNA uutetaan suurempi tilavuus plasmaa (1,0 ja 2,5 ml plasmaa vastaavat 5-12,5 malliin määriä perustuvat alkuperäistä mallia tilavuus määritelmä). Keskimääräinen määrä DNA uutetaan DNA 1491 ng, (jotka vaihtelevat 580 ng 2590 ng). Tämä määritys havaittu selkeä

CDO1

metylaation 8 40 CRC tapausta (20%). Kirkas metylaatio havaittiin 1 6 (16,7%), 2 10 (20,0%), 1 13 (7,7%), ja 4 11 (36,4%) vaiheen I, II, III, ja IV CRC tapauksissa vastaavasti (Fig. 4a). Mitä korkeampi vaiheessa, sitä suurempi on metylaatio tasolle, joka havaittiin (Fig. 4b). Potilaiden taustat esitetään taulukossa 1. Vaikka

CDO1

metylaatio useammin löytyy CRC potilaalla on kaukainen etäpesäke, ennuste potilaiden denaturoidulla

CDO1

plasmassa ei ollut merkittävästi huonompi kuin potilaat, jossa ei metyloituja

CDO1

havaittiin plasmassa (Fig. 4c). Alla kynnys signaali vastasi 1/1000 laimennus positiivisen kontrollin (Fig. 4d). Jos tällainen marginaalinen alle kynnyksen signaalin

CDO1

metylaatio sisältyi myönteinen signaali, sitten metylaatio havaittiin kaikissa 40 CRC potilaista.

(a) Q-MSP analyysi metyloitua

CDO1

käyttää paljon plasmajohdetun DNA CRC potilaiden ero vaiheissa. (B) edustaja positiivisia tapauksia esitetään mukaan vaiheeseen. Kuva paksusuolen kuidun ensisijainen syöpä on mukana jokaisessa kuvassa. (C) Survival käyrä CRC potilaiden mukaan metyloitunut

CDO1

tasot plasmassa. (D) edustaja tapaukset osoittavat marginaalinen positiivinen asia esitetään.

Yhdistelmä metyloitu

CDO1

kohonneita seerumin CEA /CA19-9 havaitsemiseksi parannettavissa I-III peräsuolen syöpä

Näistä yli 40 potilasta, 39 oli informatiivinen koskien ennen leikkausta arvo seerumin CEA ja CA19-9. CEA oli positiivinen ( 5,0 ng /ml) 14 näistä 39 potilasta (35,9%), kun taas CA19-9 oli positiivinen ( 37,0 IU /ml) 9 näistä 39 potilasta (23,1%). Nopeus havaitseminen CRC mukaan vaiheeseen laskettiin suhteessa CEA, CA19-9, CEA /CA19-9 yhdistelmä, tai CEA /CA19-9 /plasma

CDO1

metylaatio yhdistelmä (Fig. 5a ). Nopeus havaitsemisen vaiheen IV CRC CEA, CA19-9 tai CEA /CA19-9 oli korkea. Kuitenkin yhdistäminen plasma

CDO1

metylaatio dataa CEA /CA19-9 ei lisännyt havaitseminen hinnat. Toisaalta,

CDO1

lisätä havaitseminen hinnat vaiheen I, II, ja III CRC, joita pidetään parannettavissa (Fig. 5a). Vaikka vain 21% tällaisista parannettavissa potilaille voitiin havaita perustuu CEA tasoilla,

CDO1

yhdistelmä lisäsi havaitsemismäärä tällaisten kovettuvan potilaista 39,3% (Fig. 5b).

(a) CRC paljastumisaste CEA, CA19-9, yhdistelmä CEA /CA19-9, ja yhdistelmä CEA /CA19-9 /plasma

CDO1

metylaatio mukaan CRC vaiheessa. (*) Osoittaa p 0,01. (**) Tarkoittaa, p 0,05. (B) parannettavissa CRC (vaihe I-III) tunnistus nostettiin yhdistämällä plasman

CDO1

metylaatio tiedot.

Keskustelu

Koska havaittiin, että syöpä erityisiä muutoksia veressä voidaan havaita syöpäpotilailla, lukuisia kasvaimen merkkiaineita on kehitetty kliiniseen käyttöön. CRC, seerumin CEA ja CA19-9 ovat hyvin tunnustettu sellaisiksi hyödyllisiä markkereita [18], [19]. Koska korkeat arvot seerumin CEA ja CA19-9 usein havaitaan vaiheessa IV peräsuolen syövän, nämä merkit ovat hyödyllisiä ennustamisessa ennustetta tai kyseessä varhaista havaitsemista uusiutumisen poliklinikalla keskustassa [18]. Koska nämä merkit voivat joskus havaita toistumisen aikaisintaan diagnostisen kuvantamisen kuten CT tai kaiku, ne ovat välttämättömiä lääkärit, jotka kohtelevat CRC kliinisenä välineenä. Toisaalta, valitettavasti nämä merkit eivät ole riittäviä syövän toteamiseksi, kun sitä sovelletaan havaitsemiseen kovettuvan CRC. Ennen leikkausta CRC havaitseminen hinnat CEA ja CA19-9 noin 30~50% tai vaiheen I CRC ja 10~20% vaiheen III CRC [20]. Jos uusi tuumorimarkkeri veressä voitaisiin käyttää yhdessä niin klassista kasvainmerkkiaineet, tämä lisäisi havaitsemismäärä parannettavissa CRC ja nämä merkit olisivat lupaavia varten seulonta CRC lääkärintarkastus [21].

