Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) toimivat transkription sääntelyviranomaisten ja pelata keskeisiä rooleja karsinogeneesissä. Mukaan miRNA kohde tietokantoja, yksi miRNA voidaan säädellä monia geenejä tavoitteensa, kun taas yksi geeni voidaan kohdistaa monet miRNA. Nämä havainnot osoittavat, että suhteita miRNA ja niiden tavoitteita voi olla yksi-yhteen. Kuitenkin monet raportit ovat kuvanneet vain yksi-yhteen, yksi-useita tai useita-yhteen suhde miRNA ja sen kohdegeenin ihmisen syövissä. Näin ollen on tarpeen määrittää, onko yhdistelmä joidenkin miRNA säätelisi useita tavoitteita ja osallistuvat syövän synnyn. Löytää joitakin ryhmiä miRNA jotka voivat synergistisesti säädellä tavoitteensa ihmisen mahasyövän (GC), me uudelleen analysoitiin edellisessä miRNA ilmaisun array tietoja ja totesi, että 50 miRNA oli säädelty käsittelemällä 5-atsa-2′-deoksisytidiini in GC solulinjassa. ”TargetScan” miRNA kohdetietokannassa ennusti, että jotkut näistä miRNA on yhteisiä kohdegeenien. Olemme myös viittasi GEO tietokantaan ilmentämiseen näistä yhteisistä kohdegeenien ihmisen GC, jotka saattavat liittyä mahasyövän. Tässä tutkimuksessa kartoitettiin kahden miRNA yhdistelmiä, miR-224 ja -452 sekä miR-181C ja -340. Yli-ilmentyminen molempien miRNA yhdistelmien dramaattisesti alassäädetty niiden kohdegeenien,

DPYSL2

ja

KRAS

, ja

KRAS

ja

MeCP2

, vastaavasti. Nämä miRNA yhdistelmät synergistisesti vähentynyt soluproliferaatiota transfektoitaessa. Lisäksi olemme paljasti, että nämä miRNA olivat alassäädetty kautta promoottori hypermetylaation GC soluissa. Siten on todennäköistä, että suhteita miRNA ja niiden tavoitteet eivät ole yksi-yhteen, vaan useita-to-useita in GC, ja että nämä monimutkaiset suhteet voivat liittyä mahasyövän.

Citation: Hashimoto Y, Akiyama Y, Yuasa Y (2013) Multiple-to-Multiple väliset suhteet MikroRNA ja kohdegeenien mahasyövän. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10,1371 /journal.pone.0062589

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 14 joulukuu 2012; Hyväksytty: 24 maaliskuu 2013; Julkaistu: 08 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Hashimoto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta A3 Foresight Program Japan Society for Promotion of Science (JSPS) (YY), ja tutkimusapurahoja että JSPS nuorten tutkijoiden (YH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA), luokka pienet ei-proteiini-koodaavat RNA: t, on havaittu olevan uudenlainen geeni säädin, jotka sitoutuvat 3′-alueet (UTR: t) ja kohde-mRNA: n, mikä on johtanut in mRNA: n hajoamisen tai saarto mRNA käännös [1]. On yleisesti tunnettua, että miRNA muutoksia, jotka liittyvät kasvaimen kehittymisen [1]. Mukaan miRNA kohde tietokantoja, yksi miRNA voidaan säädellä monia geenejä tavoitteensa, kun taas yksi geeni voidaan kohdistaa monet miRNA. Kuitenkin lukuisat tutkimukset paljastivat one-to-one suhde miRNA ja sen kohdegeenin. On myös raportoitu, että useita tai klusterin miRNA yhteistoiminnallisesti säätelevät geenin, joka liittyy syövän synnyn [2] – [4]. Toisaalta, useita geenejä on kohdistettu yhden miRNA [3], [4]. Jopa useita-to-useita suhteita miRNA ja tavoitteet on raportoitu käyttäen laskennallisia analyysejä [5], [6]. Kuitenkin on ollut vain muutamia papereita kokeellisesti validointi multiple-to-useita suhteita syöpäsoluissa.

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin ihmisen pahanlaatuinen sairaus ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti, joiden arvioitu miljoona uutta tapausta vuodessa [7]. Mahalaukun syöpien histologisesti luokitellaan kahteen päätyyppiin, suoliston ja hajanainen tyypit [8]. Diffuusi-tyyppinen GC on usein vaikeasti ja sillä on huono potilaan ennustetta. Viime aikoina olemme osoittaneet, että menetys Cdh1 ja Trp53 toiminnot indusoi hajanainen tyyppi GC hiirillä mallit [9]. Vaikka tämä havainto auttaa meitä kehittämään uusia ihmisen mahalaukun syövän hoitomuotoja, lisätutkimuksia molekyylitason mekanismit mahasyövän ovat tarpeen kehittää muita lähestymistapoja täsmähoitoihin.

