Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Solun muuttoliike on monimutkainen prosessi, säätelee useita geenejä, signalointipolkujen ja ulkoisia ärsykkeitä. Löytää geenejä tai farmakologisia aineita, jotka voivat moduloida vaeltavien aktiivisuutta solujen, seulonta strategioita, jotka voidaan seurata erilaisten vaeltavien parametrien suuri määrä näytteitä on tarpeen.

Menetelmät

Esillä olevassa tutkimus, kuvaamme kehittäminen kvantitatiivisen, suurikapasiteettisten solu migraatiokokeessa, joka perustuu muunnetun phagokinetic raitoja (PKT) menettelyä, ja soveltaa sitä identifioida uusia pro-vaeltavia geenien syöpään liittyvien geenikirjastolla. Lyhyesti, solut ympätään fibronektiinin päällystetty 96-kuoppalevyille, peitetty yksikerroksista karboksyloitujen lateksihelmiä. Liikkuvia soluja selkeä helmiä, joka sijaitsee pitkin muuttavien polkuja, jotka muodostavat raitoja, jotka ovat visuaalisesti käyttämällä automatisoitua, lähetetyn valon seulonta mikroskoopilla. Kappaleet segmentoidaan ja tyypillistä monen muuttujan, morfometrisiin analyysi, ratkaista erilaisia ​​morfologisia ja kineettisen ominaisuuksia.

Johtopäätökset

Tässä ruudussa tunnistimme 4 uusia geenejä johdettu rintasyöpä liittyvä cDNA-kirjaston, jonka yli-ilmentyminen indusoi suuria muutoksen muuttoa paikallaan MCF7-solut. Tämä lähestymistapa voi toimia suuren seulonnan uusia keinoja moduloida solujen muuttoliikettä patologisten tilojen kuten tuumorimetastaasin ja invaasio.

Citation: Naffar-Abu-Amara S, Shay T, Galun M, Cohen N., Isakoff SJ, Kam Z, et al. (2008) tunnistaminen Novel Pro-muuttavien, Cancer liittyvien geenien kvantitatiivisella, mikroskopia-Based Screening. PLoS ONE 3 (1): e1457. doi: 10,1371 /journal.pone.0001457

Academic Editor: Neil Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 21 lokakuu 2007; Hyväksytty: 18 joulukuu 2007; Julkaistu: 23 tammikuu 2008

Copyright: © 2008 Naffar-Abu-Amara et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Israel Science Foundation ja NIGMS avustuksen Cell Migration Consortium (NIH Grant U54GM64346), ja jonka Kahn rahasto systeemibiologian klo Weizmann Institute.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Solun muuttoliike on kriittinen rooli lukuisissa fysiologisissa prosesseissa, mukaan lukien alkion kehitys, tulehdusreaktioita, haavan paranemista, ja angiogeneesi, sekä patologisten tilojen kuten kasvaimen invaasion ja metastaasin [1], [2]. Tutkia mekanismeista säätelyyn solujen vaeltamiseen, erilaisia ​​laadullisia ja määrällisiä lähestymistapoja on kehitetty. Näitä ovat 2- ja 3-ulotteinen time-lapse elokuvia, seuranta kulkeutumista viljellyt tai kudoksen upotetut solut [3], [4], haavan sulkemisen määrityksissä [5] – [7], matriisi-läpäisevyyttä määrityksissä [8] , [9] ja ”tallennus” solujen ”siirto” historia ”, joka perustuu määrityksiä, kuten PKT muodostumisen [10]. Jälkimmäinen määritystä käytetään laajalti tutkimiseen vaeltavien toimintaa eri solutyyppejä [3], [11], matriisi remontin [12], [13] ja häiritseekin solumigraation kemiallisella tai geneettinen modulaattorit [14] – [19]. Tällaiset tutkimukset ovat erityisen tärkeitä syövän solun liikkuvuus, jonka uskotaan heijastaa invasiivisia tai metastaattista potentiaalia näiden solujen in vivo [14], [20] – [23]. Siten tunnistaa kemikaaleja, jotka muuttavat solujen vaeltamiseen, tai geenejä, joiden häiriön vaikutusta solujen vaeltamiseen voitaisiin mahdollisesti käyttää modulaatio metastaattisen solumigraation.

