Krooninen sairaus

tiivistelmä

fibroblastikasvutekijäreseptori 4 (FGFR4) on elintärkeä varhaisessa kehitysvaiheessa ja kudosten korjaamiseen. FGFR4 ekspressiotasot ovat erittäin vähäiset aikuisen kudoksissa, paitsi useissa kiinteiden kasvainten kuten peräsuolen syöpä, joka osoitti yliekspressio FGFR4. Täällä FGFR4 mutaatio analyysi hävittää läsnä aktivoivia mutaatioita, muut kuin Arg

388, eri peräsuolen syövän solulinjoissa ja kasvainten näytteitä. Vakaa shRNA FGFR4-hiljentämisen SW480 ja SW48 solulinjoja johti merkittävä lasku solujen lisääntymisen, tarttuvuus, solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Tämä lasku kasvaimia ja invasiivisia ominaisuuksia paksusuolisyövän solujen mukana lasku Etana, Twist ja TGFp geeniekspressiotasot ja kasvua E-kadheriinin, aiheuttaen paluuta enemmän epiteelin fenotyyppi, kolmessa eri solulinjoissa. Lisäksi, FGFR4-signalointi aktivoi onkogeeninen SRC, ERK1 /2 ja AKT reittejä koolonkarsinoomasoluissa ja edistää kasvua solujen eloonjäämistä. Merkitystä FGFR4 kasvaimen kasvua tukivat kaksi erilaista strategiaa. Estäjät kumotaan FGFR4 liittyvien solujen kasvua ja signalointireittejä samalla määrin kuin FGFR4-vaiennetaan soluissa. Erityisiä FGFR4 kohdistamisen käyttämällä vasta-aineita herättivät samanlaisen väheneminen solujen kasvua. Lisäksi FGFR4 knock-down soluilla alennettua kyky

in vivo

kasvainten muodostumista ja angiogeneesiä paljaisiin hiiriin. Yhdessä tietomme tukevat ratkaiseva merkitys FGFR4 kasvainten synnyssä, invaasio ja selviytymistä peräsuolen syövän. Lisäksi FGFR4 kohdentaminen osoittanut sen soveltuvuus ja peräsuolen syövän hoidossa.

Citation: Peláez-García A, Barderas R, Torres S, Hernández-Varas P, Teixido J, Bonilla F, et ai. (2013) FGFR4 Rooli epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon ja sen terapeuttista arvoa peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (5): e63695. doi: 10,1371 /journal.pone.0063695

Editor: Qian Tao, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: Marraskuu 9, 2012 Hyväksytty: 06 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 16, 2013

Copyright: © 2013 Peláez-García ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat apurahan BIO2009-08818 Espanjan tiede- ja innovaatio, myöntää perustettu tutkimusryhmät (AECC) ja myöntävät S2011 /BMD-2344 /Colomics2 päässä Comunidad de Madrid. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

fibroblastikasvutekijät (FGF: t) on liitetty useita biologisten prosessien aikana alkion kehitys, haavan paraneminen, hematopoieesia ja angiogeneesiin [1]. Ne sitoutuvat neljä FGF reseptoreihin (FGFR) nimetty FGFR1-4 [2]. FGFR: ää rakenne sisältää ligandia sitovan domeenin, joka sisältää kolme erilaista immunoglobuliinin kaltaista domeenia (kutsutaan Ig I, Ig II ja Ig III). Ligandi domeeni, jota seuraa yksi transmembraaninen domeeni ja solunsisäinen sytoplasminen tyrosiinikinaasidomeeni. FGFR4 näyttää eniten ilmentymisen rajoittunut malli alkion kehityksen ja kudosten korjaamiseen [3], [4] verrattuna muihin kolmeen FGFR: ää, ja sen ilme pitoisuus pienenee vaikutukset. Aikuisilla FGFR4 ilmaistaan ​​lihasten myofibroblasteja regeneroinnin aikana seuraavia vammoja, mutta ei kypsä luustolihasten [5]. FGF-reseptorien säätelyhäiriötä on osoitettu olevan tärkeä rooli syövän kehittymisessä ja etenemisessä. Näitä muutoksia on ehdotettu tapahtua yliekspressio, geenimonistuksen tai mutaatio [6].