Promoottori CpG-saarekkeen hypermetylaation on yksi yleisimmistä mekanismeista jonka tuumorisuppressorigeeneille inaktivoidaan ihmisen syövissä [10]. Viime aikoina on tullut ilmeiseksi, että jotkut miRNA ovat myös tavoitteita epigeneettiset hiljentäminen syövät [11]. Meidän ja muut ryhmät ovat aikaisemmin osoittaneet, että farmakologinen tai geneettinen häiriöitä DNA: n metylaation syöpäsolulinjoissa indusoi ylössäätöä huomattava määrä miRNA [12] – [15]. Nämä tiedot johtivat tunnistamiseen ehdokas kasvaimeen tukahduttava miRNA joiden hiljentäminen liittyy CpG-saarekkeen metylaation. Toistaiseksi metylaatio miR-124 perheen jäsenten on havaittu peräsuolen syövän ja kasvainten muissa elimissä [11]. Lisäksi miR-34b /c klusteri on tyypillinen CpG-saarekkeen, ja säätyy alas läpi usein metylaation peräsuolen ja syöpien [12]. Samoin huomasimme, että miR-181C metylaatio liittyy mahasyövän säätelemällä onkogeenisten geenien

KRAS

ja

NOTCH4

[13]. Down-regulation monien miRNA kautta metylointi samanaikaisesti esiintyy syöpäsoluissa, ja voi parantaa useita-to-useita suhteita miRNA ja tavoitteet.

Tässä tutkimuksessa vahvistaa useita-to-useita suhteita miRNA ja tavoitteiden syöpäsoluissa, osoitimme, että kaksi paria useita miRNA, miR-224 ja -452 sekä miR-181C ja -340, oli useita kohdegeenien ja synergistisesti laski solujen lisääntymistä säätelemällä tavoitteensa ihmisen GC soluissa.

tulokset

50 miRNA olivat säädellään ylöspäin GC Cell Line, KATO-III, kun 5-atsa-2′-deoksisytidiini hoito

tunnistaminen ehdokas miRNA että synergistisesti vaikuttavat heidän kohdegeenien, me uudelleen analysoitiin edellisessä microarray data (GEO liittymisen nro GSE16006) [13]. Me katsoi, että miRNA tasot olivat säädelty 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-CDR) käsittely kun verkko voimakkuudet erityisesti 3 paikkoja oli yli 1,5-kertainen. Lisäksi olemme myös valittu miRNA jonka keskiarvot todettiin kasvoi yli 3-kertaiseksi mikrosiruanalyysillä. Näiden pohjalta uudet kriteerit, huomasimme, että 50 miRNA olivat säädellään ylöspäin GC solulinjassa, KATO III (taulukko S1). Me vahvisti säätely ylöspäin 5 6 edustajan esiaste miRNA, eli miR-145, -148a, -152, -224 ja -340, kun 5-atsa-CdR käsittely RT-PCR (Kuva 1A).

(A) RT-PCR analyysejä esiasteen miRNA Kato-III solut käsittelemättömiä (U) tai käsitelty (A) 5-atsa-CdR.

GAPDH

mRNA: n ilmentymisen käytettiin latauskontrollina. (B) RT-PCR analyysejä esiasteen miRNA ihmisen GC solulinjoissa käsittelemätöntä (U) tai käsitelty (A) 5-atsa-CdR (5 mikromol /l), ja normaali mahan limakalvoja.

GAPDH

mRNA: n ilmentymisen käytettiin latauskontrollina. (C) Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi kypsän miR-224 ekspression 9 GC-solulinjojen ja CRC-solulinja HCT116. (D) Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi kypsän miR-224 ja -452 tasoilla KATO III-solujen käsittelemätöntä (U) ja käsiteltiin 0,2 umol /l 5-atsa-CDR (A), 0,3 umol /l TSA (T), tai näiden kahden yhdistelmä lääkkeiden (A /T). M, mock.

