Krooninen sairaus

tiivistelmä

HPV-DNA integroitumisen isännän genomiin on ominaisuus, mutta ei yksinomainen askel aikana kohdunkaulan syövän synnyn. Se on vielä Kiistanalaista, onko virus yhdentyminen edistää muutosprosessia takaamisen konstitutiivista ilmentymistä viruksen onkogeenien. On yhä enemmän todisteita ei-satunnaista jakautumista integraation loci ja suora osallistuminen solujen syöpään liittyvien geenien. Tässä tutkimuksessa tätä asiaa laajentamalla olemassa olevien tietojen asettamat ylimääräinen 47 HPV16 ja HPV18 positiivinen kohdunkaulan syöpä. Tarjoamme tukevaa näyttöä aikaisemmin määritelty integraatiota kohteiden ja ovat paljastaneet toisen klusterin integraation sivustojen sisällä sytogeneettisten kaistan 3q28. Lisäksi läheisyydessä näiden kohteiden lukuisia MikroRNA (miRNA) sijaitsevat ja niitä voidaan vaikuttaa integroidun HPV-DNA. Kokoamalla tietomme ja julkaistut raportit 9 geenejä voidaan tunnistaa mikä vaikutti HPV integraation vähintään kahdesti riippumaton kasvaimia. Joissakin kasvaimia viruksen-solufuusio transkriptit olivat jopa identtisiä suhteessa virus- luovuttaja ja solujen akseptorikohtia käytetään. Kuitenkin tarkka integraatio sivustot todennäköisesti eri koska yksikään integraation sivustot analysoitu tähän mennessä ovat osoittaneet enemmän kuin muutama nukleotidin homologia virus- ja isännän sekvenssit. Siksi DNA rekombinaationa liittyy suuria homologialueet at Integraatiokohdan voidaan sulkea pois. On kuitenkin kiehtovaa, että sekvenssin rinnastus useilla alueilla HPV16-genomin havaittiin olevan erittäin homologinen ulottuu jopa 50 nukleotidia edellä mainitun geenien ja integrointi verkoissa. Yksi yleinen alue homologiaa solun sekvenssien välissä viruksen geenin E5 ja L2 (nukleotidit asemat 4100-4240). Me spekuloida, että tämä ja muut homologisia alueita ovat mukana yhdentymisprosessissa. Meidän havainnot viittaavat siihen, että kohdennettuja häiriöitä, mahdollisesti myös kriittinen solujen geenien, HPV integraatio on edelleen ongelma on ratkaistu.

Citation: Schmitz M, Driesch C, Jansen L, Runnebaum IB, Durst M (2012) non-Random integrointi HPV Genome kohdunkaulan syöpä. PLoS ONE 7 (6): e39632. doi: 10,1371 /journal.pone.0039632

Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, lääketieteellisen tiedekunnan, Chile

vastaanotettu: 03 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 24. toukokuuta 2012 Julkaistu: 27 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Schmitz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain varoista Deutsche Forschungsgemeinschaft (DR780 /3-1) myönnetty CD- ja MD. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pysyvä infektio korkean riskin ihmisen papilloomavirukset (HR-HPV) erityisesti HPV16 ja 18 on tunnustettu korkeimmalla riskitekijänä kehittämiseksi kohdunkaulan syövän [1]. Useimmat HR-HPV-infektiot ovat joko piilevä tai salliva. Piilevien tartuntojen on huonosti määritelty, mutta oletetaan, että viruksen genomi on säilytettävä episomi on pohjapinta ja parabasal solujen epiteelin aiheuttamatta selvää fenotyyppisiä muutoksia isäntäsolussa. Virusreplikaation suhteen virionin tuotanto rajoittuu terminaalisesti erilaistuneita soluja väli- ja pinnallinen epiteelikerrosten ja tuloksia kytkimen latentti salliva vaiheeseen tai suoraan akuutti infektio. Normaalisti HR-HPV-infektiot ovat itsestään rajoittuvia ja häviävät useita kuukausia. Kuitenkin arviolta 10% tapauksista muuttamassa HPV-infektion tyypin kehittyy. Tämä muutosprosessi on ominaista sääntelyn purkaminen viruksen onkogeenien E6 ja E7 pyöräilyn soluissa mikä johtaa lopulta kromosomi epävakautta ja mutaatioiden. Taustalla mekanismit sääntelyn ovat moninaiset. Integrointi HPV-genomin on tunnusomainen vaihe kohdunkaulan syövän synnyn ja sen ulkonäkö korreloi etenemistä syövän esiasteita (CIN2 /3) invasiivisia karsinooma [2], [3], [4], [5], [6]. Kuitenkin, integraatio ei ole pakollista tähän prosessiin ja sen osoitettiin olevan HPV-tyyppiä riippuvainen. Vinokurova ja työtovereiden totesi, että HPV16, 18 ja 45 olivat huomattavasti useammin läsnä integroitu tilassa verrattuna HPV-tyypit 31 ja 33 [7]. Mielenkiintoista korkein karsinogeeninen potentiaali katsoneet HPV16 ja HPV18 [8].