Aikaisemmin ryhmämme tunnistettu FGFR4 kuin autovasta tavoite peräsuolen syöpä (CRC) käyttäen proteiini mikrosiruja [7]. Lisäksi havaitsimme selvän yliekspressio FGFR4 kolorektaalisyövässä solulinjoissa (erityisesti 2 ulos 4 erittäin metastasoituneen kolorektaalisyövän solulinjoja), jonka potentiaali yhdistys FGFR4-ilmaisun loppuvaiheissa peräsuolen syöpä [8]. FGFR4 on raportoitu olevan yli-ilmentynyt ihmisen rinta-, eturauhas-, paksusuoli-, rabdomyosarkooma, mahan, haiman, hepatosellulaarinen ja aivolisäkkeen adenokarsinoomat [4], [9], [10], [11], [12], [13] , [14], [15], jossa se voi edistää kasvaimen etenemistä useiden mekanismien [4], [9]. Lisäksi FGFR4 ekspressiotasoja liittyivät etäpesäkkeitä ja huono selviytyminen mahalaukun, keuhko-, rinta- adenokarsinooma ja rabdomyosarkoomasolut [16], [17], [18]. FGFR4 somaattiset mutaatiot ovat harvinaisia ​​syövän [11], [19], [20], [21]; Arg

388 on yleisin yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) in FGFR4, joka provosoi entistä vakaammat ja pitkäaikainen reseptorin aktivoitumista. Se on yhteydessä huonoon ennusteeseen positiiviselle solmulle rintasyöpä, laadukkaat pehmytkudossarkooman, pään ja kaulan ja keuhkojen okasolusyöpä [9], [16], [18], [22], [23].

Niistä 18 FGF ligandit, FGF19 sitoo valikoivasti FGFR4 [24], vaikka se sitoo myös FGFR1. Sitoutuminen tapahtuu, on kompleksi, joka käsittää hepariinin, FGFR4 ja kaksi FGF-molekyylien, joka laukaisee FGFR dimerisaatio, mikä autofosforylaatiota useita tyrosiinitähteiden solunsisäinen tyrosiinikinaasidomeeni [3], [25]. FGF19-FGFR4 on ehdotettu rooli induktioon maksasolujen proliferaation ja syövän syntymistä [26]. Vastaan ​​suunnattuja vasta FGF19 ovat osoittaneet terapeuttista lupaus eri tuumoriksenografteja [27]. Kuitenkin esto FGF19 saattaa toimia eri FGF reseptoreihin [28].

Olemme käyttäneet erilaisia ​​paksusuolensyöpä näytteitä ja solulinjoissa (SW480, SW620, SW48, KM12C ja KM12SM) [29], [30], [31] tutkimaan läsnäolo SNP tai aktivoivia mutaatioita FGFR4 ja luonnehtia sen biologista merkitystä kuin onkogeenin ja terapeuttinen kohde kolorektaalisyövässä. KM12C ja KM12SM epiteelisolujen on samanlaisia ​​geneettinen tausta, jotka eroavat toisistaan ​​metastasoituneeseen ominaisuudet [31]. SW480 ja SW620 kaksi isogeenisiin peräsuolen syövän solulinjoissa. SW480 eristettiin ensisijainen Duke B kasvain kolorektaalisyövän, kun taas SW620-solulinja eristettiin metastaattista imusolmuke saman potilaan [30]. SW48 peräsuolen syövän soluja oli peräisin kasvaimesta Duke n C vaiheessa [30]. Nämä viisi solulinjat eroavat myös FGFR4 proteiinin ekspressiotasot [8]. Tutkimuksessamme ei uusia SNP: itä tai aktivoivat mutaatiot löydettiin FGFR4. Kuitenkin keskeytys- toiminto kokeet paljastivat merkittävän roolin FGFR4 kasvaimia tuottavassa ominaisuuksien peräsuolen syövän soluja, koska sen ehtyminen kumottu leviämisen, tarttuvuus, muuttoliike ja hyökkäystä. FGFR4-hiljentäminen aiheutti säätely ylöspäin E-kadheriinin ilmentymisen ja alas-säätely Snail ja muiden epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) välittäjiä. Lopuksi osoitimme, että FGFR4 kohdistus onnistui torjunnassaan kasvaimen kasvua

in vitro

ja

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Eettinen komitea Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Madrid, Espanja) hyväksyi protokollia käytetään kokeellista työtä hiirillä.

Cell Lines, RNA, Antibodies ja estäjät

kolorektaalisyöpä solulinjoja KM12C ja KM12SM [31], [32] saatiin tri I. Fidleriltä (MD Anderson). SW480, SW48 ja HEK293 solulinjat olivat ATCC. Soluja kasvatettiin vakiintuneiden protokollien [7]. RNA uutettiin solulinjoista ja 20 pariksi normaali /kasvainkudoksen syöpää potilailla, joilla on RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc.) mukaan valmistajan protokollaa. Uutettu RNA kvantifioitiin NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies Inc.).

yhteensä 15 erilaista vasta-aineita käytettiin, mukaan lukien proteiinit, jotka liittyvät FGFR4 signalointireitin ja ohjaus proteiineja. Source, klonaalisuuden ja ehdot käyttö kaikissa tapauksissa ja tekniikka on määritelty taulukossa S1. FGFR4-polyklonaalisia vasta-ainetta (sc-124, Santa Cruz Biotechnology) ja ohjaus GST-spesifinen polyklonaalinen vasta GE Healthcare käytettiin FGFR4 kohdistaminen kokeita. FGFR inhibiittorit olivat PD173074 (Sigma) ja TKI-258 (Novartis). PD173074 on yleiseurooppalainen FGFR estäjä, joka indusoi apoptoosin [33]. TKI-258 on kliinisesti merkittäviä, multi-estäjät, mukaan lukien VEGFR ja PDGFR-kinaasien mm [34]. Muut inhibiittorit olivat: PP2 (Sigma) SRC, JNK Inhibitor II ja UO126 (Calbiochem) varten MEK1 /2. Niitä käytettiin 3 uM ja 15 uM, kuten aiemmin on raportoitu [35].