TargetScan Arvioitu yhteinen kohdegeenien ehdokasjoukon miRNA

onko vai ei epigeneettiseltä säännellyn miRNA on yhteisiä kohdegeenien, me etsinyt TargetScan tietokannan (versio 5.1) niiden yhteiset tavoitteet. Mukaan TargetScan, 50 miRNA voitaisiin luokitella 46 ryhmään niiden siemen sekvenssit. TargetScan osoitti myös, että nämä 46 ryhmät voivat kohdistaa 6460 geenejä. Näistä kohdegeenien, valitsimme joista 13 ilmentymistä oli kuitenkin lisääntynyt GC GEO tietokannassa (GEO liittymisen nro GSE2685) tai liittyvän mahasyövän (taulukko S2). Täällä me keskitytään neljään miRNA, miR-152, -181c, -224 ja -340, koska olemme jo raportoitu, että miR-181C on epigeneettiseltä säädellä vähentävästi GC [13] ja CpG saaret sijaitsevat ylävirran alueilla kolme muuta miRNA (kuvio 2A ja C, ja kuvio S1). Kuva 2a paljastaa myös, että miR-452 on ryhmitelty kanssa miR-224. TargetScan ennustaa, että viiden miRNA voi säädellä yhteisiä tavoitteita. Esimerkiksi

DPYSL2

(Dihydropyrimidinaasi-, kuten 2, joka tunnetaan myös nimellä romahtaa vastauksena välittäjänä proteiini 2,

CRMP2

) on kohdistettu miR-224, -452, ja -181c,

KRAS

by miR-224, -452, -181c, -340 ja -152, ja

MeCP2

(metyyli-CpG-sitova proteiini 2), jonka miR-181C ja -340, vastaavasti (kuvio 3).

(A), (C) Kaaviokuva miRNA ja niiden isäntägeenejä. Täytetyt laatikot edustavat eksonit vastaanottavan geenien ja tyhjiä laatikoita Merkitään transloimattomat alueet vastaanottavan geenejä. Taivutettu nuolet osoittavat transkription aloituspaikkoja isännän geenejä. Pystysuora nuolet osoittavat sijainnit miRNA. Pystysuorat paksut viivat osoittavat CpG sivustoja. Arrowheads osoittavat alueita tutkitaan MSP. (B), (D) MSP analyysit miR-224 ja miR-340, vastaavasti, GC solulinjoissa. Bändit ”Mt” kaistat ovat PCR-tuotteet saadaan metylaatiospesifistä alukkeita, ja ne, jotka ovat ”Un” kaistat saatiin unmethylation alukkeilla; PBL, perifeerisen veren lymfosyyttien. Ilmaisu on miRNA on ilmoitettu alla valokuvia MSP tuloksia.

Punaiset viivat, säilynyt sivusto; sininen viiva, säilynyt sivusto nisäkkäillä; keltaiset viivat, huonosti säilynyt sivusto.

Expression of miR-224, -452, -152 ja -340 Laskua DNA hypermetylaation GC Cell Lines

tarkasteltiin osallistumista epigeneettiset muutokset down-regulation miRNA. Ilmaisu Mir-224, -340 ja -152 lisääntyi 5-atsa-CdR hoito useissa GC solulinjoissa (kuvio 1 B). Me analysoitiin kvantitatiivisesti kypsä miR-224 ilmentymistä 9 GC solulinjoissa ja peräsuolen syöpä (CRC) solulinjassa. Ei ilmentyminen miR-224 havaittiin 7 10 syöpäsolun riviä (kuvio 1 C). Olemme myös analysoineet ilmaus muutoksen miR-224 /-452 klusteri KATO III käsiteltyjen solujen pienellä annoksella 5-atsa-CdR (0,2 umol /l), histonideasetylaasi- estäjä, trikostatiini A (TSA, 0,3 pmol /l), tai näiden kahden lääkkeitä. KATO-III solujen pieniannoksiseen 5-atsa-CdR hoito osoitti ajan sääntelyn miR-224 /-452 cluster, kun taas TSA ei yksinään aiheuta säätelyä ylöspäin. MIR-224 /-452 klusteri synergistisesti säädellään ylöspäin KATO III solujen yhdistetyn 5-atsa-CdR ja TSA käsittely (kuvio 1 D). Nämä tulokset osoittavat, että miR-224 ja miR-452 voidaan alassäädetty avulla DNA: n metylaation GC solulinjoissa kuin saman transkriptioyksikköön.

