Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen maksasolusyövän (HCC) edustaa biologisesti aggressiivinen ja Chemo kestävä syöpiä. Johtuen pieniaffiniteet- apoptoottisten tekijä Mcl-1 BH3 jäljittelevää lääke ABT-737 ei aiheuta voimakkaita syöpää tappaminen toimintaa erilaisissa syövän mallien mukaan lukien HCC. Nykyinen tutkimus osoitti, että yhdistämällä ABT-737 ja Celastrol synergistisesti tukahdutti HCC solujen lisääntymistä, ja indusoi apoptoosin, joka oli mukana kanssa kaspaasi kaskadin ja vapautumista sytokromi C mitokondrioita. Lisäksi tutkimus osoitti, että vahvistettu Noxa aiheuttama Celastrol oli avaintekijä synergian, koska Sirna välittämää knockdovvn Noxa ilmentymisen HCC-soluissa johti laski apoptoosin ja heikennettyjä antiproliferatiivisia yhdistelmän vaikutuksista. Lisäksi Tutkimuksemme purkaa, että kun Celastrol altistuminen, aktivointi endoplasmakalvoston (ER) stressi, sanottuna eIF2α-ATF4 reitin pelataan välttämätön rooli aktivointi Noxa, joka oli validoitu se havainto, että ehtyminen ATF4 merkittävästi kumottu Noxa korkeutta Celastrol. Meidän havainnot korostavat uutta signalointireitin, jonka kautta Celastrol lisäävät Noxa ilmaisun, ja ehdottaa mahdollista käyttöä ATF4 välittämää sääntely Noxa lupaavana strategiana, jolla parannetaan syövän vastaisen toiminnan ABT-737.

Citation: Zhu H, Yang W, hän Lj, Ding Wj, Zheng L, Liao Sd, et al. (2012) upregulating Noxa ER Stress, Celastrol Kiinnostavuus Tehostemateriaalit Anti-Cancer vaikutusta yhdessä ABT-737 Human maksasyövän solut. PLoS ONE 7 (12): e52333. doi: 10,1371 /journal.pone.0052333

Editor: Tetsuo Takehara, Osakan yliopisto Graduate School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 07 elokuu 2012; Hyväksytty: 12 marraskuu 2012; Julkaistu: 20 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Zhu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitollisena tunnustavat taloudellisen tuen Fundamental Research rahastojen Central yliopistot (nro 2011FZA7008) ja Zhejiangin maakunnan Natural Science Foundation of China (nro Y2110933). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ABT-737 on voimakas pienimolekyylinen estäjä, joka on suunnattu Bcl-2-säännelty apoptoosireitin, joka toimii Bad kaltainen BH3 jäljittelevää. Se selektiivisesti rajaa Bcl-2, Bcl-XL: n ja Bcl-w: n, mutta ei Mcl-1 ja Bfl-1 /A1. Prekliinisissä tutkimuksissa, ABT-737 on osoittanut yhden aineen vaikutus erilaisia ​​leukemiaa [1], lymfooma [2], ja pienisoluinen keuhkosyöpä [3]. Vaikka ABT-737: n on osoitettu olevan lupaava terapeuttinen aine, se ei todennäköisesti ole tehokas yksittäisenä aineena kiinteitä kasvaimia johtuu sen alhainen affiniteetti Mcl-1 ja korkeatasoinen Mcl-1 ilmentymisen syöpäsoluissa [4] – [7]. Tämä tekee etsintä yhdistelmästrategioista parantamiseksi ratkaisevaa nykyiseen hoitoon ABT-737 syöpää vastaan, joista kuuma kysymys on yhdistää ABT-737 muiden lääkkeiden kanssa, joilla on kyky moduloida Mcl-1. Aiemmissa tutkimuksissa, huomasimme, että gemsitabiini voisi lisätä ubikinaation ja myöhemmin hajoaminen Mcl-1, siis näytteillä synergistinen sytotoksisuuden kanssa ABT-737 useissa syöpäsolujen [6]. Samoin GDC-0941-edistävät hajoamista Mcl-1 oli myös vastuussa sen synergistinen tappamista rintasyövän solujen ABT-737 [5]. Siksi muutos on Mcl-1 ilmentymisen käynnistäisi herkistymistä ABT-737 peruuttaa soluissa.

