Krooninen sairaus

tiivistelmä

Androgeenien aktiivisuus on avainasemassa eturauhassyövässä etenemiseen. Androgeenireseptorin (AR) on tärkein välittäjäaine androgeenin toiminnan eturauhasen kautta sen kyky toimia transkription välittäjänä. Tässä suoritimme genomin laajuinen analyysi ihmisen AR sitoutumisen promoottorit läsnä ollessa agonistin tai antagonistin in androgeenista riippuvainen eturauhassyöpä-solulinjaa. Monet AR sitoutuneen promoottorit ovat sitoutuneet kaikissa tutkittiin olosuhteissa, kun taas toiset ovat sitoutuneet vain, kun läsnä on agonistin tai antagonistin. Useita kuvioita rikastuvat AR sidottu promoottoreita, kuten AR Response Element (ARE) puoli päällä ja tunnustusta elementtejä transkriptiofaktoreiden Lok1 ja SOX9. Tämä viittaa siihen, että nämä 3 tekijät voivat määritellä moduulin yhteistyössä toimivien transkriptiotekijöiden eturauhasen. Mielenkiintoista, AR sitoutuneet promoottorit ovat edullisesti sijoitettu AT rikas genomialuetta. Analyysi mRNA ilmaisun tunnistettu kanan ovalbumiinin ylävirtaan promoottori-transkriptiotekijä 1 (COUP-TF1) välittömänä AR kohdegeenin joka on vaimentua sitoutuessaan agonistin ligandoidun AR. COUP-TF1 immunovärjäys paljasti nucleolar lokalisaatio COUP-TF1 epiteelissä ihmisen androgeeniriippuvaisessa eturauhassyöpä, mutta ei viereisen eturauhasen hyvänlaatuisen epiteelin. Stromasoluja sekä ihmisen ja hiiren eturauhasen esittävät ydinvoiman COUP-TF1 värjäystä. Me osoittavat lisäksi, että on olemassa käänteinen korrelaatio COUP-TF1 eturauhasessa stroomasolujen ja nouseva androgeenivaikutuksen kanssa etenee murrosiässä. Tässä tutkimuksessa laajennetaan altaan tunnustettujen otaksuttu AR tavoitteet ja yksilöidään säätelee negatiivisesti tavoite AR – COUP-TF1 – mikä saattaa olla merkitystä ihmisen eturauhasen syöpä.

Citation: Perets R, Kaplan T, Stein I , Hidas G, Tayeb S, Avraham E, et al. (2012) Genome Wide analyysi androgeenireseptorin Targets paljastaa COUP-TF1 uutena Player Human eturauhassyöpä. PLoS ONE 7 (10): e46467. doi: 10,1371 /journal.pone.0046467

Editor: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Ranska

vastaanotettu: 31 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 03 syyskuu 2012; Julkaistu: 04 lokakuu 2012

Copyright: © Perets et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoitti Dr. Miriam ja Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (AMRF), Israel Science Foundation ja Eturauhassyöpä Foundation (EP). TK tukivat Euroopan molekyylibiologian järjestön (EMBO) pitkäaikainen tohtorintutkinnon apurahan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin ei-ihosyöpä miehillä Yhdysvalloissa, joiden arvioitu määrä 217730 uutta tapausta Yhdysvalloissa vuonna 2010 [1]. Androgeenien puute hoito on tällä hetkellä tukipilari edenneen eturauhassyövän hoitoon. Androgeenideprivaatio voidaan saavuttaa androgen ehtymisestä (esim hoito GnRH) joskus yhdessä androgeenireseptorin antagonistit, kuten flutamidi ja bikalutamidin [2] – [4].

androgen n vaikutusta normaaleihin ja pahanlaatuisten eturauhasen solujen välittämää kyvyllään tulla soluihin ja sitoa sen reseptori – AR. Koska ligandin AR sijaitsee sytoplasmassa kompleksissa lämpöisku- proteiinit (HSP) ja co-chaperones [5] – [7]. Kun androgeenireseptorin sitovia AR läpikäy rakenteellisten uudelleenjärjestely, joka johtaa hajottamisen HSP, altistuminen sen tumalokalisaatiosignaalin ja translokaation tumaan. Nuclear AR sitoutuu DNA, rekrytoi yhteistyössä aktivaattorit ja helpottaa kohdegeenien transkription. Transkription kohde- geenien katsotaan olevan tärkeä keino, jonka avulla AR vaikuttaa soluihin. Sitoutuneen ligandin steroidi-reseptoreja canonically uskotaan sitoutuvan konsensussekvenssi DNA, joka koostuu kahdesta heksameerisen puoli-sivustoja konsensussekvenssin 5′-TGTTCT-3 ’, joka on järjestetty kuten käänteinen toistoja, erotetaan kolmen nukleotidin [8] – [ ,,,0],15]; mutta tätä oppia äskettäin väitti suhteen AR. Se on äskettäin ehdotettu, mitä tukee myös tietoja, että puoli sivusto on riittävä AR DNA: han sitoutumisen läsnä ollessa androgeenireseptorin [16] – [18].