On raportoitu, että introni miRNA säännellään promoottori metyloinnin vastaanottavaan geenejä [14], [15]. Tulosten mukaan laskennallisen analyysin miR-224 /-452 cluster ja miR-340 sijaitsevat introni 6

GABRE

ja introni 2

RNF130

, vastaavasti, jotka molemmat sisältävät tiheä CpG saaria vain promoottorialueissa niiden isäntägeenejä (kuvio 2A ja C). Olemme tutkineet suhde ekspressiotasot näissä miRNA ja metylaatiostatuksen vastaanottavan geenien GC solulinjoissa MSP-analyysi. GC solulinjoja ilman miR-224 ilmaisu esillä ainoastaan ​​metylaatio signaaleja, kun taas ilmaisu-positiivisten solulinjojen osoitti vahvaa unmethylation kuviot (kuvio 2B). Samanlainen suhde havaittiin Mir-340 GC solulinjoissa (kuvio 2D). Nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen näiden miRNA GC solulinjoja voidaan vaientaa kautta promoottori metylaatio niiden isäntägeenejä.

epigeneettiseltä Säännellyt miRNA johtune- GC Cell Proliferation

Voit selvittää epigeneettiseltä säännelty miRNA ovat kasvaimen suppressoiva tai ei, arvioimme vaikutus 5-atsa-CDR siDICER1-transfektoiduissa KATO III ja DICER1 KO HCT116 (D1KO) soluja (kuvio 4A). Käsittelemätön KATO-III ja vanhempien HCT116-solut osoittivat hidastumisen lisääntymistä hoidon jälkeen 5-atsa-CdR. Toisaalta, in siDICER1-transfektoiduissa KATO III ja D1KO soluja, vaikutus 5-atsa-CdR hoidon soluproliferaatioon tuli heikko molemmissa tapauksissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikutus 5-atsa-CdR aleni alhainen tai nolla DICER1 soluja, ja että epigeneettiseltä säännelty miRNA tärkeä rooli GC ja CRC-soluja.

(A) kasvukäyrät KATO -III, HCT116 ja DICER1 KO HCT116-soluissa. KATO III-solut transfektoitiin 20 nmol /l siDICER1 tai salattu siRNA. Parittaiset t-testiä käytettiin vertaamaan arvot testi- ja kontrollinäytteiden. Arvo P 0,05 otettiin merkittäviä. (B) edustaja tulokset kohdegeenin ilmentymisen RT-PCR-analyysi.

Jotta analysoida suhde näiden miRNA ja 13 kohdegeenien esitetty taulukossa S2, transfektoimme KATO III solujen siDICER1 ja /tai käsiteltiin 5-atsa-CdR. Vaikka ilmentyminen 3 (

DPYSL2

,

KRAS

ja

MeCP2

) ja 13 geenien väheni sen jälkeen, kun 5-atsa-CdR hoitoa, näiden geenien ilmentymistä teki muutu 5-atsa-CdR käsittely ja sen jälkeen transfek- siDICER1 (kuvio 4B).

Combinational transfektio miR-224 ja -452 Tukahdutettu GC Cell Proliferation

transfektoitu GC-solulinjoissa miR-224 ja /tai -452 jäljittelee edustajana miRNA klustereita, tai negatiivinen kontrolli, ja suoritetaan sitten veteen ratkaista tetratsolium-8 (WST-8) määrityksillä. Seitsemänkymmentä kaksi tuntia transfektion jälkeen, havaitsimme, että ektooppinen ekspressio miR-224 tai -452 esti kasvua kahden solulinjan, KATO III ja AGS (kuvio 5A). Erityisesti, monimuotoiset transfektio miR-224 ja -452 jäljittelee laajasti vähensi kasvua kahden GC solulinjoissa (kuvio 5A).

(A) Proliferation määrityksiin, joissa WST-8. KATO III ja AGS-solut ympättiin 1 x 10

3 ja 1 x 10

4 solut 96-kuoppalevyille, vastaavasti, ja solut laskettiin 24, 48 ja 72 tuntia. Viljelmät suoritettiin kolmena kappaleena; baareja, SD. Ilmoitettu miRNA transfektoitiin molemmissa solulinjoissa joko yksinään tai yhdistelmänä. (B) RT-PCR-analyysi transfektion jälkeen miR-224 ja /tai miR-452. Ilmentyminen kohdegeenien analysoitiin 48h myöhemmin RT-PCR: llä. (C) DPYSL2 proteiinin ilmentymisen jälkeen ektooppinen ilmentyminen miRNA jäljittelee Kato-III ja AGS soluja. DPYSL2 proteiini analysoitiin 72h myöhemmin Western blottauksella. (D) RT-PCR-analyysi

DPYSL2

ilmentymistä KATO-III ja AGS soluja käsiteltiin joko salattu tai

DPYSL2

siRNA. (E) leviämisen määrityksiin transfektion jälkeen siDPYSL2 tai Salatut Kato-III ja AGS soluja.

