Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori delta (PPARD) on ydin- hormonireseptoripositiivinen mukana kolorektaalisyövässä ( CRC) erilaistumista ja etenemiseen. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää esiintyvyys ja kirjo varianttien

PPARD

geenin CRC, ja niiden osuus kliinis päätepisteet.

menetelmät ja havainnot

suora sekvensointi on

PPARD

geeni tehtiin 303 primaarikasvaimille, verinäytteistä 50 potilaalla on ≥3 vaikuttaa ensimmäisen asteen sukulaiset, 50 potilasta 2 vaikutti ensimmäisen asteen sukulaiset, 50 satunnaista potilaita, 360 tervettä verrokkia, ja 6 koolonsyöpäsolulinjoissa. Mutaatio analyysi paljasti 22 eri transversiot, 7 heistä olivat uusia. Kolme kaikki vaihtoehdot olivat somaattiset (c.548A G, p.Y183C, c.425-9C T, ja c.628-16G A). Kaksi missensemutaatioita (p.Y183C ja p.R258Q) olivat patogeenisia käyttämällä

in silico

ennakoivaa ohjelma. Viisi toistuva variantteja löydettiin /vieressä eksonit 4 (c.1-87T C, c.1-67G A, c.130 + 3G A ja c.1-101-8C T) ja eksonin 7 (c.489T C). Variant c.489C /C havaittu kasvaimia oli korreloi huonompi erilaistumiseen (

P

= 0,0397).

Johtopäätökset

Olemme löytäneet 7 uudenlaisia ​​varianttien joukossa 22 perinnöllinen tai hankittu

PPARD

variantteja. Somaattisten ja /tai missense variantit havaitaan CRC potilailla ovat harvinaisia, mutta osoittavat kliinistä merkitystä

PPARD

geeni.

Citation: Ticha I, Gnosa S, Lindblom A, Liu T, Sun XF (2013) variantit

PPARD

Gene ja niiden kliinis merkitys peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (12): e83952. doi: 10,1371 /journal.pone.0083952

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 17 syyskuu 2013; Hyväksytty: 10 marraskuu 2013; Julkaistu: 31 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Ticha et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant Support : Tätä työtä tukivat avustuksia Ruotsin Cancer Foundation, Swedish Research Council, ja terveyslautakunnan Research Council in Kaakkois-Ruotsissa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Worldwide, diagnoosi peräsuolen syöpä (CRC) sijoittuu toiseksi naisilla ja kolmanneksi miehillä, ja on neljänneksi yleisin syy syövän kuolleisuus. Lisäksi esiintyvyys CRC on kasvussa [1]. Patogeneesin CRC on monimutkainen ja ei vielä täysin ymmärretä. CRC on ajateltu olevan monivaiheinen prosessi syytetään kertyminen genomisen aberraatioita, epäonnistuminen apoptoosin, ja poikkeavuuksia useita signalointireittien [2]. Tuoreessa tutkimuksessa ruotsalaisten perheiden vaikuttaa CRC osoittaa merkittävää vaikutusta geneettisen taustan familiaalinen CRC potilaiden [3]. Ne liittyvät geenit taudin alkamisen ja etenemisen CRC ovat rajalliset. Low-penetrant geenejä voi olla tärkeä rooli peräsuolen kasvainten synnyssä ja on tunnistettava.

Viimeisen vuosikymmenen aikana, suurta huomiota on kiinnitettävä tutkimiseen roolin peroksisomiproliferaattoriaktivoidun reseptorin delta (PPARD) CRC [4]. Aiemmin Sunin tutkimusryhmä suoritetaan mRNA ja proteiini analysoidaan CRC kudos- ja solulinjoista, joka ehdotti estävää roolia PPARD peräsuolen kasvainten synnyssä [5] – [8]. Harman

et al

. [9] saatiin myös vahvoja todisteita siitä, että PPARD vaimentaa paksusuolen syövän synnyn, muuntogeenisten hiiriä malleja. Erityisesti PPARD edistää erilaistumista ja tukahduttaa solujen lisääntymistä, jota tukevat myös muut [10]. Lisäksi Sun ja työtoverit löysivät korrelaation korkeampi ilmaus PPARD ja suotuisa selviytymistä peräsuolen syöpäpotilailla [6].