läsnä AR-antagonistin, kuten kuten flutamidi, AR transkription monimutkainen vielä muotoja, mutta transkriptio tunnettu AR-kohdegeenien ei tapahdu mahdollisesti kautta rekrytointi yhteistyössä repressors. Esimerkiksi, lisättäessä antagonistin bikalutamidi, AR siirtyy tumaan, sitoo promoottorin sen tunnettu kohdegeenin PSA ja rekrytoi co-repressorit, kuten SMRT ja NCOR [19], [20]. Muodostumista antagonisti sitoutuu AR transkription monimutkainen laajalti tutkittu yhden promoottorit [19] – [21]. Kuitenkin genominlaajuisten promoottori täyttöaste antagonisti sitoutuu AR ei koskaan tutkittu ennen. Oletimme, että androgeeniriippuvaisessa eturauhassyövän solut antagonisti sitoutuu AR sitoutuu ainutlaatuinen joukko kohdegeenien, jotka saattavat poiketa kohdegeenien agonistin sitoutuneen AR.

Olemme hyödyntäneet genominlaajuisia sijainti analyysi AR vuonna läsnäolo agonistin, antagonistin tai ei ligandia tutkia eroja ja yhtäläisyyksiä AR kohdegeenien näissä olosuhteissa. Olemme nähneet useita promoottoreita, jotka ovat konstitutiivisesti läsnä ollessa sitoutuneen agonistin ja antagonistin, sekä promoottorit, jotka on sidottu ainoastaan, kun läsnä on joko yksi. Olemme edelleen luonnehtia yksi uusi AR säätelee negatiivisesti kohdegeenin COUP-TF1, joka promoottori sitoutuu vain läsnäollessa antagonisti.

Tulokset

androgeenireseptorin kohdegeenien ihmisen eturauhasen syöpäsolujen

LAPC4 eturauhassyövän solut ilmentävät villityyppistä AR [22], mikä AR asema useimpien androgeeniriippuvaisessa eturauhasen syöpiä. Joissakin eturauhassyövän solulinjoissa, tietyt AR-antagonistit voivat toimia agonisteina, luultavasti johtuen sellaisen mutantin läsnä ollessa AR [23] – [27]. Niinpä testattiin ensin vaikutus androgeenireseptorin tai AR-antagonisti kasvuun LAPC4-solujen in vitro verrattuna soluissa, joita käsiteltiin pelkällä vehikkelillä. LAPC4 solut lisääntyivät läsnä androgeenin, mutta ei, kun läsnä on antagonisti. Kun yhdistetään FLUTAMIDE antagonisoi proliferatiivista vaikutusta androgeenireseptorin (kuva S1). Nämä tulokset vahvistavat androgen riippuvuutta LAPC4 soluja, osoittavat, että FLUTAMIDE toimii antagonistina AR: n proliferatiivisen vaikutuksen ja sulkea pois mahdollisuutta, että FLUTAMIDE voi toimia toiminnallinen AR agonisti tässä solulinjassa.

tunnistamiseksi suoraan kohdegeenien AR eturauhassyöpäsoluissa, kun läsnä AR-agonisti, AR-antagonisti, tai sen puuttuessa sekä, LAPC4 solut ensin androgeenien ablatoitu kolme päivää. Sitten soluja inkuboitiin pelkästään vehikkeliä, 10 nM R1881: n tai 40 uM flutamidi 16 tuntia. Pituudet aktivointi ja R1881 pitoisuus valittiin mukaan aikaan maksimaalinen AR rekrytointi parhaimmillaan tutkittu kohdegeenin PSA [28]. Kromatiinin immunosaostuksella (ChIP) AR-sitoutuneen kromatiinin suoritettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Immuno-saostetaan osa ja näyte tulo DNA hybridisoitiin microarray edustaa 19000 ihmisen geenin promoottorit. Sitovat tiedot kolmen chip chip kokeita analysoitiin ja koettimia, jotka oli sidottu p-arvo 0,001 katsottiin AR sitoutuu promoottorit (arbs).

analyysi AR kohdegeenien pelkkää apu-, R1881 ja flutamidi paljasti kolme ryhmää arbs. On olemassa jonkin verran päällekkäisyyttä kohdegeenien nämä kolme edellytystä, sekä ARBs kunkin ehdon (kuvio 1a ja taulukko S2). Luettelot kohdegeenien paljasti joitakin geenejä, joiden tiedettiin säädellä AR kuten HOXB13 [29], [30]. Jotkut tunnetut AR-kohdegeenien kuten PSA ei palautettu Näissä paneelit vaikka geeni erityisiä ChIP ilmoittanut, että se on ensisijaisesti sitoo AR (kuva S2a). Tämä edellyttää tiettyä väärien negatiivisten havainnoista. Kuitenkin koska koko joukko tavoitteita ei tiedetä väärä negatiivinen korko ei voida arvioida.