MIR-224 /-452 Cluster Co-operatiivisesti Vähentynyt ilmentyminen

DPYSL2

ja

KRAS

tutkimiseksi, onko miR-224 /-452 klusteri on todella liittyy sääntelyyn

DPYSL2

ja

KRAS

, me analysoi ilmaus

DPYSL2

transfektion jälkeen KATO-III ja AGS solujen miR-224 /-452 cluster yksin tai yhdessä. Suoritimme RT-PCR ja Western blot -analyysit.

DPYSL2

ja

KRAS

mRNA-tasot laskivat transfektion jälkeen MIR-224 tai miR-452 matkivat (kuvio 5B). Mielenkiintoista on, että kyseessä on monimuotoiset transfektoimalla miR-224 ja -452, ilmentymistä näiden kohdegeenien oli edelleen alassäädetty (kuvio 5B). Alas-säätely DPYSL2 havaittiin myös proteiinitasolla kahdessa solulinjoissa (kuvio 5C). Tutkimme myös ekspressiotasot muiden viisi geeniä,

MeCP2, MYC, JUNB, MUC1

ja

SETDB1

, joita ei ole esitetty kohteina miR-224 tai -452 mukaan TargetScan. Kuten odotettua, ei ilmaisullisia muutoksia näiden viiden geenien löytyivät KATO-III-solujen transfektion jälkeen miR-224 tai -452 (kuva S2). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-224 ja -452 nimenomaan alassäädetty

DPYSL2

ja

KRAS

.

DPYSL2

liittyi GC Cell Proliferation

tutkittiin, mikä vaikutus knockdovvn

DPYSL2

, jonka osoitettiin olevan tavoite miR-224 /-452 klusteri, soluproliferaatioon. Transfektio

DPYSL2

siRNA vähensi selvästi tasot

DPYSL2

transkriptit (kuvio 5D), ja esti kasvua AGS ja KATO III-solujen 72 tunnin kuluttua pudotus on

DPYSL2

(kuvio 5E), mikä osoittaa, että DPYSL2 on onkogeenisessä toimintaa.

Combinational transfektio miR-340 ja -181c Tukahdutettu GC Cell Proliferation, ja aiheuttama Down-asetus

KRAS

ja

MeCP2

Expression

toisena esimerkkinä useita-to-useita suhteita MikroRNA ja kohde- geenejä, olemme analysoineet suhdetta miR-340 /-181c ja

KRAS /MeCP2 .

Kun miR-340 ja miR-181C transfektoitiin KATO-III solujen lisääntymistä oli synergistisesti alassäädetty kahdella miRNA (kuvio 6A). Onko vai ei epigeneettiseltä säännelty miR-340 ja miR-181C yhteistoiminnallisesti vaikuttaa tavoitteensa, olemme analysoineet mRNA tasot

KRAS

ja

MeCP2.

On RT-PCR-analyysi,

KRAS

ja

MeCP2

havaittiin alas-säädellä miR-340 ja miR-181C yksin, tai monimuotoiset transfektio Kato-III soluissa (kuvio 6B). Koska neljän geenien,

MYC, JUNB, MUC1

ja

SETDB1

osoittaen ei ennustettu sivustoja näiden kahden miRNA jonka TargetScan ilmaisu tasot eivät muuttuneet tässä tutkimuksessa. Edustavat tiedot on esitetty kuviossa 6B. Siten vaikutukset miR-340 ja -181c saattavat olla ominaisia ​​yhteisen kohdegeenien sekä miR-224 ja -452.

(A) Proliferation määrityksiin transfektion jälkeen miR-340 ja /tai miR -181c jäljittelee Kato-III soluissa. (B) muutokset geenien ilmentyminen jälkeen ektooppinen ilmentyminen miR-340 ja /tai miR-181C.

Expression ja metylaatiostatuksen miR-224 ja -340 Alkeisyhdistyksessä GC asioissa

Tutkimme metylaatiostatuksen miR-224 ja -340 perusterveydenhuollossa GC tapauksissa. Metyloidut malleja miR-224 havaittiin 15 26 (57,7%) ensisijainen GC kudoksiin (kuvio 7A ja taulukko 1). Pariksi ei-syöpä mahalaukun limakalvon tuskin näytteillä mety- miR-224. Seuraavaksi määrällisesti tutki miR-224 tasoilla ensisijainen GC kudosten ja vastaavien ei-syöpä limakalvon by TaqMan RT-PCR. Merkittävä väheneminen miR-224 ilmentyminen GC kudoksissa havaittiin metylaatio-positiivisten syöpätapausta verrattuna in metylaatiospe- kielteisiä ja ei-syöpä mahan limakalvojen (kuvio 7C).

