Krooninen sairaus

tiivistelmä

APC tuumorisuppressorigeeniä usein mutatoitunut paksu- ja peräsuolisyövän, jossa nonsensemutaatiota osuus 30% kaikista mutaatioita tässä geenissä. Uudelleen WT APC geeni syöpäsoluihin yleensä vähentää kasvainten muodostumiseen tai aiheuttaa apoptoosia. Tässä tutkimuksessa selvitimme mahdollisuutta käyttää huumeita aiheuttaa ennenaikaisen lopetuskodonin (PTC) läpikirjoittautumisesta (aminoglykosidit, negamycin), keinona aktivoimalla endogeenisen APC. Kvantitatiivista läpikirjoittautumisesta 11 nonsense mutaatioiden APC, pystyimme tunnistamaan ne antavat suurimmat tasot läpikirjoittautumisesta hoidon jälkeen. Näiden mutaatioiden, olemme osoittaneet, että aminoglykosidin tai negamycin hoito johti talteenotto biologisen aktiivisuuden APC syöpäsolulinjoissa, ja osoitti, että APC-taso aktiivisuus oli verrannollinen indusoidun läpikirjoittautumisesta. Nämä havainnot osoittavat, että hoito läpikirjoittautumisesta indusoijien olisi pidettävä mahdollisena strategia syöpien aiheuttama nonsensemutaatiota APC-geenin. Ne tarjoavat myös rationaalinen määrittelyperustan mutaatioiden reagoivien läpikirjoittautumisesta indusoijia.

Citation: Floquet C, Rousset’n JP, Bidou L (2011) läpikirjoittautumisesta Ennenaikainen lopetuskodonien että adenomatoottisen polypoosin coli Gene Palauttaa sen biologista aktiivisuutta in Human syöpäsoluja. PLoS ONE 6 (8): e24125. doi: 10,1371 /journal.pone.0024125

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. helmikuuta 2011; Hyväksytty: 04 elokuu 2011; Julkaistu: 31 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Floquet et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varoja Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC nro 5016 on JPR) ja Association Française contre les Myopatioita (sopimus 13986). CF rahoitettiin osittain Ranskan opetus- ja tutkimus- ja osittain apurahan päässä Ligue Nationale Contre le Cancer. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

APC (adenomatoottisen polypoosin coli) tuumorisuppressorigeeniä koodaa 311 kDa multidomain proteiinin sitoutumiskohdat lukuisia kumppaneita, kuten mikrotubulukset, ak- siini ja beeta-kateniinin [1]. Tämä proteiini toimii negatiivisena säätäjänä Wnt-reitin, joka on osallisena transaktivaatiota kohdegeenien, kuten onkogeenin c-myc ja sykliini D1-geeni [2]. APC-geeni on mutatoitunut 80% paksusuolen syövistä ja mutaatioita esiintyy varhaisessa kehityksessä kaikkein Polyploidisten peräsuolen syövät. On osoitettu, että uudelleen villityypin APC-geeni syöpäsoluihin vähentää yleensä kasvainten muodostumiseen tai indusoi apoptoosia [3], [4]. Kaiken kaikkiaan, 30% kaikista mutaatiot tässä geenissä ovat nonsensemutaatiota [5].

Viime vuosina tiettyjen antibioottien on osoitettu häiritä nisäkkään ribosomin, indusoimalla läpikirjoittautumisesta ennenaikaisen stop-kodonit (PTC ). Aminoglykosidit ovat antibiootteja yleisimmin tutkittu tässä suhteessa, ja useita tutkimukset ovat viitanneet siihen, että nämä lääkkeet voitaisiin käyttää innovatiivisia strategioita hoidettaessa geneettisiä sairauksia aiheuttamien nonsensemutaatiota (tarkistettavaksi [6], [7], [8]) . Dipeptidin antibiootti negamycin ei ole rakenteellisesti sukua aminoglykosidit [9], ja on todettu olevan tehokkaampi kuin gentamisiinille edistämiseksi läpikirjoittautumisesta noin nonsense-mutaation [10]. Tämä lääke voi siten olla houkutteleva vaihtoehto hoitoa potilaille kuljettaa nonsense-mutaatio.