BH3-ainoa proteiini Noxa kykenee selektiivisesti vuorovaikutuksessa Mcl-1, vapauta Bak tai Bax maasta Mcl- 1 aktivoi mitokondrio apoptoosireittiä tai kohdistaa sen proteasomaalisten hajoaminen [5] – [8]. Koska sen tyypillinen ominaisuus, Noxa on korostettu tehokas tekijä kääntää vastustuskyky ABT-737, joka on aiheuttanut Mcl-1. Lucas KM et al osoitti, että yli-ilmentyminen Noxa voimakkaasti voitti ABT-737 resistenssin melanoomasoluissa [9]. Lisäksi Noxa indusoivia aineita on myös raportoitu herkistää syöpäsolut ABT-737, mukaan lukien Bortetsomibi [10], Fludarabiinin [11], Oksaliplatiini [12], jne. Viime aikoina, Dai Y et al osoittivat, että Celastrol, luonnollinen uute voimakkaiden syöpälääkkeen ominaisuuksia, voisi johtaa induktion Noxa ja pilkkominen Mcl-1 [13], joka herätti huomiomme tutkia vaikutuksia, kun yhdistää tämän aineen kanssa ABT-737, jonka syöpälääkkeen toiminta oli läheistä sukua Mcl -1.

Celastrol on farmakologisesti aktiivinen yhdiste alunperin tunnistettu perinteisen kiinalaisen lääketieteen Thunder of God Vine juuren uutteiden, ja on käytetty luonnollinen ratkaisu tulehdustiloja ja syöpähoidon vuosia [14]. Koska HSP90 estäjä, Celastrol häiritsi HSP90-Cdc37 vuorovaikutus vastaan ​​haimasyöpäsoluissa [15], [16], ja määräsi vaikutus ER-stressin vastaus [17]. Lisäksi Celastrol voivat aiheuttaa apoptoosin aktivoimalla Noxa ja moduloiva Mcl-1 [13], yksityiskohtaisia ​​mekanismeja ei tunneta, ja mahdollinen sovellus jäävät hämäräksi.

Tässä tutkimuksessa tutkimme mahdollisesti synergistinen kyvyt ABT- 737 yhdessä Celastrol ihmisen maksasyövän solulinjoja, joissa lähinnä satama korkea Mcl-1-proteiinin ilmentyminen [18]. Yhdistelmä-indeksi (CI) arvot antiproliferatiivisia ominaisuuksia kahden ihmisen maksasyövän solulinjoja Bel-7402 ja HepG2 oli alle 0,7, mikä osoittaa synergian yhdistelmä ABT-737 ja Celastrol. Lisäksi Celastrol suuresti voimistaa ABT-737-välitteistä apoptoosia in Bel-7402 ja HepG2-soluissa stimuloimalla Noxa ilmaisun ja sen vuorovaikutus Mcl-1, joka oli riippuvainen induktioon ER stressin vastaus, erityisesti aktivointi ATF4. Yleensä Tutkimuksessamme ensiksi määritetään synergiavaikutuksen ABT-737 plus Celastrol ihmisen maksasyövän soluja, avaaminen mahdollisuus yhdistää nämä kaksi agenttia kuten voimakas terapeuttinen yhdistelmä, ja ymmärtää, että aktivointi ER stressiä, joka johtaa manipuloinnista Noxa voisi toimi tehokkaana strategiana estää Mcl-1 ja siten lisätä syövän toimintaa ABT-737.

MTT määrityksiä käytettiin tutkimaan solujen lisääntymistä estävä toiminta ihmisen maksasyövän Bel-7402 ( A) ja HepG2 (B-solut). Soluja 96-kuoppaisille levyille altistettiin serial pitoisuudet ABT-737, Celastrol tai jatkuva-suhde seos näiden kahden 72 tuntia. Pitoisuudet sovellettu olivat 1,25-10 uM ABT-737, 0,16-1,25 pM Celastrol. Pitoisuus-vaste-käyrät kahden solulinjojen ABT-737, Celastrol ja yhdistelmä esitettiin. Kolme riippumatonta kokeet suoritettiin, ja keskihajonta oli edustettuna virhejanoina. Cl-arvot osoitettiin taulukossa 1.

Materiaalit ja menetelmät

1. Kemikaalit ja reagenssit

ABT-737 ostettiin Selleck Chemicals (Houston, TX). Celastrol syntetisoitiin professori Wei Lu (East China Normal University), jonka puhtaus on yli 99%. Sekä ABT-737 ja Celastrol liuotettiin dimetyylisulfoksidiin varastossa pitoisuutena 20 mM (DMSO). Ensisijainen vasta-aineita PARP, pro-kaspaasi-3, Bax, Bim, Bcl-x L, ubikitiini, Actin ja HRP-leimatun sekundaarisen anti-vuohi-anti-hiiri-anti-kani-vasta-aineet hankittiin valmistajalta Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); ensisijainen vasta-aineita pilkotaan-kaspaasi-3, Puma, sytokromi c, Bcl-2, Mcl-1, ATF4, Chop, p-eIF2α (Ser51), eIF2α, HSP70, p-ERK, ERK, ja CDK4 ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA); ensisijainen vasta-aineita Noxa hankittiin Calbiochem (Darmstadt, Saksa).