edustaja tulokset miR-224 ( A) ja miR-340 (B) MSP analyysit ensisijainen GC kudoksissa. Bändit ”Mt” kaistat ovat PCR saadut tuotteet metylaatiospesifistä alukkeita, ja ne, jotka ovat ”Un” kaistat saatiin unmethylation-alukkeita. ”Ca ’ja’ N ’merkitsevät ensisijainen GC ja pariksi ei-syöpä kudoksiin, vastaavasti. ”F” ja ”M” tarkoittavat naisen ja miehen. Musta tähdet osoittavat näytteitä, joissa poikkeavaa hypermetylaatiota CpG-saarekkeiden havaittiin. (C) vertailu miR-224 metylaatiostatuksen ja miR-224 tasot mahan kudoksissa. Suhteelliset tasot miR-224 ilmentymistä mahalaukun kudoksissa määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR ja sitten verrataan miR-224 metylaatiostatuksen mahalaukun kudoksissa: N miR-224 Un (ei-syöpä ilman miR-224 metylointi; n = 20), Ca miR-224 Un (GC kudokset ilman miR-224 metylointi; n = 10), ja Ca miR-224 Mt (GC kudoksiin miR-224 metylointi; n = 15). Kahden otoksen t-testi suoritettiin tutkia eroa kahden ryhmän välillä. (D) vertailu miR-224 metylaatiostatuksen ja

DPYSL2

mRNA tasot GC kudoksissa. Suhteelliset tasot

DPYSL2

ilmentymistä mahan kudoksissa määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR, normalisoitu siitä

GAPDH

, ja sitten verrataan miR-224 metylaatiostatuksen Mahan kudoksissa: N miR-224 Un (ei-syöpä ilman miR-224 metylaatio, n = 6), Ca miR-224 Un (GC kudokset ilman miR-224 metylaatio, n = 8), ja Ca miR-224 Mt (GC kudoksen miR -224 metylaatio, n = 7). Laatikot osoittavat 25. ja 75. prosenttipisteet, vaakasuorat viivat sisällä laatikot osoittavat medians ja palkit osoittavat 10. ja 90. prosenttipisteet. NS, ei merkittävää.

analysoitava tarkemmin

DPYSL2

mRNA-tasot verrattuna metylaatiostatuksen miR-224 GC kudoksissa: GC kanssa miR-224 metylointi (Ca miR-224 Mt), GC jossa miR-224 unmethylation (Ca miR-224 Un), ja ei-syöpä kudoksiin unmethylation (N miR-224 Un).

DPYSL2

mRNA tasolla ”Ca miR-224 Mt” ryhmässä oli merkittävästi suurempi kuin vuonna ”N miR-224 Un” ja ”Ca miR-224 Un” ryhmiä, p = 0,049 ja p = 0,035, vastaavasti (kuvio 7D). Täten on olemassa korrelaatio metylaatiostatuksen miR-224 ja

DPYSL2

ilmentymistä GC kudoksissa.

miR-340 metylaatio taajuus oli suhteellisen pieni ensisijainen GC testatuissa kudoksissa (4 26, 15,4%) (kuvio 7B ja taulukko 1), kun taas yksikään 26 pariksi ei-syöpä mahalaukun limakalvon näytteillä näennäinen metylaation Mir-340. Kuten miR-152 metylointianalyysi yritimme kolme alukesarjoista suunniteltu ylävirran alueelta miR-152 sisältävä CpG-saarekkeiden (kuva S1), mutta mikään niistä ei täysin sovitetun miR-152 lausekkeen MSP analysoi (tuloksia ei ole esitetty).

keskustelu

Vaikka on raportoitu, että ilmaisu joidenkin miRNA on vähentynyt useissa syövissä kautta DNA: n metylaatio, useimmat raportit kuvattu, että suhde poikkeava ekspressio miRNA ja sen kohdegeenien oli one-to-one, yksi-useita tai useita-yhteen. Tutkia mahdollisuus useiden-to-useita suhteita miRNA ja tavoitteiden syöpäsoluissa, olemme keskittyneet kahden yhdistelmiä miRNA GC soluissa, MIR-224 /-452 klusteri, ja miR-181C ja -340, tässä tutkimuksessa . Huomasimme, että kaksi miRNA, miR-224 ja -452 sekä miR-181C ja -340, oli useita kohdegeenien,

DPYSL2

ja

KRAS

, ja

KRAS

ja

MeCP2

vastaavasti ja synergisesti laski proliferaatiota in ihmisen GC solulinjoissa. On huomattava, että onkogeeni,

KRAS

[16], havaittiin kohdistetaan neljä miRNA, vaikka ehdokas sitoutumiskohdat neljästä miRNA ovat erilaisia ​​3′-UTR