LACP4 soluja androgen riistää 72 tuntia ja sitten käsiteltiin ajoneuvo (etanoli), synteettinen androgeenireseptorin (R1881) tai AR-antagonisti flutamidi. Solut kiinnitettiin 16 tuntia hoidon jälkeen ja siru siru analyysi tehtiin tunnistamiseksi AR sidottu promoottorit. A. lukumäärä AR sidottu promoottorien kummassakin hoitoryhmässä, ja päällekkäisyyttä ryhmien on esitetty Venn-kaavio. Kunkin ryhmän sekvenssin promoottorin n koetin array analysoitiin läsnä klassisen AR vaste-elementin (ARE) tai puoli-sivuston. Näkyy ovat taajuudet sisältävät sekvenssit ARE tai puoli sivuston Jokaisessa hoitoryhmässä ja taajuus kaikissa koettimista array (tausta). P-arvo rikastaminen laskettiin ryhmän taajuudella verrattuna taustan array tavallisilla opiskelijan t-testiä. Inset ruudussa näkyy klassisen AR vaste-elementin sekvenssin. B. Taulukko, joka osoittaa rikastuminen ARE ja puoli sivuston päällekkäisyyksiä ryhmien välillä. Kunkin parin koeolosuhteissa taajuuden ARE ja puoli sivusto lasketaan päällekkäin promoottoreita ja kaikissa edistäjiä molemmissa ryhmissä. P-arvo rikastumisen päällekkäin promoottoreita verrattuna kaikkiin promoottorit lasketaan hypergeometrisen jakeluun. C. Co-immuunisaostuksessa AR ja SOX9 in LAPC4 soluissa.

Genominlaajuiset sijainti analyysitulokset validoitiin käyttäen geenispesifistä chromatin IP kahdeksan ARBs kaikissa kolmessa hoitoja (katso kuva S2 ja kuva 2c). Kromatiinin IP suoritettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät, ja PCR: ää käytettiin määrittämään määrän spesifistä DNA-fragmenttia, että saostunut osa. Kvantifiointi rikastus tehtiin laskennallisen puolueeton menetelmä. Käytimme kolme kertaa runsaammin kuin meidän sitova cutoff (perustuen PSA-promoottori sitova, katso kuva S2a). Olemme validoitu sitovia kahdeksan genomista paikkakunnalla, kukin läsnäollessa ajoneuvon, agonistia tai antagonistia. Niistä 24 edellytyksin testattujen 18 osoitettiin sitoutua AR jono. Noista 16 sitoivat myös geenin tietyn IP. Siksi päätellään, että 16/18 (89%) promoottori-olosuhteissa testattu, geeni erityisiä tietoja vahvistivat array data, joka ilmaisee vääriä positiivisia 11%.

. LAPC4-soluja androgen riistää 72 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten synteettisellä androgeenin (R1881), AR-antagonisti (flutamidi) tai vehikkeliä (etanoli) 24 tuntia. Reaaliaikainen PCR: ää käytettiin määrittämään mRNA-tasot on ilmoitettu geenejä. Jokainen ilmentymistason säädettiin GAPDH mRNA-tasolla ja esitetään kertainen muutos ajoneuvon käsitelty kontrolli. Jokainen pylväs edustaa vähintään neljä kokeiluja jokaisessa tehdään kolmena kappaleena. P-arvo laskettiin käyttäen opiskelijan t-testissä verrattuna ajoneuvon käsittelyä. B. Western blot-analyysi osoittaa COUP-TF1 ja AR ekspressiotasoja käsittelyn jälkeen R1881 tai FLUTAMIDE 48 tuntia. Jokainen hoitoryhmä oli suoritettu ja esitetty kaksoiskappaleet. C. Analyysi AR sitoutumisen COUP-TF1 genomisen lokuksen. LAPC4-soluja androgen riistää 72 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten synteettisellä androgeenin (R1881), AR-antagonisti (flutamidi) tai vehikkeliä (etanoli) 16 tuntia. Siru anti AR-vasta suoritettiin. PCR ilmoitettu lähialueiden COUP-TF1 transkription aloituskohdasta verrattuna Sitoutumaton geeni on esitetty 3 kertaisia ​​tulon ja immunosaostettiin jae. Enrichment sitoutumaan kunkin alueen verrattuna ei-sidottu promoottori (GAPDH) on määrällisesti kunkin kuvan alla. PCR varten 5’UTR COUP-TF1 esitetään ylälamellin (COUP-TF1 5’UTR), sitoutumisesta COUP-TF1 promoottori on esitetty keskellä paneeli ja sitoutumaan alueeseen ylävirtaan promoottori (COUP-TF1 ylävirtaan) esitetään alimmassa paneelissa. D. Kaavioesitys AR sitoutumiskohtien genomisessa lokukseen ympäröivän vallankaappaus-TF1 TSS, kuvassa C. Vihreät palkit edustavat alueita analysoitiin AR sitova. Genominen sijainnit AR sitoutuminen, kun mukana flutamidia ja R1881 on merkitty vihreällä ja oranssi kolmioita vastaavasti.