Tavoitteemme tässä tutkimuksessa oli kehittää PKT lähestymistapa seuranta solujen vaeltamiseen, joka on toistettavissa, yhteensopiva suurikapasiteettisten mikroskopia, ja antaa määrällistä tietoa, morfologiset ja dynaaminen, muuttavaa prosessia. Osoitamme tässä, että vaikka PKT tallentaa integroitu historian vaeltavien toimintaa yhdellä kertaa pisteen, määrälliset kuvankäsittelyohjelma, mahdollistaa laskeminen sekä ”staattinen” muuttujia kuten radan pituus ja alueen, ja ”dynaaminen” muuttujia kuten siirtymänopeuksien , pysyvyys ja lamellitiiviste aktiivisuus.

suurikapasiteettisten migraatiokokeessa tässä on kuvattu, ja kuvankäsittelyohjelma kehitetty mittaamaan eri piirteitä muuttoprosessista, tarjota nopeaa, luotettavaa ja kvantitatiivinen lähestymistapa arvioimiseksi soluvaelluksen monipuolinen solutyyppejä, viljelty erilaisissa olosuhteissa, ja altistuvat erilaisia ​​kemiallisia tai geneettisiä häiriöitä.

tulokset

Kehitetään helmi-pohjainen suurikapasiteettisten PKT määritys

Critical kehittämään tämän PKT määrityksen oli sopivien helmiä, jossa on optimaalinen mitat ja kemialliset ominaisuudet (taulukko S1). Helmet, jotka havaittiin sopivin PKT määrityksissä soveltaa moniin erilaisiin solutyyppeihin oli karboksylaatti-modifioitu lateksi (CML) valkoisena polystyreenihelmien, joiden keskimääräinen halkaisija on 340 nm, ja negatiivisen varauksen pitoisuus 184,7 μEq /g. Nämä helmet muodostavat homogeenisen ja näkyvä yksikerroksista; sitoutumisensa alustaan ​​on yritys riittää estämään spontaanin irtoamisen, mutta silti alttiita poisto vaeltavien solujen.

pintakemiasta helmien havaittiin olevan vahva vaikutus PKT määritys: helmet aldehydillä modifioituja pinta kiinnitetään lujasti alustaan, eikä sitä voitu poistaa vaeltavien solujen. Helmet sulfatoitu pinta taipumus aggregoitua, jolloin saatiin ei-yhtenäisen yksikerroksisen. Karboksyloidut helmiä kanssa tai ilman ylimääräisiä sulfaatti ryhmiä, oli taipumus muodostaa melko homogeenisen suspensioita sentrifugoinnin jälkeen. Pintatiheys Karboksylaattiryhmien vaikuttaa myös radan muodostus: alhainen varaustiheys (23,9 μEq /g) aiheutti helmi vuorovaikutuksessa voimakkaasti pinnan kanssa siten, että monet solutyypit eivät tehokkaasti poista helmiä kuin ne siirretään. Helmiä karboksylaatti Välituotteen tiheyden (91,4 μEq /g) havaittiin optimaalinen joidenkin kiinnittyneitä soluja (esim H1299, REF52) mutta ei solujen heikompaa kiinnikkeistä (esim MCF7, B16-F10). Helmet, jotka sisältävät karboksyyliryhmiä, jonka tiheys on 160-185 μEq /g havaittiin olevan optimaalinen määrityksiä sovelletaan erilaisia ​​solutyyppejä.

Lisäksi, halkaisija helmiä oli merkittävä vaikutus näkyvyyttä kappaleet ja vakautta yksikerroksisen. Niinpä pieniä helmiä ( 300 nm halkaisijaltaan) tuskin voidaan visualisoida, kun taas suuret helmet (~1,000 nm halkaisijaltaan) taipumus irrottaa pinnasta ja sitten spontaanisti kiinnitä, jolloin heikosti määritelty kappaleita. Optimaalinen pallon läpimitta automaattisen PKT määrityksissä havaittiin olevan noin 400 nm.

Kehittäminen mikroskopia järjestelmän

PKT-määritykset rekisteröitiin käyttäen solu-seulonta mikroskoopin [24], jossa on laser automaattitarkennus laite [25]. Mikroskooppi käyttöohjelma ja kuva hankinta ohjelmisto kirjoitettiin hakemuksena sisällä UCSF PRIISM ympäristö (https://msg.ucsf.edu/ive). Tässä sovelluksessa, kuvat otettiin käyttäen 10 × /0,4 tavoite, alle läpivalaisu. Kevyt diffuusori asetettiin yläpuolelle monikuoppalevyä, minimoida ei-homogeeninen valaistus ja välttää varjoja yleisesti aiheuttama kapea hyvin seiniin.

erityinen hankinta Ohjelma valvoo valaistus; automaattisen tarkennuksen ja kuva hankinta vaiheet kaikille valittujen kenttien kussakin hyvin, ja kaikkien valittujen kuoppiin levyyn optimoiden samalla kokeellinen tiedot (esim. hyvin lukumäärä, kentän sijainti, valotusaika, tavoite, optinen asetus, ja vastaavat). Jotta tallentaa maksimaalinen kokonaisten solujen kappaleita, kuvia viereisten kenttien oli sulatettu saumattomaksi montaasi, jossa kappaleita ulottuu useamman kuin yhden kuvan yhdistetään suurella tarkkuuden (kuva S1).