2. Cell Culture

Ihmisen maksasyövän solulinjoja Bel-7402 ja HepG2 ostettiin Shanghai Institute Biokemian ja solubiologian (Shanghai, Kiina) ja ylläpidetään 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa. Bel-7402-soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, ja HepG2-soluja Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia.

. Soluja käsiteltiin 10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol ja yhdistelmä 24, 48, 72 tuntia ja apoptoosi testattiin propidiumjodidivärjäys hajotettiin solujen tumat, analysoitiin virtaussytometrialla. B. Käsittelyn jälkeen 10pM ABT-737, 1,25 uM Celastrol ja yhdistelmä 72 tuntia, solut värjättiin DAPI ja noudatettava Leica DMI 400B Xuorescence mikroskoopilla. Soluja käsiteltiin 10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol ja yhdistelmä 24 h; C. lysaatit kerättiin ja immunobloted kaspaasi-3, pilkotaan kaspaasi-3 ja PARP vasta; D. Kaspaasi-3-aktiivisuus määritettiin käyttäen spesifisen substraatin Ac-DEVDPNA; HepG2-soluja käsiteltiin 10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol ja yhdistelmä 24 tuntia. E. Bel-7402 ja HepG2 solut värjättiin JC-1, sitten havaittiin Leica DMI 400B Xuorescence mikroskooppi; F. proteiinin tasot Bax, Bcl-2, Bcl-x L ja Mcl-1 HepG2 ja Bel-7402-soluja havaittiin Western blot analyysillä. Tiheys Proteiinijuovan määritettiin käyttämällä Bio-Rad Määrä One kuvantamisen ohjelmistoja; G. erottaminen sytosoliin suoritettiin. Sytosoliin analysoitiin, ja vapauttamaan sytokromi c arvioitiin western blotting-analyysi. Tulokset olivat samanlaisia ​​vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *,

p

0,05; **,

p

0,01.

3. Cell eloonläämismääritys

Solujen eloonjäänti arvioitiin MTT solunelinkykyisyysmääritys. Lyhyesti, eksponentiaalisesti kasvavia Bel-7402 ja HepG2-solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja viljeltiin yön yli 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa ennen hoitoa alttiina DMSO ajoneuvon, sarjanumero pitoisuudet ABT-737, Celastrol tai yhdistelmä 72 tuntia. Sitten soluja inkuboitiin MTT: tä (5 mg /ml, 20 ul /kuoppa) 4 tunnin ajan ja formatsaanisakka rakeet tuotetaan elävien solujen liuotettiin DMSO: hon. Absorbanssi 570 nm: ssä mitattiin käyttämällä Multiscan-spektri (Thermo Electron Corporation Marietta, OH). Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena kolmessa riippumattomassa kokeessa.

4. Apoptoosin analysointi DAPI Värjäys

Eksponentiaalisesti kasvavat Bel-7402 ja HepG2-solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja viljeltiin yön yli 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa ennen hoitoa DMSO ajoneuvon serial pitoisuudet ABT-737, Celastrol tai yhdistelmä 72 tuntia. Kerätyt solut pestiin kerran PBS: llä, inkuboitiin 0,1% Triton ja 0,1% DAPI huoneen lämpötilassa 3 minuutin ajan, pestiin sitten kahdesti PBS: llä ja kuvattiin Leica DMI 400B fluoresenssimikroskoopilla.

. Bel-7402-soluja käsiteltiin 10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol ja yhdistelmä 3, 6, 12 h. B. HepG2-soluja käsiteltiin with10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol 12, 24, 48 h. Sitten lysaatit kerättiin ja immunobloted kanssa NOXA, Bim, PUMA ja PARP-vasta-aineita.

5. Apoptoosin analysointi PI Värjäys

Eksponentiaalisesti kasvavat Bel-7402 ja HepG2-soluja ympättiin ja viljeltiin yön yli 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa ennen hoitoa DMSO ajoneuvon, sarjanumero pitoisuudet ABT- 737, Celastrol tai yhdistelmä 24 h, 48 h ja 72 h. Kerätyt solut pestiin kerran PBS: llä ja kiinnitettiin kylmällä 70% etanolilla -20 ° C: ssa vähintään 2 h. Kiinnitetyt solut pestiin kaksi kertaa PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 40 ug /ml RNaasi A: ta 37 ° C: ssa 30 minuuttia ja 10 ug /ml propidiumjodidia pimeässä huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Virtaussytometria tehtiin FACScan (BD Biosciences, San Jose, CA).