kokeet paljastivat perustava sitoutumisen AR PSA promoottorin läsnäollessa ajoneuvon R1881 tai FLUTAMIDE (kuvio S2a), kuten odotettua [20]. Konstitutiiviset AR sitoutuminen validoitu useita muita geenejä, kuten romaanin ARBs

sox5

(kuva S2b),

dock1

(kuvio S2C) ja

slitrk3

(kuvio S2E).

IL1R2

on uusi ARB, läsnä ollessa sitoutuneen joko agonisti- tai antagonisti, mutta ei ilman ligandia (luvut S2F).

B3gnt5

promoottori sitoo AR vain agonistin läsnä ollessa (kuvio S2D).

AR-kohdegeenien on jaettu tasaisesti pitkin eri kromosomien kaikki ligandeja testattiin, kuten analysoitiin Webgestalt [31] (kuva S3).

Gene ontologia merkintä (GO) analyysi suoritettiin löytää toiminnallisia ryhmiä, jotka rikastetaan sisällä arbs. Kaikissa ligandi asetukset tutkittiin, vaikka suuri vaihtelu kohdegeenien, rikastettu luokat, olivat ne luokat osallistuvat DNA: ta sitova ja transkription aktiivisuus (taulukko 1).

OVAT puoli sivusto on vallalla AR sitoutumiskohtia

Etsimme esiintyvyys kanonisen androgen tunnustusta osa ARB joukko tunnistimme, verrattuna kaikkiin 18051 -koetinten jono. Annoimme jopa kaksi kohtaanto 15 emäsparin androgeenireseptorin vaste-elementin (ARE) järjestyksessä. ARE löytyi 4% kaikista antureista on jono. Kun skannaus ARE kolmessa luetteloihin ARBs oli vain lievä rikastuminen verrataan taustan R1881 ja flutamidi ryhmät (kuva 1a). Kun skannaus varten ovat promoottorit, jotka oli sidottu kahdessa olosuhteissa verrattuna sen esiintyvyys edistäjiä molemmissa ryhmissä ei ollut lisärikastumisen (kuvio 1 b). Samanlaisia ​​tuloksia on kuvattu muut, niin AR sidottu promoottoreita ja AR sidottu parantajia [16] – [18]. Siten tuloksemme tukevat käsitystä, että dogmaattinen kanoninen OVAT sivusto ei yksinään, on keskeinen rooli AR rekrytoinnissa.

Seuraavaksi kysyimme, onko ARE puoli sivuston (5′- AGAACA-3 ’) on rikastettu tahansa ryhmistä, ilman epäsuhta. Puoli-sivusto on etsinyt ARBs verrattuna array tausta. Puoli-site ARE havaittiin hyvin rikastettu kaikki kolme ryhmää ARBs (kuva 1a). Näin ollen aiemmin raportoitu puoli-sivusto, joka on yleistä ARBs läsnä agonistin [16] – [18] on myös rikastettu läsnä antagonisti. Puoli sivusto on edelleen rikastunut promoottorit, jotka on sidottu kahteen olosuhteissa, verrattuna sen esiintyvyys molemmissa ryhmissä yhdessä (kuvio 1 b). Siksi olosuhteissa selvitimme puoli sivusto on yleismaailmallinen tunnistuselementtinä androgeenireseptorin riippumatta ligandin.

SOX9 ja Lok1 ovat otaksuttu AR keratekijöitä

sekvenssianalyysi ARB käytettiin paljastaa AR co-transkriptiotekijöiden, jotka voidaan yleisesti liittyy siihen. Jotta etsiä tunnustamista elementtien tunnettujen transkriptiotekijöiden käytimme CIS [32] skannata ARBs aiemmin määritellyn tunnustamista elementtejä tunnettujen transkriptiotekijöiden. Rikastetun elementtiä kunkin ryhmän ARBs voidaan nähdä taulukossa 2. Niistä elementtejä, jotkut, kuten MMA ja forkhead perheiden transkriptiotekijöiden, aiemmin raportoitu liittyvän AR toimintaa [17].

