Krooninen sairaus

tiivistelmä

Meidän tutkimuksissa munasarjasyöpäsoluja olemme tunnistaneet alaryhmien soluja, jotka ovat ohimenevä E /M hybridi vaihe, eli solut, jotka samanaikaisesti ilmentävät epiteelin ja mesenkymaaliset markkereita. E /M-solut eivät ole homogeenisia, mutta

in vitro

ja

in vivo

, sisältävät osajoukkoja voidaan erottaa perustuu useisiin fenotyyppisten ominaisuuksien, kuten solunosasijaintia E-kadheriinin, ja ekspressiotasot Tie2, CD133, ja CD44. Matka- osajoukko (E /M-MP) (kalvo E-kadheriinin

pieni /sytoplasminen E-kadheriinin

korkea /CD133

korkea, CD44

korkea, Tie2

alhainen) on korkeasti rikastetun kasvaimen muodostavia soluja ja näyttää ominaisuuksia, jotka liittyvät yleensä syövän kantasoluja. Tuloksemme viittaavat siihen, että E /M-MP solut kykenevät erilaistumaan eri suvusta tietyin edellytyksin ja on kyky itseuudistumisen, eli säilyttää osajoukko erilaistumattoman E /M-MP-solujen erilaistumisen aikana. Trans-erilaistuminen E /M-MP solujen mesenkymaaliset tai epiteelisolut liittyy menetys kantasolujen merkkiaineiden ja kasvainten muodostumiseen.

In vivo

ksenograftin kasvaimen kasvua ohjaavat E /M-MP soluja, jotka aiheuttavat munasarjan epiteelin syöpäsolujen. Sen sijaan,

in vitro

, olemme huomanneet, että E /M-MP-solujen erilaistuvat mesenkyymisolujen, on prosessi, johon reitit liittyy epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon. Olemme myös havainneet fenotyypin plastisuus, joka oli riippuvainen ulkoisista tekijöistä, kuten stressistä luonut nälänhätää tai kosketuksessa joko epiteeli- tai mesenkyymisolujen yhteistyössä kulttuureissa. Tutkimuksemme tarjoaa parempaa ymmärtämistä fenotyypin monimutkaisuus munasarjasyöpä ja vaikuttaa munasarjojen syövän hoidossa.

Citation: Strauss R, Li Z-Y, Liu Y, Beyer I, Persson J, Sova P, et ai. (2011) analyysi epiteelisolujen ja mesenkyymikasvaimia Merkit munasarjasyövässä paljastaa Fenotyyppiset heterogeenisuus ja plastisuus. PLoS ONE 6 (1): e16186. doi: 10,1371 /journal.pone.0016186

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 27 elokuu 2010; Hyväksytty: 13 joulukuu 2010; Julkaistu: 14 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Strauss et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat NIH myöntää R01 CA080192, R01 HLA078836 ja Tyynenmeren Munasarjojen Cancer Research Consortium /Erikoistunut ohjelma huippututkimusta Munasarjasyöpä Grant P50 CA83636. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on esitetty, että kasvaimen uudelleen kasvun, samoin kuin kemoterapian resistenssin ja etäpesäkkeiden, ovat riippuvaisia ​​pienellä alaryhmällä syövän solujen kasvain, joka on ajateltu edustamaan syövän kantasoluja (CSCS). Määrittävä tunnusmerkki kantasoluja, sekä normaali- että pahanlaatuinen kudos, on kyky itse uudistaa mutta samanaikaisesti antaa tytärsoluja, jotka ovat sitoutuneet erilaistumista fenotyyppejä, jotka usein rajat suvusta. Tämän saavuttamiseksi, kantasolut voivat käydä läpi epäsymmetrisen solunjakautumisen jolloin ne erottaa solun kohtalon determinantteja vain yhteen kahdesta tytärsolujen [1]. Aikuisten nisäkkäillä, kantasoluja on karakterisoitu useita kudoksia, mukaan lukien veri-järjestelmän, keskushermoston, lihasten, paksusuoli-, rinta-, ja luun /rustoa.

syövän kantasoluja kiinteitä kasvaimia, paljon voidaan oppia tutkimuksista hematopoieettisten kantasolujen (HSC), joihin sitä on osoitettu, että elinsiirron yhden solun osaksi myeloablated vastaanottaja voi muodostaa uudelleen koko verenkiertoon. Tämä lopullinen HSC synnyttää hierarkian pluripotenttien progenitorisolujen tulleita asteittain rajoitetaan niiden erilaistumista potentiaalia. Leukemia on ajateltu olevan peräisin joko HSC: ista, joka hankki geneettisiä tai epigeneettiset muutokset ja pantiin osittain eriytetty ja tuumorigeenisia, tai esisolujen että hankittu kyky itse uudistaa [2]. Olemassaolo kantasolujen tietyntyyppisten leukemia tukevat vahvasti lentiviraalinen koodaus ihmisen akuutti myelooinen leukemia solujen ja tarkkailu Yksittäisten kloonien läsnä NOD-SCID-hiirissä jälkeen sarjasiirteillä merkittyjä soluja [3]. Tutkimukset leukemia kantasolujen osoitti myös suuri fenotyyppisten plastisuus vaiheesta riippuen kasvaimen kasvun, kasvaimen mikroympäristössä, ja ulkoiset tekijät, kuten stressi luonut radio-tai kemoterapiaa [2].