Tämä ligandiaktivoituja transkriptiotekijä kuuluu ydinaseiden hormonin superperheen, ja koodataan geenin

PPARD

(MIM # 600409), joka on yhdeksän eksonia, viisi näistä on koodaus, ja ulottuu noin 85 kb: n kromosomissa 6p21.2 [11]. PPARD voidaan aktivoida rasvahapot ja niiden johdannaiset, ja sen ekspressio on suhteellisen korkea ruoansulatuskanavassa verrattuna muihin kudoksiin [12]. PPARD on osoitettu olevan osallisena säätelyyn lipidi- ja glukoosiaineenvaihdunnan ja niihin liittyviä häiriöitä [13] – [15], ja sitä pidetään lupaavana lääke tavoite hoitoon metabolisen oireyhtymän sairauksiin [16].

Huolimatta syntymässä yksimielisyys siitä, että PPARD on keskeinen toimija CRC, erilaiset havainnot vaikeuttavat erityistä roolia kasvainten synnyssä. Onko PPARD on edistää tai estämällä rooli peräsuolen syövän synnyn on edelleen keskustelu [17], [18]. Geneettisiä variantteja

PPARD

geeni saattaisi olla vastuussa näistä kiistaa ja tähän mennessä rooliin

PPARD

variantit CRC ei ole tutkittu. Vain muutamia tutkimuksia tutkittu suhdetta polymorfismien

PPARD

geenin ja ominaisuuksia rasva ja hiilihydraattien aineenvaihduntaan [19], [20]. Coding eksonit 4-9 ja

PPARD

geeni sekvensoitiin suuri ihmisen genomin analyysi rinta- ja paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [21], [22]. Kuitenkin

PPARD

ei validoitu ehdokkaaksi syöpää geeni näissä analyyseissä. Variant c.489T C (rs2076167) oli suljettu etsiä ehdokkaan alleelien alttiita CRC mutta mitään korrelaatiota kanssa riski CRC todettiin [23].

PPARD on osoitettu olevan osallisena CRC kehittämiseen ryhmämme ja muut. Kuitenkin merkitys

PPARD

genomista muutoksia CRC ei ole täysin osoitettu. Tavoitteet Tämän tutkimuksen oli (

i

) taajuuden määrittämiseksi ja kirjo varianttien

PPARD

geeni neljässä eri ikäluokat CRC-potilailla 303 kudosnäytteitä CRC, ja 150 verinäytteitä: 50 satunnaista CRC potilasta, 50 potilasta 2 vaikutti ensimmäisen asteen sukulaiset, ja 50 perinnöllinen potilaalla on ≥3 vaikutti ensimmäisen asteen sukulaiset, ja (

ii

) arvioida mahdollisia suhdetta varianttien kanssa kliinis muuttujia. Kuusi ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa, yleisesti käytetty

in vivo

paksusuolisyövän mallia Sunin laboratorio- ja muut, olivat mukana tässä tutkimuksessa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

tutkimus hyväksyi eettisten toimikuntien Linköpingin yliopisto, Ruotsi ja Karolinska Institutet, Ruotsi.

Potilaiden ja terveiden verrokkien

Tähän tutkimukseen osallistui ensisijainen CRC kudosta, ja, jos saatavilla, kaukainen normaali limakalvo alkaen kantajia

PPARD

variantti 303 potilasta (ryhmä I) diagnosoitiin yliopistollisen sairaalan Linköpingissä Vrinnevi Hospital Norrköpingissä. Tissue kerättiin ensisijainen leikkauksen vuosina 1989 ja 2004, ja varastoidaan -70 ° C: ssa. Verinäytteet ei ollut saatavilla tämän kohortin. Edelleen, verinäytteet ulkopuoliselta CRC potilaista: 50 satunnaista CRC potilaat (ryhmä II), 50 potilasta 2 vaikutti ensimmäisen asteen sukulaiset (ryhmä III), 50 perinnöllinen potilaalla on 3 tai enemmän vaikutusta ensimmäisen asteen sukulaiset (ryhmä IV), ja 360 ei-syöpä valvonta, tutkittiin. Verinäytteitä (ryhmä II-III) saatiin vuosina 2004 ja 2009 14 eri sairaalassa keskellä Ruotsissa. Arvioida väestö taajuus

PPARD

variantteja, ohjaamaan muita kuin syöpä alaryhmä, joka sisältää verenluovuttajia rekrytoitiin vuoden 2010 aikana Uppsalan alueella Ruotsissa käytettiin. Molemmat tapaukset ja valvonta olivat Euroopan syntyperä ja Ruotsista. Kirjallinen suostumus luovuttajalta tai lähiomaisen saatiin käyttöön niiden näytteiden tutkimustarkoituksiin. Ominaisuudet potilaiden ja verrokkien on esitetty taulukossa 1. kasvaimista paremmin erilaistumista mukana hyvin ja kohtuullisesti eriytetty kasvaimia, ja pahempaa erilaistuminen mukana huonosti eriytetty, mucinous tai sinettisormus-rengas solujen karsinooma. Kasvain eriyttäminen tietoja ei saatu ryhmille II-IV.

