Krooninen sairaus

tiivistelmä

Death signalointi tarjoamat tuumorinekroositekijä (TNF) liittyvien apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) voi aiheuttaa kuoleman syöpäsolujen juurikaan sytotoksisuuden normaaleihin soluihin; tämä solukuoleman on ajateltu mukaan kaspaasi-riippuvaista apoptoosia. Reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ovat myös välittäjiä, jotka aiheuttavat solukuoleman, mutta niiden roolit TRAIL: n indusoiman apoptoosin ei ole selvitetty täysin. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet ROS ja kaspaasit ihmisen haimasyövän soluja, joille tehdään kaksi erilaista TRAIL-indusoidun solukuoleman, apoptoosin ja necroptosis. TRAIL-käsittely lisäsi ROS kahden TRAIL-herkkien haimasyövän solulinjoissa, MiaPaca-2 ja BxPC-3, mutta ROS olivat mukana TRAIL-indusoitua apoptoosia vain MiaPaca-2-soluissa. Yllättäen esto ROS joko

N

asetyyli-L-kysteiini (NAC), peroksidin estäjä, tai Tempol, superoksidi- estäjä, anneksiini V- /propidiumjodidi (PI)

+ aikaisin nekroottisen väestö TRAIL-käsitellyissä soluissa. Lisäksi molemmat necrostatin-1, estäjä reseptoriin vuorovaikutuksessa proteiinikinaasi 1 (RIP1), ja siRNA-välitteisen knockdovvn RIP3 pienensi anneksiini V:

– /PI

+ varhain necrotic väestöstä jälkeen TRAIL hoidon. Lisäksi se lisäisi varhaisia ​​apoptoosin aiheutettiin TRAIL-käsiteltyjen syöpäsolujen esteen alaisena joko kaspaasi-2 tai -9. Kaspaasi 2 toiminut ylävirtaan kaspaasi-9, eikä ylikuulumisen välillä havaittiin ROS ja kaspaasi-2 /-9 in TRAIL-käsitellyissä soluissa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ROS edistää TRAIL-indusoitua apoptoosia in MiaPaca-2-soluissa, ja että ROS olla inhiboiva rooli TRAIL-indusoidun necroptosis of MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluja, ja kaspaasi-2 ja -9 pelissä sääntely osa tässä prosessissa.

Citation: Zhang M, Harashima N Moritani T, Huang W, Harada M (2015) roolit ROS ja Kaspaasit in TRAIL-indusoitua apoptoosia ja Necroptosis Human haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 10 (5): e0127386. doi: 10,1371 /journal.pone.0127386

Academic Editor: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 23 tammikuu 2015; Hyväksytty: 15 huhtikuu 2015; Julkaistu: toukokuu 22, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee osittain avustusta opetus-, tiede-, urheilu, kulttuuri, ja tekniikka Japanin (no. 25430150 NH, ja no. 24501331 MH) ja Shimanen University ”SUIGANN” Project. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

jäsenet tuumorinekroositekijän (TNF) sytokiiniperheessä, kuten TNFa ja Fas-ligandin (FasL), tärkeitä rooleja tulehduksen ja immuniteetin [1]. Vaikka TNF-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) on tämän perheen jäsen, tämä molekyyli voi aiheuttaa syöpää solukuoleman aiheuttaen samalla lähes sytotoksisuutta normaaleihin soluihin [2]. On positiivisia ja negatiivisia reseptorit; kuoleman reseptori (DR) 4 ja DR5 tarjoavat proapoptoottisiin signalointi, kun taas valereseptori (DCR) 1 ja DcR2 estää apoptoottista signalointi [3]. Normaalit solut on ilmoitettu osoittavan TRAIL-vastarinnan suosivista ekspression DcRs [4]. Siksi TRAIL ja sen DR odotetaan olevan käyttökelpoisia syöpälääkkeen molekyylien ja tavoitteet ja niitä on käytetty ja kohdennettuja useissa kliinisissä tutkimuksissa [5, 6]. Sitoutuminen TRAILin DR syöpäsoluihin tarjoaa kaspaasin 8-riippuvaisen kuoleman signalointi ja laukaisee ”ulkoista” apoptoottista polku [7]. Kaspaasi-8 muuntaa Bid ja tBid, mikä edistää mitokondriot-välitteisen kaspaasi-9-riippuvaisen luontainen ”apoptoottinen reitti [8]. Vaihtoehtoisesti ROS (reaktiivisia happiradikaaleja) myös tärkeitä rooleja solun kuolemaan ja signalointi [9]. ROS aiheuttaa luontainen apoptoosin laukaisemalla DNA-vaurioita [10]. Kääntäen, DNA-vaurioita aiheuttaa ROS tuotanto [11]. DNA-vaurioita ja /tai ROS tuotanto voi laukaista kaspaasi-9-riippuvaisen apoptoosin. Lisäksi jotkut raportit ehdotti, että ROS on mukana apoptoosin TRAIL-käsiteltyjen ihmisen syöpäsoluja [12-14]. Kuitenkin roolit ROS TRAIL aiheuttama syöpä solukuolemaa on vielä tutkimatta kokonaan.