6. Määrittäminen mitokondrion kalvon Depolarisaatiospektrit

Eksponentiaalisesti kasvavat Bel-7402 ja HepG2-solut ympättiin, ja viljeltiin yön yli 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa ennen hoitoa DMSO ajoneuvon, sarjanumero pitoisuudet ABT-737 , Celastrol tai yhdistelmä 24 tuntia. Kerätyt solut pestiin kerran PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 10 ug /ml JC-1 (5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’- tetraethylbenzimidazolyl-arbocyanine jodidi). Jälkeen incubationat 37 ° C: ssa 20 minuutin ajan, solut pestiin kahdesti PBS: llä, sitten kuvata Leica DMI 400B fluoresenssimikroskoopilla tai analysoitiin virtaussytometrialla.

HepG2-solut transfektoitiin NOXA siRNA mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin with10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol ja yhdistelmä 48 tuntia. A. Lysaatit korjattu ja immunobloted kanssa NOXA vasta-aineella. B. Lysaatit korjattu ja immunobloted kanssa katkaistiin kaspaasi-3 ja PARP-vasta-aineita. C. suhteet pilkkoa-kaspaasi 3 /β-Actin. D. suhteet pilkkoa-PARP /Actin. Tiheys Proteiinijuovan määritettiin käyttämällä Bio-Rad Määrä One kuvantamisen ohjelmistoja. E. Solujen hengissäsäilymisosuudet havaittiin MTT: llä. *,

p

0,05; **,

p

0,01.

7. Western Blot-analyysi

Bel-7402 ja HepG2-solut otettiin talteen, pestiin kerran PBS: lla, ja suspendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,5% deoksikolihappo happoa, 0,02% natriumatsidia, 1% NP-40, 2,0 ug /ml aprotiniinia, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi) jäillä 30 minuutin ajan. Lysaatteja sentrifugoitiin 13000 rpm: llä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pitoisuudet koko lysaatin proteiinia havaittiin standardin Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad, San Diego, CA). Western blot-analyysi, 40-100 ug proteiineja elektroforeesilla SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Pierce Chemical) ja tutkittiin primaarisilla vasta-aineilla ja sen jälkeen piparjuuriperoksidaasiin kytketty toissijaisen vasta-aineita 1:5000 laimennus. Proteiinit saatiin näkyviin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (ECL) plus- Amersham Biosciences (UK).

8. Mittaaminen kaspaasi-3 Activity

kaspaasi-3 mitattiin pilkkomalla selektiivinen alustan asetyyli-Asp-Glu-Val-Asp P-nitroanilidi (Ac-DEVDPNA) (Beyotime Biotekniikan instituutti). Solut hajotettiin ja proteiinipitoisuus supernatanteista mitattiin Bradfordin menetelmällä ja yhtä suuret määrät proteiineja (10 ui) inkuboitiin kokonaistilavuudessa 100 ui, joka koostuu 80 ul: havaitsemisen puskuria. Reaktio aloitettiin lisäämällä kaspaasi-3-substraatteja Ac-DEVD-PNA (10 ui). Kun oli inkuboitu 60 min 37 ° C: ssa, pilkkoutumisen alustan havaittiin käyttämällä Multiscan-spektri (Thermo Electron Corporation Marietta, OH) aallonpituudella 405 nm. Toiminta kaspaasi-3 ilmaistiin muutoksina DEVDase aktiivisuuden.

9. Detection of sytokromin c vapautumiseen

Solut kerättiin, pestiin kerran PBS: llä, ja suspendoitiin uudelleen uuttopuskuriin [20 mmol /L HEPES (pH 7,5), 1,5 mmol /l MgCl

2, 10 mmol /L KCI, 1 mmol /l EGTA: a, 1 mmol /l EDTA: a, 250 mmol /l sakkaroosia, 0,1 mmol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja 1 mmol /l DTT: tä], ja homogenisoitiin käyttäen microhomogenizer. Homogenaatteja sentrifugoitiin 750 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sitten supernatantit sentrifugoitiin 10000 x g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja jäljelle jäävä supernatantit pidettiin sytosoliin osa. Kun Western blot-analyysi, anti-sytokromi c-vasta-aineita (Cell Signaling Technology) käytettiin havaittiin mitokondrioiden vapautumisen sytokromi c.

hoidon jälkeen 10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol ja yhdistelmä 24 tuntia , solu-uutteet immunosaostettiin Mcl-1 (A) tai Noxa (B) vasta-aineita. Immunosaostumat alistettiin SDS-PAGE: lla ja tutkittiin Noxa (A) tai Mcl-1 (B) vasta-aineita. Lysaatit kerättiin ja immunobloted kanssa Mcl-1, Noxa ja Actin vasta-aineita.