Vektorit, shRNAs, siRNA: t ja Transfektiot

pRS-vektorit, jotka sisältävät erityisiä shRNAs (TI378641, TI378642, TI378643 ja TI378644) ja FGFR4 (NM_022963), ja ohjaus shRNA ei-tehokkaita minkä tahansa ihmisen sekvenssin (TR30003) olivat Origene. Stabiilisti transfektoidut solut saatiin retrovirusinfektiota. Lyhyesti, HEK293FT solut transfektoitiin pRS-vektorit ja pNGVL-gag-pol ja pNGVL-VSVG pakkaus vektoreita käyttäen jetPRIME Transfection Reagent (Polyplus). Sen jälkeen, kun soluja on inkuboitu 12-15 h seerumittomassa elatusaineessa, elatusaine korvattiin DMEM: llä, joka sisälsi 10% FBS: ää ja penisilliiniä /streptomysiiniä. Päivä sen jälkeen, jotka sisälsivät lentivirus- partikkeleita sentrifugoitiin, laimennettiin 1:02-01:10 DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää ja antibiootteja, ja sitä lisätään SW480 ja SW48 peräsuolen syövän soluja. Kolmen päivän inkuboinnin jälkeen tartunnan SW480 ja SW48 peräsuolen syövän solut valittiin käyttämällä 1 ug /ml puromysiiniä (Sigma) 2-3 viikkoa. Sitten soluja viljeltiin 0,5 ug /ml puromysiiniä.

FGFR4 siRNA: t ja valvonta hankittiin Sigmalta. SiRNA transfektioissa, 5 x 10

5-soluja siirrostettiin viljelylevyille, ja pidettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% vasikan sikiön seerumia 37 ° C: ssa 5% CO

2: ssa 24 tuntia. Solut transfektoitiin 55 pmol siRNA käyttäen 2 pl JetPrime transfektioreagenssia 200 ul JetPrime puskuria. Sitten 48 tunnin kuluttua transfektiosta solut analysoitiin western blot ja semikvantitatiivinen PCR [35].

Sequence Analysis, Semikvantitatiivisilla ja Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

cDNA syntetisoitiin käyttäen Superscript III First Strand Synthesis kit (Invitrogen). Käytetyt alukkeet saada FGFR4-sekvenssi on aiemmin kuvattu [36]. Lyhyesti, neljä paria alukkeita (A, B, C ja D) käytettiin saamaan koko molekyylin PCR fragmentteja, noin 1000 bp: n käyttäen Advantage 2-polymeraasia (Clontech). Eksonukleaasi I (USB) ja katkaravun alkalista fosfataasia (USB) lisättiin PCR-tuotteet. Ne sekvensoitiin suoraan käytettäessä ABI7002 sekvensseri (Applied Biosystems).

cDNA syntetisoitiin kuten edellä, ja sitä käytetään semikvantitatiivinen PCR-analyysi TGF-β1 ja GAPDH-mRNA: n tasot paksusuolen syövän solulinjoissa. PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen seuraavia alukkeita; Ihmisen TGF-β1, sense 5′-ACCGGCCTTTCCTGCTTCTCA-3 ’, antisense 5′-CGCCCGGGTTATGCTGGTTGT-3′; ihmisen GAPDH, sense, 5’-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3 ’, antisense 5′-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3’. Alukkeina FGFR1-3 testata spesifisyys shRNAs ja siRNA: iden kohdistuu FGFR4 olivat: FGFR1, aistimaan 5′-CACAAGCCACGGCGGACT-3 ’, antisense 5′-TGATGCTCCAGGTGGCAT-3′; FGFR2, sense 5’-CGTTGCCATTCAAGTGACTG-3 ’, antisense 5’GACAAAATCTTCCGCACCATC-3’; ja FGFR3, sense 5’CAGTTGGTCTTCGGCAGC-3 ’, antisense 5′-TGCTGCCAAACTTGTTCT-3’.

qRT-PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen edellä kuvattua EMT markkeri alukkeita [37] ja SYBR-Green Master PCR sekoitetaan (Applied Biosystems), kolmena kappaleena. PCR ja tiedonkeruu suoritettiin IQ5 (BioRad). Kaikki kvantitaatiot normalisoitiin käyttämällä ihmisen GAPDH. Semi-kvantitatiivisen PCR: n D alukkeiden parin käytettiin määrän määrittämiseksi FGFR4 cDNA käyttämällä GAPDH monistuksen spesifisiä alukkeita kontrollina [36].