Lisäksi apoptoosin, necroptosis pidetään nyt toinen muoto ohjelmoidun solukuoleman [15, 16]. Necroptosis on ohjelmoitu nekroosi, joka voidaan aktivoida, kun stimulaatio TNFa: lla, FasL, tai TRAIL. Roolit ja mekanismit apoptoosin ja nekroosin on vakiintunut, kun taas niille necroptosis painopiste on ollut viimeaikaisissa tutkimuksissa [16-18]. Necroptosis on saanut paljon huomiota, koska tyyppi solukuoleman, joka aiheuttaa tulehduksen [17]. Under kaspaasi-8 inhibition, reseptorin vuorovaikutuksessa proteiinikinaasin 1 (RIP1) ja RIP3 muodostavat monimutkaisen ja liipaisin necroptosis [19, 20]; ylimääräisiä viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että RIP3 on keskeinen rooli tässä prosessissa [18, 21]. Vaikka jotkut raportit viittaavat siihen, että TRAIL voi aiheuttaa necroptosis syöpäsoluja [22-24], mekanismeja ei ole selvitetty täysin.

Tässä tutkimuksessa selvitettiin roolit ROS ja caspases in TRAIL: n indusoiman apoptoosin ja necroptosis ihmisen haiman syöpäsoluja. Niistä neljä ihmisen haimasyövän solulinjoissa, ROS tasot olivat koholla vain kaksi TRAIL-herkkien linjojen: MiaPaca-2 ja BxPC-3. Kuitenkin ROS ollut proapoptoottisen rooli vain MiaPaca-2-soluissa, mutta ei BxPC-3-soluissa. Näissä kokeissa havaittiin, että TRAIL käsiteltäväksi ROS esto lisäsi väestön anneksiini V

– /propidiumjodidia (PI)

+ alussa nekroottisten solujen in MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluja, mikä viittaa siihen, että ROS ollut estävä rooli TRAIL aiheuttaman necroptosis molemmissa solulinjoissa. Lisäksi necrostatin-1 (a RIP1 estäjä) pienensi anneksiini V

– /PI

+ ovat näissä TRAIL-käsiteltyjä soluja, ja siRNA-välitteisen knockdovvn RIP3 osoittivat samankaltaisia ​​tuloksia BxPC-3-soluissa, mikä että solukuolemaa havaittiin johtui necroptosis. Lopuksi necroptosis edistettiin TRAIL käsiteltäviksi esto joko kaspaasi-9 tai -2, joista jälkimmäinen pitää ”orpo” kaspaasi joiden roolit solukuoleman ei ole selvitetty täysin [25, 26]. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ROS lisääntyvät TRAIL-herkkien MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluissa, mutta että ROS osallistuvat apoptoosin ainoastaan ​​TRAIL saaneilla MiaPaca-2-soluissa. Tuloksista käy ilmi, että ROS ja kaspaasi-9 /-2 pelata sääntelyn rooleja TRAIL aiheuttama necroptosis ihmisen haimasyövän soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

kaksi ihmisen haimasyövän solulinjoissa (AsPC-1 ja BxPC-3) hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Kaksi muuta ihmisen haimasyövän solulinjoissa (MiaPaca-2 ja Panc-1) oli ystävällisesti Dr. K. Takenaga (Shimanen yliopisto Lääketieteellinen tiedekunta) [27]. Nämä solulinjat pidettiin DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) ja 20 ug /ml gentamysiini (Sigma-Aldrich). PrEC on normaalin eturauhasen epiteelin solulinja hankittiin Lonza (Walkersville, MD, USA) ja pidettiin PrEBM (Lonza).