Menetys viruksen E2-geeni on yhteinen seurausta HPV yhdentymistä. Tämä tapahtuma voi johtaa kohonnut ilmentyminen onkogeenien E6 ja E7 johtuu siitä, että E2 ei voi enää tukahduttaa ilmentymisen viruksen onkogeenien

trans

[9], [10]. Kuitenkin huomata, että äskettäin analyysi biopsialaitteet ei korrelaatiota ilmentymisen tasojen viruksen onkogeenin selostukset ja fyysinen tila virusgenomin todettiin [11]. Koska kopioinnin suhteen aktiivisia viruksen integraation sivustot toistaiseksi analysoitu CIN2 /3 tai kohdunkaulan karsinoomat edustavat päätepiste kloonivalintamenetelmää prosessi käytännöllisin tietojen tulkintaa on, että integraatio takaa ilmentämällä viruksen onkogeenien tasolle tarvitaan ylläpitämään transformoidun tilan solussa. Viime aikoina useat tutkijat ovat myös keskitytty vaikutuksista integraatio voi olla isännän genomiin. Systemaattinen analyysi genomin rakenteen integraatio lokuksessa on paljastanut usein genomista rakenteellisia muutoksia on HPV insertiokohtien kohdunkaulan syöpä [12]. Kaksi muuta julkaisut tarjoavat näyttöä kattava toiminnallinen menetys tuumorisuppressorigeeneille,

ZBTB7C

ja

CASZ1

, vastaavasti. Molemmissa tapauksissa geenin ilmentyminen estyy johtuen insertiomutageneesin yhdessä heterotsygoottisuuden menetys [13], [14]. Vaikka tällaiset lähettämiä todennäköisesti ovat harvinaisia ​​tapahtumia on yhä selvemmäksi, että HPV integraatio ei tapahdu täysin sattumanvaraisesti. Aikaisemmassa tutkimuksessa voisimme osoittaa, että suurin osa viruksen solufuusio transkriptien kohdunkaulan karsinoomien yhteistyössä puhtaaksi solun sekvenssit tunnettu tai ennustettu geenejä. Todellakin, 17 74 (23%) integraation Kohteet sijaitsivat alueella sytogeneettisten bändejä 4q13.3, 8q24.21, 13q22.1, ja 17q21.2, klustereita vaihtelevat 86-900 kb. Integraatio kuormittajat 8q24.21 ja 13q22.1 ovat lähellä viereiseen hauras sivustoja. Kiinnostava on, että yhdentymistä MYC lokukseen 8q24.21 korreloi voimakkaasti korkeita

MYC

ilmaisun [15], [16], [17] mikä

cis

säätelyvaikutukset ollessa kohdistamaa virusgenomin.

ilmiö ei-satunnainen integraatio HPV-DNA on kiehtova ja se voi olla vain kysymys kromatiinin saavutettavuutta kopioinnin suhteen aktiivisia alueita tai hauras sivustoja, jotka ovat alttiita kaksinkertainen säikeen katkoksia [18 ], [19], [20]. Jotta ymmärrettäisiin paremmin roolin ja mekanismit viruksen integraation kohdunkaulan syövän synnyn on tarpeen kerätä lisää tietoa vertailua varten. Niinpä olemme analysoineet virus–solufuusio selostukset 34 HPV16 positiivisia ja 13 HPV18 positiivinen kohdunkaulan karsinoomat. Perusteella näiden uusien tietojen aiemmin määritellyt kuormittajat integraatiota voidaan vahvistaa ja laajentaa, jos. On myös yhä enemmän todisteita siitä, että lukuisat geenit vaikuttavat enemmän kuin kerran integroimalla.