Läsnäolo CSCS kiinteissä kasvaimissa on ehdotettu ihmisen syövissä, mukaan lukien rinta- [4], aivojen [5], paksusuolen [6], pään ja kaulan [7], haiman [8], eturauhassyöpä [9], munasarjasyöpä [10], [11], [12 ], ja ihosyöpä [13]. Kiinteä kasvain kantasoluja on määritelty ”pieni joukko syöpäsolujen sisällä syöpä, joka muodostaa säiliön omavaraisia ​​solujen yksinomainen kyky itse uudistaa ja aiheuttaa heterogeeninen suvusta syöpäsolut muodostavat kasvain” [ ,,,0],14]. Useat solun pinnan markkereita, mukaan lukien CD24, CD44, CD133, CD166, EpCAM, tai väriaine efflux määrityksiä on käytetty lajitella populaatioiden oletetun syövän kantasoluja primäärikasvain viljelmiä tai solujen suspensioita saatu tuumoribiopsioissa. Sen jälkeen siirrettäväksi immuunivajausta hiiriin, kasvaimet muodostavat useita satoja markkeri-positiivisten solujen, kun taas merkki-negatiiviset solut suuruusluokkia suurempia numeroita tarvitaan, jotta saavutettaisiin sama taajuus kasvaimen muodostumisen (katsaus: ks. [15] Viime aikoina käyttämällä parannettu ksenotransplantaatio tekniikka, tutkimus ihmisen melanoomasolujen osoittivat kasvaimen muodostumisen siirrostuksen jälkeen yhden tuumorisolun [16] ja siten tärkeä askel kohti todiste CSC olemassaolosta tehtiin.

useimmissa karsinoomat, etenemistä kohti maligniteetti liittyy menetys epiteelin erilaistumista ja siirtyminen kohti mesenkymaaliset fenotyyppiä (EMT) [17]. EMT pahentaa liikkuvuutta ja invasiivisuus monien solutyyppien ja pidetään usein edellytyksenä kasvaimen tunkeutuminen ja etäpesäke. EMT on ominaista lisääntynyt ilmentyminen mesenkymaalisten markkereita (vimentiinin, trombospondiini, N-kadheriinin, vitronektiini), lisääntyneen ekspression soluväliaineen yhdisteiden (kollageeni IV: n ja fibronektiinin), vähentynyt ilmentyminen epiteelin markkerit (E-kadheriinin, Occludin, Desmoplakin, ja Mucin1), muutettu sijainti transkriptiotekijöiden ( β-kateniinin, Snail, Slug, Twist, Sox 10, ja NFKB) ja aktivoituminen kinaasien (ERK1, ERK2 ja PI3K /AKT) [17]. On myös lukuisia esimerkkejä kehittyneitä karsinoomien osoittavat, että mesenkymaaliset solut voivat saada takaisin ominaisuudet epiteelisolujen, prosessissa, jota kutsutaan mesenkymaaliset epiteeli- siirtyminen (MET) [18]. Ilmeisesti epiteelin fenotyyppi syöpäsolujen ja kyky muodostaa fyysiset esteet ovat mekanismi, joka rajoittaa pääsyä huumeiden, vasta-aineita tai immuunijärjestelmän solujen sivustoja kasvaimia. On arveltu, että sekä EMT ja MET liittyy solujen metastabiilissa hybridi tilassa, esim. solujen piirteitä sekä epiteeli- ja mesenkymaalisten solujen [19].