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkyky analysoitiin käyttämällä WST- 8 määritys (Nacalai Tesque, Kioto, Japani). Lopussa itämisaika, 10 ui WST-8-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyjä inkuboitiin vielä 3 tuntia. Absorbanssi kussakin kuopassa mitattiin 560 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

Reagenssit

inhibitiomäärityksissä seuraavat inhibiittorit lisättiin 1 h ennen lisäksi TRAIL: yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), kaspaasi-8-estäjä Z-IETD-FMK (R Thermo Scientific, Rockford, IL , USA), joka sisältää proteaasi-estäjän cocktail (Nacalai Tesque). Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin 4-12% gradientti tai 12% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja. Membraanit blokattiin ja blotteja inkuboidaan seuraavat ensisijaiset vasta-aineet: anti-RIP3 (13526; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-kaspaasi-3 (9668, Cell Signaling Technology), anti-kaspaasi-8 ( M032-3, Medical and Biological Laboratories, Nagoya, Japani), anti-kaspaasi-9 (9508; Cell Signaling Technology), anti-kaspaasi-2 (2224; Cell Signaling Technology), anti-β-aktiini (BioLegend, San Diego , CA, USA), tai anti-α-tubuliinin (Santa Cruz Biotechnology). Pesun jälkeen huoneenlämpötilassa inkuboinnin kalvojen 30 min joko vuohen anti-kani-tai vuohen anti-hiiri-alkalinen fosfataasi-konjugoitua sekundaarista vasta-aineita (Invitrogen) käytettiin havaitsemaan ensisijainen vasta-aineita. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttäen CDP-tähti kemiluminesenssin ja kuvattavan käyttäen ImageQuant LAS-4000-järjestelmä (FujiFilm, Tokio, Japani).

transfektio Sirna (siRNA) B

transfektio siRNA oli suoritettiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RIP3 siRNA (sc-61482) hankittiin Santa Cruz Biotechnology. Ohjaus siRNA (6568) ostettiin Cell Signaling Technology. Kolmen vuorokauden kuluttua siRNA transfektion jälkeen solut käytettiin myöhemmissä kokeissa.

Tilastolliset analyysit

Data arvioitiin tilastollisesti käyttämällä paritonta kaksisuuntaisella Studentin

t

-testaukset.

P

arvo on alle 0,05 pidettiin osoittamaan tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

Tuotanto ROS TRAIL-herkkien haimasyöpäsoluissa

ensin tutkinut herkkyys ihmisen neljän haimasyövän solulinjoissa ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolulinja PrEC TRAILiin hoitoon. Valitsimme nämä syövän solulinjoista, koska ne ovat hyvin ominaista niiden mutaatioiden

K-ras

ja

p53

[28] ja koska me aiemmin tutkittu niiden TRAIL herkkyys [29]. Tämän seurauksena, elinkelpoisuutta sekä MiaPaca-2 ja BxPC-3-solut vähenivät, kun läsnä TRAIL annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas muut kolme riviä (Panc-1, AsPC-1, ja PrEC) ei ollut selvää herkkyyttä kohti TRAIL (kuvio 1A). Tutkimme seuraavaksi ilmentymistä TRAIL-reseptorien näillä soluilla (kuvio 1B). Ilmaisu DR4 oli lähes mahdoton havaita kaikissa solulinjoissa. Vaikka DR5 ilme Pancin-1 ja PrEC oli alhainen, kaikki solulinjat oli positiivinen DR5. Mitä houkutuslinnut reseptorien MiaPaca-2 ja PrEC solut olivat osittain positiivisia DcR2. Me seuraavaksi ratkaistava, onko ROS tuotettu näissä solulinjoissa ja totesi, että TRAIL hoito lisäsi merkittävästi ROS tasoilla vain MiaPaca-2 ja BxPC-3-solut (

P

0,05 MiaPaca-2,

P

0,01 BxPC-3) (kuvio 1 C ja 1 D). PrEC solut puolestaan ​​laskenut ROS jälkeen TRAIL hoidon. Nämä tulokset osoittivat, että ROS valmistetaan vain TRAIL-herkkien haimasyövän solulinjoissa (MiaPaca-2 ja BxPC-3).

