Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kaksi keskeistä tapahtumaa, nimittäin tarttuvuus ja invaasio, ovat keskeisessä asemassa esiintyminen etäpesäke. Tärkeää on, että 37 kDa: n /67 kDa: n laminiinireseptori (LRP /LR) on liitetty parantaa näiden kahden tapahtuman mikä helpottaa syövän etenemisessä. Nykyisessä tutkimuksessa, rooli LRP /LR tarttumista ja hyökkäys maksasyövän (HUH-7) ja leukemia (K562) soluihin tutkittiin. Virtaussytometria osoitti, että HUH-7 soluilla merkittävästi suurempi solun pinnalla LRP /LR tasot verrattuna huonosti invasiivisen rintasyövän (MCF-7) ohjaus soluja, kun taas K562 soluilla huomattavasti pienempi solun pinnalla LRP /LR tasot verrattuna MCF-7-kontrollisoluja. Kuitenkin Western blotting ja densitometrinen analyysi osoitti, että kaikki kolme tuumorigeenisia solulinjat eivät eroa merkittävästi suhteen yhteensä LRP /LR tasoilla. Lisäksi hoito maksasyövän solujen anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18 ​​(0,2 mg /ml) vähensi merkittävästi liiman mahdollisia soluja 1-laminiinin ja invasiivisia mahdollisten solujen kautta ECM-like matrigeeliä, kun taas leukemia solut eivät osoittaneet merkittäviä eroja molemmissa tapauksissa. Lisäksi Pearsonin korrelaatiokertoimet ehdotti suoraa oikeassa suhteessa toisiinsa solun pinnalla LRP /LR tasoilla ja liiman ja invasiivisia mahdollisia maksasyövän ja leukemiasoluja. Nämä havainnot viittaavat siihen, mahdollista käyttöä anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18 ​​vaihtoehtona terapeuttinen työkalu metastasoituneen maksasyövän kautta haitan LRP /lR- laminiini-1 vuorovaikutusta.

Citation: Chetty C, Khumalo T, Da Costa Dias B, Reusch U, Knackmuss S, Little M, et al. (2014) Anti-LRP /LR Erityiset Vasta IgG1-iS18 ​​vaikeuttaa Adhesion ja Invasion maksasyövän solut. PLoS ONE 9 (5): e96268. doi: 10,1371 /journal.pone.0096268

Editor: Corinne Ida Lasmezas, The Scripps Research Institute Scripps Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu 25 marraskuuta 2013 Hyväksytty: 04 huhtikuu 2014; Julkaistu: 05 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Chetty et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Research Foundation, Etelä-Afrikan ja Medical Research Council, Etelä-Afrikassa. Kaikki mielipiteet, havainnot ja johtopäätökset tai suositukset ilmaistaan ​​tämän materiaalin ovat samat kuin tekijä (t), ja siksi, National Research Foundation ei ole vastuussa tässä suhteessa siihen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: S.F.T.W. on tällä hetkellä PLoS One Editorial Board Member. UR, S.K. ja M.L. sidoksissa tai palveluksessa Affimed Therapeutics A. G., kaupallinen yhtiö, joka tuottaa terapeuttisia vasta-aineita syövän ja tulehdussairauksien alueilla. Lisäksi anti-LRP /LR vasta käytettiin tässä tutkimuksessa saartoa hyökkäyksen ja tarttuvuus on kuvattu kaksi kansainvälistä patenttia mahdollisina terapeuttisina syövän vastaista työkaluja. Nimittäin patentti, EP0984987, jonka otsikkona on ”liukoinen laminiinireseptori edeltäjän ja menetelmiä estää sen vuorovaikutus” on patenttivaatimuksen koskee farmaseuttista koostumusta, joka käsittää liukoista laminiinireseptori prekursori- tai funktionaalisen johdannaisen tai fragmentin ja sen omistaa University of the Witwatersrand. Tämä patentti on validoitu Yhdistyneessä kuningaskunnassa ja Saksassa. Toinen patentti, EP1670826, on yhteisomistuksessa yliopiston Witwatersrand ja Affimed Therapeutics AG ja on nimeltään ”yksiketjuinen vasta-aine vastaan ​​vaikuttavan 37 kDa /67 kDa laminiinireseptori välineinä diagnosointiin ja hoitoon prionitautien ja syöpä, tuotanto ja niiden käyttöä ”. Tämä myönnetty eurooppalainen patentti validoitiin Yhdistyneessä kuningaskunnassa, Ranskassa, Saksassa, Sveitsissä ja Itävallassa. Patenttivaatimuksen ohjataan yhden ketjun vasta-ainemolekyylin erityisesti suunnattu LRP /LR hoitoon prionitautien tai syöpä. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Syöpä on maailmanlaajuinen taakka, joka on osoitettu olevan johtava kuolinsyy taloudellisesti kehittyneissä maissa ja toiseksi yleisin kuolinsyy taloudellisesti kehitysmaissa [1]. Mukaan Maailman Cancer Research Fund (WCRF), arviolta 14,1 miljoonaa syöpätapausta diagnosoitiin vuonna 2012, ja on ennustettu, että noin 24 miljoonaa uutta syöpätapausta diagnosoidaan vuoteen 2035 mennessä maailmanlaajuisesti (http: //www.wcrf.org/cancer_statistics/). Tällä hetkellä keuhkosyöpä on todettu yleisimmin diagnosoitu syöpä tyyppi, jossa kaksi syöpätyyppien keskeinen tässä tutkimuksessa nimittäin maksasyövän ja leukemia, on rankattu kuudenneksi ja yhdestoista eniten diagnosoitu syöpä tyyppejä, vastaavasti (GLOBOCAN). On raportoitu, että noin 782000 tapauksia maksasyövän ja 352000 leukemiatapausten diagnosoitiin vuonna 2012 (https://www.wcrf.org/cancerstatistics/world syöpä statistics.php), mikä osoittaa tarve kehittää tehokkaita hoitoja syöpää vastaan.