Huomasimme SOX9 elementin merkittävästi rikastettu ARBs kaikissa kolmessa testatuissa olosuhteissa. Etenkään FLUTAMIDE käsitellyn ryhmän ARBs SOX9 tunnistuselementtinä todettiin 15%: ARBs (p = 0,0003). Mielenkiintoista, SOX9 äskettäin kuvattu aktiivinen eturauhasen syövän synnyn ja alkionkehityksen [33], [34] [35] ja aktivoituvat vasteena androgeenien hoitoon varhaisessa eturauhassyövän kehitykseen [34]. Niinpä SOX9 ja AR yhteistyötä immuunisaostumassa in LAPC4 soluissa (kuvio 1 c). Yhdessä Tuloksemme viittaa SOX9 otaksutuksi AR kofaktorin.

edelleen halusi etsiä uusia motiiveja, jotka rikastuneet ARBs kautta

de novo

aihe haku. Rikkaaes [36], numeroitu

de novo

motiivi hakualgoritmi, paljasti motiivi GCAAATCA voidaan merkittävästi rikastettu agonisti sidottu ryhmä, ja edelleen analyysi osoitti sen olevan rikastettu kaikissa ARB ryhmissä (taulukko 3 yläosa ). Tämä sekvenssi on päällekkäin kanoninen Lok1 tunnistuselementtinä ATGCAAAT. Kanoninen Lok1 tunnistuselementtinä on myös yleistä listalta ARBs joskaan ei yhtä merkittävästi kuin GCAAATCA (taulukko 3 alaosa).

ARBs sijaitsevat AT-rikas genomialuetta

jotta edelleen luonnehtia ARBs laskimme GC-pitoisuus kaikkien ARBs, ja vertasi sitä array taustan GC-pitoisuus. Yllättäen huomasimme, että ARBs ovat erittäin ja merkittävästi rikkaita. GC-pitoisuus koko ryhmän on 54,3%, kun taas GC-pitoisuus agonistin ja antagonistin ARB ovat 46,4% (p = 1,6 * 10

-13) ja 48,5% (p = 3,4 * 10

-5 ), vastaavasti. Jotta voitaisiin vahvistaa, että tämä ilmiö ei ole valintaa bias array, vertasimme sen GC-pitoisuus MLL1 sitoutuneen antureista, jotka julkaistiin samoja array [37]. MLL1 sidottu koettimet sisälsivät 56,1% GC, samanlainen array tausta. Edelleen vahvistaa tämän tuloksen laskimme GC-pitoisuus aiemmin julkaistu AR sidottu promoottorit. Vuonna Massie

et al.

Tietojen joukko, joka analysoitiin androgeenin sidottu promoottorit läsnä ollessa androgeenireseptorin [16] löysimme GC-pitoisuus oli 52,6% verrattuna 53,6%: in koko ryhmän (p = 0,0004). Sen määrittämiseksi, että tämä ei ole yleinen ilmiö transkriptiotekijöiden tutkimme GC-pitoisuus p53 sitoutumiskohtien vastauksena säteilylle [38]. GC-pitoisuus P53 sitoutumiskohtien on 55,7% verrattuna 52,5% taustan. Tämän vuoksi päättelemme, että AR taipumus yhdistää AT rikas promoottorit.

AR sitoutuminen promoottori ei riitä androgeenisäätelyn sääntelyä vierekkäisten geenien

arvioimiseksi, AR sitoutumisesta transkription mittasimme mRNA ilmentyminen useiden ARB geenien alle 3 eri androgeenireseptorin hoitoja, joissa niiden todettiin sitoutuvan käyttäen reaaliaikaista PCR. Kuten odotettua, jotkut ARBs osoitti voimistunutta ilmentymistä, kun androgen hoidon ja vähentynyttä ilmentymistä lisättäessä antagonistin flutamidi. Kuitenkin muut ARBs kuten DOCK1 ja Gli3 eivät näy androgeeni vastaus koeolosuhteissa (kuvio 2a). COUP-TF1, joka ehdotti meidän genominlaajuisia analyysi sitoutua AR useilla paikkakunnilla ympäröivä transkription aloituskohdasta (TSS), säätelee negatiivisesti androgeenien (kuvio 2a).

syntaksiinin 6 ( STX6) on rakkula kuljettaja proteiini, joka oli hiljattain osoitettu säätelevän p53 ja vaaditaan syöpäsolun tarttumisen ja eloonjääminen [39]. STX6 paljastui meidän genominlaajuisia sijainti analyysi sitoutua AR läsnäollessa joko R1881 tai FLUTAMIDE. STX6 mRNA-tasot hieman vaimentua by R1881, vaikka tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Kuitenkin STX6 merkittävästi voimistuvan FLUTAMIDE (kuvio 2a).

Kuten odotettua, tunnettu AR tavoite PSA voimistuvan androgen ja alas säätelee FLUTAMIDE.

Näin AR sitoutuminen promoottori sivustot voivat liittyä joko voimistumista, downregulation tai ei muutosta transkription.