tutkimukset ovat keskittyneet munasarjasyöpä. Munasarjojen syöpä on neljänneksi yleisin syöpä naisilla ja on korkein kuolleisuus kaikista syövistä naisen sukuelimiin. Noin 90% ihmisen munasarjasyövän johtuu munasarjojen pinnan epiteeli (OSE). Mesodermistä peräisin normaalin OSE osoittaa epiteeli- ja mesenkymaalisten ominaisuuksia, tunnettu siitä, että geenien molempien keratiini ja vimentiinin [20]. Mielenkiintoista, vain pieniä määriä E-kadheriinin ovat näkyvästi OSE soluissa [21] ja sen ilmentyminen rajoittuu osallisuuden kystat ja syvä rakoja, huomattavan alueille, joilla aikaisin pahanlaatuinen tapahtumia uskotaan syntyvän [22]. Eheys OSE kerrosten ensisijaisesti ylläpitävät N-kadheriinin, mikä korostaa entisestään epiteelin /mesenkymaaliset fenotyyppi tässä kudoksessa [23], [24]. Uskotaan, että OSE solut sopeutua solujen mikroympäristössä mukaan siirtymisistä epiteelin ja mesenkymaaliset vaiheissa [20]. Tällaiset kyvyt ovat yleensä rajoitettu kehittymätön palauttamiseksi, tai neoplastisia epiteelin ja siksi tehdä ainutlaatuisen fenotyypin plastisuus. Arvellaan, että tämä plastisuus sijaitsee sen alkuperästä munasarjasyöpä. Erityisesti munasarjakarsinoomat näyttää ainutlaatuinen ominaisuus verrattuna muihin epiteelin peräisin syöpiä. Kun taas viimeksi mainittu on tunnusomaista menetys epiteelin ominaisuuksien aikana kasvaimen etenemisen, kohonnut ilmentyminen E-kadheriinin havaitaan ensisijaisen neoplastisten munasarjojen epiteelin [25]. Kuitenkin tämä ensimmäinen siirtymistä entistä eriytetty fenotyypin aikaisin kasvaimen etenemistä näyttää sitten seuraa reacquisition mesenkymaalisten ominaisuuksia kehittyneempiä munasarjakasvainten, johon toissijainen menetys E-kadheriinin [26], [27], [28] . Mielenkiintoista, epiteelin /mesenkymaaliset fenotyyppi ilmi OSE soluissa [29] löytyy myös leviämisrintamassa paksusuolen [30] ja rintasyövän [31], ja normaalissa orvaskeden kudoksen haavan paranemisen aikana [32].

tässä tutkimuksessa Tarjoamme tukevat tiedot yksi tärkeimmistä piirteistä CSC, osoittamalla pluripotenttisuus eli kyky aiheuttaa fenotyypiltään heterogeeninen tytär soluja. Tuloksemme viittaavat siihen, että munasarjasyöpäsoluja nämä ominaisuudet liittyvät kiinteästi ilmiöiden EMT ja MET.

Tulokset

Ensisijainen munasarjasyöpä viljelmät sisältävät otaksuttu CSCS

Me perustettiin 51 munasarjasyöpä kulttuureissa koepaloja /askites luokan III ja IV karsinoomat (taulukko S1). Pilkkomisen jälkeen tuumoribiopsioissa kollagenaasin ja trypsiinin, solususpensioita viljeltiin rintaepiteelisolulinja Basal Medium täydennettynä EGF, insuliinin, hydrokortisonia, naudan aivolisäkeuutetta (MEGM) ja 1-2% FBS: ää enintään 5 päivää. Jotta voitaisiin vahvistaa niiden Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja poistamaan fibroblastien ja leukosyytit, ensisijainen solut ruiskutetaan utarerasvaa pad immunopuutoksesta SCID-beige (C.B-Igh-1b /GbmsTac-Prkdcscid-Lystbg N7) hiirillä. Yhdeksän primääriviljelmissä muodostunut ksenograftikasvaimissa elinsiirron jälkeen 1 x 10

6 solua (katso taulukko S1). -ksenografteja Leikataan sitten, pilkottiin proteaasien ja viljeltiin MEGM 10% FBS: ää. Yhden kulttuurin, toisen ja kolmannen asteen ksenografti suoritettiin. Osiot ja suspensiot alkuperäinen koepaloja nimettiin OVC-biopsia, ovc805-koepala jne johdettuja primäärisiä viljelmiä potilaan koepalat nimettiin ovc316-PC, ovc805-PC, jne; kohdat tai kasvain jäädyttämiseen ksenograftikasvaimissa johdetut viljelmät nimettiin ovc316-X, ovc805-X, jne; johdetut viljelmät ksenografteista nimettiin ovc316-XC, ovc805-XC jne

viljelmät sisälsivät eri solutyyppejä, joilla on selkeästi erotettavissa subsets ilmaista erilaisia ​​syövän markkereita (esim CA-125 tai CEA), joka oli mieleen heterogeenisyys kasvainsolujen nähtynä analyysi osien alkuperäisestä kasvaimesta tai -tuumoriksenografti (kuvio 1A, vasen kolme paneelia). Erityisesti kasvainsolun heterogeenisuus oli vähemmän ilmeinen perustettu munasarjasyövän solulinjoissa kuten SKOV3-IP1 (kuvio 1A, oikea paneeli).