Tulokset

47 87 HPV16 tai HPV18 kasvaimia analysoitu virus-solufuusio transkriptit voitiin monistaa. Fusion transkriptit havaittiin useammin HPV18 kasvaimissa (72%) kuin HPV16 kasvaimissa (49%). Loput kasvaimet sisälsivät joko vain episomaalinen virus- genomien tai integroitu HPV-DNA, joka on kopiointia ajatellen hiljainen. Solu sekvenssit fuusio transkriptien leimasi käyttäen NCBI ihmisen megaBlast työkalu. Tunnistaa ilmenevän geenin osiksi ja ennustettu geenit kaikki muut solujen sekvenssit analysoitiin käyttämällä UCSC blat tietokantaan.

kromosomaalinen luovutus Fusion Transcripts

Yhteensä 23 fuusio selostukset sisälsivät sekvenssejä tunnettuja geenejä ja 23 sisälsivät sekvenssit ennusti geenien ja EST. Yhdessä tapauksessa solun sekvenssi ei vastannut mitään tietokantaa merkinnät. Viruksen solufuusio selostukset voitaisiin myöntää kaikille kromosomeja, paitsi kromosomi 11, 14, 16, 18 ja 20 ja on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Aikaisemmassa tutkimuksessa oli jo kuvattu, että jotkut alueet useammin vaikuttaa integraation kuin muut osat genomin [21]. Kolmessa kuormittajat olemme nyt löytäneet uusia integraatio tapahtumia: Alueet 8q24.21 ja 13q22.1 vaikutti kahdesti alue 4q13.3 vaikutti kerran. Lisäksi kolme fuusio transkriptit kartoitettu 600 kb alueen kromosomi sytogeneettistä bändi 3q28 ja siten edustavat uutta hotspot HPV integraatiota. Kuvio 1 sisältää tietoja Kraus ja kollegoiden ja esittää kaikki viisi kuormittajat, niiden koko ja läheisyys liittyvien hauras sivustoja ja miRNA.

Esitetään integrointi sivustoja sijaitsevat sytogeneettisten bändit 3q28 (A), 4q13.3 (B), 8q24.21 (C), 13q22.1 (D) ja 17q21.2 (E). Vaaleansininen nuolet: geenit vaikuttavat HPV integrointi; punaiset nuolet: HPV fuusio selostukset kuvattu tässä työssä; harmaa nuolet: HPV fuusio selostukset kuvanneet Kraus et al. 2008; Vihreät nuolet: hauras sivusto; tummansininen nuolet: MikroRNA.

Assosiaatio Fragile sivustot ja miRNA

Niistä 47 integraatio loci tunnistettu, 10 (21%) tapahtui yhteinen hauras sivusto (CFS ) ja 6 (13%) harvoissa hauras sivustoja. Lisäksi 15 (32%) tapauksista integrointi sivustot olivat reunustavat hauras sivustoja etäisyydellä 200 kb enintään 5 Mb. Toinen 16 integraatio sivustot eivät liittyneet hauras sivustoja. Lisäksi 32 integraatio Kohteet sijaitsivat etäisyydellä 3 Mb miRNA (taulukko 1).