kvantifiointi muuttavien parametreja, jotka perustuvat PKT morfometria

tunnistaa yksittäisiä kappaleita, kuvat alistettiin ”madaltuminen”, kompensoivat siten epähomogeeninen valaistus, pehmentää ja kontrastisäätö. Saatu intensiteetti Histogrammi tuotti merkittävän huipun, joka vastaa häiriöttömät taustan (kuvio 1c, musta tähdellä); korkea intensiteetti piikin helmi vapaata kappaletta (kuva 1c, sininen tähti); ja matalan intensiteetin vastaavat pikselit helmi-ladattu soluissa (kuvio 1 c, punaisella tähdellä). Soveltamalla kahden binaarisen kynnysarvoja, soluja (kuvio 1 d), ja kappaleet (kuvio 1 e) voidaan erottaa toisistaan. Roskat, naarmuja, seuraa ilman, tai useamman kuin yhden solun, risteäviä kappaleita, ja kappaleet joka ulottuu rajalle montaasi, tunnistettiin ja heitettiin pois (kuvio 1f, segmentit esitetty sinisellä). Saadakseen hieno määritelmä radan rajojen, jotka hieman hämärtynyt tasoitus vaiheessa (kuvio 1 g), radan rajat laskettiin uudelleen alkuperäisestä kuvien avulla Useita aika segmentointi analyysi [26] (kuva 1 h).

(a ) montaasi 4 × 4 kentät (1024 × 1024 pikseliä), kukin hankittu käyttäen 10 × /0.4 tavoite. (B) Yksi kenttä (512 × 512 kuvapistettä, binned 2 x 2) (c) Histogrammi pikselin intensiteetti: tärkeimpien huippu (*) vastaa tausta pikseliä; vähäinen huippu kirkkaita intensiteetti (*) vastaa seurata pikseliä; ja tumma pikseleitä edustavat solurungoissa ja roskat (*). Punainen pystysuorat viivat merkitsevät kahden kynnyksen erottaa kappaleen pikselit soluista ja taustan. (D, e) Binary kuvia, levittämisen jälkeen kynnysarvot. Pikseliä voimakkuudet alemman kynnysarvon (solujen ja jätteiden) ovat värillisiä valkoinen (d), ja pikseliä intensiteetit yläpuolella korkeampi kynnys (radat) ovat värillisiä valkoinen (e). (F) Kaikki liitettyjen laitteiden koko montaasi esitetään: Raidat punaisina. Esineet joko liian pieniä tai liian suuri alue sisällytetään kuvan analyysien tai sijaitsevat rajoilla montaasi, on esitetty sinisellä. (G) Laajentuminen segmentoitua kentän seuraavat binary segmentointia. (H) Sama alue kuvattu (g), seuraava multi-asteikko segmentointi, ja myös hieno ääriviivat radan ja radan akselit. Mittaviivat: 250 um.

jälkeen segmentointi vaiheessa, me määrällisesti eri morfometrisiin parametrit jokaisen solun tyyppi. Radan parametrit, jotka mitataan automaattisesti mukana rata-alueella, kehä, pääakseli, pienempi akseli, aksiaalinen suhde ja kiinteys. Seuraa reitin pituus ja päästä-päähän pituus oli käsin mitattiin. Rata parametrit lasketaan näistä morfometrisiin parametrit sisältävät pysyvyys, tehokas nopeus, keskimääräinen vaellusnopeus, lamellitiiviste aktiivisuutta, ja yleinen suuntaavuus. Nämä morfologiset ja ”dynaaminen” parametrit on esitetty taulukossa S2, ja graafisesti esitetty kuvassa 2.

automaattinen laskeminen eri morfometrisen parametrejä käytettiin tässä tutkimuksessa, osoitetaan käyttämällä pkts muodostama H1299, B16-F10 ja MCF7-soluissa. Lasketut parametrit sisältävät: Total rata-alueella (im

2), rajattu punaisella; netto rata-alueella sen jälkeen, kun solu alue vähennetään; pieniä ja suuria akselit (pm) parhaiten sopivan ellipsin; suhde akselit; vaellusnopeus [pituus luuranko ja oksat (vihreä + sininen) /Muuttoaikoina], tehokas nopeus [end-to-end etäisyyden (punaisia) /Muuttoaikoina]; seurata kehä; karheus [Perimeter

2 /(4π * Area)] ja lujuus [rata-alueella (sininen) /alue kuperan rungon (punainen + sininen), joka sulkee radan]. Arvot osoitettu kuviossa viittaavat yksiraiteista esitetty.