A) kasvainbiopsioissa ja primaariviljelmiä värjää positiivinen munasarjasyöpä markkereita CA-125 ( vihreä) ja CEA (punainen) ja näyttää suurempi heterogeenisuus kuin vakiintuneesta solulinjasta SKOV3-IP1. Näkyy ovat ovc316-biospy, ovc316-PC, ja ovc316-X. Analyysi ovc1208-biopsia, ovc1208-PC, ovc0117-biopsia, ovc0117-PC, ovc100506-biopsia, ja ovc100506-PC paljasti saman heterogeenisyys. B) valomikroskoopilla munasarjasyövän kulttuurin ovc316-XC. Viljelmä sisältää kaksi erillistä populaatioiden suhteen trypsiinin herkkyyttä. Vasen paneeli: varhaisessa passage kulttuuri käsittelemätöntä (vasemmalla), 10 minuutin kuluttua trypsiinikäsittelylle (keskellä), ja sen jälkeen trypsiinin herkkien solut poistettiin (oikealla). Oikea paneeli: Kasvain muodostuminen elinsiirron jälkeen trypsiinin vastustuskykyisten (TR) ja trypsiini-herkän (TS) solujen SCID-beige hiiret. Kasvaimen muodostumiseen arvioitiin 3 kuukautta inokulaation jälkeen. TIC TR: 1/185, TIC TS: 1/109. Chi-square = 0,0524. C) Immunofluoresenssianalyysi ihmiselle erityisiä mitokondrioiden (Mx) markkeri, syöpämarkkerien CEA, epiteelin markkeri E-kadheriinin ja mesenkymaaliset markkeri laminiinin klonaalisia johdetut viljelmät ovc316-XC. Klonaalisia viljelmät sisältävät ihmisen syöpäsoluja joko epiteelin (ylempi paneeli), mesenkymaaliset (keskellä) tai molemmat fenotyypit (E /M hybridi-klooni, alempi). D) Kasvaimen muodostava kyvyt elinsiirron jälkeen 10

5 E, M tai E /M-solut SCID-beige hiiret. Kasvaimen muodostumiseen arvioitiin 4 kuukautta inokulaation jälkeen. E) ksenograftikasvaimissa johdettu E /M hybridi klooneja. Ihmisen alkuperä kasvainsolujen on osoitettu värjäämällä ihmiselle tietyn mitokondrioita markkeri (vihreä). Värjäys epiteliaalisen antigeenin AE1 /3 ja kasvaimen antigeeniä CEA osoittaa fenotyypin heterogeenisyys kasvaimia, jotka ovat peräisin klonaalinen E /M kulttuureissa. Laminin-ilmentyminen rajoittuu pitkälti vascularized alueille. F) H 6) kahteen osaan perustuva trypsiiniä vastus, ja testattu niiden tuumorigeenisyystesti SCID-beige hiiret, mutta ei eroa kasvaimen muodostavien kyky havaittiin (kuvio 1 B, oikea paneeli).

Kuten tehty aikaisemmin aiemmassa tutkimuksessa, jossa analysoitiin solujen vastustuskykyä onkolyyttisiä adenoviruksia [33], loimme 100 kloonisolulinjojen johdetut viljelmät aikaisin passage ovc316-XC solut. Kloonit laajennettiin ja analysoitiin ihmisen erityisiä ja syövän markkereita (sulkea läsnäolo hiiren stroomasolujen) sekä epiteeli- ja mesenkymaalisten markkereita (kuvio 1C). Kaikkiaan 20% tuloksena viljelmiä rajoittuvat epiteelin fenotyypin (E-kadheriinin positiivisia; ”epiteelin klooni”), kun taas 19% oli mesenkymaaliset (laminiini positiivinen, ”mesenkymaaliset klooni”). Loput 61% klonaalisen viljelmät sisälsivät sekä epiteeli- ja mesenkymaalisten solujen, lisäksi soluja, jotka olivat positiivisia sekä epiteeli- ja mesenkymaalisten markkereita (kuvio 1C). Soitimme näissä soluissa epiteelin /mesenkymaaliset (E /M) hybridi soluja. Klonaalinen epiteelin ja mesenkymaaliset kulttuureissa oli rajallinen pitkäaikainen proliferaatiopotentiaali (20-25 kulkee mesenkymaalisten, 20-40 kanavat epiteelin viljelmät vastaavasti). Erityisesti siirtojen aikana, solut yhdessä 20 epiteelin kloonit menettänyt kalvo E-kadheriinin ja klaudiini 7 ja hankki mesenkymaaliset transkriptio variantti p120 kateniinin [33], mikä osoittaa, että se koki EMT (kuva S1).

Tärkeää on vain viljelmissä, jotka sisälsivät E /M-soluja pystyivät muodostamaan kasvaimia SCID-beige-hiiret kuluessa 4 kuukautta, kun 10

5-soluja (passage 6) injektoitiin (kuvio 1 D). Kasvaimet näkyvissä fenotyyppinen heterogeenisyys, sisälsi kasvain strooman ja olivat vascularized (kuvio 1 E). Kaiken histologia kasvainten peräisin siirrettyjen klonaalinen E /M-soluissa oli samanlainen kuin potilaan kasvaimen (kuvio 1 F). Sarjasiirteillä peräisin olevien solujen nämä kasvaimet myös synnytti uusia kasvaimia (tuloksia ei ole esitetty). Merkittävää on, tämä tutkimus osoittaa, että yksittäinen solu voi muodostaa klooni, joka on sen jälkeen kykenee muodostamaan heterogeenistä kasvain. Tämä tarkoittaa, että alkuperäinen solu on potentiaalinen syövän kantasoluja, joilla on kyky erilaistua, itse uudistaa ja muodostaa kasvain. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että ensisijainen munasarjasyöpä viljelmät ovat fenotyypiltään heterogeeninen ja että kasvaimeen aloitetaan solut näyttävät olevan ominaisuuksia mesenkymaalisten ja epiteelin (E /M-solut).