COUP-TF1 sääntelyn AR ja -antagonisteja

lisäksi kysyä, onko FLUTAMIDE sitoo AR on toiminnallinen transkriptionaalinen rooli . Tähän kysymykseen päätimme keskittyä yhteen FLUTAMIDE aktivoidun promoottorin – promoottori kanan ovalbumiinin Upstream Promoottori – transkriptiotekijä 1 (COUP-TF1). Vallankaappaus-TF1 on orpo tumareseptori, joka toimii lähinnä transkription repressori [40], [41]. Meidän

in vivo

sitova analyysi ehdotti, että AR sitoo genomista sekvenssiä ylävirtaan transkription aloituskohdasta vallankaappauksen-TF1 useilla paikkakunnilla ja 5’transloimaton alue (UTR) ja

vallankaappaus-tf1

geenin. Jotta tutkittaisiin sääntelyä COUP-TF1 AR ensin edelleen validoitu sitoutumisen AR geenisekvenssejä ympäröivä vallankaappaus-TF1 transkription aloituskohdasta. Läsnä AR-antagonistin flutamidi AR on sidottu alueella 1-2 KB ylävirtaan TSS, vallankaappaukseen-TF1-promoottorin ja 5′-UTR: n geenin. Kuitenkin, kun läsnä on androgeeni AR sitoo alueella 1-2 kb ylävirtaan TSS, mutta ei promoottori tai 5’UTR (kuvio 2c ja 2d).

Kuten edellä on kuvattu, COUP-TF1 mRNA-tasoja negatiivisesti säännellään androgen ja säätää positiivisesti FLUTAMIDE. Olemme edelleen validoitu tämän havainnon proteiinitasolla Western blot analyysi. COUP-TF1 proteiinin tasot LAPC4 solut eivät muutu lisäyksen jälkeen R1881 48 tuntia androgen puutteellisista soluista. Kuitenkin, kun läsnä on flutamidia 48 tuntia, COUP-TF1-proteiinin tasot nousevat (kuvio 2b). Mielenkiintoista, samanaikaisesti sen säätelyä COUP-TF1, AR ilmentyminen säädeltiin vähentävästi lisäämällä flutamidia, mikä osoittaa negatiivinen kierre AR aktivaation LAPC4 soluissa. Johtopäätöksenä on osoituksena kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR ja western blot-analyysit, antagonisti sitoutuu AR säätelee positiivisesti COUP-TF1 in LAPC4 soluissa.

COUP-TF1 ilmentyy pahanlaatuisia eturauhasen epiteelisolujen eikä normaalissa eturauhasessa epiteelissä

tutkia ekspressiokuviota COUP-TF1 ihmisen eturauhasen ja eturauhassyövän käytimme immunohistokemia havaitsemaan COUP-TF1 28 ihmisen kasvaimen näytteitä. Havaitsimme COUP-TF1 on pahanlaatuinen epiteelin 21 ulos 28 ensisijaisen eturauhassyöpänäytteissä tutkitaan. Emme löytäneet korrelaatiota COUP-TF1 värjäys ja Gleason tai tauti uusiutuu joko epiteeli- tai stroomasoluissa. Emme kuitenkaan löytänyt merkitsevästi korkeampi COUP-TF1 värjäytymisen neoplastisia eturauhasen epiteelin ja premaligneja eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasia (PIN) verrattuna värjäys viereisten hyvänlaatuinen eturauhasen epiteelin (kuva 3a ja 3b). Tämä viittaa siihen, että COUP-TF1 voisi olla rooli alkuvaiheessa eturauhasen kasvaimien syntyyn. Mielenkiintoista, COUP-TF1 jaettiin epiteelisoluissa on nucleolar jakeluun, kun taas stroomasoluja, jotka ympäröivät epiteelin neoplasia osoitti ydin- värjäytymiskuvio.

. Immunohistokemiallinen värjäys ihmisen eturauhassyöpänäytteissä ja viereisen hyvänlaatuinen rauhaset varten COUP-TF1 esittää nucleolar jakautuminen COUP-TF1 pahanlaatuisissa soluissa (ylhäällä vasemmalla) eikä COUP-TF1 värjäytymistä viereisessä hyvänlaatuinen rauhanen (alhaalla oikealla). Stromasoluja osoittavat tumavärjäystä of COUP-TF1. Edustaja 28 analysoitujen näytteiden näytetään. B. Eturauhasen intraepiteliaalinen neoplasia (PIN) esittää nucleolar jakautuminen COUP-TF1 ja viereisten stroomasolujen näyttää tumavärjäystä. C. immunovärjäys LAPC4 ksenografteista osoittaa nucleolar COUP-TF1 värjäystä.