(A) Neljä ihmisen haimasyövän linjat ja PrEC soluja viljeltiin, kun läsnä oli TRAIL . 48 tunnin kuluttua, solujen elävyys määritettiin WST-8-määrityksessä. Esitetyt tiedot edustavat keskiarvoa kolmesta kuoppiin. (B) ekspressio DR4, DR5, DcR1, ja DcR2 viiden solulinjoissa tutkittiin virtaussytometrialla. Rivi edustaa värjäytymistä mAb spesifisiä joko DR4: n tai DR5: n, jota seurasi FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Solid harmaa edustaa värjäys FITC-konjugoidulla anti-hiiri-IgG yksin. Mitä ilmaus DcR1 ja DcR2, linja edustaa värjäyksen mAb erityisiä DcR1 ja DcR2; kiinteä harmaa edustaa värjäytymistä isotyypin FITC-konjugoitu anti-hiiri-IgG. (C) Viisi solulinjoja viljeltiin TRAIL (50 ng /ml). Kun 6 h MiaPaca-2 ja 12 h muut neljä riviä, nämä solut viljeltiin karboksi-H

2DCFDA (50 uM) 30 minuutin ajan ja tutkittiin niiden ROS tasoilla virtaussytometrialla. Numero edustaa fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo. (D) tiedot on esitetty edustavat keskiarvoa kolmesta kuoppiin. MFI: keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus. *

P

0,05, **

P

0,01, NS, ei merkittävää.

esto ROS laski TRAIL: n indusoiman apoptoosin ainoastaan ​​MiaPaca -2-solut

vieressä tutkittiin vaikutuksia kahdessa ROS-inhibiittorit, NAC ja Tempol [30], on TRAIL: n indusoiman apoptoosin TRAIL-herkkien MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluja. TRAIL huomattavasti prosenttiosuudet anneksiini V

+ solujen keskuudessa solulinjoissa (

P

0,01). Lisääminen NAC, peroksidia estäjä, vähensi prosenttiosuus anneksiini V

+ TRAIL käsiteltyä MiaPaca-2-solut (

P

0,05), mutta ei vähennä apoptoosin TRAIL saaneilla BxPC- 3-soluissa (kuvio 2A ja 2B). Vaihtoehtoisesti, lisäämällä Tempol, superoksidi-estäjä, ei ollut mitään vaikutusta TRAIL-indusoitua apoptoosia MiaPaca-2-soluissa mutta kasvoivat sen TRAIL-käsitelty BxPC-3-solut (

P

0,01) (kuvio 2C ja 2D). Nämä tulokset osoittavat, että ROS, peroksidia ja superoksidi, saavat aikaan vastakkaiset vaikutukset kahden TRAIL-herkkien solulinjojen; peroksidi lähettää pro-apoptoottisen roolin TRAIL-käsitelty MiaPaca-2-soluissa, mutta superoksidi on anti-apoptoottinen in TRAIL-käsitelty BxPC-3-soluissa.

(A) MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluja viljeltiin TRAILin kanssa (50 ng /ml) kanssa tai ilman NAC (10 mM) 24 tunnin ajan. Värjäyksen jälkeen anneksiini V-FITC /PI, virtaussytometria-analyysi suoritettiin. Luvut edustavat osuudet kunkin osajoukon. (B) prosenttiosuudet anneksiini V

+ solut on esitetty. (C) Molemmat solulinjat viljeltiin TRAIL (50 ng /ml) kanssa tai ilman sitä Tempol (1 mM) 24 tunnin ajan ja analysoitiin virtaussytometrialla. (D) Prosenttiosuudet anneksiini V

+ solut näkyvät. Kaikki datapisteet esitetään edustavat keskiarvoa kolmesta viljelykuoppiin. *

P

0,05, **

P

0,01, NS, ei merkittävää.

RIP1- ja RIP3 riippuvaa necroptosis in TRAIL saaneilla haimasyövän soluja ROS inhibitio

tarkastamisen vaikutuksia ROS estoa TRAIL-indusoitua apoptoosia MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluissa, havaitsimme, että prosenttiosuudet anneksiini V

– /PI

+ aikaisin necrotic solut lisääntyivät TRAIL käsittelemällä sitä ROS esto (kuvio 2A ja 2C). Tulokset anneksiini V

– /PI

+ aikaisin nekroottisten solujen on laskettu ja esitetty kuvassa 3A. Lisääminen NAC huomattavasti prosenttiosuudet anneksiini V

– /PI

+ TRAIL-käsitellyt solut (

P

0,01 MiaPaca-2,

P

0,05 BxPC-3). Samanlainen tulos havaittiin, kun Tempol lisättiin TRAIL-käsitelty BxPC-3-solut (

P

0,01 BxPC-3), mutta ei MiaPaca-2-soluissa. Koska anneksiini V:

– /PI

+ solut edustavat aikaisin nekroottisia soluja, nämä tulokset viittaavat siihen, että TRAIL indusoi ohjelmoidun kuolion (necroptosis) alle ROS esto, varsinkin peroksidia esto. Me seuraavaksi kysytään lisäämällä necrostatin-1, estäjä RIP1 ja kuolion [31], voivat vähentää nämä varhaiset nekroottisia soluja. Kuten kuviossa 3B ja 3C, yhdistelmä TRAIL ja NAC huomattavasti osuudet anneksiini V

– /PI

+ MiaPaca-2 ja BxPC-3-solut (

P

0,01 for MiaPaca-2 ja BxPC-3), kun taas lisäämällä necrostatin-1 vähensi merkittävästi niitä (

P

0,01 MiaPaca-2,

P

0,05 BxPC-3 ).