Solut kehällä trypsiini-resistenttien subsets sisältävät epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä hybridi (E /M) soluja, jotka yhteistyössä tahra kantasolujen merkkiaineita

Kun on löydetty välinen mahdollinen yhteys tuumorigeenisia syövän kantasolun ja epiteelin /mesenkymaaliset piirteet on klonaalisia kulttuureissa ovc316-XC, teimme immunofluoresenssimenetelmällä analyysit ensisijaisen munasarjasyöpä viljelmiä (johdettu koepaloja tai ksenografteja), jossa on useita epiteeli- ja mesenkymaalisten markkereita (kuvio 2). Olemme keskittäneet analyysin soluja, jotka eristettiin ksenografteista ja oli juuri (passage 0/1) tai äskettäin (kanavat 6-10) on sovitettu kudosviljelmässä ja sisälsi suuria osuuksia trypsiini vastustuskykyisten subsets. Nämä osajoukot värjätään positiiviseksi epiteelin markkereita E-kadheriinin, claudin7 ja EpCAM sivusuunnassa solukalvojen (kuviot 2A, B). Solut ympäröivä epiteelin alaryhmiä olivat negatiivisia näille markkereita niiden sivusuunnassa kalvot ja värjätä mesenkymaalisten proteiinien vimentiinista ja laminiini. Tarkempi analyysi E-kadheriinin paljasti fenotyyppisen monimuotoisuuden ovc316-XC kulttuureissa. Kahdenlaisia ​​soluja, jotka paikallinen E-kadheriinin niiden kalvot havaittiin, kalvo E-kadheriinin

korkea ja kalvo E-kadheriinin

pieni (kuvio 2A, alapaneeli, aseta # 2 ja 3 #). Kolmas tyyppi viereisten solujen kalvo E-kadheriinin

korkea solut sisälsivät selvästi havaittavissa E-kadheriinin sytoplasmassa /tumassa (kuvio 2A, alapaneeli, aseta # 2). Sytoplasmisen E-kadheriinin

korkea solut värjättiin myös positiiviseksi mesenkyymisolun markkereita, kuten laminiini sekä caldesmon-1 (a myelooinen merkki), endoteelin /endoteelin progenitorimerkkiaineiden CD31, ja VCAM-1 (kuvio S2A). E-kadheriinin

korkea E /M-soluissa ilmaisivat myös korkeita angiopoietiini Tie2 (kuvio S2A, oikea paneeli). Erityisesti Tie2 on merkkiaine hematopoieettisten kantasolujen joka löytyy myös useita kasvaimia [34], [35].

A) analyysi E-kadheriinin (vihreä) ja Laminin (punainen) in munasarjasyöpä kulttuureissa. Suurennus merkittyjen alueiden näkyy alareunassa: A1) E-kadheriinin

negatiiviset solut ilmentävät laminiini. A2) Epiteelin /mesenkymaaliset (E /M) hybridisoluista: E-kadheriinin

alhainen solut näyttävät lähinnä sytoplasmista lokalisaatio E-kadheriinin ja korkea ilmentymä laminiinin. E-kadheriinin

korkea solut sisältävät kohonnut kalvo E-kadheriinin ja alhaisempiin määriä laminiinin. A3) E-kadheriinin

positiivisissa soluissa on lisääntynyt solukoko ja ylläpitää alhaisempi selvästi kalvo-lokalisoitu E-kadheriinin kuin E-kadheriinin

korkea soluja. Laminin ilme on lähes poissa E-kadheriinin

positiivisia soluja (ylempi oikea paneeli). B) Analyysi ylimääräisiä epiteelin (vihreä) ja mesenkymaaliset (punainen) markkereita paljastuu E /M hybridi soluja ovc316-XC kulttuureissa. Epiteelin merkki

korkeat solut ovat lähellä mesenkymaalisten merkki

korkea solujen ja tahra kaksinkertainen positiivinen alueilla, jotka sisältävät aloilla. Vasemmassa ja keskimmäinen paneeli, huomaa, että kaikki solut ovat positiivisia vimentiinista ja CD44. C) CD133 merkitsee alueita, jotka sisältävät E-kadheriinin

korkea ja E-kadheriinin

alhainen soluja. D) E-kadheriinin

korkea ja E-kadheriinin

alhainen solujen vahvaa yhteistyötä merkintöjen kanssa EMT-indusoijien Snail, Twist, ja NGAL. Mittakaavapalkki on 40 uM. On esitetty kuvia ovc316-XC. Immunofluoresenssianalyysi of ovc0117-PC, ovc0122-PC, ovc100506-XC, ja ovc100728-XC osoittivat samanlaisia ​​tuloksia.