On huomattava, jopa näennäisesti samanlaiset parametrit (esim. ”Vaellusnopeus” ja ”tehokas nopeus”) voi vaihdella suuresti. Esimerkiksi, B16-F10-solu, kuviossa 2 on esitetty, esillä lähes sama migraationopeus (62,4 um /h), kuten H1299 solu (67,26 um /h), kun taas jälkimmäinen solutyypin näytetään paljon suurempi efektiivinen nopeus (57,26 um /hr, verrattuna 20,4 um /h B16-F10 solu), mikä osoittaa enemmän pysyviä muuttoliikkeen kuin entinen. Arvioida ”sivuttainen” lamellisesta toimintaa, joka vaikuttaa leveys ja karheus radan rajojen, mittasimme radalla kehä, ja lasketaan karheus ja lujuus parametrit. Analyysi osoitti, että vaikka perimeters kappaleiden muodostama H1299 ja B16-F10-solut olivat lähes samat, karheus parametri oli huomattavasti suurempi B16-F10 solu (5,2) kuin H1299 solussa (3,2), mikä osoittaa korkeampi lamellitiiviste toimintaa melanoomasoluja. Tämä havainto oli suoraan varmistettiin nopeutus elokuvia (kuva 3, ja elokuvat S1 ja S2).

Eri ajankohtina näkyvät joka sivusuunnassa lamellivalurauta aktiivisuuden H1299 (ylempi paneeli) tai B16-F10 (alempi paneeli) solut jättää jälkiä muoto ja karkeus radan rajan. (Täyspitkä elokuvat ovat saatavilla verkossa Movie S1 ja elokuva S2, tässä järjestyksessä.)

soveltaminen PKT morfometria mittaamiseen solutyyppispesifisten ja lääkkeiden aiheuttaman vaikutuksia vaeltavia parametrien

a) eri solutyyppejä tuottaa PKT Tunnusomaista.

PKT tässä kuvatussa kokeessa käytettiin testaamaan vaeltavien käyttäytymistä erilaisissa solulinjoissa. Näitä ovat: B16-F10 ja B16-F1-melanoomasoluja; MDA-MB-231 ja MCF7-rintasyöpäsoluihin, REF52, SV80 ja NIH3T3 fibroblasti linjat; H1299 keuhkokarsinooma soluja, ja useat eturauhassyöpä linjat (DU145, PC3 ja CL1). Neljä näistä solulinjoista (MDA-MB-231, MCF7, H1299 ja B16-F10) käytetään varten kuva (katso kuva 4a ja taulukko S3). MCF7-solut, esimerkiksi tuskin siirtyvät, jotka tuottavat vain pieni, helmi-vapaa vyöhyke ympärille jokaisen solun, joiden keskimääräinen netto rata-alueella on 4900 ± 2400 pm

2 (n = 93). B16–F10-melanoomasoluja tuottaa haarautunut kappaleita takia laajentamista useiden filopodia ja ohut lamellin pääosin kohtisuoraan tärkein muuttavien rata, joiden keskimääräinen nettoala 7400 ± 2800 pm

2 (n = 124). MDA-MB-231-solut ovat laajasti vaeltavia metastaattinen soluja, jotka tuottavat sekä pitkä ja leveä kappaleet, joiden keskimääräinen nettoala 13500 ± 6300 pm

2 (n = 149). H1299 solut ominaista nopea ja erittäin pysyviä muuttoliike, muodostaen raidat joiden keskimääräinen netto ala on 14000 ± 7600 pm

2 (n = 104).

(a) montaasi 2 x 3 kuvia PKT MCF7-solut, sekä MDA-MB-231-soluja, B16-F10-soluja, ja H1299-soluissa. Huomaa erot radan nettoala (A

N) ja aksiaalisuhde (X), riippuen solulinjasta. (B) montaasi 2 x 3 kuva H1299 ohjaus solujen, jotka ilmentävät pitkä vaeltavia polkuja, jotka ovat hyvin pysyviä. Montaasi kuvia Latrunculin A (4 uM) – ja Nocadazole (2,5 uM) hoidetun kuoppiin osoittavat esti soluliikkuvuus; PMA (100 ng /ml) hoidetun ja esittää lisäystä solun liikkuvuus. Mittaviivat: 250 um.

b) Vaikutukset solun tukirangan huumeita PKT rakenteellisia ja dynaamisia ominaisuuksia.

