Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on tyypillistä nopea eteneminen ja alhainen eloonjäämisaste. Siksi uusia terapeuttisia aineita tarvitaan kipeästi tähän tautiin. Kapsaisiini, vaikuttava aine chili paprikat, näyttää antiproliferatiivista aktiivisuutta eturauhasessa ja epidermoidikarsinooma syöpä

in vitro

. Kuitenkin, anti-proliferatiivista aktiivisuutta kapsaisiini ei ole tutkittu ihmisen SCLCs. Esillä käsikirjoitus täyttää tämän mitätön tiedon ja tutkii antiproliferatiivinen vaikutus kapsaisiinia vuonna SCLC

in vitro

ja

in vivo

.

Menetelmät /Principal Havainnot

BrdU määritysten ja PCNA ELISA osoitti, että kapsaisiinin näyttää vankka antiproliferatiivista aktiivisuutta ihmisen neljän SCLC solulinjoissa. Lisäksi kapsaisiini voimakkaasti tukahdutti kasvua H69 ihmisen SCLC kasvaimet

in vivo

minkä toimen CAM määrityksiä ja paljaisiin hiiriin malleja. Toinen osa tutkimusta yritettiin antaa yksityiskohtaista tietoa molekyylitason mekanismit antiproliferatiivista aktiivisuutta kapsaisiini. Olemme havainneet, että anti-proliferatiivista aktiivisuutta kapsaisiinia korreloi lasku ilmentymisen E2F-reagoiva proliferatiivinen geenien, kuten sykliini E, tymidylaattisyntaasin, cdc25A ja Cdc6, sekä mRNA: ta ja proteiinia tasolla. Transkriptiotekijän E2F4 välittämän anti-proliferatiivista aktiivisuutta kapsaisiini. Ablaatio E2F4 tasosta vuoteen siRNA metodologia tukahdutettu kapsaisiinin aiheuttamaa G1 pidätys. ChIP analyysit osoittivat, että kapsaisiini aiheutti rekrytointi E2F4 ja p130 on E2F-reagoiva proliferatiivinen promoottorit, mikä rajoitti soluproliferaatiota.

Johtopäätökset /merkitys

havaintojen mukaan antiproliferatiivisia vaikutuksia kapsaisiini voisivat olla käyttökelpoisia terapiassa ihmisen SCLCs.

Citation: Brown KC, Witte TR, Hardman WE, Luo H, Chen YC, Carpenter AB, et al. (2010) Kapsaisiini Näyttää antiproliferatiivinen vaikutus ihmisen pienisoluisen keuhkosyövän soluviljelmässä ja Nude hiiret mallit kautta E2F Pathway. PLoS ONE 5 (4): e10243. doi: 10,1371 /journal.pone.0010243

Editor: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 8. tammikuuta 2010 Hyväksytty: 24 maaliskuu 2010; Julkaistu: 20 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Brown et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Center of Biochemical Research Excellence Pilot Research Grant National Institutes of Health (lupanumeroon 5P20RR020180); Lääkkeiden Manufacturers Association Foundation Research Starter Grant; Marshallin yliopiston ADVANCE toveruutta; Grant-in-Aid perustutkintoa tutkimus avustusta National Aeronautics and Space Administration; ja Young kliinisen tutkijan palkinto päässä lentoemäntä Medical Research Institute (lupanumeroon 82115). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on aggressiivinen pahanlaatuisen edustaa 13% kaikista keuhkosyöpää, joiden kokonaispituus 5 vuoden pysyvyys on alle 5% [1], [2]. Tällaiset tilastot korostavat tarvetta uusia hoitostrategioita tähän sairauteen. Viimeaikaiset edistysaskeleet perustiedot molekyylitason tapahtumia mukana SCLC etenemistä ovat johtaneet potentiaalisten aineita hoitotoimenpiteiden [2], [3], [4], [5]. Nämä strategiat sisältävät kasvutekijän /reseptori-spesifiset inhibiittorit, proteiinikinaasi-inhibiittorit ja ravitsemukselliset aineet. Tunnistaminen ravitsemukselliset aineet, jotka näyttävät antiproliferatiivista aktiivisuutta, voivat edustaa uutta terapeuttista avenue ihmisen SCLC.

kapsaisiini, suuret vaikuttava aine chili, käytetään paikallisesti hoitoon liittyvän kivun ja tulehduksen erilaisia sairaudet [6], [7]. Kemopreventiossa tutkimukset osoittavat, että kapsaisiinin voi tukahduttaa syövän synnyn ihon, paksusuoli-, keuhko-, kielen ja eturauhasen [8], [9], [10], [11], [12]. Vaikka nämä tutkimukset ovat käsitelleet kemopreventatiivisille potentiaalia kapsaisiini, vain muutama on käsitelty sen potentiaalia syövän aineena. Esimerkiksi kapsaisiini on osoitettu indusoivan apoptoosin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), T-solu-leukemia, ruokatorven karsinooma, astroglioma, eturauhasen, paksusuolen ja mahalaukun syövän solujen soluviljelymalleissa [13], [14], [15], [16], [17]. Lisäksi hallinto kapsaisiini on osoitettu tukahduttaa eturauhassyövän kasvaimen kasvua nude-hiirissä malleissa [10], [18].