Cultures at passage 0/1 yleisesti osoittivat korkeampia ilmaisee yleisesti epiteelin ja mesenkymaalisten markkereita kuin kulttuureissa in kohdissa 6-10 ja muodostivat 3-ulotteinen solun ryhmittymien /palloja, jotka sisältävät E /M hybridisoluista erittäin proliferatiivinen alueilla (kuvio 2B). E /M hybridi vaihe solujen (sisällä palloja) varmistettiin kaksinkertainen värjäys muiden epiteelin markkereita (EpCAM, claudin7) ja mesenkymaaliset markkereita (N-kadheriinin, vimentiinistä). Lisäksi aloilla värjättiin EpCAM ja mesenkymaalisten kantasolujen merkki CD44. Erityisesti useimmat solut värjättiin EpCAM, CD44, ja vimentiinistä (kuvio 2B), mikä viittaa siihen, että EpCAM /CD44-signaalien aliarvioida fenotyyppinen monimuotoisuus aikaisin kulku munasarjasyöpäsoluja. Paras syrjiä eri osa saavutettiin E-kadheriinin yhdessä mesenkymaalisten merkki tai CD44. Myöhemmin käytimme tätä markkeriyhdistelmä luonnehtia useimmat seurannut kokeita. Kun analysoitiin E-kadheriinin ja oletetun syövän varsi merkki CD133, kaksi subfraktioita on CD133 positiivisten solujen selviksi CD133

+ /E-kadheriinin

korkea ja CD133

+ /E-kadheriinin

alhainen solujen (kuvio 2C). Tämä havainto tukee edelleen roolia E-kadheriinin mahdollisena syrjivä markkeri syövän solualaryhmiä. Solujen E /M solupopulaation (erityisesti E-kadheriinin

alhainen solut) ilmaisi myös muita markkereita, jotka ovat ominaisia ​​kantasoluja, kuten Nanog, loka 4, ja Sox2 (kuvio S2B). E /M-soluissa, erityisesti solujen aloilla, olivat myös erittäin positiivisia EMT indusoijia Snail, Twist ja NGAL (kuvio 2D). Lisäksi olemme havainneet, että solut, jotka olivat alhaiset kalvoon klaudiini 7 pääasiassa lokalisoida beeta-kateniinin sytoplasmaan /tumassa (kuvio S2C). Transition of beta-kateniinin päässä solukalvon tumaan on varhainen tapahtuma EMT.

Kaiken immunofluoresenssitutkimukset osoittaa, että kyseessä on kaksi CD133

+ jakeet; i) kalvo E-kadheriinin

korkea ja ii) sytoplasminen E-kadheriinin

korkea /kalvo E-kadheriinin

alhainen soluja. Sytoplasmisen E-kadheriinin

korkea /kalvo E-kadheriinin

alhainen solut kantavat piirteitä muiden solulinjojen ja siksi, mitä todennäköisimmin, ovat primitiivisiä progenitorisolut tai kantasoluja.

Muuta fenotyypin, EMT ja eriyttäminen

in vitro

: virtaussytometria tutkimukset

määrällisesti numeroita sisältävien solujen epiteelin ja mesenkymaalisten fenotyyppejä viljellyissä soluissa, käytimme virtaussytometrillä ja alkoi seuraamalla solujen epiteelin markkeri EpCAM sekä tarkkaillaan vimentiinista tai CD44 merkintä solujen mesenkymaaliset ominaisuuksia. Lisäksi rajaamiseksi fenotyyppisiä muutoksia ylitöitä kuten aloittamisen EMT, analysoimme erilaisia ​​kohtia ovc316-XC solut (kuva 3). Nämä tutkimukset paljastivat useita mielenkiintoisia havaintoja. i) tuumorisolun suspensioita, jotka olivat äskettäin eristettiin ksenografteista, suurin osa soluista oli joko E /M-soluja (EpCAM

korkea /vimentiinista

korkea, EpCAM

korkea /CD44

korkea) tai E soluissa (EpCAM

korkea /vimentiinista

alhainen, EpCAM

korkea /CD44

alhainen), kuitenkin passage 1 vain E /M-soluissa voitiin havaita, mikä osoittaa, että suurin osa soluista saatujen ksenograftit jotka mukautuvat kudosviljelmän ovat E /M (kuvio 3A). Tämä merkitsee sitä, jopa varhain passage, viljelmät eivät heijasta riittävästi solukoostumuksesta kasvaimen

in situ

. Passage 1 sisälsi EpCAM

korkea /CD44

korkea /vimentiinista

korkea ja EpCAM

korkea /CD44

pieni /vimentiinista

alhainen soluja. ii) Tärkeää viljelyn aikana soluja MEGM sisältävä kasvutekijöitä /FBS (ks kohtia 1, 5, 7, 20), sekä EpCAM

korkea /CD44

korkea /vimentiinista

korkea tai EpCAM

korkea /CD44

pieni /vimentiinista

alhainen solutyyppejä katosivat ja korvattiin EpCAM

pieni /CD44

korkea /vimentiinista

korkea soluja. Tämä osoittaa, että E /M-solut erilaistuvat mesenkyymisolujen

in vitro

in EMT-tavoin. iii) Valtaosa CD133

+ solut ovat E /M hybridisolulla. Sen jälkeen viemällä kulttuuriin ovc316-XC solut menettävät nopeasti CD133 ilmentyminen samanaikaisesti menetys epiteelin ominaisuuksia.