Solut ovat pitkälti riippuvaisia ​​soluväliaineen (ECM), joka on ei-huokoinen osa kaikkia kudoksia ja elimiä, joka tarjoaa fyysisen telineiden solukomponenttien ja myös avustaa aloittamisen olennaista biokemiallisten prosessit petin kudoksen erilaistumiseen, homeostaasin ja morfogeneesiin [2]. Solut kiinni ECM toiminnan välityksellä ECM reseptorien [2]. Erityisesti, ei-integriini 37-kDa /67-kDa laminiinireseptori (LRP /LR) on tärkeä osa soluväliaineen avustava lukuisissa fysiologisissa prosesseissa [3], [4], [5]. On ehdotettu, että 37 kDa: n LRP on esiaste 67-kDa: n korkean affiniteetin laminiinireseptori LR, mutta tarkka mekanismi, jonka avulla prekursori muodostaa reseptori on tuntematon [6].

LRP /LR on pääasiassa läpäisevään reseptoriin, kuitenkin, on myös ilmeistä, että ytimen ja sytosoliin [7], [8]. Tumassa, LRP /LR on keskeisessä asemassa ylläpidossa ydinvoiman rakenteiden taas sytosoliin, se auttaa translaatiotapahtumien [8]. Koska transmembraanireseptoriproteiinia, LRP /LR palvelee useita toimintoja, kuten solujen vaeltamiseen [9], solu-matriisi adheesio [10], solujen elävyyden ja lisääntymistä [3], [4], [5].

LRP /LR on osoitettu olevan voimakas sitoutumisaffiniteetti laminiini-1. Laminiini-1 on osa perheen laminiinien, jotka ovat soluväliaineen proteiineja, jotka muodostavat useita ei-kollageenista glykoproteiineja, jotka löytyvät tyvikalvon [11], [12]. Tämä glykoproteiini uskotaan olevan kriittiset roolit Solukiinnittymisen [11], kokoonpano tyvikalvon [11], solujen kasvuun ja erilaistumiseen [13], solujen vaeltamiseen [11], [14], neuriitin kasvua [11], [15 ] ja angiogeneesi [16]. Laminiini-1 on myös osoitettu edistävän invasiivisia fenotyypin tuumorigeenisiä soluja [17].

LRP /LR on havaittu olevan yli-ilmentynyt pinnalla useita tuumorigeenisiä soluja [18]. Tämän seurauksena yli-ilmentyminen on lisääntynyt vuorovaikutus LRP /LR ja laminiini-1, ja tämä vuorovaikutus on osoitettu olevan ratkaiseva parantaminen tarttuvuus ja invasion – kaksi avaintekijää etäpesäkkeiden [19]. Pohjimmiltaan, laminiini-1 kellarissa kalvo vuorovaikutuksessa LRP /LR pinnalla tuumorigeenisen solujen johtaa tartunta [19]. Tämä puolestaan ​​johtaa siihen, että eritystä proteolyyttisten entsyymien kuten tyypin IV kollagenaasia hydrolysoimiseksi tyypin IV kollageenia tyvikalvon, jolloin tuumorigeenisia solujen hyökätä ja lopulta translokoituvat toissijaiseen sivustolla [19].