Tuoreessa tutkimuksessa osoitimme, että jopa vaatimaton aminoglykosideihin aiheuttama läpikirjoittautumisesta tason (6%) laukaisee apoptoosin syöpäsoluissa kätkeminen hölynpölyä -mutated p53-geenin [11]. Nämä tulokset edellyttäen proof-of-concept että läpikirjoittautumisesta indusoijat voidaan käyttää syövän hoidossa, jotka liittyvät läsnä nonsense-mutaation kasvainsuppressorigeenin. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme mahdollisuutta laajentaa tätä lähestymistapaa syövän liittyy nonsense-mutaatio APC-geenissä. Äskettäin Zilberberg et al osoittivat, että läpikirjoittautumisesta indusoijat paransi kliinisiä oireita kasvaimen hiirimallissa kuljettaa nonsense-mutaatio APC-geenissä. Kuitenkin välinen yhteys on alhaisempi kasvaimen kehittymisen ja PTC läpikirjoittautumisesta ei ole perustettu [12]. On yhä selvempää, että vain osa nonsensemutaatiota hyötyisi gentamisiini hoitoa, riippuen niiden nukleotidin yhteydessä [13], [14], [15], [16].

arvioitiin läpikirjoittautumisesta tehokkuutta 11 nonsensemutaatiota mukana peräsuolen syövän, jonka tarkoituksena on tunnistaa nonsense mutaatiot APC-geenin eniten reagoivat läpikirjoittautumisesta aiheuttavia hoitoja. Sillä mutaatiot, jolla on korkein läpikirjoittautumisesta tasoilla, mukaan lukien endogeeninen mutaation, antibioottihoito johti talteenotto biologisen aktiivisuuden APC.

Tulokset ja keskustelu

tunnistaminen APC nonsensemutaatiota reagoi aminoglykosidifosfotransferaasigeeni hoidon

Tutkimme 11 nonsensemutaatiota löytyy 23% syöpäsolujen kuljettaa nonsense-mutaatio APC-geenin (T. Soussi, henkilökohtainen tiedonanto). Läpikirjoittautumisesta tehokkuus on osoitettu luonteen sekvenssien ympäröivästä lopetuskodonin [13], [17], [18], [19]. Näin ollen, kunkin mutaation, lisäsimme alue, joka käsittää ympäröivän yhteydessä (27 nukleotidia) kohdalla kaksi reportterivektoria pAC99 (taulukko 1). Läpikirjoittautumisesta kvantitoitiin NIH3T3-soluissa ohimenevästi transfektoitu dual reportteri vektori, läsnä ollessa tai poissa ollessa gentamisiini (kuvio 1). Läpikirjoittautumisesta vaihteli 0,01% (Q1131X) ja 0,2% (L360X) pohjapinta läpikirjoittautumisesta, ja 0,09% (APC Q789X) ja 1,6% (L360X), kun läsnä on 800 ug /ml gentamisiiniä. Samanlaisia ​​vaihtelut perus läpikirjoittautumisesta tasoilla ja reagointikykyä Aminoglykosideille on raportoitu useissa aiemmissa tutkimuksissa [13], [18]. Testasimme myös toista antibioottia, amikasiini, joka antoi läpikirjoittautumisesta olivat samat tai pienemmät kuin ne, jotka saatiin gentamisiini (tuloksia ei ole esitetty). Tämä tulos on yhdenmukainen aiemman tutkimuksen Howard et al jotka ovat verranneet läpikirjoittautumisesta aktiivisuutta useiden aminoglykosidien [20].

läpikirjoittautumisesta tehostunut 11 nonsense mutaatiot APC-geenin arvioitiin NIH3T3-solut ja ilman gentamysiini ( 800 ug /ml) käsittely 24 tuntia. Kaksi nonsensemutaatiota (L360X ja R1114X) näytetään tasot gentamysiini-indusoidun läpikirjoittautumisesta on yli 0,5%. Keinot arvot esitetään yhdessä keskivirheen keskiarvon (SEM) (n = 5).

arvioi läpikirjoittautumisesta tasot olivat samanlaiset soluissa paksusuolen alkuperää, jonka myös arvioimalla läpikirjoittautumisesta ohjannut kukin nonsense-mutaation syövän peräsuolen DLD-1-solulinjassa. Saadut tulokset olivat samanlaisia ​​kuin ne, NIH3T3-solut (tuloksia ei ole esitetty).