Muutokset, jotka on tarkoitus käyttää kasvaimen merkkiaineita on syöpä erityinen. Metyloinnin

CDO1

promoottorialue, joka määritettiin olevassa tutkimuksessa tunnistettiin alun perin vahvan seulonta farmakologisen paljastumista microarray, joka suorittaa tutkia syöpään altis metylaatio [1], [2], [ ,,,0],9]. Käyttämällä tällaista array olemme tunnistaneet useita uusia geenejä, joilla on syöpä-altis metylaatio.

NMDAR2A-

[6],

DFNA5

[7],

OSMR

[8], ja

CDO1

[9]. Näistä geeneistä,

CDO1

erottui suhteen herkkyys ja spesifisyys ero havaitsemiseen CRC vastaavasta normaalista limakalvo. Samanlaisia ​​

CDO1

metylaatio piirteet vahvistettiin erilaisten muiden syöpien, kuten rinta-, ruokatorven, keuhko-, virtsarakko- ja mahasyövän. Koska tällainen syöpä-altis metylaatio on harvinaista, analysointi

CDO1

metylaatio on suuri kliininen mahdollisuudet havaita minimaalinen jäljellä taudin ihmisen kehon nesteistä, kuten verestä.

SEPT9

pidetään ensimmäinen molekyyli, joka usein metylaatio onnistuneesti havaittu plasmasta CRC potilaista käyttäen reaaliaikaista PCR: ää [16], [17]. Havaitseminen nopeus metyloitu

SEPT9

plasmassa parannettavissa CRC potilaiden vaiheen I-III on huomattavan suuri, on yli 60% [22]. Kiinnostavaa, niin korkea paljastumisaste metyloitua DNA plasmassa potilailla, joilla on parannettavissa CRC näkyi myös jollakin muulla tavalla. Näin ollen, käyttämällä metyyli-säteilevä menetelmä, Li et ai. osoittivat, että plasman metyloitu

vimentiinista

voitiin havaita noin 40-60% kovettuvan CRC vaiheessa I-III, ja että havaitsemisen herkkyyttä oli suurempi kuin seerumin arvosta CEA [21]. Näiden tulosten perusteella, analyysi metyloitua DNA on erittäin lupaava ehdokas työkalu veren syöpädiagnoosi, ja plasman

CDO1

metylaatio, joka oli tämän tutkimuksen katsotaan yksi tällainen ehdokas DNA. Syöpä spesifisyys ja herkkyys

CDO1

methyaltion oli osoittautunut yhtä suuri kuin joko

SEPT9

tai

vimentiinista

metylaation CRC, jossa AUC ROC käyrä erilaistua syöpä kudoksiin vastaavasta normaalista limakalvo oli 0,96 [9].

vastakohtana näille lupaavia raportit, on ollut joitakin pettymys raportteja osalta havainnointiasteet metyloituneiden geenien plasmassa [14]. Havaitseminen nopeus metyloitu

CDO1

plasmassa on pettymys 20% koko CRC potilasta analysoitiin, ja on noin 35% vaiheessa IV CRC. Meidän nykyisessä tutkimuksessa, teimme DNA malleja

CDO1

edistäjä DLD1 soluja, positiivisena kontrollina

CDO1

metylaatio, laimennettu DNA jopa 100.000 kertainen, ja vertasi

CDO1

metylaatio herkkyystason eri laimennoksia. Tämä määritys osoitti, että pienempi määrä DNA-templaatin, joka levitetään, sitä huonompi on tehoa PCR havaitsemiseen. Entistä aktiini vahvistusta tehon määrä DNA DNA: n kokonaismäärä plasmaa, joka voisi toimia mallina Q-MSP PCR-monistaminen

of CDO1

”oli yllättäen erittäin pieni (tehoa laskettiin 1 /100 1/1000). Nykyisissä tutkimuksessa, herkkyys metyloitu

CDO1

tavanomaisella Q-MSP on yli 1/1000 laimennus uutettua DNA: ta (Fig. 1 d), joka on paljon huonompi kuin säteilevä määrityksen (jotka osoittivat laimennos 1 /10.000 herkkyys) [23]. Kun tilavuus plasmaa käytetään DNA: n eristämiseksi kasvatettiin 3X (käsittää kolme mallia määriä) selkeämpi signaali saatiin Q-MSP. Kuitenkin lisäämällä plasmatilavuutta käytettiin DNA louhinta 10X (kymmenen mallin volyymit) ei antanut niin hyvä paljastumisaste kuin saadaan käyttämällä 3 mallia tilavuus. Koska 10-12 mallin määriä käytettiin Q-MSP PCR-monistus metyloitu