Sen määrittämiseksi, onko automaattiset seulonta järjestelmä kykeni havaitsemaan muutokset erityiset muuttavien ominaisuuksien aiheuttama geneettinen tai kemiallisten häiriöiden, käsittelimme H1299 soluja erilaisilla yhdisteillä (esim Latrunculin-A, nokodatsoli ja PMA) tiedetään vaikuttavan solun liikkuvuus. Vaikutus kunkin lääkkeen erilaisista morfometristä parametrit mitattiin sitten (kuvio 4b). Koska arvot kullekin PKT parametrin ei näyttänyt olevan normaali tilastolliset jakaumat, me perustuu meidän vertailu muutoksiin prosenttipisteet arvot kullekin morfometrisiin parametrin, eikä muutoksia keskiarvojen (taulukko S4). Analyysi PKT alueen H1299 käsiteltyjen solujen eri estäjien osoitti, että Latrunculin-A tai nokodatsoli lyhensi rata-alueilla, aksiaalinen suhde, muuttoliike nopeudet ja karheus, verrattuna kontrolliin soluihin. Vuonna PMA-käsiteltyjä soluja, PKT-alue, pääakseli ja laskea muuttoliike nopeudet lisääntynyt (p 0,05), mutta pienempi akseli, aksiaalinen suhde ja lujuus eivät merkittävästi poikkea kontrollisolujen.

Application ja PKT määritys tunnistaa pro-vaeltavien geenien rintakarsinooma liittyvän geenin kirjasto (BC1000) B

PKT tässä kuvatussa kokeessa käytettiin kirjaston seulomiseen syöpään liittyvien geenien kyky indusoida maahanmuuttoriskinä fenotyypin pitkälti paikallaan rintojen epiteelisolujen. Tätä varten me tartunnan viljeltiin MCF7-solut retrovirusvektoreilla, jotka koodaavat 55 geenit valitaan BC1000 kirjastosta (taulukko S5), ja testattiin niiden muuttavien aktiivisuus kvantitatiivisella PKT seulonnan.

Kuten on esitetty kuviossa 5a ja taulukossa S6 , PKT näytön ansiosta voimme tunnistaa neljä uusia pro-vaeltavia ehdokkaille: HOXB7, FGF7, ErbB3 ja PKCζ. 80

persentiilin arvoja, samoin kuin keskiarvon ja keskihajonnan, on esitetty taulukossa S6. Vaikka kaikki neljä geenit stimuloidaan MCF7 solujen vaeltamiseen, niiden vaikutukset eri vaeltavia parametrit erosivat. Näin ollen, vaikka FGF7 ja PKCζ kloonit indusoitiin muodostumista pitkä, jatkuva kappaleita, koska parantamiseksi suuntaava kalvon ulkonemat, pitkänomainen kappaleita, aiheuttama HOXB7 ja ErbB3 näytti olevan yhteydessä useiden kalvon ulkonemien kaikkiin suuntiin. Näin ollen, vaikka näkyvyys suuntaava ”eteenpäin ulokkeita” ei voida suoraan arvioida radan morfometria, on ilmeistä, että parantaminen radan pituus, joka ei ole liitetty korkea karheusarvot on todennäköisimmin Lisääntyneen suuntaava lamellipodial (taulukko S6 ja kuvio 5). On mielenkiintoista huomata, että näytön BC1000 kirjaston, muutokset muuttavien käyttäytyminen havaittiin toisen geenin, nimittäin MFGE8 (tunnetaan myös nimellä rintaepiteelin antigeenin BA46). Vaikka yli-ilmentyminen tämän geenin indusoidun vain vähäistä parannusta PKT-alueella, se ei suuresti parantaa radan epätasaisuus, mikä viittaa siihen, että se parantaa ei-suunnatulla kalvolla uloke (Naffar Abu-Amara, julkaisematon data).

(a) montaasi 4 × 4 kuvaa vertaamalla PKT tuottama GFP-MCF7 ohjaus soluja, niitä on tuotettu MCF7-solut ilmentävät BC1000 peräisin olevien geenien HOXB7, PKCζ, FGF7, ja ErbB3. Suurennus: 10 x. Mittaviivat: 250 um. (B) Laskettu suhde kunkin muuttavien morfometrisen parametrit eri BC1000 kirjasto ehdokkaita, ja ne kontrollisolujen (GFP-MCF7). Ensisijainen tilastollinen lähestymistapa hyödyntää perustui laskemalla kunkin parametrin ”80

persentiili.” Normalisoitu vaikutus GFP-ohjaus on aina nollaksi: nolla arvo ilmaisee mitään eroa ”80

persentiilin ”arvo ehdokkaan geenin, ja valvonnan soluja. Numeroita, jotka ovat enemmän tai vähemmän kuin nolla osoittavat nousu tai lasku, vastaavasti, 80

persentiili arvo testattujen parametrien. (Katso lisätietoja, katso taulukko S6).