(A) prosenttiosuudet anneksiini V

– /PI

+ solut laskettiin tulosten perusteella kuvion 2 (B) molemmat solulinjat viljeltiin TRAIL (50 ng /ml) ja NAC (10 mM) kanssa tai ilman necrostatin-1 (20 uM) 24 tunnin ajan. Värjäyksen jälkeen anneksiini V-FITC /PI, virtaussytometria-analyysi suoritettiin. Luvut edustavat osuudet kunkin osajoukon. (C) Prosenttiosuudet anneksiini V

– /PI

+ solut laskettiin. Kaikki datapisteet esitetään edustavat keskiarvoa kolmesta viljelykuoppiin. *

P

0,05, **

P

0,01.

RIP1 ja RIP3 ovat kriittisiä molekyylejä necroptosis [18-21]. Siksi tutkimme ilmaus RIP1 ja RIP3 neljässä haimasyövän solulinjoissa ja totesi, että kaikki olivat positiivisia RIP1, kun taas MiaPaca-2 ja Panc-1 olivat negatiivisia RIP3 (kuvio 4A). Olemme edelleen tutkittiin, mikä vaikutus siRNA-välitteisen knockdovvn RIP3 on necroptosis aiheuttama rinnakkaisesta inkuboinnista TRAILin kanssa ja NAC. Transfektio RIP3 siRNA laski RIP3 proteiinin ilmentymistä BxPC-3-soluissa, mutta ei ollut vaikutusta ilmentymistä RIP1 (kuvio 4B). Knockdovvn RIP3 hieman, mutta merkittävästi vähentynyt solujen elävyys vastauksena TRAIL (

P

0,05 25 ng /ml,

P

0,01 50 ng /ml) ( kuvio 4C). Kuten kuviossa 4D ja 4E, selektiivinen knockdovvn RIP3 merkittävästi vähentynyt osuudet anneksiini V

– /PI

+ -soluissa, sen jälkeen TRAIL-hoidon BxPC-3-soluja viljeltiin joko NAC tai Tempol (

P

0,01 NAC,

P

0,05 Tempol). Mielenkiintoista, esto peroksidia NAC merkittävästi kasvattanut anneksiini V

+ apoptoottisten solujen RIP3 siRNA-transfektoiduissa ja TRAIL-käsitellyn BxPC-3-solut (

P

0,01). Nämä tulokset viittaavat siihen, RIP1 riippuva necroptosis edistetään TRAIL saaneilla MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluilla eston peroksidia, ja että TRAIL kohtelun estäminen ROS (peroksidia ja superoksidi) edistää RIP3 riippuva necroptosis in BxPC-3-soluissa .

(A) ilmentyminen RIP3 ja RIP1 proteiini tutkittiin neljässä syöpäsolun riviä. p-Actin käytettiin kontrollina. (B) MiaPaca-2 ja BxPC-3-solut transfektoitiin kontrolli-siRNA tai RIP3 siRNA. Kolme päivää transfektion jälkeen solut kerättiin ja tutkittiin RIP3 ja RIP1 proteiinin ilmentymiseen. (C) BxPC-3-solut transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai RIP3 siRNA 3 päivää ennen viljeltiin TRAIL. 48 tunnin kuluttua, solujen elävyys määritettiin WST-8-määrityksessä. (D) BxPC-3-solut transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai RIP3 siRNA 3 päivää ennen viljeltiin TRAIL ja joko NAC (10 mM) tai Tempol (1 mM) 24 tunnin ajan. Värjäyksen jälkeen anneksiini V-FITC /PI, virtaussytometria-analyysi suoritettiin. Luvut edustavat osuudet kunkin osajoukon. (E) Prosenttiosuudet anneksiini V

– /PI

+ solujen ja anneksiini V

+ solut laskettiin. Kaikki datapisteet esitetään edustavat keskiarvoa kolmesta viljelykuoppiin. *

P

0,05, **

P

0,01.