SEPT9

[16] määrä DNA-templaattien Tutkimuksemme eivät olleet niin pieniä kuin ne, joita käytetään SEPT9 tutkimuksessa. Kuitenkin metyloitua DNA havaitseminen hinnat olivat huomattavasti alhaisemmat esillä olevassa tutkimuksessa kuin

SEPT9

tutkimuksessa, koska metyloiduksi

SEPT9

havaittiin noin 60% kovettuvan CRC [16].

alhaisen herkkyys määrityksessä (20%) plasman metyloidut

CDO1

, hyödyllisyys testi väestön seulontaa varten CRC edellyttää parempaa herkkyyttä varhaisten syöpien ja kehittyneet adenoomia. Saattaa olla tapoja saavuttaa mahdollisia parannuksia seuraavasti; 1) 3,5-5 ml plasmaa tulisi kerätä DNA: n eristämiseksi. 2) CDO1 PCR-aluke suurenivat. 4) Kohde oli positiivinen, jos jokin kolmesta PCR toistojen olivat positiivisia, koska kolmas PCR mittaus välttämättä lisää herkkyyttä ja vähentää spesifisyys. Seuraava haaste on tarkoitus saavuttaa tällainen keksii parantaa herkkyyttä havaitsemiseen minuutin syöpäsoluja. Jos voimme lisätä herkkyyttä edellä keksii, keräämme plasmassa terveiden henkilöiden ja voi määrittää optimaaliset raja-arvo Metyloitujen CDO1 CRC potilailla.

On 2 mahdollisia selityksiä siihen että paljastumisaste

CDO1

metylaatio olivat paljon huonommat kuin

SEPT9

metylaation plasmassa CRC potilaista. Siten havaitsemismäärä määritettynä käyttäen Q-MSP voitaisiin koholla alentamalla tasolla. Esimerkiksi, kuviossa. 4d, tässä vaiheessa IV arvosteltiin negatiivisiksi

CDO1

metylaatio. Kuitenkin kynnys pienennettiin, tässä tapauksessa voidaan pitää positiivisena. On mahdollista, että raja-arvo voidaan edelleen pienentää. Vaikka emme määrittämään plasman terveen henkilön, kynnys olisi määriteltävä verrattuna havaitsemismäärä terveen ohjaus kuten aiemmin on esitetty. [16] Toinen selitys on, että taso metyloitua

CDO1

plasmassa on pienempi kuin metyloitu

SEPT9

. CDO1 osallistuu kysteiini aineenvaihduntaan, ja kysteiini biologia on viime aikoina saanut huomiota kannalta syövän kantasolujen teoriaa. Kysteiini transporter XCT liittyy, syöpä kantasolujen markkerin CD44, ja joilla on lisääntynyt kysteiinin pitoisuus sytoplasmassa syövän kantasoluja, ja estää siten ROS: n syntyminen ja chemoresistance. Syövän kantasoluja uskotaan hengissä kauemmin ensisijainen syövän kudoksissa, mikä viittaa siihen, että vähemmän DNA voi olla peräisin syövän kantasoluja kuin muulla tavoin soluja. Jos jälkimmäinen teoria on oikea, metyloituja

CDO1

ei sovellu käytettäväksi plasman tuumorimarkkeri. Jos entinen teoria on oikea, havaitseminen hinnat syöpäsolujen perustuu plasma metyloitu

CDO1

voitaisiin lisätä parantaminen tunnistusjärjestelmä. Nykyisissä tutkimuksessa DNA: n määrä, joka on käyttökelpoinen tällaisen havaitsemisen osoitettiin olevan alhainen plasmassa. Siksi käyttöä sisäkkäisiä PCR on lupaava lähestymistapa tällaista analyysiä lähitulevaisuudessa.

Yhteenvetona analyysi metyloiduksi

CDO1

plasmassa on pettymys suhteen paljastumisaste. Kuitenkin plasma metyloitu

CDO1

on riippumaton seerumin CEA /CA19-9, joten yhdistelmä näistä merkeistä voisi lisätä havaitsemismäärä parannettavissa CRC. Toisaalta, CRC havaitsemismäärä ei lisääntynyt yhdistelmällä plasman metyloitu

CDO1

dataa CEA /CA19-9 tasoilla vaihe IV CRC. Siksi, jos CRC detektioprosentti perustuu metyloitu

CDO1

plasmassa oli nostettava käyttämällä uusia tunnistusjärjestelmä edellä kuvatun, plasma metyloiduksi

CDO1

analyysi olisi lupaava väline havaitsemiseen parannettavissa CRC mukaan lääkärintarkastus verta. Lisäksi koska

CDO1

metylaatio yleisesti todettu muissa syövissä, tämä tekniikka voi olla laajalti sovellettavissa menetelmä syövän havaitsemiseen käyttämällä verta.

tukeminen Information

Taulukko S1.

PCR tuotanto ja sekvenssi alukkeiden ja fluoresoiva koetin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0113546.s001

(XLSX) B