KRAS

(TargetScan). Olemme aiemmin raportoitu että miR-181C alassäädetty

NOTCH4

liian [13]. Siten useita-to-useita suhteita miRNA ja tavoitteita merkitty paitsi tietokannan analyysien lisäksi myös transfektiokokeis- liittyy ihmisen soluja.

miR-224- ja /tai -340-ilmentymisen-negatiivinen GC solulinjoissa näytteillä hypermetylaation signaalien MSP-analyysi ja ilmentyminen miR-224 ja -340 palautettu demetyloivan aineella. Lisäksi hypermetylaatiota miR-224 ja -340 havaittiin useammin perusasteen GC kuin vastaava noncancerous limakalvoja. In miR-224 metylointi-positiivisia tapauksia, ilmentyminen miR-224 oli huomattavasti pienempi kuin metylaatiospe- kielteisiä. Nämä tiedot viittaavat voimakkaasti siihen, että poikkeava DNA: n metylaatio on yksi tärkeimmistä mekanismeista alas-säätely miR-224 ja -340 GC soluissa.

Osoitimme, että esto miRNA käsittelyä siDICER1 transfektiolla tai käyttämällä DICER1 Knockout soluja vähentynyt vaikutus 5-atsa-CdR, eli laski solujen lisääntymisen ja alas-säätely kohdegeenien, GC ja CRC soluja. On raportoitu, että runsaasti DICER1, entsyymin, joka katalysoi viimeinen vaihe miRNA kypsymisen, on suoraan yhteydessä kasvaimen etenemistä [17]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että poikkeava sääntely miRNA kypsymisen edistää GC ja CRC muodostumista.

Huomasimme, että miR-224 /-452 klusteri poikkeavasti säädellä vähentävästi GC kautta hypermetylaation. Poikkeava ilmentyminen miR-224 on myös raportoitu muissa kasvaimissa. Expression of miR-224, anna-7f ja miR-516a on vähentynyt munasarjasyövän, ja ne säätelevät synergisesti ilmentymistä kallikreiinin liittyvien peptidaasi 10 (KLK10) [18]. miR-224 on säädellä vähentävästi metotreksaattia kestävä CRC solulinjoissa verrattuna herkkien solujen [19]. Täällä paljasti myös, että metylaatiostatuksen miR-224 korreloi

DPYSL2

tasolla ihmisen GC. Yhdessä miR-224 on tärkeä rooli kasvainten heikentävän miRNA GC sekä useissa muissa syövissä. Sen sijaan miR-224 säädellään ylöspäin maksasolukarsinoomat [20] ja medulloblastoomien [21] verrattuna normaalissa kudoksessa. Siten tarvitaan lisätutkimuksia selventämään roolia miR-224 karsinogeneesissä.

tutkineet yhteistä tavoitteet epigeneettiseltä alassäädetty miRNA.

DPYSL2

osoitettiin alas-säädellä miR-224 ja -452. DPYSL2 tärkeä rooli perustettaessa hermosolujen polariteetin [22]. DPYSL2 on mukana myös väyliä, jotka säätelevät leviämisen ei-hermosolujen kautta fosforylaation säätelyproteiineja. DPYSL2 läpi dynaaminen fosforylaatiota muutoksia vastauksena yhteyttä eston aiheuttama liikkumattomuus ja hyperfosforylaatiota DPYSL2 tapahtuu kasvain [22]. Vaikka rooli DPYSL2 on GC ei ole selvää, meidän siRNA-pohjainen knockdovvn DPYSL2 ekspression indusoi vähentäminen leviämisen kahden GC solulinjoissa, mikä viittaa siihen, onkogeeninen aktiivisuus DPYSL2.

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että multiple-to-useita suhteita miRNA ja kohdegeenien todella olemassa GC. On todennäköistä, että poikkeava metylaatio vähentää ilmentymistä useiden kasvaimeen suppressoiva miRNA, kuten miR-224, -452, -340 ja -181c, joka sitten aiheuttaa yli-ilmentyminen useiden onkogeenisten geenien, kuten

KRAS

DPYSL2

, ja

MeCP2

. Nämä epänormaalit useita-to-useita suhteita miRNA ja tavoitteiden olisi yksi tärkeimmistä mekanismien mahasyövän. Sen vuoksi on hyvin mahdollista, että epigeneettisiä lääkkeet voivat normalisoida ilmentyminen ei ainoastaan ​​kasvain-suppressoiva geenejä, vaan myös useita kasvaimen heikentävän miRNA, mikä laskee epänormaalin multiple-to-useita suhteita miRNA ja tavoitteet, ja voi siten tulla erinomainen lääkeaineet syöpää vastaan.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kirjallinen suostumus saatiin kaikissa aineissa, ja eettinen komitea Tokion Lääketieteen ja hammaslääketieteen University School of Medicine hyväksyi tämän tutkimuksen.