karakterisoimiseksi, olemme keskittyneet L360X ja R1114X nonsensemutaatiota, joka näytetään korkeimman läpikirjoittautumisesta läsnä ollessa aminoglykosidin gentamysiini (1,6% ja 0,7%, vastaavasti). Kahden valitun nonsensemutaatiota, me kvantifioitiin läpikirjoittautumisesta tasot saatiin kun läsnä on eri pitoisuuksia G418 (genetisiini), koska tämä antibiootti on voimakkain läpikirjoittautumisesta indusoija aminoglykosidit [11], [21], [22]. Molemmat nonsensemutaatiota näytetään annoksesta riippuvainen vaste G418, mikä läpikirjoittautumisesta jotka ovat suurempia kuin ne, jotka havaittiin gentamisiini, saavuttaa 2,3% L360X ja 1,8% ja R1114X (kuvio 2 A ja vastaavasti 2B). Läpikirjoittautumisesta tasot saatiin kun läsnä on dipeptidin negamycin olivat alhaisemmat kuin (L360X) tai vastaava (R1114X) niihin, jotka saatiin gentamisiini (kuvio 2 A ja vastaavasti 2B).

(A) läpikirjoittautumisesta tehostunut APC L360X nonsensemutaatiota määritettiin DLD-1-soluissa, kun läsnä oli G418: aa (10, 25, 50, 100 ja 200 ug /ml), negamycin (1 mg /ml), amikasiini (2 mg /ml) tai gentamisiini (800 ug /ml). (B) läpikirjoittautumisesta tehostunut APC R1114X nonsensemutaatiota määritettiin NIH3T3-soluja G418: n läsnäollessa (50, 100 ja 200 ug /ml) tai negamycin (1 mg /ml). Läpikirjoittautumisesta hyötysuhde DLD-1-solut olivat yhdenmukaisia ​​niiden kanssa, NIH3T3-soluissa (tietoja ei ole esitetty). (C) aminoglykosidihoidon käsittely palautuu APC aktiivisuutta. APC sitoutuminen beeta-kateniini (reppression on pTOPGlow toimittaja) on palautettu käsittelemällä DLD-1-soluja transfektoitiin ohimenevästi cDNA APC L360X G418 (10, 25, 50, 100 ja 200 ug /ml), negamycin (1 mg /ml), amikasiini (2 mg /ml) tai gentamisiini (800 ug /ml). (D) APC sitoutuminen beeta-kateniini (tukahduttaminen pTOPGlow toimittaja) on palautettu käsittelemällä LoVo kantavien solujen APC R1114X G418 (50, 100 ja 200 ug /ml) tai negamycin (1 mg /ml). Kontrollina, LoVo-soluja kotransfektoitiin pTOPGlow reportteriplasmidilla ja joko APC-kohdistaminen siRNA (siRNA APC) tai ei-suunnattu siRNA (siRNA NT) ja käsiteltiin G418 (200 ug /ml). (E) vaikutus siRNA kohdistaminen APC mRNA. Me transfektoitu tilapäisesti LoVo solujen siRNA kohdistaminen (siRNA APC) vai ei kohdistaminen (siRNA NT) APC mRNA. Kvantitatiivinen PCR: ää käytettiin määrittämään mRNA-tasoja. Tulokset on ilmaistu suhteessa mRNA: n määrää, kun läsnä on siRNA NT. Keskiarvot esitetään yhdessä SEM (n = 3).

läpikirjoittautumisesta taso riippuu luonteesta lopetuskodonin ja ympäröivän nukleotidin yhteydessä, mutta säännöt läpikirjoittautumisesta tasolla ovat monimutkaisia ​​ja pysyvät määritettävä nisäkässoluille. Läsnäolo C jäännöksen heti lopetuskodonin (+4) korreloi korkean läpikirjoittautumisesta, vaikka tämä ei näytä olevan ainoa tekijä läpikirjoittautumisesta tasolla. Useat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että vain harvat nonsensemutaatiota antaa ”merkittävä” läpikirjoittautumisesta läsnäollessa gentamysiini. Tässä tutkimuksessa vain kaksi yhdestätoista nonsensemutaatiota testattu, L360X ja R1114X, näytetään gentamysiini aiheuttama läpikirjoittautumisesta tasoilla yli 0,5%, mutta vain L360X oli C jäännös +4 asennossa. R1114X mutaatio olisi näin ollen hävittää, jos tämä olisi ollut ainoa kriteeri mutaatioiden tunnistamiseksi ottaen hyvin läpikirjoittautumisesta indusoijia. Meidän lähestymistapamme tarjoaa siis järkevä strategia tunnistaa potilaat todennäköisesti hyötyvät hoidon läpikirjoittautumisesta indusoijien.