Solulinjat

Mutaatio analyysi suoritettiin myös 6 yleisesti käytetty koolonsyöpäsolulinjaa. SW480 ja SW620 solulinjat saatiin American Type Culture Collection. SW480-solulinja perustettiin ensisijaisesta paksusuolen adenokarsinooma, ja SW620 imusolmuke etäpesäke, joka on otettu samasta potilaasta vuotta myöhemmin [24], [25]. KM12C, KM12SM ja KM12L4a solulinjoja ystävällisesti professori I.J. Fidler (M. D. Anderson Cancer Center, Houston, TX) [26], [27]. KM12C on peräisin potilaasta, jolla vaiheen II paksusuolen syöpä. KM12SM on spontaani maksan etäpesäke syntynyt injektio KM12C osaksi cecum nude-hiirten. KM12L4a, kokeellinen maksa etäpesäke, tuotetaan toistetaan sisäisen perna injektio ja korjuu maksametastaaseista nude-hiirissä. Paksusuolen syöpä solulinja HCT-116 oli ystävällinen lahjoitus Prof. B Vogelstein (Ydin solun keskus, Johns Hopkins University, Baltimore, MD) [28], [29]. Solulinjat SW480, SW620, KM12C, KM12SM, ja KM12L4a kasvatettiin Eaglen minimal essential väliaineessa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja solulinja HCT-116 McCoys5A (Sigma Aldrich), jota oli täydennetty 10% lämmön avulla inaktivoitua naudan sikiön seerumin albumiinia (GIBCO, Invitrogen, Paisley, UK), 0,5% L-glutamiinia (GIBCO), 1%: sta penisilliini ja streptomysiini cocktail (GIBCO), 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa kostutetussa inkubaattorissa. Sillä KM12 solut 2% vitamiini-liuosta (GIBCO) lisättiin. Solut kerättiin 80% konfluenssin.

eristäminen nukleiinihapot Kudokset, Blood and Cell Lines

DNA eristettiin tuore kasvainkudoksen, solulinjojen ja perifeeristä kokoverta käyttäen standardimenetelmiä täytäntöön Wizard genomisen DNA Purification System (Promega, Madison, WI) tai DNeasy Veren Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). Kokonais-RNA erityisesti kudosnäytteistä ja viljeltyjä soluja eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Mutaatioanalyysi

koodaava alue

PPARD

-geeni seulottiin PCR: llä ja DNA: n suora Sanger-sekvensoinnilla 203 kasvaimet, 150 verinäytteet CRC potilailla (ryhmä II-IV), ja 6-solulinjat. Koska aika ja kustannustehokkuuden lisäksi 100 kasvain näytteet sekä valvonta seulottiin kahdessa useimmin muuttunut alueilla ulottuu eksonit 4 ja 7 Adenine kääntämisen aloituskodonin on 102 pohja eksonista 4. Siksi eksonit 4-9 ja viereisen introni sekvenssit

PPARD

geeni monistettiin käyttäen FastStart High Fidelity PCR System (Roche Applied Science, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. BigDye Terminator

v

3,1 Ready Reaction Mix (Applied Biosystems, Foster City) käytettiin sekvensointireaktion ja erottaminen suoritettiin ABI 3500 geneettistä analysaattoria (Applied Biosystems). Kerätyt tiedot analysoitiin käyttämällä Sequence Analyzer-ohjelmisto (Applied Biosystems). Suunniteltu käytetyt alukkeet monistusta ja sekvenssianalyysi on esitetty taulukossa S1. Kukin mutaatio tai epäilyttäviä fragmentit varmistettiin muun riippumattoman PCR-monistaminen ja sekvenssianalyysillä.

Käänteistranskriptaasilla-PCR-analyysillä käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) suoritettiin valmistajan ohjeiden 3 tapauksissa täytäntöön variantteja c.130 + 3G A ja c.1-101-8C T kanssa saatavissa RNA vastaavista kasvain ja normaali kudos. 856 bp: n cDNA-fragmentti, reunustavat alukkeet RP_01 /02F 5′-CAGTGTTGTACAGTGTTTTG-3 ’ylitys risteyksessä eksonien 1 ja 2, ja PRD_08R 5′-TCTGCCTGCCACAATGTCTC-3’ joka sijaitsee eksonissa 8 PCR-monistettiin ja sekvensoitiin suoraan (Fig. 1) . Sama cDNA-fragmentti sekvensoitiin SW480, SW620, KM12C, KM12SM, ja KM12L4a solulinjat.