roolit caspases in TRAIL: n indusoiman apoptoosin ja necroptosis

Me seuraavaksi tutkinut roolit caspases vuonna apoptoosin ja necroptosis in TRAIL saaneilla MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluissa. TRAIL hoito aktivoitu kaspaasi-3, -8, ja -9 molemmissa solulinjoissa (kuvio 5A). Koska rooli kaspaasin 2 solukuolemaan ei ole selvitetty täysin [25, 32], me seurataan tätä kaspaasi ja totesi, että TRAIL hoito myös aktivoitu kaspaasi-2. Olemme edelleen tutki vaikutuksia paneelin kaspaasi estäjien TRAIL: n indusoiman apoptoosin (kuvio 5B ja 5C). Lisäyksen pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD syvästi inhiboi TRAIL-indusoitua apoptoosia sekä solulinjoissa, ja inhibiittorit kaspaasi-8, -9, tai -2 myös esti merkitsevästi TRAIL-indusoitua apoptoosia (

P

0,01). Olemme tutkineet vaikutus näiden estäjien anneksiini V:

– /PI

+ varhain apoptoottisia soluja (kuvio 5D). Mielenkiintoista, inhibiittorit joko kaspaasi-9 tai -2 merkittävästi lisääntynyt osuudet varhaisten apoptoottisten solujen TRAIL saaneilla MiaPaca-2 ja BxPC-3 viljelmät (

P

0,05 tai

P

0,01). Nämä tulokset osoittavat, että paneeli caspases osallistuu TRAIL aiheuttaman apoptoosin nämä rivit ja viittaavat siihen, että kaspaasi-9 ja -2 olla estävä rooli TRAIL aiheuttama necroptosis.

(A) MiaPaca-2 ja BxPC -3 soluja viljeltiin TRAIL (50 ng /ml) 12 h, ja proteiinin ekspressio kaspaasi-3, kaspaasi-8, kaspaasi-9, ja kaspaasi-2 arvioitiin immunoblot. a-Tubulin käytettiin kontrollina. (B) MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluja viljeltiin TRAIL (50 ng /ml) läsnä ollessa paneelin kaspaasi-inhibiittorit (20 uM) 24 tunnin ajan. Värjäyksen jälkeen anneksiini V-FITC /PI, virtaussytometria-analyysi suoritettiin. Luvut edustavat osuudet kunkin osajoukon. Prosenttiosuudet anneksiini V

+ solut (C) ja anneksiini-V

– /PI

+ -soluja (D) määritettiin virtaussytometrialla. Kaikki datapisteet esitetään edustavat keskiarvoa kolmesta viljelykuoppiin. *

P

0,05, **

P

0,01. panCi, yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä; C9i, kaspaasi-9-estäjä; C8i, kaspaasi-8-estäjä; C2i, kaspaasi-2-estäjällä. Vehikkelikontrollit sai yhtä suuri määrä DMSO: ta.

o välinen ylikuuluminen kaspaasi-2 /-9 ja ROS TRAIL-käsiteltyjen syöpäsolujen

tarkastellaan seuraavaksi suhdetta kaspaasi-9 , -2, ja ROS TRAIL saaneilla haiman syöpäsoluja. Lisäämällä kaspaasi-2-estäjän esti TRAIL-indusoidun kaspaasi-9 lohkaisu kahdessa solulinjassa, mutta ei ollut mitään näkyvää estävä vaikutus on kaspaasin 8 aktivaation (kuvio 6A). Kaspaasi-9 estäjä ei tukahduttaa kaspaasin 2 aktivaation (kuvio 6B). Lisäämällä NAC ei onnistunut tukahduttamaan TRAIL-indusoitua kaspaasi-9 ja -2 (kuvio 6C). Lopuksi tutkittiin vaikutukset kaspaasi-2 tai -9-inhibition ROS TRAIL-käsitellyt solut. Mitään selvää tukahduttaminen ROS tuotanto todettiin (kuvio 6D ja 6E). Nämä tulokset osoittavat, että kaspaasi-2 on ylävirtaan kaspaasi-9, ja että ei ole välinen ylikuuluminen näiden kaspaasit ja ROS TRAIL-käsitelty MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluissa.