Recovery APC biologista aktiivisuutta APC L360X cDNA jälkeen aminoglykosidihoidon hoidon

olivatko aminoglykosidihoidon hoitoa indusoi havaittavaa biologinen aktiivisuus APC-proteiinia, joka on valmistettu cDNA, jossa on L360X mutaatio. Aktiivinen APC välittää sitomisen beeta-kateniinin sytoplasmassa, mikä estää vuorovaikutuksen tämän molekyylin kanssa transaktivaatiota tekijä TCF ilmentämiseen tarvittavan kohdegeenien. APC-proteiinin aktiivisuus arvioitiin määrittämällä kyky tämän proteiinin sitoa beeta-kateniini, käyttäen reportteri-konstrukti, joka sisälsi TCF /beeta-kateniinin sitoutumiskohtien asetettu ylävirtaan lusiferaasi tulikärpäsen geeni (pTopGlow) [23]. Tämän reportteri-järjestelmän, välinen vuorovaikutus aktiivisen APC: n ja beeta-kateniini johtaa inhibitioon tulikärpäsen lusiferaasi ilmentymisen.

DLD-1-solut, joilta puuttuu funktionaalinen APC-proteiinin (APC del 1 bp 1406) transfektoitiin pCMV ekspressiovektori, joka sisältää joko WT tai L360X mutantti APC cDNA yhdessä pTopGlow (kuvio 2C). Transfektio WT APC vektori johti tasojen Firefly ilmaisun kymmenesosa, jotka saatiin transfektion jälkeen tyhjällä vektorilla. Ilman hoitoa L360X näkyy jäljellä toiminnan tasoa, mikä todennäköisesti johtuu epätäydellisestä menettämisestä tehtävä tämän alleelin, koska jäljellä oleva aktiivisuus on myös osoitettu mutaatioita lähellä asemissa [23]. Suurin annos G418 laski lusiferaasiaktiivisuutta kertoimella 2,5, mikä osoittaa tuotannon funktionaalisen APC proteiinin aminoglykosidihoidon hoitoon. G418 tukahdutettu lusiferaasin aktiivisuuden annoksesta riippuvaisella tavalla korreloi läpikirjoittautumisesta mitatut tasot DLD-1-soluissa (kuvio 2A). Hoito aminoglykosidien gentamisiini tai amikacin, tai negamycin myös laukaisi tukahduttamisesta lusiferaasiaktiivisuuden, osoittaa synteesi aktiivisen APC-proteiinia (kuvio 2C). Kutakin käsittelyä varten, proteiini aktiivisuus korreloi tasoon läpikirjoittautumisesta taso mitataan kahden toimittaja (kuva 2A ja 2C). Käytimme Spearmanin nonparametric korrelaatio koe (kaksisuuntainen) merkityksen arvioimiseksi tämän korrelaation. Huomasimme, että oli vahva, erittäin merkittävä korrelaatio (rs = -0,95, p 0,0001) välillä läpikirjoittautumisesta taso ja lasku lusiferaasiaktiivisuudessa. Siten sekä aminoglykosidin ja dipeptidi negamycin voi aiheuttaa APC biologista aktiivisuutta mutantti-cDNA, ja toiminnan taso on verrannollinen läpikirjoittautumisesta tasolle. Kontrollina käytimme pFopGlow vektori, joka sisältää mutatoidun TCF /beeta-kateniinin sitoutumiskohtia. Vektorin kanssa, mitään merkittävää muutosta ei havaittu sen jälkeen, kun aminoglykosidin tai negamycin hoitoon (tietoja ei esitetty).

Recovery of APC biologista aktiivisuutta endogeenisen R1114X APC-geenin jälkeen aminoglykosidin hoidon