A ja B. Bel-7402 ja HepG2-soluja käsiteltiin 1,25, 2,5, 5 uM Celastrol 3 tuntia, lysaatit kerättiin ja immunobloted Hsp70, p-ERK, CDK4 ja UB vasta-aineita. C. HepG2-soluja käsiteltiin 1,25, 2,5, 5 uM Celastrol 3 tuntia, lysaatit kerättiin ja immunobloted p-eIF2a ja ATF4. D. HepG2-soluja käsiteltiin 1,25 uM Celastrol tai plus 10 uM ABT-737: ssa 12 tuntia. Noxa mRNA-tasot määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä suhteessa GAPDH sisäisenä kontrollina. E. HepG2-solut transfektoitiin ATF4 siRNA mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen lysaatit kerättiin ja immunobloted kanssa ATF4 vasta-aineella. F. Soluja käsiteltiin 1,25 uM Celastrol 24 tuntia. Noxa mRNA-tasot määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä suhteessa GAPDH sisäisenä kontrollina. Tulokset olivat samanlaisia ​​vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *,

p

0,05.

10. Käänteinen transkriptio-PCR-määritys

Kokonais-RNA valmistettiin käyttämällä Trizol, saostetaan isopropyylialkoholia ja huuhdeltiin 70% etanolilla. Yhden juosteen cDNA valmistettiin puhdistetusta RNA: sta käyttäen oligo (dT) pohjustus (Thermoscript RT kit, Invitrogen), jota seurasi SYBR-Green reaaliaikainen PCR (Qiagen). Alukkeet olivat seuraavat: Noxa, 5′-ATGAATGCACCTTCACATTCCTCT-3 ’, 5′-TCCAGCAGAGCTGGAAGTCGAGTGT-3′ [19]; ​​GAPDH, 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ’, 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′ [20]. Suhteellisten ekspressiotasojen kohdegeenien normalisoitiin kontrolliin GAPDH. Havaitsemiseksi Xbp1 silmukoinnin, käytetyt olosuhteet käänteistranskriptio-PCR olivat seuraavat: 10 minuuttia 25 ° C: ssa, 60 min 42 ° C: ssa ja 15 min 72 ° C: ssa. CDNA tehtiin PCR-monistus käyttäen seuraavia eteenpäin ja taaksepäin-aluke: Xbp1, forward-aluke: 5’-CCTTG TAGTTGAGAACCAGG-3 ’ja reverse-aluke: 5′-GGGGCTTGGTATATATGTG G-3’ [21]. PCR-tuotteet erotettiin 1,0% agaroosigeelillä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä. Geelit valokuvattiin käyttäen Gel DOC 2000 kuva-analysaattorilla (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

11. Hiljentäminen Gene Expression kanssa Sirna (siRNA) B

Eksponentiaalisesti kasvavat solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (4 x 10

4 /kuoppa) ja viljeltiin yön yli 5% CO

2 atmosfäärissä 37 ° C: ssa. Sitten väliaine korvattiin Opti-MEM I Reduced Serum Media (GIBCO), joka sisälsi 20,0 nM Mcl-1 tai ATF4 siRNA (GenePharma, Kiina) ja Oligofectamine reagenssia (Invitrogen Corporation) valmistajan suositusten mukaisesti. Tunnetta sekvenssit siRNA olivat seuraavat: NOXA: 5′-UCAGUCUACUGAUUUACUGG-3 ’[22]; ATF4: 5’-GCGUAGUUCGCUAAGGUGAdTdT-3 ’[23]. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut otettiin talteen ja käsiteltiin DMSO: lla ajoneuvon, sarjanumero pitoisuudet ABT-737, Celastrol tai yhdistelmänä.

12. Immunosaostus

Solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen universaali lysis /immunosaostuksella-puskuria (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 25 mM NaF, 25 mM β-glyserofosfaatti, pH 7,5, 0,1 mM natriumortovanadaattia, 0,1 mM PMSF: a, 5 ug /ml leupeptiiniä, 0,2% Triton X-100, 0,5% Nonidet P-40), jäillä 30 minuutin ajan. Lysaatteja sentrifugoitiin 13000 rpm: llä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. 300 ug solun proteiinit puhdistettiin ennalta lisäämällä 1 ug normaali immunoglobuliini G yhdessä 50 ui asianmukaista proteiini A + G-agaroosi-konjugaattia (Santa Cruz) 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Immunosaostuksissa suoritettiin sopivan primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa. Kompleksit sidottu proteiini A + G-agaroosi-konjugaatti pestiin seitsemän kertaa universaali lysis /immunosaostuksella puskuria ja fraktioidaan SDS-PAGE: lla. Western blot -analyysi suoritettiin sitten.

13. Tilastollinen analyysi

Combination-indeksi (CI) on hyvin hyväksytty kvantifioivien huumeiden synergia perustuu useiden lääkkeiden vaikutuksen yhtälö Chou-Talalay [24]. Tutkimuksessamme CI kutakin pitoisuutta ABT-737, Celastrol ja yhdistelmä solun eloonjäämisen määrityksissä laskettiin CalcuSyn- Software (Biosoft, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta). CI pienempi kuin 0,9 osoittaa synergiaa; CI on 0,9-1,10 osoittaa lisäaine; ja CI suurempi kuin 1,10 osoittaa antagonismia.