edustaja Sekvensointianalyysin cDNA eristettiin normaaleista limakalvoa kantavan varianttien c.130 + 3G A (introni 4) ja c.1-101-8C T (introni 3) osoittaa puuttuvat eksonin 4; paino- – villityypin sekvenssi, mut – mutatoidun sekvenssin. Eksoni risteyksessä on merkitty

katkoviiva

. Eksoni 3 puuttui sekä villityypin mutatoitunut alleeli.

nimikkeistön Mutaatiot

Mutaatiot kuvattiin nimikkeistön mukaan järjestelmän suosittelema Human Genome Variation Society (kuorma-autoille) [30 ]. Nimitys genomisen muutoksia

PPARD

geeni, joka perustuu GenBankin viitesekvenssin NG_012345.1 ja NM_001171818.1. Mutaatiot, joita ei löydy kirjallisuudesta, yhtenäisen nukleotidin polymorfismi Database (dbSNP, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/, näytetty 8. elokuuta 2013) [31], tai Luettelon somaattiset mutaatiot Cancer (COSMIC, https://www.sanger.ac.uk/cosmic, tutustuttavissa 08 elokuu 2013 [32], katsottiin romaani. on epäjohdonmukaista kuvauksessa varianttien c.1-87C T (rs2016520) 5′-transloimaton alue (UTR) eksonin 4 ja synonyymi korvaaminen c.489C T (rs2076167; p.N163) eksonissa 7. mukaan GenBank referenssijaksoa (NCBI) villityyppisen alleelin on C, mutta mukaan genotyyppaus kontrolliryhmässä (taulukko 2) C-alleeli on vähäinen molempien versioiden osalta. Se on yhdenmukaiset kaksi muita tutkimuksia, suoritetaan genotyypityksen lukien nämä kaksi polymorfismien suurempia ikäluokat [15], [19] . Huomionarvoista, Skogsberg

et al

. [15] nimeltään variantti c.1-87T C + 294T /C. täten, nimeämme nämä variantit c.1-87T C ja c.489T C.

In silico

Prediction Työkalut vaikutusten arvioimiseksi on havaittu missense vaihtoehdot

arviointia varten toiminnallinen merkitys havaittujen missensemutaatio varianttien käytimme useita laajalti käytetty

in silico

ennustus ohjelmia. Nämä ohjelmat ehdottaa mahdollisia häiriöitä biologinen toiminta ja vakaus proteiinia: SIFT osana kaupallista Alamut 2,0-ohjelman (Interactive Biosoftware, Roven, Ranska), PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 /), PROVEAN (https://provean.jcvi.org/index.php), Kohdista GVGD (https://agvgd.iarc.fr), Mutation Taster (https://www.mutationtaster.org), MUpro ( https://mupro.proteomics.ics.uci.edu).

TILASTOANALYYSI

Analyysit suoritettiin käyttäen STATISTICA 10 (SatSoft, Tulsa, OK). Chi-neliö -testi levitettiin määritellä suhde toistuvat

PPARD

variantteja ja kliinis muuttujia, arvioida eroja muutoksiin taajuuksilla ryhmien välillä II-IV ja valvonta sekä testata jakeluun genotyyppien valvonnan varten lähtö Hardy-Weinberg tasapaino. Coxin Suhteellinen Hazard Model käytettiin testaamaan suhdetta PPARD varianttien ja potilaan selviytymistä, ja Kaplan-Meier menetelmää käytettiin eloonjäämiskäyrien. Kaikki testit olivat kaksipuolisia, ja

P

-arvo vähemmän kuin 0,05 katsottiin merkittäväksi.

Tulokset

variantit

PPARD

Gene in CRC Potilaat, Healthy Controls, ja Solulinjat

suora DNA-sekvenssin analyysi

PPARD

geeni osoittaa 22 eri yhden nukleotidin variantteja, näistä 5 olivat toistuvia ja 7 olivat uusia variantteja (taulukko 2 ja 3). Taajuus viisi toistuva

PPARD

varianttien monipuolinen CRC potilasaineistoihin, terveiden kontrollien ja solulinjat on esitetty taulukossa 2. Genotyypin jakaumia perinnöllinen toistuva yhden nukleotidin variantteja olivat yhdenmukaisia ​​Hardy-Weinberg tasapaino (tuloksia ei ole esitetty ). Kaikki havaitut variantit olivat siirtymät (4 missensemutaatio, 3 hiljainen, ja 15 ei-koodaavaa variantit). Arvioida ennustetut vaikutukset missensemutaatio muunnoksia proteiinien toimintaa, kuusi

in silico

ennustelaitteet käytettiin. Itse asiassa, somaattinen mutaatio p.Y183C, ja mutaatio p.R258Q luokiteltiin vahingollista (taulukko 4).