lisäksi aiheuttaa apoptoosin, kapsaisiini on havaittu indusoivan solusyklin pysähtymisen ihmisen syövässä solut. Useat yhtenevät tutkimukset ovat osoittaneet, että kapsaisiinin aiheuttaman G1 pysähtymisen CE 81T /VGH ihmisen epidermoidikarsinooma solujen ja syöpäsolujen tapahtua induktion p53 ja sykliiniriippuvaisen kinaasin (cdk) estäjä p21: [10], [17], [19 ], [20], [21]. Hoidettaessa ihmisen HL-60-leukemiasoluista kapsaisiini aiheutti G1 pidätys eston kautta cdk2 toimintaa. Anti-angiogeeninen aktiivisuus kapsaisiinia johtuu sen kyvystä aiheuttaa G1 pidätys endoteelisoluissa. Kapsaisiini aiheuttama G1 pidätys korreloi tukahduttaminen sykliini D1 tasoilla esto CDK4 aktiivisuuden ja Rb fosforylaatiota endoteelin ja rintasyövän solujen [21], [22]. Nämä tiedot esiin mahdollisuuden, että anti-proliferatiivista aktiivisuutta kapsaisiinia välittävät sen vaikutukset E2F-Rb-reitti.

E2F perheen transkriptiotekijöiden, joka koostuu kahdeksan jäsenen geenit (E2F1-E2F8), toistetaan keskeinen rooli säätelyssä solusyklin etenemisen ja solujen lisääntymistä [23], [24], [25], [26]. Nämä E2Fs on edelleen eritellään kahteen ryhmään niiden transkription sääntelyn ominaisuudet geenien promoottorit. E2F1, E2F2 ja E2F3 usein nimitystä ”aktivaattori” E2Fs koska ne transkriptionaalisesti aktivoida E2F tavoite proliferatiivista geenejä, kuten sykliini E, cdc25A ja Cdc6 [25], [27], [28], [29]. Nämä kohdegeenien sitten indusoivat solunjakautumisen S-vaiheen ja siten edistämään solusyklin etenemistä. Toinen alaluokka, E2F4 ja E2F5, kutsutaan nimellä ”repressori” E2Fs, koska ne tukahduttavat transkription E2F kohdistaa proliferatiivisen geenejä. E2F perheenjäsenet E2F6, E2F7 ja E2F8 ovat myös repressors. E2F7 ja E2F8 ovat viimeksi tunnistettu tämän perheen jäseniä, ja paljon vähemmän tiedetään niiden toiminta ja sääntely [25]. Huolimatta siitä, että kaikki transkriptionaalisesti aktiivinen E2Fs sitoutuvat samaan DNA tunnistuskohdan kohde promoottorit, ne ovat erilaisia ​​toiminnallisia rooleja solussa [26], [29].

tutkimukset ovat viime vuosina osoittaneet, että toiminnan of E2Fs on tiukasti säännelty tasku proteiini perhe, nimittäin Rb, p130 ja p107. E2Fs 1-3 voivat sitoutua Rb-proteiiniin, mutta E2Fs 4 ja 5 sitoutua ensisijaisesti p107 ja p130-proteiinit [24], [25], [26], [29], [30]. Rb proteiinit sitoutuvat osaan sisällä transkription aktivointi alueen E2Fs, tehokkaasti tukahduttaa niiden toimintaa. Siten lepotilassa olevat solut sisältävät korkeita E2F sitoutuneet proteiinit Rb, p130 ja p107. Puhkeamista mitogeenisten ärsykkeiden aiheuttaa fosforylaatio Rb, p130 ja p107 mukaan sykliini D ja E ja niihin liittyvät kinaasit. Fosforylaatio Rb, p107 ja p130 tuloksia niiden poistoa ja irtaantuu E2F proteiineista [25]. Nämä vapaat E2Fs myöhemmin sitoutua kohdistaa proliferatiivisten promoottoreita kuten sykliini E, tymidylaattisynteesin (TS), cdc25A ja Cdc6, jotka säätelevät solusyklin etenemistä [31], [32]. Näiden, E2F1-3 stimuloida transkriptiota edellä mainittujen geenien, kun taas E2F4 ja E2F5 tukahduttaa transkriptio [25]. Suurin osa ihmisen SCLC ovat puutteellisia RB-proteiini [3]. Siksi on todennäköistä, että kaksi muuta taskun proteiineja, p107 ja p130, on keskeinen rooli E2F sääntelyn ja solujen lisääntymistä ihmisen SCLCs.