(A) MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluja viljeltiin TRAIL (50 ng /ml) kanssa tai ilman sitä kaspaasi-2-estäjän (20 uM) 12 tunnin ajan, ja proteiinin ilmentyminen kaspaasi-3, -8, ja -9 arvioitiin immunoblot . a-Tubulin käytettiin kontrollina. (B) MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluja viljeltiin TRAIL (50 ng /ml) kanssa tai ilman kaspaasi-9-inhibiittori (20 uM) 12 tunnin ajan, ja proteiinin ilmentyminen kaspaasi-2 arvioitiin immunoblot. p-Actin käytettiin kontrollina. (C) MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluja viljeltiin TRAIL (50 ng /ml) kanssa tai ilman NAC (10 mM) 12 tunnin ajan, ja proteiini ilmentymistä kaspaasin 8, -2, ja -9 arvioitiin immunoblottauksella. p-Actin käytettiin kontrollina. (D) MiaPaca-2 ja BxPC-3-soluja viljeltiin TRAIL (50 ng /ml), jossa on esitetty estäjien (20 uM). Koska ajoneuvon hallintaan, yhtä suuri tilavuus DMSO: ssa. Kun 6 h MiaPaca-2 ja 12 h BxPC-3, nämä solut viljeltiin karboksi-H

2DCFDA 30 minuuttia, ja tutkittiin ROS tasoilla virtaussytometrialla. Numero edustaa fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo. (E) Tiedot edustavat keskiarvoa kolmesta viljelykuoppiin. MFI: keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus. *

P

0,05, NS, ei merkittävää.

Keskustelu

Koska haimasyöpä kestää hyvin perinteisiin hoitoihin ja liittyy huonoon ennusteeseen [ ,,,0],33], uudet hoitotapoja tarvitaan. TRAIL voi olla terapeuttisesti käyttökelpoisia, koska tämä molekyyli voi indusoida solukuoleman monissa syöpien aiheuttaen samalla lähes mitään sytotoksisuutta normaaleihin soluihin [2]. Tässä tutkimuksessa, ensin tutkittu roolit ROS TRAIL-indusoitua apoptoosia ihmisen haimasyövän solulinjoissa. Näissä kokeissa olemme yllättäen havainneet, että inhibitio ROS edistää TRAIL-indusoitua nekroosi syöpäsoluja. Sitten määritetään, että tämä solukuolema oli necroptosis.

ROS pelata erilaisia ​​rooleja monenlaisia ​​soluja. Alhainen fysiologiset tasot ROS funktion toisiolähetteinä solujen väliseen signalointiin ja tarvitaan normaalia solujen toimintaa, kun taas liiallinen ROS heikentää solujen toimintoja ja edistää solukuolemaa [34]. TRAIL on osoitettu aiheuttavan ROS syöpäsoluja [35], ja antioksidantit estävät DR signalointi-välitteisen apoptoosin [36, 37], mikä viittaa siihen, että ROS ovat välittäjiä kuoleman ligandin indusoiman apoptoosin. Tässä havaittiin, että ROS tuotettu vain TRAIL-herkkien haimasyövän solulinjoissa, ja että peroksidi vaikuttaa, ainakin osittain, että TRAIL-indusoitua apoptoosia in MiaPaca-2-soluissa (kuvio 2B). Vaihtoehtoisesti estäjä superoksidi Tempol yllättäen lisääntynyt apoptoosin TRAIL-käsitelty BxPC-3-soluja (kuvio 2D), viittaa siihen, että superoksidin toimii anti-apoptoottisen välittäjänä näissä olosuhteissa. Mikä oli mekanismi estävää vaikutusta superoksidin on apoptoosin TRAIL-käsitelty BxPC-3-solujen? ROS, erityisesti superoksidi, voi aiheuttaa autophagy [26, 38, 39], ja autophagy voi toimia cytoprotectively [40]. Olemme äskettäin raportoitu, että autophagy: llä on anti-apoptoottinen rooli TRAIL-käsiteltyjen haimasyövän soluja [29]. Tämän vuoksi tutkimme, autophagy indusoitiin BxPC-3-soluja, ja superoksidi-inhibiittori Tempol tukahdutetaan ROS-indusoidun autophagy, mikä edistää apoptoosia. Arvioimme taso autophagy syöpäsoluissa tutkimalla ilmaus LC3. Tämän seurauksena, autophagy oli voimakkaasti indusoitunut BxPC-3-soluissa verrattuna muihin haimasyövän solulinjoissa, kun taas Tempol ei ekspression inhiboimiseen LC3-tyypin II, markkerina autophagy [41], ja BxPC-3-solut ” S1 kuvio ”. Autophagy ei edistä ROS välittämää suojan TRAIL saaneilla BxPC-3-soluissa. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään tarkkaa mekanismia.