Toistuva

PPARD

Variant sijoittaminen suhteessa kliinis muuttujat

Association of toistuvien variantteja kliinis ominaisuudet, kuten sukupuoli, ikä, kasvaimen sijainti, vaihe ja erilaistuminen, tutkittiin. Variant c.489C /C oli merkittävästi liittyvät huonompi erilaistumista verrata T /C ja T /T-genotyyppien (

P

= 0,0397, taulukko 5). Kliinis tiedot niistä potilaista, joilla havaittiin variantti c.489C /C on esitetty taulukossa S3.

Ei ollut mitään merkittävää suhdetta toistuvien

PPARD

variantteja muihin kliinis muuttujat kuten sukupuoli , ikä, kasvaimen sijainti ja vaiheessa (

P

0,05, tuloksia ei ole esitetty).

karakterisointi Toistuva

PPARD

vaihtoehdot

yhteensä 196 variantit 106 (35%) potilasta ryhmä I, 28 variantit 17 (34%) potilasta ryhmässä II, 45 variantit 22 (44%) potilasta III, ja 22 variantit 11 (22% ) potilasta ryhmässä IV havaittiin. Viisi ituradan toistuva muutoksia (taulukko 2), neljä sijaitsevat tai vieressä eksonia 4 (c.1-87T C, c.1-67G A, ja yhteinen variantit c.130 + 3G A ja c.1-101 -8C T) ja toinen eksonissa 7 (c.489T C) osuus valtaosa kaikki tunnistetut variantit, ja usein esiintyi yhdessä ilman tiukkaa mallia variantin yhdistelmän. Valtaosa kantajia ainakin yhden pienen C-alleelin kyseiselle paikalle c.1-87 at 5′-UTR olivat myös kantajia ainakin yhden pienen C-alleelin kyseiselle paikalle c.489. Varustamot variantin c.1-67G A 5′-UTR: n eksonin 4 suorittaa myös toista versiota, joko c.489T /C tai c.489C /C, paitsi yhdessä tapauksessa (ryhmä II) ja variantit c. 1-101-8C T ja c.130 + 3G . Ituradan Introniset variantit c.1-101-8C T ja c.130 + 3G A, joka sijaitsee kahdeksan emäsparia ylävirtaan ja 3 emäsparia alavirtaan eksonista 4, vastaavasti, aina esiintynyt yhdessä. Kaikkien potilaiden ja verrokkien näitä variantteja kantajia heterotsygoottinen variantti c.489T /C, paitsi kahdella potilaalla (ryhmä II) – joka suorittaa muunnoksia c.489C /C ja c.1-67G /A, ja yksi kantaja muunnoksessa c .1-67G /A.

mutaatio analysoi veren näytteet osoittivat, että määrä potilaiden kuljettaa perinyt muutokset olivat pienempiä ryhmässä IV verrata ryhmien II ja III yhdistetään (

P

= 0,037 ), kun taas mitään eroa ei havaittu ryhmän II ja III (

P

= 0,305; taulukko 2). Taajuus toistuvia varianttien eksonit 4 ja 7 ei eronnut merkitsevästi ohjaus väestöstä ja alaryhmien II, III tai IV, paitsi yhteinen variantit c.1-101-8C T ja c.130 + 3G A, joka havaittiin 10% potilaista ryhmässä III verrattuna 2,5% kontrolleissa (

P

= 0,003; taulukko 2).

yhteinen variantit c.1-101-8C T ja c.130 + 3G A läheisyydessä konsensus silmukointikohdista ja on potentiaalia muuttaa posttranskriptionaalisella liittämiseen. Vaikutusten arvioimiseksi Näiden varianttien, RNA: iden kasvain ja normaali kudos 3 vaikuttaa yksilöiden ja terveiden valvontaa poimittiin ja käänteinen transkriptio suoritettiin. Sekvenssianalyysi PCR-fragmentti, joka käsittää alueen lopusta eksonin 1 eksoniin 8 cDNA paljasti eksonin 4 (Fig. 1). Kaikkien analysoitujen näytteiden puuttuvat eksonin 3. sekvensointi saman cDNA-fragmentin solulinjoissa paljasti myös puuttuu eksoni 3 (dataa ei esitetty). Viisi tunnettu vaihtoehto transkriptio variantteja PPARD on kuvattu (https://www.ncbi.nlm.nih.gov, Gene ID: 5467), ja vain yksi näistä variantteja sisältää eksonin 3 mRNA-sekvenssin. Vaihtoehtoinen transkriptio numero 4 kanssa ilman eksonit 3 ja 4 on vaihtoehtoiset aloituskodonin eksonissa 2 ja express-proteiinin isoformin 3, joka eroaa N-pää, koska puuttuu osa 5′-koodaavan sekvenssin. Muut transkriptivariantissa on aloituskodoni eksoni 4