koska LRP /LR-laminiini-1 vuorovaikutus on todettu olevan ratkaiseva tapahtuma tarttuvuus ja invaasio, lukkiutuvat tämä vuorovaikutus voitaisiin pitää olennaisena mekanismi hoitoon metastaattinen. Tämä syytöksiä LRP /LR tavoitteeksi varten metastasoituneen syövän. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet, että esillä olevan keksinnön anti-LRP /LR spesifisten vasta-aineiden vähentää merkittävästi liiman ja invasiivisia, että eräät tuumorigeenisiä soluja, kuten HT1080 fibrosarkooma [18], keuhkosyöpä [4], kohdunkaulan [4], paksusuolen [4] eturauhasen [4], rintojen [20] ja ruokatorven [20] syöpäsoluja. Erityisesti anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18 ​​on ehdotettu keskeyttää LRP /LR-laminiini-1 vuorovaikutusta [4], jolloin IgG1-iS18 ​​voidaan pitää mahdollisena terapeuttinen väline metastaattisen syövän.

tässä tutkimuksessa testataan anti-LRP /LR-spesifistä vasta-ainetta lgG1-iS18 ​​estää liiman ja invasiivisia potentiaali leukemia ja maksasyövän solut tutkittiin. Koska suuri esiintyvyys ja kuolleisuus näistä kahdesta syöpätyyppejä, vaihtoehtoiset hoitovaihtoehdot tullut välttämättömyys. On huomattava, että samankaltaisia ​​tutkimuksia on tehty, on kuitenkin mahdollista, että kaikki metastaattinen solutyypit voivat olla herkkiä IgG1-iS18 ​​hoitoja. Sen vuoksi on välttämätöntä toteuttaa nämä metastaattinen tutkimuksia eri syöpätyyppejä, jotta saadaan käsitys käytön vasta-vaihtoehtoisena laajakirjoinen terapeuttisia vasta-hoitoon eri syöpätyyppien. Näin ollen tämä tutkimus suoritettiin tavoitteena onko IgG1-iS18 ​​pystyy merkittävästi vähentämään liiman ja invasiivisia potentiaali leukemia ja maksan syöpäsoluja, siis tarjota mahdollisuus, että vasta-aine voidaan käyttää vaihtoehtona terapeuttinen työkalu hoidossa näiden kahden syöpätyyppeihin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja olosuhteet

Ihmisen rinta-adenokarsinooma (MCF-7), maksan karsinooma (Huh7) ja leukemia (K562) solulinjat saatiin ATCC: stä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM) runsaasti glukoosia (4,5 g /l), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiinillä 5% CO

2 ja 37 ° C: ssa.

Reagenssit ja vasta-aineet

Matrigel käytetään soluinvaasion määrityksissä on johdettu Engelbreth-Holm-parvi (EHS) hiiren sarkooma ja saatiin BD Biosciences.

Laminin-1used ja soluadheesioanalyyseissä saatiin Sigma-Aldrich.

Kloramfenikoliasetyylitransferaa- (CAT) vasta-aine saatiin Sigma-Aldrich.

IgG1-iS18 ​​rekombinanttisesti tuotettu nisäkäsekspressiojärjestelmässä raportoitu by

Zuber et al., (2008) B

konfokaalimikroskopia

jotta visualisoida sijainnin LRP /LR solun pinnalla, konfokaalimikroskopialla johdosta. Ensin soluja kylvettiin coverslip ja annettiin saavuttaa 70% konfluenssin. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä noin 15 minuuttia, minkä jälkeen useita pesuja PBS: llä. Soluja blokattiin 0,5% BSA: ta PBS: ssä 5-10 minuutin ajan. Yhden PBS pesun, ylimääräinen PBS blotattiin pois. Pääliliuskat sisältävät solut laitettiin lasilevylle (solujen kanssa osoittaa ylöspäin), ja tämän jälkeen lisättiin primaarisen vasta-aineen IgG1-iS18 ​​(1:100), laimennettu 0,5% BSA: ta. Lähettää inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, peitinlasit huuhdottiin kolme kertaa PBS /BSA: ta. Kun oli lisätty FITC-kytketty sekundaarinen vasta-aine, joka oli laimennettu 0,5% BSA: ta, inkuboimalla pimeässä annettiin 1 tunti. Seurasi kolme pesua kuten edellä, DAPI laimennettiin PBS annettiin sitten 5-10 minuuttia, jotta värjäystä ytimen. Solut pestiin lopuksi kerran PBS yksin ja asentaa puhtaalle levylle käyttäen GelMount (Sigma-Aldrich). Jakso 45 minuutin myönnettiin mahdollistaa asettamiseksi tapahtuu.