Jotkut ligandit, mukaan lukien TNFa, FasL ja TRAIL, voivat aiheuttaa sekä apoptoosin ja necroptosis [1]. Mekanismeja, jotka määräävät solujen päätös apoptoosiin tai necroptosis on tutkittu intensiivisesti. Apoptoosin, kaspaasit ovat teloittajista apoptoosin; kuitenkin, nämä proteaasit ole positiivista roolia necroptosis [15]. ROS ehdotetaan olevan teloittajista of necroptosis [42], ja jotkut solutyyppejä, kuten hiiren L929 ja alkion fibroblastit tuottavat ROS vastauksena TNFa ja näyttää necroptosis [43, 44]. Lisäksi hoito antioksidantit estää necroptosis joissakin solutyypeissä [44]. Kuitenkin, ROS ei tarvita necroptosis kaikissa solutyypeissä ja antioksidantit eivät pysty suojaamaan joitakin solulinjoja tämän tyyppinen solukuoleman [45, 46]. Nämä tekijät osoittavat, että ROS-välitteinen necroptosis on todennäköisesti riippuvaista solutyypistä ilmiö. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että lisäämällä NAC estää peroksidia edistetään necroptosis upon TRAIL stimulaation kahdessa ihmisen haimasyövän solulinjoissa (kuvio 3A). Tämä lisäys väheni necrostatin-1, joka on RIP1 inhibiittori [30] (kuvio 3B ja 3C), ja siRNA-välitteinen RIP3 pudotus laski necroptosis in TRAIL-käsitelty BxPC-3-soluilla estyminen ROS (peroksidin ja superoksidi) (kuvio 4D ja 4E). Nämä tulokset osoittivat, että ROS olla estävä rooli TRAIL aiheuttaman necroptosis in BxPC-3-soluissa. Vaihtoehtoisesti MiaPaca-2-solut olivat negatiivisia RIP3 (kuvio 4), mikä viittaa siihen, että RIP3 oli tarpeeton necroptosis in TRAIL saaneilla MiaPaca-2-soluissa.

Tuloksemme viittaavat siihen, että ei ole ilmeistä ylikuuluminen välillä ROS ja kaspaasi-2 /kaspaasi-9 olemassa koejärjestelmässä. Se on edelleen ratkaisematta, kuinka varhaisessa necrotic väestö aiheutettiin TRAIL käsittely esteen alaisena kaspaasin 2 tai -9. Esto kaspaasin 8 edistää RIP1 /RIP3 kompleksin muodostumista, joka voi johtaa kuolemaan signaloinnin aiheuttama necroptosis [19, 20]. Tämä ei näytä olevan kyse näissä kokeissa, jossa esto kaspaasin 8 oli vähemmän vaikutusta kuin teki esto kaspaasi-2 tai -9 (kuvio 5B ja 5D). Lisäksi yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä Z-VAD ei ollut vaikutusta TRAIL aiheuttamaa necroptosis haiman syöpäsoluja.

kaspaasi-2 on kutsutaan ”orpo” kaspaasi [25], ja sen rooli TRAIL-indusoitua apoptoosia syöpäsolujen ei ole osoitettu täysin. On raportoitu, että kaspaasi-2 on välttämätön optimaalisen TRAIL -välitteisen pilkkomisen Bid ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa [47]. Lisäksi, kaspaasi-2 hioo syöpäsolujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin käsittelemällä prokaspaasi-8 [48]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että esto kaspaasi-2 tukahdutetaan apoptoosin TRAIL-käsiteltyjen syöpäsolujen. Vaihtoehtoisesti ROS aktivoida kaspaasi-2, ja DNA-vaurioita myös indusoi sen pilkkominen [49]. Me raportoi äskettäin, että ROS laukaista DNA-vaurioita, mikä johtaa kaspaasi-2 in munuaissolusyövässä linjojen [50]. Kaspaasi 2 aktivoinnin vastauksena DNA vaurioita on tärkeä yhteys tämän vahingon ja aktiivisuutta apoptoottisen reitin [50, 51]. Lisäksi ROS laukaisi kaspaasi-2 aktivaation ja indusoi apoptoosia ihmisen leukeemisten T-solulinjan [51]. Kuitenkin tässä tutkimuksessa ei havaittu olevan ylikuulumisen välillä ROS ja caspases (kuvio 6).

ilmentymistä joko DR4 tai DR5 on edellytys TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Viisi solulinjat tutkimukset olivat positiivisia DR5, mutta ei DR4 (kuvio 1B).