Erot Saharan G1 väestö, kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja Bax /Bcl-2 ratiofor kukin kahteen ryhmään (yhdistelmä

vs.

ABT-737; yhdistelmä

vs.

Celastrol), ja erot pilkotun kaspaasi-3 /aktiini, halkaistut PARP /aktiini, ja selviytyminen prosenttiosuus yhdistelmän ryhmän Noxa vaiennetaan soluissa

vs.

hallita siRNA soluja, taita muutos Noxa mRNA Celastrol käsiteltyjen solujen ATF4 siRNA soluissa

vs.

hallita siRNA soluja, arvioitiin parittomia kaksipuolinen Studentin t-testi ja merkitty ** p 0,01 ja * p 0,05. Jokaista analyysia varten kolmen erillisen kokeen tehtiin tietojen saamiseksi.

Tulokset

1 sytotoksisuus ABT-737 ja Celastrol Yhdistelmä Human hepatosellulaarinen sinoomasolulinjoja

Ensinnäkin käyttämällä MTT-määritystä arvioimme sytotoksisuutta ABT-737, Celastrol ja yhdistelmä ilmoitettuina pitoisuuksina 72 h kaksi HCC-solulinjoissa Bel-7402 ja HepG2. Vastaavat hengissäsäilymisosuus käyrät kuvassa. 1. verrattuna ABT-737 tai Celastrol yksin, yhdistelmä ABT-737 ja Celastrol kohdistama merkittävämpi anti-leviämisen vaikutuksia sekä Bel-7402 ja HepG2. Cl-arvot laskettiin CalcuSyn ohjelmisto on kiinteän suhteen pitoisuudet ABT-737 ja Celastrol (taulukko 1). Synergy (CI 0,70) tai voimakas synergia (CI 0,30) havaittiin molemmissa testattu syöpäsolulinjoissa.

2 ABT-737 synergized kanssa Celastrol on Trigger Apoptosis

2.1 ABT-737 plus Celastrol aiheuttama parannettu apoptoosin.

sekä ABT-737 ja Celastrol raportoidaan moduloida apoptoosia syöpäsoluissa, näin me innostuivat määrittää synergiavaikutuksen ABT-737 plus Celastrol on apoptoosin Bel-7402 ja HepG2-soluissa . Ensinnäkin PI värjäytymistä Sub-G1 sisällön analyysia käytetään kuvaamaan apoptoosin Bel-7402 ja HepG2 solut käsitellään 10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol tai yhdistelmä 24 tuntia, 48 tuntia ja 72 tuntia. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, ABT-737 yhdistettynä Celastrol johtivat enemmän apoptoosin kuin mono-hoitoryhmissä; solut kärsivät apoptoosin seuraavan yhdistelmän hoito lisäsi aikariippuvainen. Erot apoptoottisten solujen välillä yhdistelmähoidon versus mono-hoitoryhmässä olivat tilastollisesti merkitseviä sekä Bel-7402 ja HepG2 solut (*,

p

0,05; **,

p

0,01) (Fig. 2A). Tyypillisiä morfologisia piirteitä apoptoosin, mukaan lukien kromatiinin tiivistyminen, ydin- pirstoutuminen ja muodostumista apoptoottisten elinten havaittiin myös 10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol tai yhdistelmää saaneilla Bel-7402 ja HepG2-soluissa DAPI värjäystä. 10pM ABT-737 yhdistettynä 1,25 uM Celastrol aiheuttama enemmän apoptoottisia kappaleita kuin mono-hoitoja (Fig. 2B). Kaspaasi-3-on kriittinen efektori kaspaasi apoptoottisten reittien, jotka klassisen substraatti on poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) [25]. Western blot -analyysiä käyttämällä, olemme havainneet kaspaasi-3 ja pilkkominen PARP. Sekä Bel-7402 ja HepG2-soluissa, vaikka ABT-737 ja Celastrol oli vähäinen vaikutus kaspaasi-3 ja PARP, yhdistelmä aiheutti paljon merkittävämpi pilkkominen kaspaasi-3 ja PARP (Fig. 2C). HepG2-solut, ottamalla käyttöön kaspaasi-3-spesifisen substraatin Ac-DEVDPNA, ABT-737 ja Celastrol co-hoidon osoitettiin laukaista huomattavaan kasvuun kaspaasi-3-aktiivisuus (4,2-kertainen verrattuna kontrolliin ryhmä) (Fig. 2D) , kun taas mono-hoitoryhmässä ei muotoutuneet selvää kaspaasi-3 aktivaation (1,1-kertainen ja 1,0-kertainen, in Celastrol- ja ABT-737-ryhmään), joka oli johdonmukainen sen havainnon kuvassa. 2C, edelleen osoittaa synergistisesti indusoiman apoptoosin ABT-737 ja Celastrol. Yleensä nämä tiedot osoittivat, että yhdistelmä ABT-737 ja Celastrol johti parantuneeseen apoptoosin Bel-7402 ja HepG2-soluissa.