antiproliferatiivista aktiivisuutta kapsaisiini ei ole tutkittu ihmisillä SCLCs . Esillä käsikirjoitus täyttää tämän aukon tiedon ja näyttää ensimmäistä kertaa, että kapsaisiini voi voimakkaasti inhiboimaan ihmisen SCLCs käyttämällä useita soluviljelmissä ja

in vivo

malleissa. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että suurin osa ihmisen SCLCs on mutaatioita Rb ja p53, sekä häiriöstä, että E2F-Rb-reitti [3], [4], [5]. Saadut tiedot mikrosiruja, kudosnäytteitä keuhkosyöpäpotilaita ja ihmisen keuhkosyövän solulinjat osoittavat, että solusyklin säätelymolekyyleja, kuten E2F1-5, p130, Skp2, sykliini D1 ja p16, edistää kasvua ja etenemistä keuhkotuumoreiden [33] . Siksi me arveltu, että kapsaisiini näyttää antiproliferatiivista aktiivisuutta ihmisen SCLCs säätelemällä aktiivisuutta E2F perheen transkriptiotekijöiden.

Tämä käsikirjoitus on alustava tutkimus, jonka tarkoituksena on tutkia antiproliferatiivista aktiivisuutta kapsaisiinin ihmisen SCLC sekä soluviljelmissä ja eläinmalleissa. Tässä osoitamme ensimmäistä kertaa, että kapsaisiini näyttää voimakas anti-proliferatiivista aktiivisuutta ihmisen neljän SCLC solulinjoissa

in vitro

. Lisäksi tuloksemme osoittavat, että kapsaisiini estää kasvua ihmisen SCLC kasvaimia CAM ja paljaisiin hiiriin malleja. Olemme myös tutkineet panos E2F perheen transkriptiotekijöitä kasvua estäviä vaikutuksia kapsaisiinin SCLC soluissa. Havaitsimme, että kapsaisiini estää proliferaatiota ihmisen SCLCs kautta tietyn jäsenen E2F perheen, nimittäin E2F4. Ablaatio E2F4 tasoja kahden riippumattoman siRNA havaittiin käänteinen anti-proliferatiivista vaikutusta kapsaisiini. Lisäksi kapsaisiini aiheuttama kasvun pysähtymisen liittyi lasku ilmaus E2F kohdegeenien sykliini E, TS, cdc25A ja Cdc6. Lopuksi chromatin IP (chip) analyysi ihmisen SCLC-solujen osoitti, että hoito kapsaisiinia väheni rekrytointi aktivaattori E2Fs eli E2F2 ja E2F3, jotta proliferatiivinen promoottoreita kuten sykliini E, TS, cdc25A ja Cdc6. Toisaalta, rekrytointi repressorin E2F4 parannettiin kapsaisiini hoitoa. Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen, että kapsaisiini näyttää voimakas anti-proliferatiivista aktiivisuutta ihmisen SCLC soluissa eri tavalla säätelemällä E2F perheen transkriptiotekijöiden. Lisäksi tuloksemme esiin mahdollisuuden, että ravitsemukselliset aineet, kuten kapsaisiini voi olla käyttökelpoinen hoidettaessa ihmisen SCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Nude hiiret saatiin Charles River Laboratories ja sopeutettiin yhden viikon ajan. Heidän majoitettiin HÖYRYKARKAISTUT häkkejä

mielinmäärin

ruoan ja veden HEPA-suodatettua telineet ja seurattava eläimen henkilökunnalta. Kaikki toimenpiteet, joissa karvattomia hiiriä tehtiin mukaan Animal Care ja käyttö ohjeet laitoksessa akkreditoitu Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care (AAALAC) Kansainvälinen ja hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University (protokolla # 371).