Virtaussytometria

kvantifiointi solun pinnan tasojen LRP /LR suoritettiin käyttämällä virtaussytometria. EDTA (5 mM), PBS: ssä käytettiin helpompi irrottaa tarttuvien solujen jota seurasi sentrifugointi 1200 rpm, 10 min. Solut myöhemmin vahvistetaan uudelleen suspendoimalla solut PFA 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solut sentrifugoitiin uudelleen 1 x PBS: ssä, joka mahdollisti valmistamiseksi viiden solususpensioiden, yksi, joka ei ole vasta-ainetta lisättiin (siis, joka toimii värjäämätön ohjaus), yksi, joka anti-CAT-vasta-ainetta lisättiin (joka toimii isotyyppikontrolli) ja yksi johon anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18 ​​lisättiin. Loput kaksi Solususpensiot inkuboitiin vain PBS: ssä, jotta voidaan käyttää negatiivisten kontrollien IgG1-iS18 ​​ja anti-CAT-vasta-ainetta. Kaikki suspensiot inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunti. Seuraavat kolme pesuvaihetta 1X PBS: llä, vuohen anti-humaani-fykoerytriini (PE) kanssa kytkettyä sekundaarista vasta-ainetta (Beckman Coulter) lisättiin solususpensioon, joka sisältää IgG1-iS18 ​​primaarisen vasta-aineen sekä yhden suspensioiden, jotka inkuboitiin PBS: ssä vain . Solususpensiota, että inkuboitiin anti-CAT-vasta-ainetta sekä Jäljelle jäävä solususpensio, joka inkuboitiin vain PBS: ssä, molemmat täydennetty vuohen anti-kani-allofykosyaniini (APC) kanssa kytkettyä sekundaarista vasta-ainetta ja sen jälkeen vielä 1 tunnin inkubaation aikana kaikkien solususpensioiden. Lisäksi kolme post-inkuboinnin pesut suoritettiin ja solususpensiot analysoitiin käyttämällä BD Accuri C6-virtaussytometrillä. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

SDS-PAGE ja Western blotting

Yhteensä LRP /LR-tasot määritettiin käyttämällä natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE ). Suorittaa SDS-PAGE, 10 ug kokonais-proteiinia käytettiin. Proteiineja, jotka erotettiin koon mukaan SDS-PAGE sitten tunnistettiin soveltamista spesifisten vasta-aineiden prosessissa Western blotting. Proteiinit erotetaan polyakryyliamidigeelissä siirrettiin polyvinylideenifluoridiin (PVDF) kalvo käyttäen 1X siirto-puskuria (20% metanolia 192 mM glysiiniä ja 25 mM Tris) 45 minuuttia 350 mV ja puolikuiva siirtävän laitteen. Estopuskuria (3% BSA 1X PBS Tween) käytettiin sitten, jotta estää blotatun kalvo 1 tunti. Kun estetty, kalvo tutkittiin anti-LRP /LR erityisiä primaarinen vasta-aine IgG1-iS18 ​​(1:10000) 1 tunnin ajan. Ennen inkubointia kalvon vuohen anti-ihmis-peroksidaasi (1:5000) sekundäärinen vasta-aine, pestiin kolme kertaa 1X PBS: llä Tween suoritettiin. Lisäksi kolme pesua 1 x PBS-Tween tehtiin inkuboinnin jälkeen toisen vasta-aineen, jota seurasi havaitseminen HRP käyttämällä parannetun kemiluminesoivan substraatin (Thermo tieteellinen). Saatu fluoresenssi kehitettiin ja kiinnitetty X-ray elokuva. Kokeet toteutettiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin 3 kertaa.

adheesiomäärityksellä

Jotta voitaisiin arvioida liima potentiaali vaihtelee tuumorigeenisen solulinjojen tyvikalvon

in vitro

, laminiini-1 (10 ug /ml) (BD Biosciences) käytettiin päällystämään 96 microwell levyjä, jolloin päällystämättömän kaivoja voidaan käyttää negatiivisina kontrolleina. Sen jälkeen kun päällyste on kuopissa 1 tunnin ajan ja pesu 0,1% BSA DMEM: ssa, muun proteiinin sitoutumiskohdat mikrokuoppalevyn blokattiin käyttäen 100 ui 0,5% BSA DMEM: ssa yhden tunnin ajan. Solut suspendoitiin seerumittomassa viljelyalustassa ja lisättiin kuoppiin tiheydellä 4 x 10