Suunta ien sisällä Fusion Tanscripts

Kaksikymmentä kolme 47 fuusio selostukset sisälsivät sekvenssejä tunnettuja geenejä . 12 tapauksessa vastaanottavan geenin suunnattu suuntaan viruksen promoottorin eli sekä viruksen ja ihmisen sekvenssit olivat sense-orientaatiossa. Lähes kaikki näistä kasvaimista, viruksen sekvenssi saumattu solun eksonisekvenssissä (11 12 tapahtumat). 23 fuusio selostukset sisälsivät ennustetun geenisekvenssien ja 8 yhdistettiin sense-orientaatiossa. 3 tapauksissa suuntaus ei voitu määrittää, koska välisen epäjohdonmukaisuuden tietokannoista (taulukko 1).

Identtiset Geenit vaikuttavat Integration eri kasvaimet

tiedonkeruun tämän tutkimuksen ja julkaistut tiedot viisi geenejä ja neljä ennustettu geenit voitiin tunnistaa mikä vaikutti ainakin kahdesti itsenäinen kasvaimia (taulukko 2). Neljä näistä geeneistä sijaitsevat kuormittajat 3q28 (

LEPREL1

ja

TP63

), 8q24.1 (

LOC727677

) ja 13q22.1 (

BG182794

). Toinen geenit sijaitsevat muualla genomissa. Kun taas geenit

Chr2.3.305.a

,

LEPREL1

,

NT_008046.7

, ja

LIPC

vaikuttivat kahdesti integroimalla,

TP63

vaikutti kolme kertaa,

LRP1B

,

LOC727677

ja

BG182794

neljästi ja

TMEM49

jopa kuusi kertaa.

Lisäksi geenit

NT_008046.7

,

LOC727677

,

BG182794

ja

TMEM49

ovat huomionarvoisia, koska ainakin kaksi kasvaimet satama identtinen virus- solufuusio selostukset suhteessa virus- luovuttaja ja akseptorisilmukointikohtien käyttää.

keskustelu

HPV integroitumisen isännän genomiin on todennäköisesti hyvin yleinen tapahtuma, mutta ei voi olla helposti havaita, jos integraatio tapahtuu yhdessä solussa ilman myöhempää kloonivalinnan painetta. Useimmissa kohdunkaulan syövistä on vain yksi kopiointia ajatellen aktiivisen HPV integraatio sivusto. On näyttöä siitä, että nämä integraation sivustot ovat varhainen klonaalinen tapahtumia, jotka ovat tarjonneet valikoiva etu laajentamiseen kasvaimen. Koska niiden osuus karsinogeenisia prosessin selvittäminen näiden tiettyjen integraatio tapahtumat ovat olennaisia ​​ymmärtämisen HPV aiheuttama syövän synty.

Viral-solufuusio transkriptit ovat molekyylitason markkereita kopioinnin suhteen aktiivisia integraation sivustoja ja voidaan havaita 3` RACE-protokollaa (jäljempänä APOT määritys), jonka avulla PCR-amplifikaation myöhempää sekvenssianalyysillä. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet viruksen solufuusio transkriptien 47 kohdunkaulan karsinoomat. Yhtä poikkeusta lukuun ottamatta fuusio selostukset käsittävät solujen sekvenssejä joko tunnettu tai ennustettu geenejä. Tämä on sopusoinnussa tulosten edellisessä analyysin ja ehdottaa, että yhdentyminen tapahtuu enimmäkseen kopioinnin suhteen aktiivisia alueita [21]. Lisäksi kanssa kirjallisuudessa 66% integraatio tapahtumat olivat joko (34%) tai vieressä hauras sivuston (32%) [18], [19], [20], [21]. Myös integrointi HPV-DNA lähellä miRNA on ilmeinen. miRNA liittyy sääntelyn tärkeitä prosesseja, kuten kehitys, proliferaatiota, erilaistumista ja apoptoosia [22], ja ne ovat usein vapautettu syöpäsoluissa [22], [23]. Niistä 75 miRNA naapurustossa integraatiopaikkoja 19 on jo yhdistetty syöpään (kuva 1). Näistä miR-34a, miR-191, miR-28, miR-944, miR-31, miR-7-2, miR-9-3, miR-497, miR-195, miR-301a, miR-21, miR-181C, miR-27a, miR-99a ja miR-let7c ilmentyvät kohdunkaulan syövän soluihin [24], [25], [26], [27], [28], [29]; kun taas miR-34a, miR-21, miR-191, miR-9-3, miR-181d, miR-23a, miR-24-2, miR-99a ja miR-125b2 raportoidaan olevan osallisena muiden kasvain yksiköt [ ,,,0],28], [30], [31], [32].