Soluviljely ja transfektio

ihmisen SCLC solulinjoja NCI-H69, NCI-H82 (jäljempänä H69 ja H82, vastaavasti), DMS53 ja DMS114 saatiin American Type Culture Collection, Rockville, MD. Nämä solulinjat valittiin, koska ne on tutkittu laajasti, ja niiden fyysisten ja molekyylitason ominaisuudet muistuttavat läheisesti SCLC potilailla. Gazdar et al., (1985), joka eristettiin alun perin ja ominaista H69 ja H82 solulinjat [34], [35]. He havaitsivat, että morfologia ja kasvuominaisuudet H69 ja H82-solut olivat tyypillisiä SCLC kasvainsolujen todettu potilailla. Lisäksi biokemiallisten profiilia näiden solujen (läsnä L-dopadekarboksylaasiestäjä neuroendokriinisiä markkereita, bombesiini-kaltainen immunoreaktiivisuus, neuroni-enolaasin ja korkeita pitoisuuksia aivojen isoentsyymin kreatiinikinaasi) havaittiin olevan identtinen ihmisen SCLC kasvainten potilailla . Vastaavasti, DMS53 ja DMS114 solut eristetään ensin ihmisen SCLC biopsiat ja tunnettu siitä, että Pettengill et al., (1980). He havaitsivat, että molemmat DMS53 ja DMS114 säilytti fyysisen, morfologiset ja biokemialliset profiilin ihmisen SCLC kasvainten klinikalla [36].

H69 ja H82 pidettiin RPMI-1640 täydennetty 2 mM glutamiinia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS). DMS53 ihmisen SCLC-soluja viljeltiin Waymouth n MB752 /1 väliaineessa, joka sisälsi 2 mM glutamiinia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä ja 10% FBS: ää. Elatusaineet varten DMS114 ihmisen SCLC-solujen oli identtinen DMS53, paitsi että väliaine sisälsi lisäksi 2% natriumbikarbonaattia.

Ensisijainen normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (NHBE) ja pienten hengitysteiden epiteelisoluissa (SAEc) saatiin Lonza Technologies, Sveitsi. NHBEs ylläpidettiin BEBM väliaineessa, joka sisälsi kasvutekijöitä. Samoin SAECs pidettiin SABM alusta täydennettynä kasvutekijöitä. Sekä BEMB, jota ja SABM media valmistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki kokeet, joissa käytetään NHBEs ja SAECs suoritettiin välillä kanavien 3-8 [31].

MTT-määritys

MTT-määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu Heo et al., (1990). H69 ja H82-soluja maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 50000 solua /kuoppa. DMS53 ja DMS114 solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5000 solua /kuoppa. Levyjä inkuboitiin 24 tunnin ajan, jotta täydellisen kiinnityksen soluihin. Sen jälkeen soluja käsiteltiin 50 uM kapsaisiinia 24 tuntia, 48 tuntia tai 72 tuntia. Jälkeen ilmoitettuina ajankohtina, 50 ui MTT-liuosta (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyjä inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa [37]. Sitten imettiin, ja 150 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan liuottamiseksi formatsaanikiteet. Absorbanssi levyt mitattiin ELISA-lukijalla (Benchmark, BioRad) aallonpituudella 540 nm. Kukin näyte suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja koko koe toistettiin kahdesti.

BrdU ja PCNA lisääntymismääritykset

bromideoksiuridiinia (BrdU) merkinnät entsyymi immunosorbenttimääritys (ELISA-pakkauksia), saatiin Roche Biochemicals ja käytettiin vaikutusten tutkimiseksi kapsaisiinin proliferaatioon ihmisen neljän SCLC solulinjoissa, H69, H82, DMS53 ja DMS114. BrdU on tymidiinin nukleotidianalogi, joka on sisällytetty aikana S-vaiheen (sen sijaan, että tymidiini) ainoastaan ​​DNA lisääntyvien solujen [31], [32], [38].

H69 ja H82-solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 50000 solua /kuoppa. DMS53, DMS114, SAEc ja NHBE solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 10000 solua /kuoppa. DMS53 ja DMS114 inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa 36 tuntia poistamiseksi endogeenisen kasvutekijöitä. 36 tunnin kuluttua, nämä solut stimuloitiin uudelleen 10% FBS: n läsnä tai poissa ollessa konsentraatiot kapsaisiinia 18 tuntia, joka on aika, joka tarvitaan S-vaiheen pääsyä [31], [32], [38] . NHBEs ja SAECs luovutettiin lepotilassa tyvi- väliaineessa, joka sisälsi ¼ määrä (v /v) kasvutekijöiden 24 tunnin ajan (cit). Tämän jälkeen soluja stimuloitiin täydellistä väliainetta, joka sisältää täyden määrän kasvutekijöiden 18 tuntia edellä kuvatulla tavalla. Nopeus BrdU mitattiin ELISA-tekniikka, ja prosenttiosuus solujen S-vaiheen määrä määritettiin kolorimetrisellä arviointi (λ = 405 nm). Absorbanssi soluja käsiteltiin 10% FBS: ää tai täydellistä elatusainetta oletettiin olevan 100% ja kapsaisiinia aiheuttama pienenemistä S-vaiheessa laskettiin prosentteina kontrolli FBS käsiteltyjen solujen. Kukin näyte testattiin kolmena kappaleena, ja määritys toistettiin kahdesti.