Analyysi satunnaisessa 20 pariksi (näytteet, jotka olivat heterotsygootteja tai homotsygootteja mutatoidun variantin ainakin yhden polymorfisen sivustoja c.1-87 tai c.489) paljasti yhtä suuri heterotsygotian polymorfisessa sivustoja c.1-87T /C ja c.489T /C 4 normaaleissa kudoksissa, kun taas sovitettu kasvaimen DNA-näytteiden eri osa molempien alleelien havaittiin toistuvasti (kuvio 2).

N – normaali kudos, T – kasvainkudoksen; # 516 on esimerkki sekvenssianalyysi samalla kuviolla normaalissa ja kasvainkudoksessa.

karakterisointi Novel ja /tai somaattisten

PPARD

Vaihtoehdot

Seitsemän romaani variantteja havaittiin potilailla, valvontaa ja /tai solulinjoissa (taulukko 3). Näistä kolme variantteja oli missense ja 6 sijaitsevat intronit. Yksi näistä uusia introni variantteja oli somaattisen, yksi löydettiin kontrolliryhmässä ja yksi HCT-116-solulinja. Kaikki nämä vaihtoehdot olivat heterotsygoottinen ja havaittiin vain kerran. Sitä paitsi uusi variantteja, toinen 2 satunnaista ja 8 harvinainen variantteja havaittiin. Ominaisuudet potilailla, joilla on havaittu harvinaisia ​​muunnos on esitetty taulukossa S2.

Kiinnostavaa kyllä, kaksi kolmesta havaittu somaattisten variantteja, c.425-9C T (seitsemän emäsparia 3 ’konsensus silmukoitumiskohta) ja c .548A G (eksonissa 7, joka johtaa muutokseen erittäin konservoituneita tyrosiiniaminohapoksi on kysteiini kodonin 183, ja esiintyi yhdessä yhteisten variantteja c.1-101-8C T ja c.130 + 3G A) , havaittiin ei kahdessa muussa DNA-näytteet uutetaan avaruudellisesti eri puolilla kasvaimen eikä vastaavassa normaalissa limakalvo.

missensemutaatio c.773G A (p.R258Q) eksonissa 8 havaittiin SW480 ( solulinja on johdettu paksusuolen adenokarsinooma), mutta ei SW620-soluissa (solulinja on peräisin imusolmuke etäpesäke). Tämä muunnos tapahtuu ligandin sitova alue ja muutoksen aiheuttavan erittäin konservoituneita aminohappo arginiini glutamiinin.

Molemmat missensemutaatio variantit c.548A G (p.Y183C) ja c.773G A (s. R258Q) on ehdotettu olevan patogeeninen käyttämällä

in silico

ennakoivaa ohjelmia (taulukko 4).

keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa ensimmäistä kertaa sekvenssianalyysi

PPARD

geeni erilaisissa ryhmissä CRC potilaiden terveiden kontrollien ja koolonisyöpäsolulinja malleja. Havaitsimme 5 toistuvia ja 17 harvinaisia ​​muunnoksia, joista 7 on raportoitu ensimmäistä kertaa tässä tutkimuksessa. Kaksi tai useampi

PPARD

variantteja, enimmäkseen toistuvia muutoksia, esiintyi yhdessä suurimmalla osalla potilaista, joilla havaittiin variantti. Kaksi neljästä havaittujen missensemutaatio variantteja (p.Y183C ja p.R258Q) luokiteltiin

in silico

ennustus ohjelmia todennäköisesti patogeeninen.

Vielä kiinnostavaa, analyyseja kohortin 303 CRC potilaat (ryhmä I) paljasti, että kantajia toistuva variantti c.489C /C oli huonompi eriytetty kasvain verrattuna c.489C /T ja c.489T /T. Kuitenkin, ei ole selvää, onko tämä muunnos vie kehitystä kasvain, tai jos se on vain matkustajien mutaatio ei ole suoraa vaikutusta kunto tuumorisolujen.

On ehdotettu, että syövät proksimaalisen ja distaalisen paksusuoli voi olla kaksi erillistä syöpä, joilla on erilainen geneettinen ja ympäristöön liittyvien riskitekijöiden ja siellä kuvattiin geneettisiä eroja syöpiä, jotka syntyvät proksimaali- ja distaalisen paksusuolen [33]. Silti emme paljasta merkittäviä eroja jakautuminen muutoksiin välillä paksusuolen ja peräsuolen karsinoomat, eikä vasemmalta oikealle puolinen kasvaimia.