5 solua /ml, jotta voidaan arvioida tarttumista potentiaalia. Lisäksi soluja, jotka on esi-inkuboida IgG1-iS18 ​​(0,2 ug /ml) ja anti-CAT (Sigma, 0,2 ug /ml) vasta-ainetta negatiivisena kontrollina lisättiin asianomaisiin kuoppiin, jotta voidaan tutkia vaikutuksia vasta-aineiden tarttuvuutta potentiaalia soluja. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunti ja sen jälkeen tarttumattomat solut pestiin pois PBS: llä ja kiinnittyneet solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan. Tarttuneet solut värjättiin 0,1% kristallivioletilla. Väriä uutettiin käyttäen 1% SDS: ää ja absorbanssi uutetaan näytteestä 550 nm: ssä määritettiin mittana liima potentiaalia. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

Invasion määrityksessä

In vitro

analyysi kyky kasvaimia solulinjojen hyökätä tyvikalvon tehtiin käyttäen ECM-kaltainen matrigeeliä. Seerumittomassa kylmä kulttuuri (DMEM) käytettiin, jotta laimentaa matrigeelin ja tämä laimennettu geeli annosteltiin ylempään kammioon 24 transwell levy (BD Falcon, 8 um huokoskoko). Tämä jälkeen geeli annettiin jähmettyä noin 5 tuntia 37 ° C: ssa. Kun se on korjattu, solut suspendoitiin uudelleen seerumittomaan viljelyalustaan ​​tiheydeksi 1 x 10

6 solua /ml. Vasta-aineen hoitoja tarvitaan soluja inkuboidaan IgG1-iS18 ​​(0,2 ug /ml) tai negatiivisena kontrollina anti-CAT (Sigma, 0,2 ug /ml) vasta-ainetta. Tämän jälkeen soluja ladattiin ylemmän Matrigel-piiriin kammioon ja inkuboitiin 18 tuntia. Alempi kammio täytettiin 500 pl viljelyalustaa, joka sisälsi 10% FCS: ää (testissä) ja ei FCS: ää (ohjausta varten), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 18 tunnin ajan. Tätä seurasi imemällä median alempi ja ylempi kammio. Noninvasiiviset solut poistettiin sitten käyttämällä pumpulipuikolla. Jäljellä olevat invasiiviset solut pestiin sitten 300 ul: lla PBS: ää ja kiinnitetään käyttäen 300 ui 4% paraformaldehydiä, 10 min. Solut värjättiin käyttämällä 0,5% toluidiinisinisellä väriaineen ja uuttamisen jälkeen väriaine käyttäen 1% SDS, absorbanssi mitattiin sitten 620 nm: ssä käyttäen ELISA-lukijaa. Kokeita tehtiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

Tilastolliset arviot

kaksisuuntaisella Studentin t-testi luotettavuusvälin 95% käytettiin, jotta voidaan analysoida tietoja , jossa p-arvot alle 0,05 pidetään merkittävänä. Laajuus tai aste yhdistyksen välillä LRP /LR tasoja solun pinnalla ja invasiivisen /liima potentiaali mitattiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiokerrointa. Pearsonin korrelaatiokerrointa käytettiin myös mittaamaan korrelaatio liiman ja invasiivisia potentiaalia solulinjoissa. Positiivinen kerroin oli osoitus suoran välisen suhteellisuuden kaksi muuttujaa, kun taas negatiivinen kerroin hiljaista käänteinen suhteellisuutta.

Tulokset

Maksasyövän ja leukemiasolujen paljastaa LRP /LR solun pinnalla

avaintutkimus esiintyminen etäpesäkkeiden on vuorovaikutusta laminiini-1 ja LRP /LR solun pinnalla. Siksi oli tarpeen visualisoida solun pinnan LRP /LR keinona vahvistuksen, että solut todellakin tehdä näyttö LRP /LR pinnallaan. Molemmat tuumorigeenistä solulinjoissa, sekä huonosti invasiivisen rintasyövän ohjaus, paljasti LRP /LR solun pinnalla, kuten on kuvattu kuviossa 1 a). Vihreä fluoresenssi kuvien alla on osoitus solun pinnan LRP /LR kuin soluja ei läpäiseviksi ja toisen vasta-aineen osoitettiin eivät sitoudu epäspesifisesti, mikä vahvistetaan valvonnan kuvattu kuviossa 1 b) ja kuvio 1 c) alla. Anti-CAT-vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina, koska sen kyky sitoutua spesifisesti kloramfenikoliasetyylitransferaasi (CAT), joka on bakteeri-proteiini ja on sen vuoksi jäänyt nisäkässoluissa.