Soluproliferaatio arvioitiin myös mittaamalla tasot proliferoivan solun tuma-antigeeni (PCNA) käyttäen PCNA ELISA-kittiä Calbiochem. H69, H82, DMS53 ja DMS114 maljattiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin samalla tavalla kuin BrdU määritystä edellä kuvatulla tavalla. Tämän jälkeen väliaine poistettiin, ja uudelleen suspendoimalla puskuriin (50 mM Tris, pH 8, 5 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 1 ug /ml pepstatiinia, 0,5 ug /ml leupeptiiniä) lisättiin soluihin. Taso PCNA soluissa kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi 405 nm: ssä, mukaan valmistajan protokollaa. Kukin näyte testattiin kahtena kappaleena, ja määritys toistettiin kaksi kertaa kunkin solun tyypin.

Cell Cycle Analysis

H69 SCLC-soluja käytettiin solusyklin analyysi, käyttämällä muunnelmaa propidiumjodidin tekniikka [15], [39]. Lyhyesti, 5 x 10

5 soluja käytettiin näytettä kohti. Kukin näyte inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa 36 tuntia poistamiseksi endogeenisen kasvutekijöitä. 36 tunnin kuluttua, sitten solut stimuloitiin uudelleen 10% FBS: n läsnä tai poissa ollessa 50 uM kapsaisiinia 18 tuntia, joka on aika, joka tarvitaan S-vaiheen pääsyä [30]. Solut kerättiin, pestiin kahdesti puskurilla (1 mM EDTA DPBS ilman kalsiumia ja magnesiumia, jota on täydennetty 1% ultra low IgG FBS, Invitrogen Corporation), kiinnitettiin jääkylmässä 70% etanolia ja suspendoitiin uudelleen propidiumväriä jodivärjäyksen ratkaisu (50 ug /ml propidiumjodidia, 25 ug /ml RNaasi A: ta DPBS: ssä /EDTA-puskuria) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Näytteet analysoitiin BD FACS Aria II virtaussytometrillä (BD Biosciences).

lysaatit ja Western-blottaus

Lysaatit kustakin solulinjasta tehtiin käyttäen NP-40-pohjainen hajottamismenettelyllä [ ,,,0],31], [38], [40]. DMS114 soluja kasvatettiin 100 cm: n maljoille noin 70% konfluenssiin. Solut suoritettu lepotilassa inkuboimalla seerumittomassa alustassa 36 tuntia. Tämän jälkeen soluja stimuloitiin uudelleen 10% FBS: n läsnä tai poissa ollessa osoitetun annoksia kapsaisiini 18 tuntia. Solut kerättiin ja pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä. Sitten solut lyysattiin M2 hajotuspuskuria (20 mM Tris, pH 7,6, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl: a, 3 mM EGTA, 3 mM EDTA, 4 uM DTT: tä, 5 mM PMSF, 1 mM natriumfluoridi, 1 mM natrium- vanadaatti, 25 ug /ml leupeptiiniä, 5 ug /ml pepstatiini, 5 ug /ml aprotiniinia, 25 ug /ml trypsiiniä-kymotrypsiini-inhibiittori). Seitsemänkymmentä mikrolitraa lyysipuskuria lisättiin jokaiseen 20 ui hematokriitti suurenee. Lysaattia pyöritettiin 4 ° C: ssa 30 minuuttia ja sen jälkeen sentrifugoitiin 15000 g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti kerättiin lisäanalyysiä varten. Proteiinipitoisuus lysaattia mitattiin käyttämällä Bradford-reagenssia (Bio-Rad Labs). Sata viisikymmentä mikrogrammaa alikvootti proteiini ajettiin 10% SDS-PAGE geelillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (BioRad Labs).

suhteellinen ekspressio osoitetaan proteiinien analysoitiin western-blottauksella. E2F1 monoklonaalisia ja polyklonaalisia E2F2-6 vasta saatiin Santa Cruz Biotechnology. Monoklonaalisia vasta-aineita TS, cdc25A ja Cdc6 saatiin myös Santa Cruz Biotechnology. Monoklonaalinen vasta-aine sykliini E saatiin BD Biosciences. Monoklonaaliset β-aktiini-vasta-aine saatiin Sigma Chemical Company, USA. Polyklonaaliset GAPDH-vasta-aine saatiin Trevigen, Inc. sekundääriset vasta-aineet hankittiin Pierce Biotechnologies. Signaali saatu Western blot kokeissa havaittiin, että SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce Biotechnologies). Tulokset Western blot-määritykset kvantitoitiin densitometrinen analyysi (BioRad Gel Documentation System) käyttäen analyysin ohjelmisto määrä 4.5.2.