Western blot -analyysi

Protein otteet peräsuolen syöpä solut valmistettiin ja määrällisesti kanssa 2D-Quant kit (GE Healthcare) mukaan aiemmin julkaistu protokollat ​​[7]. Sitten, 25 ug kutakin proteiinia uutetta ajettiin rinnakkain käyttäen 10% SDS-PAGE. Immunoblottausta, proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Hybond-C extra) käyttäen puolikuivaa laitteet (Bio-Rad). Blokkauksen jälkeen membraaneja inkuboitiin erityisiä mono- tai polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​valitun proteiineja. Membraanit inkuboitiin optimoitu laimennoksilla primaarisilla vasta-aineilla, jota seuraa inkubointi joko HRP-anti-hiiri-IgG: tä (Pierce) on 1:5000 laimentamisen tai HRP-anti-kani-IgG: tä (Sigma) 1:5000 laimennus. Erityisiä reaktiiviset proteiinit tehtiin näkyviksi SuperSignal West Pico Suurin herkkyys Substrate (Pierce). Runsaasti proteiineja Western blot määrityksissä määritettiin densitometrialla käyttämällä Määrä Yksi 1D Analysis Software v4.6 (Bio-Rad Laboratories).

Cell Adhesion, Invasion, Apoptosis Detection, leviämisen, ja haavan paraneminen Analyysit

soluadheesioanalyyseissä, 96-kuoppaisia ​​levyjä päällystettiin Matrigelillä (0,4 ug /mm

2) (BD Biosciences) on pinnoite (0,1 M NaHCO

3, pH: 8,8) yli yön 4 ° C: ssa ja sitten inkuboitiin tartunta-alustassa (0,5% naudan seerumin albumiinia seerumittomassa DMEM) 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa estämään epäspesifisen sitoutumisen. Solut nälkään ilman seerumia 5 h ja leimattiin BCECF-AM (Molecular Probes) 30 minuutin aikana 37 ° C: ssa, irrotettiin 2 mM EDTA PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen tarttumista väliaineessa. Sitten, 10

5 soluja lisättiin kolmena kappaleena levyille ja inkuboitiin 30 min. Poista tarttumattomat solut, levyt pestiin kahdesti DMEM: llä. Bound solut hajotettiin käyttämällä 1% SDS PBS: ssä ja fluoresenssi kvantifioida Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo Scientific). Sillä Matrigel invaasio määrityksiä, 8 x 10

5 SW480 tai SW48 solut suspendoitiin uudelleen invasion väliaineessa (seerumittomassa DMEM, joka sisälsi 0,5% BSA: ta), ja ladattiin 8 um huokoskoon suodattimien päällystetty 35-50 ui 1 :3 laimennus matrigeelin (BD Biosciences) in siirtoaltaat (Costar). Alempi osastot invaasion kammiot täytettiin alustalla, joka sisälsi 10% FBS (Gibco). 22 tunnin kuluttua inkuboinnin 37 ° C: ssa, ei-tunkeutuvat solut poistettiin ylemmältä pinnalta suodattimen, ja solut, jotka vaelsivat suodattimen läpi kiinnitettiin 4% paraformaldehydiä (Sigma), värjättiin kristallivioletilla ja tunkeutuvat solut laskettiin mikroskoopilla. Haavan paranemista, SW480 ja SW48 solut ympättiin kolmena rinnakkaisena tiheydellä 10

6 solua per kuoppa 24-kuoppalevyille. Sen jälkeen, kun liitetiedoston, 1 mm leveä haavan valmistettiin yksisolukerros, kasvualusta korvattiin, ja kuva on otettu (päivä 0) in Olympus CK40 mikroskooppi on varustettu Olympus DP12 kamera x 40 suurennuksella. Kuvia saman kentän otettiin 24 tunnin välein.

apoptoosin detektiomäärityksiä, soluja inkuboitiin 1 mM H

2O

2 16 h ilman seerumia. Sitten solut irrotettiin ja inkuboitiin FITC-leimatun anneksiini V (Miltenyi Biotec Inc.) ja propidiumjodidin mukaisesti valmistajan ohjeiden ja analysoitiin sytofluorometrillä (Coulter Epics XL). Soluproliferaatiomäärityksiä, suoritettiin kokeita seuraavia vakiintuneita menettelyjä [38], [39]. Lyhyesti, kasvualusta vaihdettiin 24 h ymppäyksen jälkeen (päivä 0) ja soluja inkuboitiin edelleen kolmen päivän aikana. Sitten väliaine poistettiin ja solut värjättiin 100 ui kromogeenisen väriaineen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (Sigma) lopulliseen konsentraatioon 1 mg /ml DMEM: ssä . Soluja inkuboitiin edelleen 1 h 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Sitten väliaine huolellisesti pois ja 100 ui DMSO: ta (Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan häiritä soluja. Absorbanssi luettiin 570 nm: ssä. Kaikki kokeet tehtiin kolme kertaa kahtena kappaleena. Vähentämiseksi proliferaation, solujen elinkykyisyys edusti vertaamalla vaikutusta anti-FGFR4 tai anti-GST (kontrollina) vasta-aineita tai spesifisiä inhibiittoreita verrattuna käsittelemättömiin soluihin (100% leviämisen) inkuboitiin samoissa olosuhteissa [39].