A) Triple-väri virtaussytometria analyysi ksenograftin /koepala solususpensioissa ja viljeltyjä soluja

in vitro

eri kohtia. Vasen paneeli: EpCAM /CD44 /CD133. Oikea paneeli: EpCAM /vimentiinista /CD133. B) Passage 1 ja 5 solut altistettiin 14 päivää kasvutekijä /FCS nälkään ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla. On esitetty tietoja ovc316-X ja ovc316-XC. Havainnot vahvistettu solususpensioiden biopsioista ja primääriviljelmistä (ovc100506-biopsia, ovc100506-PC, ovc100728-biopsia, ja 100914). C) Immunofluoresenssianalyysi of passage 3 ja 18 viljelmät ovc316-XC. Solut alussa käytäviä (passage 3) ovat kohonneet E-kadheriinin ja laminiini verrattuna kulku 18. Solut koot ovat kasvaneet ja pallo-kasvu korkeasti solutiheyksiin on huomattavasti pienempi korkea kohtia. Prosenttiosuus puolella väestöstä (SP) positiiviset solut on esitetty alla. Mittakaavapalkki on 40 uM. D) Kasvaimen muodostuminen elinsiirron jälkeen on ovc316-XC passage 3 ja 18 solujen SCID-beige hiiret (arvioitu 4 kuukauden ajan inokulaation). TIC p3: 1/110, TIC p18: 1/744. Chi-square: 0,245.

Olemme myös havainneet, että useiden kanavien nälkään voi pysähtyä erilaistumista ja menetys epiteelin fenotyypin, kun taas tasojen CD133 hieman laskevan tämän prosessin aikana (kuva 3B). Kaiken kaikkiaan olemme havainneet, että ensisijainen munasarjasyöpä kulttuureissa näytä pallo muodostumista viljeltynä ilman kasvutekijöitä (kuva S3).

ottaa tunnistettu E-kadheriinin markkerina kykenevät erilaistumaan solujen osajoukkoja, me toistuva virtaussytometria analyysit E -cadherin (kuvio S3). Eriyttäminen näkyi myös väheneminen tasoja E-kadheriinin ja laminiini jälkeen johtamisella. Kun taas varhainen viljelmät sisälsivät suuren määrän palloja, E-kadheriinin

korkea soluja, ja liikaa laminiinin, korkea passage solut osoittivat merkittävästi pienentää pallo kasvu ja alhainen näiden proteiinien taas solun koko kasvoi (kuvio 3C). Tämä vahvistettiin myös virtaussytometrialla tutkimuksissa kohtia 1, 3, ja 7 (kuviot S3A-C). Nämä tutkimukset osoittavat, että mesenkymaaliset (E-kadheriinin

negatiivinen /matala) Alafraktio lisääntyy siirtojen aikana ja samanaikaisesti EMT. CD133

+ solut olivat erittäin positiivisia CD44 (kuva S3A). Analysoimme myös kalvo Tie2 sisään korrelaatio E-kadheriinin (kuvio S3B). Immunofluoresenssianalyysin avulla, Tie2 soluja on epiteelin fenotyyppi ja ovat alhaisempia CD44 kuin CD133

+ soluja. Erityisesti korrelaatio E /M-fenotyyppi, CD133 /CD44-positiivisuus, ja tuumorigeenisyystesti tukee myös virtaussytometrialla analyysi klonaalisen viljelmät (kuvio S3C). Vain E /M-kloonit sisälsivät huomattavia määriä CD133

+ solujen kohonnut ilmentyminen CD44 (ja kuten on esitetty aikaisemmin, vain E /M-kloonit muodostivat kasvaimia). Menetys ”kantasolu” ominaisuuksia siirtojen aikana näkyy myös pelkistämällä osa puolen väestöstä (SP) soluja 7,8 ± 0,5%: iin kulku 3) 2,1 ± 0,3%: iin passage 18 (kuvio 3C). SP solujen fenotyyppi on liittynyt syövän kantasoluja aiemmissa tutkimuksissa munasarjasyövän [36]. Lopuksi menetys CD133

+ ja E /M-solut korreloivat alentunut kyky muodostaa kasvaimia (kuvio 3D).