kanan alkion rakkokalvon (CAM) määritys

Erityiset pathogen- ilmainen (SPF) hedelmällisen kananmuniin (Charles River Laboratories, North Franklin, CT) inkuboitiin 37,5 ° C: ssa 75% suhteellisessa kosteudessa, ja pyöritetään jatkuvasti hitaasti automaattisella muna kääntölaite (GQF Manufacturing Company, Savannah, GA). Päivänä 9, munat valaistiin ja ikkunat avataan kuori paljastaa CAM [41]. H69-soluja (3 x 10

6) suspendoitiin 100 ui kylmää seerumia, sekoitetaan 100 ui kylmää BD matrigeelin Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA) ja 50 uM kapsaisiinia. Nämä solut levitettiin CAM kunkin kanan alkion. Munia inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 päivää ennen kasvaimen implantit poistettiin, valokuvattiin ja punnittiin. Kaikkiaan 12 munaa analysoitiin kussakin ryhmässä [41].

Kasvaintenvastainen Studies in Nude hiiret

Eight 4 viikkoa vanhoja nude hiiriä saatiin Charles River Laboratories ja sopeutunut yhdelle viikko. Heidän majoitettiin HÖYRYKARKAISTUT häkkejä

mielinmäärin

ruoan ja veden HEPA-suodatettua telineet ja seurattava eläimen henkilökunnalta. Kaikki toimenpiteet suoritettiin mukaan Animal Care ja käyttö ohjeet laitoksessa akkreditoitu Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care (AAALAC) Kansainvälinen ja hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University (protokolla # 371).

H69-solut kerättiin ja uudelleen suspendoitiin 01:01 (v /v) liuoksen seerumittomassa elatusaineessa ja matrigeelin matriisi (BD Biosciences). Kaksi miljoonaa solua 100 ui injektoitiin subkutaanisesti lapaluiden välistä kunkin hiiren [42]. Sen jälkeen, kun kasvaimet olivat saavuttaneet 100 mm

3, hiiret kytketty ohjaamaan AIN-76A ruokavalio, joka sisälsi 10% maissiöljyä, kunnes oli saavutettu tuumoreiden 800 mm

3. Tämän jälkeen hiiret jaettiin kahteen ryhmään. Hoitoryhmässä (N = 4), muutettiin ruokavaliota, joka sisälsi 50 mg kapsaisiinia /kg ruokaa (joka on noin 10 mg kapsaisiinia /kg hiiren per päivä). Vertailuryhmä (N = 4) jatkettiin valvontaa ruokavalio. Hiiret punnittiin kerran viikossa. Ruokansa kulutusta seurattiin punnitsemalla jääneen ruoan kerran viikossa. Anto kapsaisiinin ei aiheuttanut epämukavuutta tai laihtuminen hiirillä. Lisäksi ruoan saanti oli samanlainen kontrolli- ja kapsaisiini-käsitellyillä hiirillä.

lääkehoito jatkettiin, kunnes kasvaimia kontrolliryhmän saavutti 2000 mm

3. Kasvaimen pituudet (l), leveydet (w) ja korkeus (h) mitattiin päivittäin (6 päivää pois viikossa) kullekin hiirelle. Kasvaintilavuudet laskettiin (P x L x h) /2 [43], [44]. Jälkeen euthanizing hiiret, tuumorit leikattiin irti. Puolet kasvaimen jäädytettiin nestemäisessä typessä ja käytetään tekemään lysaatit. Kasvaimen lysaatit valmistettiin käyttäen T-Per lyysipuskuria (Pierce Biotechnology), mukaan valmistajan protokollan [38]. Toinen puoli kasvaimen kiinnitettiin formaliiniin ja käyttää immunohistokemiaa.

Caspase lohkaisu Pitoisuus

Caspase pilkkominen määritys suoritettiin kasvaimen valmistetut lysaatit verrokkihiiristä ja kapsaisiini-käsitellyistä hiiristä käyttämällä kaspaasi -3 pilkkominen kit (Chemicon, Temecula). Kasvaimen lysaatit valmistettiin käyttäen T-Per lyysipuskuria edellä kuvatun mukaisesti. Alikvootti 60 ui lysaattia käytettiin kussakin reaktiossa. Lisäksi 60 ui sisplatiinin saaneista H69 lysaattia (valmistettu käsittelemällä H69 solujen 30 uM sisplatiinia 72 tuntia) käytettiin positiivisena kontrollina, mukaan valmistajan protokollaa. Kukin näyte testattiin kahtena kappaleena, ja määritys toistettiin kaksi kertaa kunkin solun tyypin.