konfokaalimikroskopialla

Solut kiinnitettiin 1% paraformaldehydillä ja permeabilised PBS-0,5% Triton X-100 ennen inkuboinnin FGFR4 spesifisen vasta-aineen tai TRITC-phalloidin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa . FGFR4 tai E-kadheriinin vasta-aineet havaittiin AlexaFluor 488-leimattua anti-kani-lgG-vasta-ainetta. Solut havaitaan vahvan -konfokaalimikroskoopilla (TCS-SP5-AOBS-UV, Leica-Microsystems) jälkeen tuma counterstaining DAPI. Kuvat otettiin kanssa 63 × immersioöljyobjektiivilinssillä käyttämällä Leica konfokaali Software. Näytettyjen kuvien otettiin kiinni samalla osiot eri näytteissä.

In vivo

tuumoriksenografteja

Swiss karvattomia hiiriä (Charles River) käytettiin etäpesäke ja -tuumoriksenografti tutkimukset . Eettinen komitea Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Madrid, Espanja) hyväksyi protokollia käytetään kokeellista työtä hiirillä.

tuumoriksenografteja, hiiriin ruiskutettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen käyttäen 1 x 10

7 SW48 stabiilisti transfektoidut peräsuolen syövän solut 0,2 ml PBS: matrigeeliin laimennettuna 1:03. Kasvaimen koot seurattiin vähintään kahdesti viikossa ja kukin eläin lopetettiin käyttämällä CO

2 kammion mukaisesti suuntaviivojen ihmisille Endpoints for Animal Käyttö Biomedical Research.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastolliset analyysit, ellei toisin mainita, tehtiin Microsoft Excel. Tiedot esitetään mediaani ± keskihajonta. Arviointia varten tilastollisen merkittävyyden verrataan ryhmien kaikkien

p

arvot olivat peräisin kahden tailed tilastollinen testi 95%: n luottamusväli.

p

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

FGFR4 Mutaatiotutkimukset Status peräsuolen syövän solulinjoissa ja Tissue Näytteitä

Tutkimme FGFR4 mutaatioita kolorektaalisyövässä solulinjoissa ja syövän näytteitä, jotka voisivat edistää vasta-tunnustaa yli-ilmentyminen tai aktivointi. Kokonais-RNA eristettiin ja cDNA syntetisoidaan retrotransskription. cDNA: ta käytettiin templaattina läsnäolon määrittämiseksi mutaatioiden.

Kaikkiaan löydettiin 3 SNP FGFR4 cDNA 4 peräsuolen syövän solulinjojen ja 20 syövän näytteet (taulukko 1 ja kuvio S1). Havaitsimme kolme mutaatiota solunulkoisessa ja transmembraanidomeenin FGFR4 potilasnäytteistä. Sen lisäksi hyvin tunnettu Arg

388 SNP [9], [15], löysimme V10L lokalisoitu signaalipeptidi ja P136L välillä immunoglobuliinialueita 1 ja 2 (kuva S1). Nämä kaksi SNP on aiemmin raportoitu ilman korrelaatio patologisia ilmentymiä [40], [41]. Vuonna KM12C ja KM12SM peräsuolen syövän soluja, havaitsimme läsnäolo Arg

388 SNP, kun taas SW480 ja SW48 eivät sisältäneet tätä SNP. 20 kolorektaalisyövän näytettä, 60% potilaista polymorfismin Arg

388, kun taas esiintyvyys kaksi muuta mutaatiota oli 55% ja P136L ja 15% V10L. Nämä tiedot ovat yhtäpitäviä aiemmin julkaistujen tietojen, jossa 50% kasvaimista esittää Arg

388 SNP, 53% polymorfismin P136L ja 30% kasvaimista sisältävät V10L [9].

emme löytäneet mitään aktivoivaa mutaatio FGFR4 tai nukleotidimuutos pois aiemmin raportoituihin FGFR4. Sitten nämä tiedot viittaavat siihen, että lisääntyneen ilmentymisen FGFR4 voisi vastata autovasta induktioon CRC potilailla ja suurempi hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden paksusuolen syövän.