Lisäksi kolme somaattisten

PPARD

variantteja, c.425-9C G (p.Y183C), ja c.628-16G A, havaittiin kolme satunnaista paksusuolen kasvaimet (ryhmä I). Havaitsimme heterogeeninen somaattinen variantti, joka ei ollut havaittavissa kaikissa sekvensoitiin kasvain osittain. Variantti c.548A G on ilmoitettu COSMIC tietokannassa somaattisten mutaatioiden yhdellä potilaalla vaikuttaa okasolusyöpä [32]. Ajan tasalla, COSMIC sisältää 40 erilaista

PPARD

somaattisen variantteja, hajallaan koko geenin, havaittiin 43 ainutlaatuinen potilailla. Näistä 3 hiljainen ja 7 missense variantteja löydettiin 10 mucinous paksusuolen adenokarsinoomien, ja yksi missense muunnos peräsuolen kasvain näytteessä. Somaattisten

PPARD

variantit kuvataan myös keuhko-, rinta-, munasarja-, endometria, maksan ja eturauhassyövän, ja neuroblastooma. Läsnäolo somaattisen varianttien CRC kasvaimissa tukee merkitystä

PPARD

CRC kasvaimien syntyyn.

Screening potilaan verinäytteestä osoittivat samanlaisia ​​taajuus toistuvien varianttien sijaitsevat tai vieressä, eksonit 4 tai 7, joukossa potilasryhmät II, III ja IV verrattuna kontrolliryhmään, paitsi muita yleisemmin yhteisen varianttien c.1-101-8C T ja c.130 + 3G a III. Mielenkiintoista, havaitsimme korkein taajuus ituradan varianttien matalan riskin sairastavien potilaiden populaatiosta kaksi vaikuttaa ensimmäisen asteen sukulaiset (ryhmä III), kun taas alin taajuus havaittiin korkean riskiryhmän perinnöllisen CRC potilaista (ryhmä IV). Kuitenkin olennaisia ​​tietojen tulkintaa rajoittaa pieni näyte asetetaan ja vähältä, vaikka tilastollisesti merkitseviä eroja. Lisäanalyysit suurempi joukko potilaita halutaan tarkkoja vertailevia analyysejä.

Olemme löytäneet uusia missensemutaatio c.773G A (p.R258Q) ensisijaisessa koolonisyöpäsolulinja SW480 eikä imusolmuke metastaattinen solu line SW620. Ainutlaatuinen piirre SW480 ja SW620 solulinjoissa on, että ne ovat peräisin ensimmäisen ja toisen kasvaimia resekoitu samasta potilaasta. Toinen vaihtoehto, c.1078 + 22G A, on läsnä vain primaarikasvaimen solulinjojen KM12C muttei kokeellisessa metastaattisen solulinjat KM12SM ja KM12L4a. Distinct mutaatiostatusta primaarikasvaimen solulinjoissa ja metastaattinen solulinjoissa sekä havaitseminen somaattisten varianttien vain osassa kasvaimen (c.425-9C T ja c.548A G) ovat yhdenmukaiset mallin Klonaalisten evoluutio syövän ja kasvaimensisäisellä geneettinen heterogeenisyys [34], [35]. Maantieteellinen jakautuminen alakloonien eri genomista poikkeamia sisällä kasvain ja etäpesäke kuvattiin äskettäin [36]. Esiintyminen

PPARD

mutaatio ensisijainen solulinjoissa mutta ei metastaattinen solulinjassa voi myös selittyä poiston

PPARD

loci aikana kasvain ja etäpesäke muodostumista. Lisäksi DNA-sekvenssianalyysi sovitetussa näytteistä (ryhmä I) osoitti useissa tapauksissa eri alleelien osuus kahdessa polymorfista sivustoja, joka sijaitsee eksonissa 4 ja 7, verrattuna kasvaimen normaaliin kudokseen. Ottaen huomioon, että

PPARD

geeni sijaitsee HLA (HLA) kompleksi kromosomialueen 6p, joka usein vaikuttaa poistot ja uudelleenjärjestelyt ihmisen syövissä [37], [38], havaintomme voi ehdottaa heterotsygotian menetys

PPARD

loci kasvainsolun subklooneja aikana kasvainten kehittymiseen.