huomattavaa on, että huomattava määrä fuusio- transkriptien (11/47) viruksen sekvenssit saumattu sense-orientaatiossa solukkojärjestelmäisten eksonit tunnettujen geenejä. Häiriöt geenin HPV integraatio, vaikka tämä tapahtuu intronisekvensseillä, todennäköisesti vaikuttaa geenien ilmentyminen ja joissain harvoissa tapauksissa osoitettiin vaikuttaneen täydellisen menetyksen geenien toiminnan [13], [14].

tärkeä löydös on, että se tarjoaa lisätukea klusterointi HPV integraation sivustojen kromosomi hotspot alueilla. Niistä 121 kasvaimet analysoitu (mukaan lukien tiedot Kraus et al., 2008) 22% viruksen-solufuusio transkriptien jaettiin yksi viidestä kuormittajat (kuvio 1). Kuormittajat ovat kooltaan 150 kb 995 kb ja sisältää enintään 8 integraation sivustoja. Lisäksi sisällyttämällä edelleen julkaistut tiedot 9 geenejä havaittiin vaikuttaa vähintään kaksi kertaa HPV integraatio, neljä näistä geeneistä sijaitsevat kuormittajat on sytogeneettisten bändejä 3q28, 8q24.21 ja 13q22.1 (taulukko 2). Tämä havainto on erityisen kiinnostava, koska se viittaa siihen, että integraatio ei ole vain liittyy kopioinnin suhteen aktiivisia alueita ja lähellä hauras sivustoja. Varsinkin koska joissakin kasvaimissa jopa samoja virus-solu fuusio selostukset suhteen virus-solu silmukoinnin havaittiin (taulukko 2). Kuitenkin sekvensointi integraation sivustojen tapauksessa

TMEM49

oli osoittanut, että raja-arvot kahden vastaavan kasvaimet ovat noin 17 kb toisistaan. Lisäksi sekä integraatiopaikkoja ei osoittanut mitään homologiaa viruksen ja solun sekvenssit [14]. DNA rekombinaationa liittyy suuria homologialueet at Integraatiokohdan voidaan ainakin sulkea pois

TMEM49

. Kiinnostavaa sekvenssin rinnastus geenien taulukossa 2 ovat paljastaneet useita alueita, joilla on korkea homologia HPV16-genomin. Yleisin alue korkea homologia on välillä viruksen geenin E5 ja L2 (nukleotidit asemat 4100-4240). Kuusi 9 geenien vaikuttaa vähintään kahdesti HPV integraatio osoittavat vähintään 80% homologia ulottuu jopa 34 nukleotidin (Sekvenssit S1). Lisäksi kullekin 9 geenien osoittavat edelleen homologiaa muiden osien kanssa virusgenomin. Esimerkillisesti kannat homologisten alueiden viereisen geenien

LEPREL1

ja

TP63

kanssa HPV16-genomi on kuvattu kuvassa 2. Me spekuloida, että nämä alueet voivat olla mukana yhdentymisprosessissa. Tarkoituksena on, että viruksen genomi on kytkettynä kromatiinin mennessä Brd4 jolla on keskeinen rooli kromosomaalisia toiminnallisia tapahtumia, kuten transkription, DNA: n replikaatio, korjaus ja rekombinaatio [33], [34]. Homologinen osuuksilla DNA voi sallia hehkutus osittain dissosioitujen säikeiden ja siten edistää rekombinaatiotapahtuman. Sekvenssihomologia on yhdistää sivuston itse ei tarvitse olla edellytys. Tämän lisäksi erittäin epävarmaa skenaario on myös mielenkiintoista huomata, että kaikki liittyvät geenit ovat syöpään liittyvät geenit eriasteisesti. Jos toiminnallisesti heikentynyt, ne ovat olleet rooli kloonivalinnan prosessi. Sillä ennustettu geenit

chr2.3.305.a

(N-SCAN),

NT_008046.7

,

LOC727677

(alias sweeker) ja

BG182794

ole toiminnallista tietoja. Kuitenkin,

LRP1B

kuuluu alhaisen tiheyden lipoproteiinin reseptorin geenin perhe, ja sillä on rooli tässä prosessissa reseptorivälitteisen endosytoosin. Homotsygoottinen menetys