FGFR4 Knockdown Alennettu Adhesion, Migration and Invasion of peräsuolen syövän solut

roolin tutkimiseksi FGFR4 yli-ilmentymisen kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden, tutkimme vaikutus FGFR4 ilmaisun SW48, SW480 ja SW620 peräsuolen syövän solulinjoissa, jotka eivät sisältäneet Arg

388 polymorfismi. SW480 ja SW48-solut transfektoitiin stabiilisti neljä shRNAs kohdistaminen FGFR4 plus kontrolli salattu shRNA. SW620-soluja lyhytaikaisesti vaiennetaan siRNA. shRNA # 41 osoittivat korkeimmat lasku FGFR4 proteiinin ilmentymisen (kuvio 1A) ja mRNA-tasot (kuvio 1 B) sekä solutyypeissä. shRNA # 44 oli myös tehokas vähentämään proteiinin ilmentymisen, erityisesti SW48 soluissa. Samanlaisia ​​vähennys tasot saatiin ohimeneviä siRNA hiljentämisen SW620-soluissa. Tutkia vaikutus FGFR4 hiljentäminen muiden perheenjäsenten, suoritimme RT-PCR. mRNA-tasot FGFR1, FGFR2, ja FGFR3 pysyivät muuttumattomina jälkeen FGFR4- hiljentäminen, mikä vahvistaa spesifisyys FGFR4 (Fig. 1 B). Immunofluoresenssilla analyysi osoitti, että FGFR4 ilmentyminen väheni merkittävästi SW480 ja SW48 transfektion jälkeen shRNA 41 vektoreita, vaikka jonkin verran jäljelle jäänyttä värjäytyminen havaittiin tumassa SW48-solujen (kuvio S2).

neljä shRNAs suunnattu erilaisia ​​eksonia FGFR4 ja salattu shRNA käytettiin saamiseksi stabiilisti transfektoitujen peräsuolen syövän soluja, valinta puromysiinin kanssa. Lisäksi, ohimenevä siRNA FGFR4-hiljentäminen suoritettiin SW620 paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja. A. Western blot-analyysi FGFR4 ilmentymisen pysyvästi transfektoitu SW480 ja SW48 solulinjoissa, ja lyhytaikaisesti transfektoidut SW620-soluissa. Tubuliinia käytettiin latauskontrollina. B. Semi-kvantitatiivinen PCR-analyysi FGFR1, FGFR2, FGFR3 ja FGFR4 ilmaisun käyttämällä spesifisiä alukkeita kolmessa eri solulinjoissa. GAPDH käytettiin kontrollina. C. Lisääntyminen määritettiin MTT määritysten jälkeen 24 tunnin viljelyn. Optinen tiheys oli merkittävästi vähentynyt FGFR4 taintumisen (*, p 0,01; **, p 0,001). D. Salatut ja vaiennettu soluja kasvatettiin konfluenssiin asti ja niiden muuttavien ominaisuudet analysoitiin haavan paranemista määritys 24 tunnin välein, kunnes yhtymäkohta. Edustavat kuvat arpeutumisprosessit määrityksessä esitetään. Migration nopeus (im /h) salattujen ja FGFR4-vaiennettu solut laskettiin kulkema 96 h. E. Cell tarttuvuus matrigeelin of FGFR4-vaiennettu tai salattu soluja, kun nälkää solut 5 h väliaineessa yksin. F. SW480 ja SW48 salattu soluista osoitti noin 2-kertaa korkeampi invaasio kuin shRNA # 41 FGFR4 stabiilisti transfektoitujen solujen. Tietoja kaikista kokeista ovat keskiarvoja ± SD 3 riippumattoman kokeen.

p

arvot Kaikissa kokeissa on esitetty.

arvioimiseksi kasvaimia ominaisuudet, päätimme solujen kasvua, adheesio, muuttoliike ja hyökkäys FGFR4-vaiennettu soluissa. Käyttämällä MTT määrityksiä, FGFR4-vaiennetaan SW480 tai SW48 solut osoittivat alentuneen proliferaationopeus verrattuna salattu soluihin (kuvio 1 C). Tutkia vaikutuksen FGFR4 muuttoliikettä, FGFR4-vaiennetaan SW480 ja SW48 solulinjoja istutettiin 24-kuoppalevyille ja analysoitiin haavan paranemista määrityksiä. FGFR4-vaiennetaan solut eivät kyenneet sulkemaan haavan jälkeenkin 96 h (kuvio 1 D). Kehitysvammainen muuttoliike oli tärkeämpi SW48 (3-kertainen) kuin SW480-soluja (2-kertainen). Nämä tulokset ovat samanlaiset kuin aiemmin käyttämällä kahta erilaista CRC solulinjat, HCT116 ja HT29, ja eri määrityksiä [15].

Lisäksi, käyttäen matrigeeliä määrityksiä, oli merkittävä lasku tarttuvuus ja invaasio kapasiteetin of FGFR4-vaiennettu solujen molemmissa solulinjoissa. SW480-solujen vähentynyt niiden tarttuvuus kapasiteetti 2,5-kertaiseksi, kun taas SW48 solut osoittivat lähes 4-kertainen vähennys suhteessa salattu soluihin (kuvio 1 E). Invasion on noin 2-kertainen vähennetään FGFR4 pudotus sekä solulinjoissa (kuvio 1 F). Yhdessä nämä tulokset tukevat tärkeä rooli FGFR4 kasvainten synnyssä ja hyökkäys peräsuolen syövän, on enemmän merkitystä metastaattisen SW48 soluja.