immunohistokemia

Immunovärjäys suoritettiin käyttämällä M.O.M. -värjäyspakkausta (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Parafinoidut H69 ksenografti hiiri kudosnäytteiden (4 pm) poistettiin vaha ksyleenillä ja sen jälkeen niihin lisätään etanolia. Leikkeitä altistettiin antigeenille haku hoitoon käytetään antigeeni retrival kit (BioGenex Inc.), mukaisesti valmistajan protokollaa. Sitten leikkeet käsiteltiin proteinaasi K: lla hoidon (20 ug /ml) 15 minuuttia ja reaktio lopetettiin endogeenisten peroksidaasien 0,3% H

2O

2-liuos metanolissa 30 minuuttia. Kohdat blokattiin käyttäen Avidin-Biotin esto kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Leikkeitä inkuboitiin anti-PCNA (BioGenex Inc.) monoklonaalinen primaarinen vasta-aine (1:100 laimennos) yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Leikkeet pestiin PBS: ssä poistaa ylimääräinen vasta-aine, ja kehitettiin käyttäen M.O.M. ja peroksidaasi DAB kit, joka on saatu Vector Laboratories (Burlingame, CA). Osiot vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu, asennetaan Permount-peitinlaseilla Mounting Medium (Fisher Biotech) ja valokuvattiin Olympus BX41 Kirkas mikroskoopilla. Hemotoksyliini- ja eosiinilla (H ja E) kuvat valokuvattiin 40X suurennoksella. PCNA värjäys oli valokuvattu klo 1000 kertaa suurennettu öljyllä. PCNA-positiivisia soluja, jotka ovat lisääntyvien solujen, kvantitoitiin laskemalla 5 kenttää 100-soluja. Aineisto esitetään prosenttiosuutena PCNA-positiivisten solujen.

siRNA Transfektio ja Analyysit

Kemiallisesti syntetisoitu kaksijuosteinen siRNA varten E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5 ja E2F6 ostettiin Santa Cruz Biotechnology. Transfektion kokeet suoritettiin H69 ja DMS114 soluihin [31], [45]. Asynchronous solut kerättiin ja uudelleen maljattiin 96-kuoppalevyille noin 40% konfluenssiin kasvatusväliaineessa, joka sisältää 10% FBS: ää ilman antibiootteja. Transfektio Edellä mainittujen siRNA suoritettiin käyttäen Oligofectamine reagenssia (Invitrogen Corporation), mukaisesti valmistajan protokollaa. Kahdeksantoista tuntia transfektion jälkeen, solut suoritettu lepotilassa 36 tuntia inkuboimalla seerumittomassa alustassa. Tämän jälkeen soluja käsiteltiin 10% FBS: ää, kun läsnä on 50 uM kapsaisiinia 18 tuntia. Kapsaisiini lisättiin 30 minuuttia ennen lisäystä väliainetta, joka sisälsi 10% FBS: ää. 18 tunnin jälkeen, solujen prosenttiosuus S-faasissa mitattiin BrdU ELISA-kitillä (Roche Laboratories). Ei-kohdistaminen siRNA-sekvenssin (Santa Cruz Biotechnology) käytettiin negatiivisena kontrollina transfektion kokeissa. Kukin transfektio suoritettiin kahtena kappaleena, ja koko määritys toistettiin kahdesti.

tulokset E2F4 transfektion kokeet todentaa toinen joukko riippumattomia siRNA saatu Ambion Biotechnologies [31], [45]. Protokollaa transfektion oli sama kuin edellä on kuvattu. Ei-kohdistuksen ohjaus-siRNA käytettiin negatiivisena kontrollina kaikissa kokeissa. Kukin transfektio suoritettiin kahtena kappaleena, ja koko määritys toistettiin kahdesti.

Western blotting suoritettiin kokeita sen arvioimiseksi proteiinien ekspression jälkeen siRNA transfektion [31], [45] sekä H69 ja DMS114 soluja. Jokainen transfektio on H69-soluista suoritettiin käyttäen 5 x 10

5-solut ympättiin T-10-pulloihin (Midwest Scientific) RPMI, joka sisälsi 10% FBS: ää ilman antibiootteja. Siinä tapauksessa DMS114 solujen transfektio suoritettiin 6-kuoppalevyille käyttäen 5 x 10

5 solua /kuoppa. Sekä H69-soluja ja DMS114 solut, jokainen transfektio suoritettiin kahtena kappaleena, ja koko koe toistettiin kahdesti. Transfektio ilmoitettu siRNA suoritettiin käyttäen Oligofectamine reagenssia (Invitrogen Corporation), mukaisesti valmistajan protokollaa. Ei-kohdistuksen ohjaus-siRNA käytettiin negatiivisena kontrollina. 36 tunnin kuluttua transfektion lysaatit tehtiin kuten edellä on kuvattu, ja ilmaisu on E2F perheen proteiinien määritettiin western blotting -analyysi.