Voit selvittää keskinäiset suhteet eri muuttavien parametrien, haimme Pearsonin korrelaatio testin kaikille PKT tuottaman häiriöttömät soluja (kuvio S2). Tämä analyysi paljasti, että esimerkiksi radan pituus (pääakselin aksiaalisuhde) korreloi negatiivisesti radan lujuus, mikä osoittaa, että tuotanto pitkänomainen kappaleita ohjaus solut korreloi voimakkaasti sivusuunnassa protrusive toimintaa. Tämä analyysi ulotettiin myös näihin soluihin, jotka ilmentävät erilaisia ​​pro-vaeltavia geenejä, jotta voidaan määrittää niiden kyky häiritä näennäinen keskinäinen riippuvuus eri muuttavien parametrit. Nämä analyysit osoittavat, että yli-ilmentyminen PKCζ, HOXB7 ja ErbB3 heikensi keskinäistä suhdetta radan pituus ja kiinteys.

Mitä suhteita aksiaalinen suhde ja mittasuhteet pitkä ja lyhyt akselit, ohjaus solut osoittavat hallitseva osuus pitkän akselin aksiaaliseen suhdearvo, jossa pienemmän akselin kohdistamaan rajallinen vaikutus. Soluissa, jotka ilmentävät FGF7 ja PKCζ aksiaalinen suhde on pääasiassa korreloi pääakseliin, ja ErbB3 ja HOXB7 vaikuttanut aksiaalinen suhde muuttamalla radan leveys. Näyttää siis siltä, ​​että parantaminen kokonaisuudessaan solumigraation eri pro-vaeltavien geenejä voidaan saavuttaa selektiivinen modulointi erilaisten dynaamisten solujen ominaisuuksia, kuten solujen polarisaatio ja protrusive kalvon toimintaa.

Keskustelu

ensisijainen tavoite tämän tutkimuksen kehittäminen kvantitatiivisen määrityksen solujen vaeltamiseen, joka voisi mitata useita muuttavia ominaisuuksia, ja olisivat yhteensopivia korkea-seulonnan. Merkittävimmät kokeellinen haaste mukana suunnittelemassa Tällaisessa määrityksessä on ilmeinen ristiriita omaksua nopeasti valtava määrä muuttoliiketietojen sekä tarve saada ”korkea pitoisuus” tietoa muuttavien käyttäytyminen monien solujen, mukaan lukien dynaamisia ominaisuuksia, kuten vaellusnopeus ja lamellipodial toimintaa. Koska kokoelma suora dynaaminen tietoa solujen vaeltamiseen on ristiriidassa suurikapasiteettisten, siksi päätimme tutkia epäsuora, mutta toistettavissa ja vankka, lähestymistapoja sellaisten tietojen. Ehdotamme tässä, että yksityiskohtainen morfometrisiin analyysi PKT tuottaman yksittäiset vaeltavien solut voivat tarjota tällaisia ​​määrällisiä, morfologiset ja ilmeisesti dynaamista tietoa.

uudet näkökohdat Tämän tutkimuksen, joka on kiinnitettävä erityistä keskustelua ovat: (i) valinta helmiä ; (Ii) kappaleen segmentointi ja morfometria; ja (iii) tilastollinen analyysi tietojen. Valinta helmiä PKT määritys perustui kolmeen ominaisuuksiin ”maahanmuuton alalla ’näkyvyyttä radan (vaikuttaa ensisijaisesti Liimapalon, optimaalisella pallon läpimitta 300-400 nm); niiden kyky muodostaa homogeenisen kerroksen (optimaalinen aldehydin tai karboksyloitu pinnat; Köyhät sulfaatti-modifioitu helmiä), ja kyky poistaa vaeltavien solujen (optimaalinen carboxylated- ja huono aldehydillä modifioidun helmiä). Huomattavaa on, että herkkyys karboksyloidun helmiä poistamisen siirtämällä solut korreloi käänteisesti pinnan tiheys karboksylaattiryhmät, jolloin ”hienosäätöä” helmen kerroksen tietyn solutyypin testata.

PKT segmentointi ja morfometria edellyttäen tärkeitä oivalluksia peruspiirteitä muuttoprosessista. Näitä ovat yleinen vaeltavien aktiivisuutta solun, joka vastaa verkon PKT-alueella; muuttoliike napaisuus, pituutta vastaavan pääakselin maahanmuuton (tai aksiaalinen suhde); ja ”lateraalinen” lamellisesta aktiivisuus, mitattuna radan vakautta, joukossa muita arvoja. Näiden mittausten perusteella, useat dynaamiset parametrit laskettiin, kuten keskiarvo ja tehokas siirtymänopeuksien, ja lamellaarisia toimintaa. Luonnollisesti dynaamisia tietoja päätellyt staattinen PKT morfologia, on melko epäsuora, mutta korkean resoluution tietoja [erityisesti karheus radan rajojen mitattuna Useita aika segmentointi analyysi [26]; (Kuvio 1 h)], joita voitaisiin korreloi dynaamisen tiedot perustuvat Aikakierrosvideo mikroskoopilla (kuva 3). Kun lasketaan jokaisen raidan, useita parametreja voidaan korreloida keskenään, joko kontrolli-soluissa, tai seuraavia kemiallisia tai geneettisiä hämminki.