Soluja ei tehty läpäiseviksi, jotta mahdollistavat visualisoinnin solun pinnalla. a) Soluja leimattiin primaarisen vasta-aineen IgG1-iS18 ​​ja FITC: hen liitetty sekundaarista vasta-ainetta. b) Soluja leimattiin anti-kloramfenikolia acteyltranferase (CAT), vasta-ainetta negatiivisena kontrollina. c) Soluja leimattiin vain FITC-kytketyn sekundaarinen vasta-aine vahvistaa, että sekundaarinen vasta-aine ei sitoudu epäspesifisesti.

korkea prosenttiosuudet kasvaimia aiheuttavasta solujen näyttää LRP /LR solun pinnalla

Vaikka konfokaalimikroskopia vahvisti, että solulinjat käykin näyttö LRP /LR pinnallaan, edelleen määrällisesti solun pinnan tasoa LRP /LR vaadittiin. Virtaussytometrian käyttää tähän kvantifiointiin.

Kuten kuviossa 2 A, C ja E, kaikki kolme tuumorigeenisia solulinjoissa paljasti korkeat prosenttiosuudet solujen tietyllä väestö näyttää LRP /LR solun pinnalla, jossa siirtymä kahden huiput kunkin kaavion osoittaessa muutos fluoresenssin intensiteetissä johtuu solun pinnalla solujen värjäytyminen anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18 ​​ja fluorokromi-kytketty sekundaarinen vasta-aine. HUH-7 maksasyövän soluilla suurempi prosenttiosuus soluista joilla LRP /LR solun pinnalla verrattuna K562 leukemia solut sekä huonosti invasiivisen rintasyövän (MCF-7) ohjaus solulinjaa. Kuva. 2 B, D ja F lisäksi sisältää unstained ohjaus ja tämä ohjaus toimi osoittaa, että PE sekundaarinen vasta-aine ei sitoudu epäspesifisesti. Siirtymiä Fluoresenssin intensiteetin värjäämätön, APC vain ja anti-CAT-APC leimattuja soluja (negatiivisia kontrolleja) ovat edustettuina kuviossa S1. On myös huomionarvoista, lisätä, että solu roskat ja soluaggregaatteja jätettiin analyysin ulkopuolelle, koska ne olivat ulkopuolella määritellyn portin (Fig. S3).

Ensimmäinen huippu kaavioita A, C ja E edustaa ei- leimattuja soluja eli solut leimattu vuohen anti-ihmis-PE-kytketty sekundaarinen vasta-aine vain, kun taas toinen piikki osoittaa solujen leimattu sekä anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18 ​​ja sekundäärinen vasta-aine, sekä konsentraationa 30 ug /ml. Käyrät B, D ja F kuvaavat sisällyttämistä värjäämätön ohjaus näyttää mitään epäspesifistä sekundaarinen vasta-aineen sitoutumista. Kokeita tehtiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kolme kertaa 20 000 solua määrä lasketaan näytettä kohti.

Maksasyövän solujen näyttää huomattavasti korkeampi ja leukemiasolujen näyttää huomattavasti pienempi solun pinnalla LRP /LR tasot verrattuna huonosti invasiivisen rintasyövän solujen

lisäksi solujen prosenttiosuus, joilla LRP /LR niiden solun pinnalla, todellinen solun pinnalla LRP /LR tasolla tietyn solupopulaation analysoitiin virtaussytometriaa käyttämällä. Sama määrä soluja (20000 solut) tietyillä populaatiot kolmen tuumorigeenisen solulinjat leimattiin samassa konsentraatiossa (30 ug /ml) aikaisemmin mainittujen ensimmäisen ja toisen vasta-aineiden saman ajanjakson aikana. Näin ollen mitä LRP /LR, joka on läsnä pinnalla kasvaimia solujen, sitä enemmän primaarinen vasta-aine IgG1-iS18 ​​sitoutuisi LRP /LR ja sen jälkeen, sitä enemmän IgG-erityisvaatimusten fluorokromiin kytketty sekundaarinen vasta-aine sitoutuisi primaariseen vasta-aineeseen . Näin ollen, mediaani fluoresenssin intensiteettiä (MFI) ei eroa kolmen solulinjoja (taulukko 1), ja näin ollen voidaan käyttää osoittimena solun pinnan LRP /LR tasoilla. Havaittiin, että verrattuna huonosti invasiivisia MCF-7 rintasyövän ohjaus solulinja, maksasyöpä soluja (Huh-7) näkyy korkeampia LRP /LR niiden solun pinnalla (kuvio 3). Lisäksi, K562 leukemia-solut paljastivat pienempi solun pinnalla LRP /LR tasot verrattuna MCF-7-soluissa (kuvio 3).