LRP1B

useita kohdunkaulan kasvaimista havaittiin käyttäen array-pohjainen vertaileva genominen hybridisaatio-analyysi [35]. Myös muissa kasvain yksiköiden kuten kilpirauhassyöpä [36], mahasyöpä [37], keuhkosyöpä [38], [39], [40], [41] ja suusyöpä [42], [43] hiljentäminen tai menetys

LRP1B

havaittiin. Toiminnallisesti

LRP1B

kykenee estämään solujen vaeltamiseen [44] ja sen menetys voi siten olla merkitystä ja metastaasit. Toinen geeni,

LEPREL1

, koodaa proteiinia, joka liittyy kollageenin biosynteesiä, taitto ja kokoonpano. Toistaiseksi tämä geeni ei liittynyt kohdunkaulan syöpä, mutta se havaittiin vaiennetaan rintasyövän solulinjoissa ja 26% rintasyövistä analysoitu [45]. Kaksi muuta geenit ovat

TP63

ja

LIPC

.

TP63

, jäsen p53-proteiinin perhe, on toinen geeni vaikuttaa integraation. Se toimii tuumorisuppressoriproteiinia ja poikkeava ilmentyminen todettiin useita syövän yksiköitä, mukaan lukien kohdunkaulan syöpä [46], [47].

LIPC

on sytoplasminen proteiini ilmentyy pääasiassa maksassa. Se on mukana lipidprotein aineenvaihduntaa ja katalysoi hydrolyysin fosfolipidejä, mono-, di- ja triglyseridien ja asyyli-CoA-tioestereiksi [48]. Suora yhteys syövän synnyn ei käy selvästi ilmi, mutta tuoreessa tutkimuksessa täydellinen puuttuminen ilmentymistä havaittiin 18% kohdunkaulan karsinoomien. Sen sijaan kaikki normaalit kohdunkaulan epiteelin, metaplasiaa ja CIN tarkasteli ilmaistaan ​​LIPC [14]. Useimmin vaikuttaa geenin, häiriintyy 6 kertaa, on

TMEM49

(transmembraaniproteiini 49), joka tunnetaan myös nimellä

VMP1

(ontelon kalvo proteiini 1), joka sijaitsee kromosomissa 17q23.1. Se koodaa solukalvon proteiini, joka on olennainen osa alkuperäisestä solu-solu kontakteja ja tiiviin liitoksen muodostelmia [49]. Vähentynyt ilmentyminen

TMEM49

todettiin invasiivisen rintasyövän solulinjoissa ja munuaissyövän etäpesäkkeiden [49].

TMEM49

myös näyttää olevan erityisen merkittävä kannalta vapauttamisen lähellä miRNA. miR21 sijaitsee vain 676 bp alavirtaan tämän geenin ja saattaa seurauksena HPV integraation olla joko ylös tai alas-säädellä. Association Tämän miRNA on raportoitu kaspaasi Cascade [50] ja se voi kohdistaa BTG2, geeni on antiproliferatiivisia ominaisuuksia [51]. Toistaiseksi miR21 osoitettiin voimistuvan useita syöpiä, kuten rinta-, keuhko-, paksusuoli-, haima-, eturauhas-, maha-, munasarja- ja kohtu [28], [31], [32].

kolme homologista osuuksilla 50 nukleotidit esitetään. Määrä täsmälliseen nukleotidi ottelut suluissa (katso myös Sekvenssit S1). DNA silmukka kahden homologiaa sijaitsevat

LEPREL1

käsittää 102,689 nukleotidin; toinen silmukka 269,968 nukleotidia. Harmaa pisteitä viittaavat likimääräisen sijainnin vastaavan viruksen solufuusio transkriptit havaittiin kasvainten D3829, T2107 ja T4335 (vasemmalta oikealle).

ominaisia ​​yhä enemmän kopioinnin suhteen aktiivisia HPV integrointi sivustoja on käynyt ilmi, että yhdentyminen ei ole täysin sattumaa, vaan siihen liittyy myös ensisijainen kromosomikohdissa. Yksittäisissä tapauksissa tämä voi heikentää geenien toiminnan ja edistää pahanlaatuisten etenemistä. Tällä hetkellä voimme vain spekuloida mekanismeja, jotka edistävät tämän ilmiön.