Huomattavaa on, että valtaosa havaittu muutoksia ovat kopiointia hiljaa, joko sijaitsevat 5′- tai 3 ’ -UTRs tai introneissa. Useat tekijät osoittavat, että nukleotidin muunnos (introni, nonsense, missense synonyymi) voidaan pitää mahdollisesti vahingollisia, koska se voi muuttaa normaalia pre-mRNA

kautta

muutoksia konsensus silmukoinnin sekvenssit, uusien arvoituksellinen sekvenssit, hellyyttä translaation korko tai muutoksiin mRNA tai proteiini vakaus [39] – [41]. Tällaiset aiemmin laiminlyöty variantit voivat olla herkkiä perinnöllisiä sairauksia. Valitettavasti tutkimuksessamme oli mahdotonta testata kaikkia muunnelmia mRNA tasolla puuttumisen vuoksi tietyn kudos- tai verinäytteitä RNA: n eristämistä. Kuitenkin sekvenssianalyysillä cDNA kantajia perinyt yhteisten varianttien c.130 + 3G A ja c.1-101-8C T paljasti eksonin 4, mikä voi johtaa käännöksen PPARD isoformin muuttunut N-päähän proteiinia verrattuna villityyppimuodossaan.

PPARD

variantteja 5′-UTR voi olla erityistä etua, koska arveltu säätelevän roolin mRNA ilmaisun. Kuitenkin kohortin 303 CRC potilaista, emme löytäneet yhdistyksen välillä toistuvien variantit 5′-UTR (c.1-87C T ja c.1-67G A) ja kliinis muuttujia.

Haluamme vahvistaa, että on tärkeää luonnehdinta geneettistä taustaa käytettyjen solulinjojen mallijärjestelminä. Esimerkiksi kaksi laboratoriota osoitti PPARD proteiinin ilmentyminen oli riippuvainen APC /

beta

kateniinin koulutusjakson [42], [43]. Niiden päätelmä perustuu havaintoon, että suhteellinen ilmentyminen PPARD oli joko samanlainen tai alhaisempi SW480-soluissa, jotka on mutantti

APC

geeni ja villityypin

beta

kateniinin geeni. Tässä tutkimuksessa havaitsimme missensemutaatio

PPARD

mutaatio (p.R258Q) in SW480 soluja, jotka voivat vaikuttaa tulkintaan näiden tulosten ja osoittaa rajoitettu käyttö SW480 solulinjan varten

in vivo

tutkimuksissa . Lisäksi kattava analyysi

PPARD

geeni voisi olla avuksi lääkekehityksessä, koska PPARD tarjoaa houkutteleva kohde terapeuttisen intervention toistaiseksi potilailla, joilla on metabolinen oireyhtymä [16].

Yhteenvetona tunnistimme 22

PPARD

variantteja, vaikka mahdollisesti toiminnallisia variantteja havaittu

PPARD

geeni ovat harvinaisia. Synonyymi variantti c.489T C (p.N163N; rs2076167) voisivat olla kliinistä merkitystä koskevat sen yhdessä huonompi eriytetty CRC. Lopulta tulevissa tutkimuksissa riippumattomalla kliinisestä näytteestä sarja auttaa ratkaisemaan, onko jokin

PPARD

muunnokset ovat mahdollisia määritteet CRC alttius tai prognoosi.

tukeminen Information

Taulukko S1.

käytetyt alukkeet PCR-amplifikaatiota varten ja sekvenssianalyysillä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0083952.s001

(DOCX)

Taulukko S2.

Harvinaiset

PPARD

variantit suhteessa kliinis ominaisuuksia.

doi: 10,1371 /journal.pone.0083952.s002

(DOCX) B Taulukko S3.

homotsygoottinen variantti c.489C suhteessa kliinis ominaisuuksia.

doi: 10,1371 /journal.pone.0083952.s003

(DOCX) B

Kiitokset

Kiitos kliinikoille ja potilaille niiden yhteistoiminnalle. Erityinen kiitos kuuluu Dr. Gunnar Arbman (Department of Surgery Östergötland, Norrköping, Ruotsi) näytteiden keräämiseen ja tietojen Assoc. Prof. Zdenek Kleibl MD, Ph.D (Institute of Biochemistry and Experimental Oncology, Kaarlen yliopisto, Tsekin tasavalta) kriittisen keskustelun, Brandon R. Macias FT (UCSD Medical Center, University of California, San Diego, CA ) ja Veronika Patcha Brodin FT (Division of Oncology, Department of Clinical and Experimental Medicine, Terveystieteiden tiedekunta, maakäräjien Östergötland, Linköpingin yliopisto, Linköping, Ruotsi) varten oikoluku käsikirjoitus, ja Birgitta Holmlund (Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Linköping, Linköping, Ruotsi) erinomaisesta teknistä tukea DNA eristämisen.