Kaiken havaitsimme silmiinpistävä ero fenotyyppejä solujen välillä

in vivo

ja

in vitro

. Solut, jotka on sovitettu kudosviljelmän olivat CD133

+ E /M-soluissa. Sen jälkeen viemällä E /M-solut erilaistuvat mesenkymaalisten solujen EMT tavoin. Tämä prosessi on mukana väheneminen on kasvainten muodostumiseen.

läsnäolo E /M solualaryhmiä

in situ

Ottaen huomioon, että munasarjasyövän kulttuureissa, erityisesti myöhään kohtia, vain huonosti heijastavat fenotyypin kasvaimia

in situ

, fokusoimme immunofluoresenssimenetelmällä ja virtaussytometria analyysejä osissa kasvainbiopsioissa tai ksenografteja tai solususpensioita saatu Kollagenaasikäsittelyn kasvaimet (kuva 4). Immunofluoresenssimenetelmällä analyysit jaostojen ksenografteista kerättiin viikon 10 jälkeen tuumorisolujen transplantaation (kuva 4) tai osien potilaan koepaloja (taulukko S1, kuva S4) osoitti, että kasvaimet

in situ

on klustereita E /M-soluja (EpCAM

+ /vimentiinista

+) sekä klustereita epiteelisolujen (E-kadheriinin

+ /vimentiinista

-) (kuvio 4A). Vuonna ksenografteja, pesiä E /M ja epiteelisolujen ympäröi kerrosta laminiinin. Havaitsimme myös costaining E-kadheriinin ja Tie2 (kuvio 4B). CD133

korkea solujen (siniset) ovat Tie2

alhainen ja E-kadheriinin

pieni (kuvio 4B, alempi paneeli). Mielenkiintoinen malli havaittiin, kun kaksinkertainen värjäys E-kadheriinin ja CD133 kuin CD133 positiivisia soluja löydettiin kasvain reuna aloilla aktiivisten kasvaimen kasvua (kuvio S5a). Erityisesti kaikki CD133

+ solut E /M-soluissa. Sisällä CD133

+ soluja, löysimme kaksi osajoukkoja E /M-soluissa, kuten on kuvattu aikaisemmin in vitro tutkimuksissa (kuvio 4C, suurempi suurennus kuvassa S5B). Mielenkiintoista CD133

korkea /kalvo E-kadheriinin

pieni osajoukko

in situ

osoitti läsnäolon E-kadheriinin sisällä soluliman rakkulat enemmän ilmeisesti kuin

in vitro

. Tulokset saatiin käyttämällä ksenograftikasvaimissa edustivat värjäykseen tuumorisektioiden yhdeksästä eri potilaista (taulukko S1, kuva S4).

A) olemassaolo E /M hybridisoluista

in situ

. E-kadheriinin

+ /vimentiinista

+ solut ovat läsnä koepaloja ja tuumoriksenografteissa. Näkyy ovat kuvia ovc316-biopsia ja ovc316-X. Samanlaisia ​​värjäytyminen havaittiin ovc100506-biopsia /ovc100506-X, ovc100728-biopsia /ovc100728-X, ja ovc100914-biopsia /ovc100914-X. B) korrelaatio E-kadheriinin (vihreä) ja Tie2 (punaiset) positiivisuuden munasarjasyöpä koepaloja. CD133

korkea solujen (siniset) ovat Tie2

alhainen ja E-kadheriinin

väli. Näkyy ovat kuvia ovc316-biopsia ja ovc316-X. Samanlaisia ​​värjäytyminen havaittiin ovc100506-biopsia /ovc100506-X, ovc100728-biopsia /ovc100728-X, ja ovc100914-biopsia /ovc100914-X. C) CD133

korkea soluissa on alhainen kalvo E-kadheriinin. E-kadheriinin

korkea soluilla punctated kalvo CD133 värjäystä. Näkyy ovat kuvia ovc316-biopsia ja ovc316-X. Samanlaisia ​​värjäytyminen havaittiin ovc100506-biopsia /ovc100506-X, ovc100728-biopsia /ovc100728-X, ja ovc100914-biopsia /ovc100914-X. Mittakaavapalkki on 40 uM. D-F) Triple-väri virtaussytometria analyysi ovc316-X epiteelin markkereita (x-akseli), mesenkymaaliset piirteet (y-akseli), ja syövän kantasolujen merkki CD133 (histogrammit). D) Ksenograftien sisältävät epiteelisolut, epiteelin /mesenkymaaliset (E /M) hybridisoluista, ja solut, jotka ovat negatiivisia kaikki merkit. CD133

+ solut ovat lähes yksinomaan E /M hybridi vaihe perustuu EpCAM /CD44-analyysi. CD133

korkeat solut ovat EpCAM

korkea, CD44

korkea ja vimentiinista

alhainen. E) korvaaminen EpCAM E-kadheriinin paljastaa suurempi monimuotoisuus ksenograftit. CD44

korkeat solut ovat E-kadheriinin

pieni /väli. CD133

+ solut jaetaan kahteen selkeä osa-alat. Fraktio 1: E-kadheriinin

pieni /väli- /CD44

korkea ja osa 2: E-kadheriinin

korkea /CD44

väli.