Solut leimattiin primaarisen vasta-aineen IgG1-iS18 ​​(01:25) ja anti- ihmisen fykoerytriini (PE) sekundaarisella vasta-aineella. 20000 solut analysoitiin kaikissa kolmessa solulinjat, ja mediaani fluoresenssin intensiteettiä (MFI) käytettiin indikaattorina solun pinnan LRP /LR tasoilla. MFI-arvot ilmoitetaan viimeisessä sarakkeessa taulukon 1 käytettiin, jotta rakentaa tätä lukua ja on huomionarvoista, että MFI-arvo, joka vastaa MCF-7 solulinja asetettu 100%. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kolme kertaa. ** P = 0,0025, *** p 0,0001.

Mediaani fluoresenssivoimakkuuksien saatu jälkeisen anti-CAT merkintöjä ja tunnistus osoittaa, että ei ole merkittävää eroa aste solu- pinta CAT värjäytyminen kaikissa kolmessa solulinjoissa (kuvio. S2) B

Yhteensä LRP /LR tasot eivät eroa merkittävästi toisistaan ​​kasvaimia solulinjojen

Kuten edellä mainittiin, LRP /LR ei pelkästään tapahdu solun pinnalla, mutta on lisäksi nähdään tumassa ja sytosoliin siten Western blot -analyysi suoritettiin, jotta voidaan arvioida yhteensä LRP /LR tasoilla. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa. Edustava blot on esitetty kuviossa 4. On huomionarvoista todeta, että vain 37 kDa: n laminiinireseptori esiaste voitaisiin havaita käyttämällä anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18.

Anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18 ​​käytettiin primaarisen vasta-aineen kanssa sekundaarisen HRP-kytketty vasta-aine. β-aktiini työskenteli latauskontrollina.

havaitsemisen jälkeen LRP, määrällisesti koko LRP tasoilla tarvittiin ja densitometrillä käytettiin tämän saavuttamiseksi. Kuva 5 kuvaa densitometrinen analyysi, joka osoitti tilastollisesti, ei ollut merkittävää eroa havaittu yhteensä LRP tasojen kolmen tuumorigeenistä solulinjoissa.

kvantitointi suoritettiin käyttäen densitometrian ja ovat edustavia kokeita suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa. Ei-merkitsevä (NS): p 0,05.

IgG1-iS18 ​​huomattavasti vaikeuttaa liima potentiaali maksasyövän solujen

avaintutkimus aloittamista invaasio on tarttuvuutta tuumorigeenisuudesta solu tyvikalvon läpi LRP /LR-laminiini-1 vuorovaikutuksen koska se mahdollistaa muita vuorovaikutuksia esiintyy, jotka helpottavat hajoamista tyvikalvon. Soluja inkuboitiin IgG1-iS18 ​​ja anti-CAT-vasta-aineita (0,2 mg /ml) ja sen jälkeen tunnin, absorbanssilukemia saatua liuosta oli osoitus aste solujen kiinnityksen laminiini-1-päällystetyillä levyillä.

kuten on kuvattu kuviossa 6, no-vasta-ohjaus saa määrittämiseksi liiman potentiaalin solulinjojen ja havaittiin, että sekä maksasyöpä (Huh-7) sekä leukemian soluja (K562) olivat kiinnittyneet kuin huonosti-invasiivisen rintasyövän (MCF-7) kontrollisoluja. Kuitenkin, IgG1-iS18 ​​oli ainoa tehokas on estää liima potentiaali maksasyövän solujen ja mitään merkittävää adheesion heikkenemistä havaittiin leukemiasolujen käsitelty anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18. Kuten odotettua, anti-CAT kontrollivasta-aineella ei ollut merkittävää vaikutusta liiman potentiaalia kasvaimia solulinjoissa.

p-arvot punaisella (* p = 0,0238; *** p = 0,0002) ovat osoitus kasvusta liima potentiaali maksasyövän (HUH-7) ja leukemia (K562) soluja verrattuna rintasyövän (MCF-7) ohjaus solulinjaa. p-arvot näytetään mustana (** p = 0,0031; *** p = 0,0005) edustavat väheneminen liima potentiaali hoidon jälkeen solujen sopivilla vasta-aineilla. Pienentäminen 63.35% liimassa potentiaali havaittiin annettaessa IgG1-iS18 ​​että HUH-7 maksan syöpäsoluja. Data edustaa kokeita suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

Invasion of matrigeelin maksan syöpäsoluja (HUH-7) merkittävästi rajoittavat anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18 ​​

Invasion tyvikalvon pidetään edellytys etenemisen metastaattinen syöpä, joten hyökkäystä määrityksillä käyttämällä Matrigel, joka jäljittelee komponentit tyvikalvon, suoritettiin määrittämiseksi invasiivisia potentiaali tuumorigeenistä solulinjat. Samoin tarttumista määrityksissä ei ole vasta-aine, ohjaus saa määrittämiseksi invasiivista potentiaalia solulinjoista. Lisäksi, soluja käsiteltiin anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18 ​​ja anti-CAT-vasta-ainetta (0,2 mg /ml).