solulinjat ja Kudosnäytteiden

Tutkimme 9 GC solulinjoja (KATO-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 ja GCIY), 2 CRC solulinjoja (HCT116 ja

DICER1

tyrmätä HCT116 [23]), ja 26 ensisijainen GC tapauksissa. MKN45, MKN74, TGBC11TKB ja GCIY ostettiin RIKEN solupankki ja KATO-III ja AGS olivat ATCC (American Type Cell Collection). HSC59, HSC43 ja HSC58 saatiin tri Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. KATO III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 ja HSC58 kasvatettiin RPMI 1640, ja AGS, TGBC11TKB, GCIY ja kaksi CRC-solulinjoja Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa, minimal essential keski- tai McCoyn 5A, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumi. Kirurgisesti resektoitiin näytteet 26 ensisijaisen GC potilaat satunnaistettiin saatu Affiliated sairaala School of Medicine, Tokio Lääketieteen ja hammaslääketieteen University.

In silico Analysis

viittasi GEO tietokantaan miRNA ja geeniekspressioprofiilien (GEO liittymisen nro GSE16006 ja GSE2685). Käytimme myös miRNA kohdetietokannassa ”TargetScan”.

Lääkehoito Solujen ja RNA

demetylaation tutkimuksia varten solut päivittäin käsiteltiin 5 mikromol /l 5-atsa-CdR (Sigma- Aldrich, St Louis, MO) 72 tuntia. Olemme myös käsitellyt solut 0,3 mikromol /l TSA yksin, ja yhdistelmä 0,2 mikromol /l 5-atsa-CdR ja TSA. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) tai miRNeasy mini -kittiä (Qiagen, Hilden, Saksa).

Quantitative Reaaliaikainen Reverse Transcription-polymeraasiketjureaktio

reaaliaikainen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) analyysit tehtiin käyttämällä StepOne real-time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), EagleTaq Master Mix ROX (Roche, Mannheim, Saksa), joka on TaqMan käänteistranskriptio kit (Applied Biosystems), ja TaqMan miRNA määritykset (Applied Biosystems), mukaan valmistajan ohjeiden. Ilmentymistasojen miRNA laskettiin perustuen määrästä kohde miRNA että verrattuna RNU6B kontrollina normalisoimiseksi alkupanos kokonais-RNA.

metylointi Analyysi

bisulfiittikäsittelyn DNA oli suoritettiin Methylamp (Epigentek, Brooklyn, NY). Metylaatiospesifinen polymeraasiketjureaktio (MSP) analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [26]. Alukkeen sekvenssit ja PCR-tuotteen koot on esitetty taulukossa S3.

Synteettinen miRNA transfektio

KATO III ja AGS-solut transfektoitiin esiaste Molecule jäljittelee miR-224, -452, -340 tai -181c tai salattu sekvenssi miRNA (Sigma), jolloin saatiin lopullinen pitoisuus 25-50 nmol /l käyttämällä -elektroporaattoria, Neon (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tällä 24-72 h transfektion jälkeen, solut kerättiin RT-PCR: llä tai Western blot -analyysillä.

proliferaatiomääritystä

miR-matkivat-transfektoiduissa KATO III ja AGS solut maljattiin 1 × 10

3 tai 1 x 10

4 solua kuoppaa kohti 96-kuoppalevyillä. Solujen lisääntyminen arvioitiin päivinä 1-4 transfektion jälkeen määrittämällä solujen lukumäärän soluproliferaatioon reagenssilla WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Mashikimachi, Japani), mukaan valmistajan ohjeiden.

miRNA Target Prediction ja Western-blottaus

ennustettu tavoitteet miRNA ja kohdealuei- analysoitiin TargetScan. MRNA-ekspressiotasot ennustetun tavoitteiden väliaikaisesti transfektoiduissa soluissa analysoitiin 24 h transfektion jälkeen RT-PCR: llä. Western blot-analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [26]. Ensisijainen aine oli kanin anti-DPYSL2 (1:500, # 9393, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Käytimme hiiren anti-α-tubuliinin (1:1000, sc-8085, Santa Cruz Biotechnology) sisäisenä kontrollina Western blottauksella. Toissijainen vasta-aineita käytettiin alkaliseen fosfataasiin konjugoitua anti-kani-IgG ja anti-hiiri-IgG (1:2000, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).