Materiaalit ja menetelmät

Kliininen Näytteitä

Tässä tutkimuksessa 69 HPV16 ja 18 HPV18 positiivinen koepalat kohdunkaulan kohdunkaulan potilasta seulottiin HPV integraatiota APOT määrityksessä. HPV-genotyypin Taqman perustuu multiplex reaaliaikainen PCR-määritystä käytettiin [52]. Kaikki koepaloja otettiin saaneilla potilailla laitoksella Naistenklinikka Friedrich-Schiller-Universität, Jena, Saksa vuodesta 1995 2008. Kaikki kasvaimet histopatologisesti luokiteltu levyepiteelikarsinoomia.

Nucleic Acid Isolation

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen NucleoSpin RNA II Kit (Macherey- Nagel, Düren, Saksa) protokollan mukaisesti RNA erillään kudoksista. Homogenisoitiin käyttämällä injektioneulaa, jonka halkaisija on 0,55 mm. DNA poistettiin kaikissa näytteissä DNaasikäsittely 15 min (RT). DNaasi mukana toimitetun NucleoSpin RNA II Kit. Kokonais-RNA eluoitiin 60 ul RNaasi-vapaata vettä ja säilytettiin -80 ° C: ssa lisäanalyysiä varten.

Käänteinen transkriptio

kokonais-RNA (300-500 ng) käänteiskopiointiin käyttäen 200 yksikköä Superscript II käänteiskopioijaentsyymiä (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) ja oligo (dT) alukkeen kytketty kytkijäsekvenssin (5′-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CT

(30) VN-3 ’ ), kutsutaan CDS-Primer (Clontech, Heidelberg, Saksa). Reaktiota inkuboitiin 70 min 42 ° C: ssa lopullisessa tilavuudessa 20 ui protokollan mukaisesti ja Superscript II Kit. 40 yksikköä RNaseOUT (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) lisättiin inhiboimaan RNaasi-aktiivisuus.

monistaminen Papillomavirus Oncogene Transcript (APOT) Pitoisuus

HPV-johdettu fuusio transkriptien monistettiin käyttäen APOT määritys [6]. Se perustuu 3′-nopea monistus cDNA-päiden (RACE) suoritettiin sisäkkäinen PCR-muodossa. HPV E7 alukkeita käytetään eteenpäin alukkeina (HPV16: ensimmäinen aluke: CGG ACA GAG CCC ATT ACA AT, toinen aluke: CCT TTT GTT GCA AGT GTG ACT CTA CG, HPV18: ensimmäinen aluke: TAG AAA GCT CAG CAG ACG ACC, toinen aluke : ACG ACC TTC GAG CAT TCC AGC AG) ja sovitin aluke on komplementaarinen linkkeri-sekvenssin CDS-aluketta ensimmäisen käänteisaluketta ja CDS Primer toiseksi sisäkkäistä aluketta.