Meidän kannalta, PKT määritys käytettiin löytää uusia pro-muuttavien geenien on rintasyöpä liittyvä geeni kirjasto. Ajatus, johon tämä lähestymistapa on, että huolimatta ilmeinen molekyyli- monimutkaisuus solumigraation prosessi, saattaa olla ”isäntä geenit”, jotka voivat aiheuttaa vaeltavia ominaisuuksia paikallaan solussa. Ainutlaatuinen kapasiteetti PKT määrityksen kehitimme korostamaan ja määrällisesti yksittäisten ominaisuuksia muuttavien fenotyypin, voisi sitten liittää tietyn pro-muuttavien geenin tiettyihin muuttavien mekanismien. Uusi pro-muuttavien tunnistettujen geenien ovat muun muassa: HOXB7, erbB3 PKCζ ja FGF7. Vaikka kaikki nämä geenit tiedetään olevan ”syöpään liittyvien”, nykyinen tutkimus osoittaa, että näiden osuus pahanlaatuinen prosessi saattaa liittyä niiden pro-muuttavien aktiivisuutta.

Materiaalit ja menetelmät

valmistaminen helmi päällystetty 96-kuoppalevyille

Glass pohja 96-kuoppaisille levyille (Whatman, Inc., Clifton, NJ, USA, Kat. # 7706-2370) inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, 50 ul: lla 10 ug /ml fibronektiiniä liuotettuna PBS: ään (fibronektiinin, F-1141; Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA). Tämän jälkeen kuopat pestiin kahdesti PBS: llä ja päällystettiin 340 nm valkoinen polystyreenilateksi helmiä (Interfacial Dynamics Corporation, Molecular Probes Mikropallot Technologies, USA; Tuote ei. 2-300; Erä no. 1344). Helmisuspensiota (3,2 ml), sentrifugoitiin 5 minuuttia 20800 x g, ja pelletti suspendoitiin uudelleen 4 ml: aan PBS: ää, kunnes kaikki näkyvät helmen kokkareita hajallaan. Sedimentaatio Menettely toistettiin sitten vielä kerran, minkä jälkeen helmet suspendoitiin uudelleen 7 ml: aan PBS: ää, lopulliseen konsentraatioon 0,9

12 partikkelia /ml. Alikvootit 70 ui helmisuspensiota lisättiin kuhunkin kuoppaan, jotka oli esipäällystetty fibronektiinin, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan, minkä jälkeen kevyesti PBS: llä pesun (x 5) käyttämällä levypesintä (Colombus Plus , Tecan, Sveitsi). Ennen solujen pinnoitus, PBS korvattiin 50 ul: elatusaineeseen sopiva tietyn solutyypin käytetään määrityksessä (katso kuva S3).

Cell valmistelu PKT määrityksessä

MCF7 (ATCC -HTB-22), MDA-MB-231 (ATCC-HBT-26), ja B16-F10 (ATCC-CRL-6475) soluja kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM); H1299-soluja (ATCC-CRL-5803) kasvatettiin RPMI-1640. Molemmat elatusaineita täydennettiin 10% FCS, 2 mM glutamiinia, 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), ja ylläpidetään 5% CO

2 kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Sillä PKT määritystä, 200-400 soluja (50 ui alustaa) viljeltiin kussakin kuopassa. Riippuen tyypillinen radalla mittoja, kuten määritetään alustavien kokeiden määrä päällystetty solujen, ja inkubaatioaika oli kalibroitu maksimoimiseksi yhdessä ei-risteävää solun kappaleita. Tyypillisesti 200-400 solua /kuoppa ja 7 tunnin inkuboinnin havaittiin olevan optimaalinen parametrit useimmissa soluissa.

farmakologinen häiriöistä PKT muodostumisen

vaikutusten määrittämiseksi eri farmakologisia inhibiittoreiden vaikutus H1299-solulinja, solut maljattiin ja niitä inkuboitiin yhden tunnin ajan, minkä jälkeen ne käsiteltiin joko 4 uM Latrunculin A; 2.5 uM nokodatsoli; tai 100 ng /ml PMA: ta (forboli-12-mirystate 13-asetaatti). Sitten soluja inkuboitiin vielä 4 tunnin ajan, kiinnitettiin 3% paraformaldehydillä ja pestiin kahdesti PBS: llä. Levyjä joko tutkittiin välittömästi avulla seulonta automaattitarkennuksen mikroskoopilla, tai säilytettiin 4 ° C: ssa myöhempää tarkastusta.