2.2 Aktivointi mitokondrioiden-pohjainen apoptoottisen reitin laukaisi yhdistelmä ABT-737 ja Celastrol.

Seuraavaksi, mitokondrion kalvon potentiaalia soluissa altistuminen ABT-737, Celastrol tai yhdistelmää tutkittiin JC-1 värjäystä. Solujen lukumäärä siirtymässä punaisesta vihreään fluoresenssiin ilmaisee taajuuden solujen, joilla mitokondrioiden depolarisaatio. 24 h-käsitellyn Bel-7402 ja HepG2-soluissa, kohtalainen havaittiin vihreän fluoresenssin, kun mono-hoitoja, kun taas vihreä fluoresenssi korvata useimmissa punaisen fluoresenssin jälkeen yhdistelmähoidon ABT-737 ja Celastrol (Fig. 2E). Lisäksi olemme havainneet proteiinin tasot Bax, Bcl-2, Bcl-x L, sekä mitokondrioiden vapautuminen sytokromi c: n (kuvio. 2F ja 2G). Sekä HepG2 ja Bel-7402-solut, kertyminen Bax havaittiin käsittelyn jälkeen ABT-737 ja Celastrol 24 tuntia, on kontrastin, Bcl-2 ja Bcl-x L väheni yhdistämisen jälkeen hoidon. Sitten arvioitiin suhde Bax /Bcl-2: n ja Bax /Bcl-x L HepG2-solut, jotka tärkeitä rooleja apoptoosin alkaminen [26]. Yhdistelmä ABT-737 ja Celastrol merkittävästi voimistunut suhde Bax /Bcl-2: n ja Bax /Bcl-x L, kasvaa 0,35-2,49 (Bax /Bcl-2) ja 0,55-3,91 (Bax /Bcl-x L), respectivley (Fig. 2F). Lisäksi selvää vapautuminen sytokromi c: mitokondrion sytoplasmaan indusoitui myös ABT-737 plus Celastrol yhdistelmä (Fig. 2G). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, mitokondrio polku oli mukana apoptoosin laukaisi yhdistelmä ABT-737 ja Celastrol.

3 kinetiikka Noxa induktio korreloi aktivointi Apoptotic Koneet yhdistelmällä ABT-737 ja Celastrol

luonnehtia synergistinen apoptoottisen koneiston ABT-737 ja Celastrol, western blot -analyysi suoritettiin Bel-7402 ja HepG2-soluissa altistumisen jälkeen 10pM ABT-737, 1,25 uM Celastrol tai yhdistelmä eri aikaan välein. Bel-7402-soluissa, kineettinen analyysi esitetään, että induktio Noxa proteiinien tuli detectible altistuksen jälkeen 1,25 uM Celastrol tai yhdistelmä 3 tuntia. Samalla olemme huomanneet, että lohkaisu PARP (osoittaa kaspaasi aktivointi) yhdistelmällä tuli näkyviin 6 h (Fig. 3A). HepG2-solujen induktio Noxa 1,25 uM Celastrol tai yhdistelmän, verrattuna Bel-7402-soluissa, on viivästynyt ulkonäköön 24 tunnin kuluttua, minkä jälkeen vähemmän herkkä PARP pilkkominen (Fig. 3B). Huomattavasti, kahden testattu syöpäsolulinjoissa, vaikka ajoitus kaspaasin aktivaation ja Noxa up-regulation olivat keskenään erilaisia, Noxa induktio on varmasti havaittu aikaisemmin kuin kaspaasin aktivaatio, mikä merkitsi sitä, että alle hoitoon ABT-737, Celastrol tai yhdistelmä, Noxa lisäys sai aikaan ennen apoptoottisen solukuoleman, nostamalla mahdollisuus, että Noxa induktio ollut rooli apoptoosin aikaansaama ABT-737 plus Celastrol.

lisäksi Noxa, olemme huomanneet, että ilmentyminen vielä kaksi BH3 vain proteiinien Bim ja puma myös voimistuvan yhdistelmä ABT-737 ja Celastrol (Fig. 3A ja 3B), syytetään, että nämä kaksi tekijää voi auttaa edistämään synergistinen apoptoottisten-induktio yhdistelmä.