APOT määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [6] pieniä muutoksia osalta käytetty aluke. Käänteinen aluke ensimmäisen PCR käsittää sekvenssin 5′-AAG CAG TGG TAA CAA CGC A-3 ’, sisäkkäisiä PCR-aluke sekvenssi 5′-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CT-3’. Reaktioseos, joka sisälsi 20 mM Tris-HCl, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 200 uM dNTP: itä, 250 nM aluketta kukin ja 0,75 yksikköä rekombinanttinen Taq-polymeraasia (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA), saatettiin ensimmäinen denaturointivaihetta 5 minuutin ajan 94 ° C: ssa, mitä seurasi 30 sykliä denaturointi 94 ° C 30 sekuntia, alukkeen 30 s ja pidennys 72 ° C: ssa 2 min. Varten HPV16, hehkutus lämpötila 61 ° C ja 66 ° C: ssa ensimmäisessä ja toisessa PCR-, vastaavasti, käytettiin; varten HPV18, 61 ° C ja 68 ° C. Reaktio lopetettiin lopullinen pidennysvaiheen 72 ° C: ssa 6 min. Kaksi mikrolitraa ensimmäisen PCR käytettiin templaattina nested PCR-vaiheessa. Molemmat reaktiot suoritetaan 25 mikrolitran tilavuudessa. Monistustuotteet visualisoitiin 1% agaroosigeelielektroforeesilla. Tuotteet, jotka eroavat kooltaan suuria virus- transkripti (E6 * 1-E7-E1

VE4-E5) ovat ohjeellisia virus-solufuusio selostukset. APOT määritys on useita rajoituksia. Kasvain jossa integroitu HPV genomi on kopiointia ajatellen hiljainen ei paljasta ominaisuus virus-solu fuusio otteen ja näin ollen teki negatiivisiksi integraatiota. Lisäksi kokeessa ei välttämättä tunnista virus-solu-fuusion transkriptien läsnä on ylimäärä transkriptien peräisin episomaalisesta HPV-genomeja. Lopuksi, kasvain yhtenäiseen HPV-genomin jatkuu muodossa concatemer viruksen selostukset eivät saa käsittää solujen sekvenssit ja sen vuoksi voida erottaa episomiin johdettuja selostukset. Kaiken määrityksessä aliarvioi kasvainten määrä integroitu HPV-DNA.

Sequence Analyysit

Viral-solufuusio transkriptien leikattiin geelistä ja uuttamalla käyttämällä Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (AnalytikJena, Jena , Saksa). Eristetyt tuotteet sekvensoitiin (Seqlab, Göttingen, Saksa) ja integrointi lokuksessa määritettiin tietokantaan rinnastuksia käyttämällä National Center for Biotechnology Information (NCBI) ihmisen megaBlast työkalu ja University of California, Santa Cruz (USCS) genomin selain.

PCR

valitut näytteet (n = 13) on olemassa virus-solufuusio transkriptien varmistettiin PCR: llä käyttämällä viruksen ja solun integraatio alukkeita. PCR-monistus suoritettiin lopullisessa tilavuudessa 25 mikrolitraa, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI, 3 mM MgCI

2, 50 mM KCI, 200 uM dNTP: itä, aluke 400 nM kutakin ja 1,5 U Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA). PCR-reaktiot suoritettiin ensimmäisen denaturaatiovaiheen 94 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 45 sykliä denaturointi 94 ° C: ssa 15 sekuntia, pariutuminen 58-60 ° C: ssa (riippuen käytetyn alukeparin) 20 sekuntia ja pidentyminen 72 ° C: ssa 30 sekuntia.

In Silico Analyysit

kromosomikartoitus viruksen-solufuusio selostukset ja suhteuttaa HPV integrointi hauras sivustoja ja miRNA, University of California, Santa Cruz (UCSC) genomin selain (hg19) ja Map Viewer (Build 37,3) ja National Center for Biotechnology Information (NCBI) käytettiin. Kaikki tunnetut miRNA sekvenssit lueteltu miRNA rekisterin ”miRBase” (https://www.mirbase.org/) kanssa 1527 kirjaa (release 18) homo sapiens.

tutkinta Integration Loci Frequency

Voit selvittää taajuutta HPV yhdentymisen tiettyjä geenejä ja kuormittajat, julkaisemien tietojen Dall 2008 Ferber 2003 Kraus 2008 Matovina 2009 Peter 2006 Thorland 2003 Wentzensen 2002 ja 2004 ja Ziegert 2003 [3], [15 ], [17], [19], [20], [21], [53], [54], [55] sisällytettiin.

tukeminen Information

Jaksot S1.

Sekvenssirinnastukset homologisten alueiden.

doi: 10,1371 /journal.pone.0039632.s001

(DOC) B