Jotta voitaisiin vahvistaa COUP-TF1 Vasta-aineen spesifisyyden olemme värjätään LAPC4 ksenografteissa varten COUP-TF1 ja löysi nucleolar jakautuminen COUP-TF1 ( kuvio 3 c) samanlainen jakeluun esitetyn ihmisen eturauhassyövän epiteelin. Western blot-analyysi näiden solujen samalla COUP-TF1-vasta paljasti yhden kaistan 46 KD, joka vastaa COUP-TF1.

Jotta vahvistaa negatiiviseen säätelyyn välillä AR ja COUP-TF1 eturauhasessa me käytetyt esipuberteettivaiheessa Balb /c-hiirissä. Esipuberteettivaiheessa hiirillä on alhainen testosteroni taso kolme viikkoa, jossa tasot lisääntyy hiiren saavuttaa murrosiän [42] – [44]. Tutkimme COUP-TF1 tasot prostates hiirten iässä 3, 5 ja 7 viikon kuluttua. Yhdenmukainen havaintomme ihmisen näytteissä ei ollut COUP-TF1 värjäytyminen normaalissa hiiren eturauhasen epiteelin. Olimme kuitenkin nimenomaan kiinnostuneita COUP-TF1 tasot eturauhasen strooman (urogenitaalis- mesenchyme), koska hyvin tunnustettu ratkaisevaa roolia strooman AR eturauhasen kehittämiseen [45], [46]. Stroomakasvaimet-cell COUP-TF1 laskivat hiiren iän (kuvio 4a). Erityisesti voisimme nähdä negatiivinen korrelaatio AR ja COUP-TF1 tasoa yhden eturauhasen kanaviin kaikissa diat tutkinut (vertaa kuvio 4b ja 4c). Nämä havainnot osoittavat, käänteinen suhde AR aktivointi ja COUP-TF1 ilmentymisen normaalissa eturauhasessa kehittämiseen.

eturauhanen ennalta murrosikää Balb /c-hiiriä iässä 3, 5, 7 viikkoa, saatiin ja immunohistokemiallinen värjäys COUP- TF1 oli esimuotoillut. Kullekin ikäryhmässä vähintään 4 hiiret analysoitiin. A. stroomasolujen värjäytymistä COUP-TF1 kvantitoitiin patologi prosentteina stroomasolujen värjätään. Keskiarvo kaikista lohkoa laskettiin jokaiselle hiirelle ja käytetään edelleen analyysiä. P-arvo laskettiin käyttäen opiskelijan t-testissä verrattuna ikää 3 viikkoa. B. Normaali 3 viikkoa vanha hiiri eturauhasen värjättiin AR ja c. COUP-TF1. Serial kohdat samasta rauhanen on esitetty. Epiteelisolut ovat positiivisia AR ja negatiivisia COUP-TF1. Peri-epiteelin stroomasolujen, välillä sininen ja keltaiset viivat, ovat negatiivisia AR ja positiivisia COUP-TF1. Stromasoluja kauempana rauhanen, välillä keltainen ja vihreä linjat, ovat positiivisia AR ja negatiivisia COUP-TF1. Samanlaisia ​​korreloi käänteisesti värjäyskuviot nähtiin kaikissa diat tutkinut.

Keskustelu

Siirtyminen eturauhassyöpä on hormoniresistentti tila on merkittävä käännekohta etenemisen eturauhassyöpä, ja AR on merkittävä rooli tässä muutoksessa. Nykyisin käytetyt AR-antagonistit, kuten flutamidi ja bikalutamidi, rooliin reseptoriagonistien kun tauti tulee hormoniresistentti. Ensimmäinen todiste tästä siirtyminen antagonisti agonisti oli päätellä kliininen havainto, että eturauhasen syöpä potilaista oli 30% mielekäs vastaus peruuttamista steroidi hormoni antagonisti ensimmäisenä liikkumavaraa jälkeen ensisijainen hormonihoidon epäonnistuminen [47]. Tämä ilmiö kehotetaan tutkijat tutkia kuinka AR-antagonisti voivat toimia agonisteina hormoneille resistentti eturauhassyöpä. Kaksi tutkimusta osoitti, että HRPC, AR-antagonistit rekrytoida koaktivaattoreiden (sijasta co-repressors) AR sitoutuneen kohdegeeneissä PSA ja KLK2 antamalla yksi mekaaninen selitys tälle ilmiölle [19], [20]. Oletimme, että tämän lisäksi muutos meneillään yhden kohdegeenin tasolla, on maailmanlaajuinen muutos AR-kohdegeenien jotka voivat lisätä toisen selityksen kliinisistä havainnoista. Tätä varten meidän on ensin halusi verrata in vivo DNA: ta sitovaa AR sidottu joko FLUTAMIDE tai androgen.

sitominen AR DNA, vaikka ligandi riippuvainen, ei ole riippuvainen yhteistyöstä aktivaattorit. Kun induktio FLUTAMIDE, AR sitoutuu PSA promoottori. PSA-promoottorin todettiin eri kokeissa sitoutua AR ilman ligandia (kuva S2a), kun taas tehostaja ei sitoudu unliganded AR [28]. Tämä sai meidät määritellä kirjo ARBs välillä unliganded AR, agonisti sitoutuu AR (R1881) ja antagonisti ligandoidun AR (FLUTAMIDE).