FGFR4 hiljentäminen Alennettu ilmentymisen indusorit mesenkymaaliseen Fenotyyppikuvaus

Koska soluadheesiota, muuttoliike ja invasiivisia kapasiteetti epiteelisolujen liittyvät epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), päätimme tutkia muutoksia EMT induktoreita. Sen jälkeen FGFR4 hiljentäminen, olemme tutkineet muutokset mRNA ekspressiotasot Snail1 (SNA1), TWIST1, ZEB1, ja E-kadheriinin (CDH1) reaaliaikaisella PCR: llä tai puolikvantitatiivinen PCR (TGFp 1). Vuonna SW480 ja SW620, FGFR4 knockdown aiheutti merkittävän laskun EMT indusoijia TGFp 1, SNA1 ja TWIST mukana on suuri lisäys epiteelin merkki CDH1 (kuvio 2A, B). SW48 solut osoittivat suuremman väheneminen SNA1, TGFp 1 ja TWIST1and pienempi kasvu CDH1. ZEB1 lasku oli merkittävämpi vuonna SW480 kuin metastaattisen solulinjoissa SW620 ja SW48. Epiteelin ja mesenkymaaliset markkereita analysoitiin proteiinin tason Western blot. Snail ja E-kadheriinin vahvisti mRNA tuloksia. Vimentiinista, joka on mesenkymaaliset markkeri, väheni jälkeen FGFR4 hiljentäminen kolmessa solulinjoissa (kuvio 2C). Vain pieniä muutoksia MT1-MMP ilmentyminen havaittiin SW480 ja SW48 solujen jälkeen FGFR4-hiljentäminen. Olemme kuitenkin havaittu suuri kasvu MT1-MMP ekspressiota SW620-soluja, jotka yhtäläisyyksiä ekspressiotasot E-kadheriinin, joka ilmaisee vähentäminen mesenkymaalisten fenotyypin.

. cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: stabiilisti ja lyhytaikaisesti-äänieristys ja kontrollisoluja käsiteltiin qRT-PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita EMT indusoijia SNAI1, TWIST1, ZEB1 ja CDH1, käyttämällä GAPDH normalisoimiseksi. Data edustaa mediaani ± SD kahdesta kokeesta. B. Sama cDNA tehtiin semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi monistamiseksi TGFp 1, käyttäen GAPDH kontrollina. C. SW480 ja SW48 salattuja ja FGFR4-vaiennettu solut hajotettiin ja niille WB analyysillä käyttäen spesifisiä vasta-aineita vastaan ​​merkitty proteiineja ja EMT markkereita. Runsaus kunkin proteiinin kvantifioitiin densitometrialla. Tubuliinia käytettiin latauskontrollina. D. Immunofluoresenssianalyysi E-kadheriinin muokatussa ja vaiennetaan SW480 ja SW48 soluja. DAPI käytettiin counterstaining tuman sinisellä. E-kadheriinin värjäytyminen oli vihreä.

lisääntyminen E-kadheriinin ilmentymisen, kun FGFR4 knockdovvn, vuonna vyöliitos ja solu-solu kontakteja varmistettiin immunofluoresenssilla (kuvio 2D). Erot E-kadheriinin ilmentyminen oli selvempää solukalvon, viittaa siihen, että FGFR4 hiljentäminen helpottaa ilmentymisen funktionaalisen E-kadheriinin solun pinnalla ja palaamisen epiteelin fenotyyppi. Yhdessä nämä tiedot käyttäen kolmea erilaista peräsuolen syövän solulinjoissa vahvistaa FGFR4 on tärkeä efek- in EMT. FGFR4 knock-down provosoi väheneminen Etana ja lisääntyminen E-kadheriinin kanssa tämän vaikutusta tarttumiseen, muuttoliikettä ja invaasiota.

Signaling Analysis in FGFR4-vaiennetaan solut. Rooli FGFR4 Cell Survival

vaikutuksen määrittämiseksi FGFR4 toimintaa alavirran signalointia, analysoimme vaikutus FGFR4-hiljentäminen on signalointireitteihin aktivoimisen jälkeen FGF19 ± hepariinin verrattuna seerumia. Jälkeen FGFR4 pudotus, aktivointi phosphoSRC, phosphoERK1 /2 ja phosphoAKT oli huomattavasti alhaisempi SW480 ja SW48 (kuvio 3A). ERK1 erityisesti osoitti lähes täydellisen vähentäminen. Mitä AKT, tämä vaikutus viittaa vaikutus välittyy FGFR4 kautta AKT EMT ja solujen eloonjäämistä. Testata vaikutusta FGFR4 eloonjäämiseen, solut altistettiin indusoiman apoptoosin vetyperoksidia. FGFR4-vaiennetaan solut osoittivat merkittävää laskua 20-30% eloonjääminen verrattuna salattu soluihin jälkeen vetyperoksidia hoidon (kuvio 3B). Ilman hoitoa salattuja ja FGFR4-vaiennetaan SW480 ja SW48 peräsuolen syövän solut osoittivat samantasoista apoptoosin. Tämä FGFR4 vaikutus solujen apoptoosin vasteena oksidatiivisen stressin voi olla rooli kehittynyt peräsuolen syövän, helpottaa selviytymistä metastaattisen kolorektaalisyövän soluissa.