Kuten kuviossa 7 on esitetty, maksasyövän (Huh-7-solut) ovat merkittävästi enemmän invasiivisia verrattuna huonosti invasiivisen rintasyövän (MCF-7) ohjaus solulinjassa, kun taas leukemia (K562-solut), oli huomattavasti pienempi invasiivisia potentiaalia kontrolliin verrattuna. Lisäksi IgG1-iS18 ​​onnistuneesti haitannut invasiivisen mahdollisia maksasyövän (Huh-7-solut), kun taas mitään merkittävää tulosta ei havaittu leukemiasoluja. Kuten odotettua, anti-CAT-vasta-ohjaus ei merkittävästi vaikuta invasiivisia potentiaalia kasvaimia solulinjoissa.

p-arvot on merkitty punaisella (* p = 0,0485; ** p = 0,0053) edustavat muutokset invasiivisia potentiaalia solulinjojen verrattuna MCF-7-ohjaus, kun taas p-arvot on esitetty mustalla (* p = 0,0214; ** p = 0,0091), ovat osoituksena vaikutus sopivia vasta-aineita on invasiivisia potentiaalia solulinjoissa. Kun anto IgG1-iS18 ​​että HUH-7 maksasyöpä soluja, vähentää noin 39,75% havaittiin osalta invasiivisia potentiaalia soluja. Data edustaa suoritettujen kokeiden kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

Keskustelu

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että solun pinnalla, eri tuumorigeenisia solulinjat osoittavat yli- on 37 kDa /67 kDa LRP /LR, siis viittaa siihen, että LRP /LR-laminiini-1 vuorovaikutus voi olla keskeinen syöpäsoluja tehdään etäpesäkkeiden [21]. Siksi voi olla hyödyllistä estää tätä vuorovaikutusta keinona haittaavat tarttuvuuden ja invasion – kaksi tapahtumaa havaittiin olevan ratkaiseva esiintyminen prosessin etäpesäke. Tekemä tutkimus Zuber

et al

on osoittanut, että IgG1-iS18 ​​vasta-aine on erittäin spesifinen LRP /LR [18]. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18 ​​huomattavasti vaikeuttaa liiman ja invasiivisen potentiaalia kohdunkaulan [4], keuhko [4], eturauhas- [4], paksusuolen [4], rintojen [20] ja ruokatorven [20] syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa tutkittiin miten LRP /LR tarttumista ja hyökkäys maksasyövän (HUH-7) sekä leukemia (K562) soluja, ja tavoitteena oli selvittää, onko soveltaminen anti-LRP /LR spesifistä vasta-ainetta IgG1-iS18 ​​merkittävästi pienentää liiman ja invasiivisia mahdollisia näiden kahden tuumorigeenisiä solulinjoja.

Aluksi konfokaalimikroskopialla paljasti, että kaikki kolme tuumorigeenisiä solulinjoja jopa näyttö LRP /LR niiden solun pinnalla (kuvio. 1a). Kuitenkin, tämä tekniikka rajoittaa se, että se ei ole kvantitatiivinen ja edelleen analyysi tarpeen, jotta voidaan luoda, mille tasolle LRP /LR näkyy solun pinnalla näiden tuumorigeenisiä solulinjoja.

Merkittävästi high prosenttiosuudet ( 87%), kaikki kolme tuumorigeenisiä solulinjoja, eli Huh-7, K562, ja MCF-7 (huonosti invasiivisen rintasyövän ohjattu) soluilla LRP /LR niiden solun pinnalla (kuvio 2). Lisäksi havaittiin, analysoimalla eroja mediaani fluoresenssin intensiteetit, verrattuna MCF-7-ohjaus solulinja, maksasyöpä soluja (Huh-7) paljasti huomattavasti korkeampi ja leukemiasolujen (K562) paljasti merkittävästi alhaisempi solun pinnan LRP /LR tasoa (kuvio 3). Kuten edellä todettiin, LRP /LR on olennaisia ​​rooleja tarttuvuus, invaasio, proliferaatio ja migraatio solujen [9]. Nähdä, että Huh-7 solulinjan tiedetään olevan invasiivinen ja K562 ymmärretään olevan suspension solulinja (ATCC), solun pinnan tasoa LRP /LR, että on havaittu, voidaan korreloi invasiivista potentiaalia näiden solujen