Meidän genominlaajuisia sijainti analyysi AR kohdegeenien olemme havainneet, promoottorit, jotka ovat sidottu konstitutiivisesti kanssa agonistista ligandin antagonisti ligandi tai ei ligandia lainkaan (kuva S2). Mikään niistä harvoista geenien arveltiin sitoutua vain läsnäollessa ajoneuvon mukaan meidän

in vivo

sitova analyysi, oli validoitu geenispesifisistä chromatin immunosaostusanalyysille; Näin se on vähemmän todennäköistä, että ligandia sitovan indusoi AR irtaantuu kromatiinin.

useita geenejä differentiaalisesti sitoo AR, läsnä ollessa agonistin tai antagonistin (kuva 2c ja selvittää S2D). Jotta voidaan arvioida vaikutusta AR sitova transkription mittasimme ilmentyminen useiden näiden ARB geenien alle 3 erilaisen kohtelun olosuhteissa. Osa konstitutiivisesti sitoutuneen geenit androgeenireseptorin säädellä (esim STX6 ja PSA). Toiset ilmaistiin LAPC4 mutta ei säätele androgeenien olosuhteissa, joissa ne sitoutuvat. Siksi AR sitova ei riitä transkription aktivoituminen ARBs tai androgen sääntelyä. On todennäköistä, että ylimääräinen vaatii ehtoja kuten rekrytointi co-aktivaattoreita, ylimääräisiä transkriptiotekijät tai histonimodifikaation. Vaihtoehtoisesti AR voi olla vastuussa transkription aloitukseen, mutta ei transkriptio venymä, joka vaaditaan aktiivisesti puhtaaksi geenien [48].

Tämä ero sitoutuminen, kun mukana flutamidia voi olla erityisen tärkeä, kun harkitaan antagonisti agonisti muuntaminen hormoneille resistentti eturauhassyöpä. On kohtuullista olettaa, että nämä geenit voidaan helposti aiheuttama kun siirryttäessä hormoni vastareaktioita koska ne on jo sitoo AR, ja tarvitsee vain edelleen rekrytoida yhteistyötä aktivaattorit ja pohjapinta transkriptio koneita. Tämä havainto voisi myös olla terapeuttista merkitystä hyödyntämällä käsitettä synteettinen kuolleisuutta: Ne tavoite geenejä, jotka vain aktivoidaan FLUTAMIDE käsitellyissä soluissa voisi toimia terapeuttisina kohteina yhdistettynä FLUTAMIDE.

Jotta saataisiin tietoa AR: n toimintaa androgeeniriippuvaisessa eturauhasen syövän bioinformatical analyysi AR-kohdegeenien suoritettiin. GO analyysi ARBs viittaa siihen, että AR kykenee sen solujen vaikutuksen sitoutumalla promoottorit muiden transkriptiotekijöiden läsnä kaikkien eri ligandeilla (taulukko 1). Tämä viittaa siihen, että AR on päällikön säätelijä eturauhasen epiteelisolujen.

Seuraavaksi etsimme tunnettujen ja

de novo

motiiveja arbs. Analyysin perusteella voidaan tunnistaa transkriptiotekijät, jotka toimivat yhteistyössä sääntelyviranomaisten transkription kanssa AR. Meidän analyysi paljasti ei-konsensus Lok1 motiivi, joka oli raportoitu aikaisemmin olevan osallisena AR transkriptio [49]. Analyysi kaikista tunnetuista Transfac motiiveja paljasti sekä Brachyury ja SOX9 kuviot on hyvin rikastettu ARBs kaikkien ryhmien (taulukko 2).

Brachyuri on jäsenenä T-box proteiini perhe, joka on laajasti mukana alkionkehityksen [ ,,,0],50], ja vaikka se oli kuitenkin ilmaistaan ​​eturauhasen suuren mittakaavan ilmaisu analyysit [51], ja useissa eturauhassyövän solulinjoissa [52], sen tarkka merkitys ei koskaan raportoitu.

SOX9, on Sry liittyvä korkea Mobility Group (HMG) tekijä, joka on aikaisemmin raportoitu olevan merkitystä eturauhasen kehittämiseen. Se ilmaistaan ​​kehittää eturauhasen epiteelisolujen silmut vahvin ilmentyminen distaalisessa kärjissä silmut. Vakava vika kehittämiseen vatsanpuoleisen eturauhasen havaittiin SOX9 mutantti eläimillä [53]. Mahdollinen asema SOX9 kuin AR co-säädin on edelleen arvioitava. a.