4 Noxa tarvittiin Voimakkaat Augmentation ABT-737-tappaminen Celastrol

Kuten edellä mainittiin, Noxa todennäköisesti osallistua indusoiman apoptoosin yhdistelmähoidot ABT-737 ja Celastrol. Tunnistaa osallistumisen Noxa ja sen rooli apoptoosin, me ensin pudotti Noxa transfektiolla Noxa erityisiä siRNA HepG2-soluissa 48 tuntia. Ilmentyminen Noxa väheni huomattavasti, kun transfektio Noxa siRNA (Fig. 4A). Sitten HepG2-soluissa transfektoimalla Noxa siRNA hoidettiin 10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol tai yhdistelmää vielä 48 tuntia. Kuva. 4B osoitti, että Noxa erityisiä siRNA vähensi pilkkominen kaspaasi-3 ja PARP by ABT-737 yhdistettynä Celastrol. Kolmesta itsenäisestä kokeesta, suhde pilkottiin kaspaasi-3 /β-Actin ja halkaistut-PARP /β-aktiini analysoitiin (Fig. 4C ja 4D), joka osoitti, että pudotus on Noxa ilmeisesti johti askelvähennys suhteet, viittaa alennettu apoptoottisen voimakas ABT-737 plus Celastrol yhdistelmän Noxa-vaiennetaan soluissa. Lisäksi transfektio Noxa siRNA peruutetaan myös synergistinen antiproliferatiivinen vaikutus yhdistelmän ABT-737 ja Celastrol HepG2-soluissa, solun selviytymisen osa aggrandizing välillä 57,14%: sta 93,56% (kuvio. 4E). Nämä tiedot osoittivat, että osuuskunta syöpälääkkeen vaikutuksia ABT-737 ja Celastrol tarvitaan Noxa, joista Knockdown heikennettyjä sytotoksisuus ja apoptoottinen vaikutus ABT-737 plus Celastrol.

5 Celastrol edisti sitominen Noxa ja Mcl -1

Suurin vastus ABT-737 ajatellaan olevan sen alhainen affiniteetti Mcl-1. Noxa on BH3 vain proteiinia, joka voi tehokkaasti sitoutua Mcl-1 ja estää pro-selviytymisen vaikutuksia Mcl-1. Ottaen huomioon induktio Noxa jonka Celastrol ja yhdistelmä hoidon, päätimme vuorovaikutuksen Noxa ja sen korkean affiniteetin kumppani Mcl-1, joka johti Noxa /Mcl-1-kompleksit. Selventämään tätä asiaa, me immu- Mcl-1-proteiinia ja koestettiin Noxa HepG2-soluissa käsitelty 10pM ABT-737, 1,25 uM Celastrol tai yhdistelmä 24 tuntia. Kuten paljasti kuvassa. 5A, Celastrol mono-hoito paransi vuorovaikutusta Mcl-1 ja Noxa HepG2-soluissa ja Noxa sitoutumisen Mcl-1 kohonnut merkittävästi jälkeen yhdistelmähoito; sillä välin, Mcl-1-proteiinin tasot laski Celastrol saaneilla ja yhdistelmä-käsiteltyjen HepG2-soluissa. Olemme edelleen suorittaa käännetyn IP käyttäen anti-Noxa vasta-aineita ja myös huomannut lisäystä Mcl-1 sidottu Noxa (Fig. 5B). Yhdessä induktio Noxa jonka Celastrol kannusti vuorovaikutuksen Noxa ja Mcl-1, johti vähentäminen Mcl-1, mikä edistää tehostetun indusoiman apoptoosin ABT-737 ja Celastrol yhdistelmä.

6 Celastrol aiheuttamia Hsp90 Inhibition ja ER-stressi vastaus johti lisäys Noxa

6,1 Celastrol aiheuttamaa hajoamista Hsp90 asiakkaan proteiineja.

jotta valaista korrelaatio HSP90 kohdistaminen vaikutuksia [ ,,,0],27] ja Noxa induktion Celastrol-altistetuissa soluissa, hajoaminen Hsp90 asiakkaan proteiineja, kuten fosfori ERK1 /2 ja CDK4, seurattiin western blottauksella sekä Bel-7402 ja HepG2-soluissa, joiden sarjanumero pitoisuuksien Celastrol 3 h ( Fig. 6A ja 6B). Lisäksi mukaisesti edellisessä raportissa, Celastrol myös lisääntynyt Hsp70 ilmaisua, joka on tunnusmerkki Hsp90 esto [28]. Koska Hsp90 asiakas valkuaisesta väärin laskostuneet ja ubikitinoitu mukaan Hsp90 esto ja ovat sitten alas-säädellä proteasomaalisten hajoaminen [29], me sitten havaitaan, onko Celastrol voisi aiheuttaa proteiinin ubikinaa- seuraa proteasomaalisten hajoaminen. Kuten on esitetty kuviossa.