. Salattu ja FGFR4-vaiennetaan SW480 ja SW48 solut nälässä, ja inkuboitiin FGF19, hepariinin, tai FGF19 plus hepariini 30 minuuttia DMEM: ssä. Sitten solut lyysattiin ja suoritettiin WB-analyysillä käyttäen spesifisiä vasta-aineita vastaan ​​fosforyloidun ja yhteensä AKT, ERK1 /2 ja SRC. Tubuliinia käytettiin latauskontrollina. B. Soluja inkuboitiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja antibiootteja läsnä tai poissa ollessa H

2O

2: ssa 16 tuntia, ja sille suoritettiin apoptoosin havaitsemiseen määrityksissä. Unt., Käsittelemättömät solut. Tiedot osoittivat tulokset yhdessä edustavassa kokeessa kolmesta. C. Invasion poikki matrigeelin salattujen ja vaiennettu soluja käsiteltiin estäjillä on MEK1 /2 (UO126), JNK, ja SRC (PP2) esitetyllä tavalla. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD 3 itsenäisen kokeen.

tutkimiseksi synergistinen vaikutus parantaa FGFR4 estoa signalointireiteissä soluinvaasion, käytimme spesifisiä inhibiittoreita on kohdennettu ja salattu soluja. UO126 (a MEK1 /2-estäjän ylävirtaan ERK1 /2) ja PP2 (SRC estäjä) vähensi hyökkäyksen kapasiteettia SW480 ja SW48 soluja. Vähennys oli paljon selvempi salattu kuin vaimennettu soluissa (kuvio 3C). JNK estäjä aiheutti vain vähäinen vaikutus hyökkäystä kapasiteetin salattu ja vaiennettu SW480 ja SW48 soluja. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että FGFR4-knockdown aiheutti merkittävän vähentämisen SRC ja MEK1 /2-ERK1 /2-välitteistä hyökkäyksen SW480 ja SW48 soluja, samanlainen kuin aiheuttama erityinen estäjät suojatuista soluissa.

FGFR4 kuten terapeuttisena kohteena peräsuolen syövän

seurasi kaksi erilaista strategiaa todistaa terapeuttinen arvo FGFR4 kolorektaalisyövässä. Ensiksi testasimme kaksi estäjät PD173074 ja TKI-258. Sitten käytimme FGFR4-vaimennettu solujen tutkimaan riippuvuutta FGFR4 tuumorikasvulle hiiren ksenografteissa. Metastaattinen solulinjoja (SW48 ja KM12SM), jotka ilmentävät enemmän FGFR4, olivat herkempiä kemiallisten inhibiittorit kuin huonosti tai ei-metastaattinen solulinjoissa (KM12C, SW480) (kuvio 4A). Multi-estäjä TKI oli tehokkaampi kuin yleiseurooppalaisen FGFR estäjä PD vähentää kolorektaalisyövän proliferaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla (

p

arvo 0,001), etenkin metastaattisen solulinjoissa. 80 nM konsentraatio, esto oli suurempi metastasoitunut kolorektaalisyöpä solulinjoissa (20% vuonna SW48 ja 60% KM12SM) kuin ei-metastasoituneen soluja tai kontrolli soluja. Vuonna KM12 soluissa, TKI esto oli tehokas jopa 1 nM pitoisuus. Viite solulinjaa HEK293, joka ilmaisee alhainen FGFR4, estyi pienemmällä määrin. Solukasvun inhibitio oli yhteydessä inhibitioon loppupään säätölaitteet vaikuttavat FGFR4-signalointireitteihin (kuvio 4B). Merkittävimmät vaikutukset saatiin TKI-258. Havaitsimme valtava vähennys ( 90%) vuonna SRC aktivointi, merkittävä lasku (50-80%) in phosphoERK1 /2 ja heikko väheneminen phosphoAKT molemmissa solulinjoissa (kuvio 4B). Lasku aktivointi FGFR4-signalointireittien oli samanlainen kuin havaittiin, kun FGFR4-hiljentäminen, vahvistaa seuraus FGFR4. Vahvista FGFR4 spesifisyyden, käytimme kaupallisen anti-FGFR4 vasta-aineiden SW480 ja SW48 peräsuolen syövän soluja. Havaitsimme merkittävän inhibition lisääntymistä, annoksesta riippuvainen, verrattuna kontrollisoluihin (

p

arvo 0,01) (kuvio S3).