Reaaliaikainen PCR

H69 solut altistettiin seerumistarvaatio 36 tuntia ja sen jälkeen niitä stimuloitiin 10% FBS: ssa 8 tunnin ajan [46]. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy miniprep QIAGEN. Yksi mikrogramma RNA: ta oli DNaasia käsiteltiin käyttäen RQ1 DNaasia (Promega), minkä jälkeen ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi käyttäen iScript cDNA-synteesin kit (Bio-Rad). Fraktio (1/20) lopullisesta cDNA reaktion tilavuus käytettiin kutakin PCR [46]. Alukesekvenssit [46], [47], ovat seuraavat:

sykliini E (forward-aluke): 5’TTCTTGAGCAACACCCTCTTCTGCAGCC3 ”.

sykliini E (käänteinen aluke): 5’TCGCCATATACCGGTCAAAGAAATCTTGTGCC3″.

TS (forward-aluke): 5’CTGCCAGCTGTACCAGAGAT3 ”.

TS (käänteisaluke-): 5’ATGTGCATCTCCCAAAGTGT3″.

Cdc6 (forward-aluke): 5’CCCCATGATTGTGTTGGTAT3 ”.

Cdc6 (käänteinen aluke): 5’TTCAACAGCTGTGGCTTACA3 ”.

18S (forward-aluke): 5’CTCAACACGGGAAACCTCAC3″.

18S (käänteisaluke-): 5’AAATCGCTCCACCAACTAAGAA3 ” .

Reaaliaikainen PCR suoritettiin Bio-Rad iCycler.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) määritys

H69 pidettiin seerumin puutteessa 36 tunnin ajan inkuboimalla niitä seerumitonta RPMI-1640 [31], [32], [40], [48]. Sen jälkeen, nämä lepotilassa H69-soluja stimuloitiin uudelleen 10% FBS: n läsnä tai poissa ollessa 50 uM kapsaisiinia 8 tuntia. Kaksikymmentäviisi miljoonaa solua kohden käytettiin IP reaktiota. Soluja käsiteltiin 1% formaldehydiä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa silloittaa proteiineja ja DNA: ta. Silloittaminen lopetettiin lisäämällä 0,125 M glysiiniä. Kanin anti-hiiri-vasta-ainetta käytettiin kontrollina kaikissa reaktioissa. PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen 5 ui DNA immunosaostusreaktiot tai 1 ui DNA: ta input reaktiossa templaattina. PCR-syklien olosuhteet TS ja Cdc6 olivat seuraavat: 94 ° C 2 min; sitten 35 sykliä 94 ° C 30 s, 56 ° C: ssa 30 s ja 65 ° C: ssa 30 s; ja sen jälkeen 65 ° C: ssa 2 min. PCR-syklien olosuhteet sykliini E olivat seuraavat: 94 ° C 2 min; sitten 35 sykliä 94 ° C 30 s, 66 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C 30 s; ja sen jälkeen 72 ° C: ssa 2 min. Aluke sykliini E käsitti kaksi kolmesta E2F sitoutumiskohdat promoottorin, kuten on kuvattu Nevins et al., (1994). Nämä sitoutumiskohdat muodostavat suuren affiniteetin E2F sitoutumiskohdista ihmisen sykliini E promoottori [49]. PCR c-Fos-promoottorin (jota ei säädellä E2F) käytettiin negatiivisena kontrollina kaikissa kokeissa. Sekvenssit PCR-alukkeiden, joita käytetään PCR: t olivat seuraavat:

sykliini E (forward-aluke): 5’CCCCGTCCCTGCGCCTCGCTG3 ”.

sykliini E-promoottori (käänteinen aluke): 5’CGGCGGCGGCGACGGCAGTGG3″ .

Cdc6 promoottori (forward-aluke): 5’GGCCTCACAGCGACTCTAAGA3 ”.

Cdc6 promoottori (käänteisaluke-): 5’CTCGGACTCACCACAAGC3″.

TS promoottori (forward-aluke): 5’TGGCGCACGCTCTCTAGAGC3 ”.

TS promoottori (käänteinen aluke): 5’GACGGAGGCAGGCCAAGTG3″.

cdc25A, c-fos alukkeita ja PCR-olosuhteita kuvataan [29].

tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM ja esittää käyttäen Graph Pad Prism 5. erot kontrollin ja käsiteltyjen välillä näytteet analysoitiin varianssi- analyysillä (ANOVA), jota seurasi Dunnettin monivertailutesti . Kasvain kasvu kateenkorvattomissa hiirissä analysoitiin ANOVA seurasi Neuman-Keuls testi. Vuonna immunohistokemia kokeissa kaikki PCNA positiiviset tumat laskettiin viisi riippumatonta aloilla Kaksi riippumatonta tarkkailijaa satunnaistetussa kaksoissokkotutkimuksessa tavalla.