Screening Muuttoliikettä aiheuttavia geenejä

seulomiseksi maahanmuuttoon aiheuttavia geenejä, me valittu 55 kandidaattigeenit päässä BC1000 kirjastosta: (https://www.hip.harvard.edu/research/breast_cancer/index.htm), kootaan Harvard Institute of Proteomiikka kirjallisuuden louhinnan ohjelmisto [27]. Tämä kirjasto koostuu kokoelma täyspitkän cDNA: iden tiedetään liittyvän rinta- syövän kehittymisen. CDNA: t kloonataan puromycin- valittavissa retrovirusvektoria (JP1520) [28] on Creator ™ uudelleenyhdistelyjärjestelmässä (Clontech, Mountain View, CA). 55 geenit testattu (katso taulukko S5) valittiin satunnaisesti tästä kirjastosta, ja oli jalomielinen lahjoitus Prof. Joan Brugge (Department of Cell Biology, Harvard Medical School, USA). Geenit vietiin MCF7-solujen avulla retrovirusinfektiota. Kukin klooni testattiin sen vaikutukset solujen vaeltamiseen, käyttäen PKT määritystä. Kuten valvontaa, myös syntyy JP1520 GFP-proteiinia ekspressoivien MCF7-soluissa. PKT-määritys suoritettiin 96-kuoppaisilla levyillä. Neljäsataa solua kuoppaa kohti ympättiin, ja 8 kuoppaa testattiin kunkin kloonin. Soluja inkuboitiin 7 tunnin ajan, ja sitten kiinteät käyttäen 3% PFA. Tietoja kerättiin käyttämällä automaattitarkennusta-seulonta mikroskoopilla.

Tilastollinen analyysi

Koska jakauma radan parametrit näyttää ei-normaalijakaumat, käytimme prosenttipiste tilastollinen työkalu arvioiden parametrien vaihtelua. Esimerkiksi 80

th persentiilin rata-alueella on arvo karjua josta 80% kappaleista alueen löytyy.

Erot ohjaus ja käsiteltyjen viljelmien arvioitiin merkityksen käyttämällä Two-Sample Kolmogorov- Smirnov hyvyys fit hypoteesitestin. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Pearsonin korrelaatio Testi suoritettiin arvot vaihtelevat välillä +1 (täydellinen positiivinen lineaarinen suhde kahden testattu muuttujaa) -1 (täydellinen negatiivinen lineaarinen suhde). P-arvo 0,0014 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Taulukko S1.

vertailu ominaisuuksia eri helmiä käytetään PKT määrityksessä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001457.s001

(0,03 MB DOC)

Taulukko S2.

parametrit merkintä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001457.s002

(0,03 MB DOC) B Taulukko S3.

PKT analyysi eri solulinjoissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001457.s003

(0,03 MB DOC) B Taulukko S4.

PKT analyysi H1299 käsiteltyjen solujen eri lääkkeitä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001457.s004

(0,03 MB DOC) B Taulukko S5.

Lista testatuista geenien.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001457.s005

(0,04 MB DOC) B Taulukko S6.

PKT analyysi MCF7-solujen yli-ilmentävät tiettyä pro-muuttavien geeni.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001457.s006

(0,05 MB DOC) B Kuva S1.

Järjestelmällä kuvaava kuva hankinta ja näyttö prosessi. (A) Kaavio 96-kuoppalevylle. (B) asennot 52 kenttiä, joka voidaan hankkia yhden hyvin, käyttäen 10 x tavoite. (C) montaasi 4 × 4 kuvaa (1024 × 1024 pikseliä), joka vastaa merkityn alueen hyvin. (D) Täystarkkuuskuvatiedostojen yhden kentän (512 × 512 pikseliä) sisällä montaasi (merkitty c). Mitta-asteikko: 250 um.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0001457.s007

(2,03 MB TIF) B Kuva S2.

Auto-korrelaatio PKT morfometrisiin parametrit ohjaus soluissa, ja soluissa, jotka ilmentävät pro-muuttavien geenejä. Auto-korrelaatio eri morfometrisiin parametrit laskettiin torjunta- (GFP-MCF7) kirjasto, sekä solujen yli-ilmentävät erilaisia ​​pro-vaeltavia geenejä on kuvattu kuvassa 5. Kukin suorakulmio on jaettu valkoinen viiva kahdeksi kolmioksi; kunkin kolmion osoittaa korrelaatio testi erilaisen ehdokkaan. P-arvo kunkin korrelaation tulos näkyy alla vastaavuuspistemäärä numeron.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0001457.s008

(4,16 MB TIF) B Kuva S3.

Kaavamainen pääpiirteittäin 96-kuoppalevyn valmistautuminen PKT määritystä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001457.s009

(0,96 MB TIF) -iin Movie S1.

PKT muodostumista H1299, levitettiin polystyreenihelmet.