olivatko aminoglykosidin hoito endogeenisen nonsensemutaatiota antaisi samanlaiset tulokset. LoVo-solujen (APC R1114X) transfektoitiin reportteriplasmidilla pTopGlow ja jätetään hoitamatta tai hoidettiin G418 tai negamycin. Aktiivisuus lusiferaasi tulikärpäsen reportterigeeni oli maksimaalinen ilman hoitoa, ja asetettiin 100%, mikä ei ole aktiivisuutta APC-proteiinia. Hoito negamycin ja G418 laski pTopGlow tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuus 50% ja 18% viitearvon, vastaavasti (kuvio 2D). Aktiivisuustaso korreloi läpikirjoittautumisesta tehokkuus (kuvio 2B). Yllättäen, gentamysiini hoitoon, vaikka edistää tasot läpikirjoittautumisesta samanlainen kuin saatiin negamycin, ei laskenut pTopGlow tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuutta (dataa ei ole esitetty). Siten läpikirjoittautumisesta tehokkuus ei ole ainoa määräävä tekijä talteenottoon täyspitkän proteiinin aktiivisuutta. Itse asiassa PTC läpikirjoittautumisesta vastaa sisällyttämistä lähes sukulais aminoasyyli-tRNA [24], [25], [26], [27] (komplementaarinen kaksi kolmesta nukleotidien lopetuskodonin), aiheuttaa mahdollisesti korvaaminen normaali jäännös aminohappo ristiriidassa vakautta tai aktiivisuutta täysipituinen proteiini [10]. On mahdollista, että eri aminohappoja on liitetty sijasta lopetuskodonin läsnä näiden kahden lääkkeen, jossa on vain negamycin hoito johtaa sisällyttäminen (an) aminohappo (t) yhteensopiva biologinen aktiivisuus proteiinin. Tämä tilanne saattaa aiheutua eri liikennemuotojen toiminta näitä lääkkeitä: aminoglykosidit näyttävät sitoutuvan yksinomaan dekoodaus keskus [28], kun taas negamycin on osoitettu sitoutuvan paitsi A-pienten ribosomialayksikköä [9], mutta myös seinään muodostuvan ketjun exit tunnelin suuren ribosomialayksikköä [29]. Voisimme siis odottaa osajoukko luonnon vaimennin tRNA valitaan eri jälkeen aminoglykosidien ja negamycin hoitoja.

Kuten muidenkin mutaation testattu, lusiferaasin ilmentyminen pFopGlow kätkeminen mutatoitunut TCF /beeta-kateniinin sitoutumiskohdista ei vaikuttanut merkittävästi antibioottihoidolla (tuloksia ei ole esitetty). Pyysimme, että aktiivisen APC proteiini oli tosiasiallisesti vastuussa havaittu lasku tulikärpäsen lusiferaasin ilmentymisen käyttäen siRNA erityisesti suunnattu APC mRNA. Ensin käytettiin RT-PCR tarkistaa, että siRNA alentaa tehokkaasti APC mRNA (kuvio 2E). LoVo-soluja kotransfektoitiin pTOPGlow reportteriplasmidilla ja siRNA kohdistamista tai ei kohdistamista APC.

Kun G418 hoidon (200 ug /ml), APC-kohdistaminen siRNA antoi lusiferaasiaktiivisuuden pienenemiseen kaksi kertaa pienempi kuin havaittiin puuttuessa siRNA, kun taas epäspesifisten siRNA ei ollut vaikutusta lusiferaasia esto (kuvio 2D). Siten vaikutus toimittaja järjestelmässä havaittiin erityisesti, kun läsnä on APC mRNA osoittaa, että se välittyy aktiivisen APC-proteiinia.

Näiden kahden mutantteja, tutkimme kyky aminoglykosidin hoidon palauttaa tuotannon täyspitkän APC-proteiinia. Pystyimme tunnistamaan täyspitkän APC-proteiinin HeLa-soluissa (APC WT), mutta tämä proteiini ei ollut havaittavissa sen jälkeen, kun lääkehoitoa joko LoVo-soluja (R1114X) tai DLD-1-solut, jotka oli transfektoitu L360X cDNA (kuvio 3). Tämä ei ole havaittu johtui todennäköisesti rajoituksista tekniikka havaita pieniä määriä suuren (311 kDa) proteiinin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että alhaiset APC-proteiini voi olla riittävä säätelevät TCF /beeta-kateniinin transkription monimutkainen.

LoVo-soluja jätetään hoitamatta tai hoidettiin G418 (200 ug /ml) 72 tuntia. Western-blotit FE-9-vasta-aine on suunnattu N-terminaalisen pään APC. Katkaistun muodot vastaavat mutatoituja alleeleja esiintyy LoVo-solujen on osoitettu nuolilla. Ote HeLa-solut (APC WT) käytettiin kontrollina; bändi havaittiin 311 kDa.

Johtopäätös

Tässä tutkimuksessa selvitimme kyky läpikirjoittautumisesta aiheuttavia molekyylien tuotannon indusoimiseksi toiminnallisen APC proteiini soluissa kuljettavat eri nonsense mutaatiot APC-geenissä. Biologinen aktiivisuus havaittiin kahden nonsensemutaatiota useimmat reagoivat aminoglykosidille hoitoon (R1114X ja L360X), ja tämä aktiivisuus on suoraan verrannollinen läpikirjoittautumisesta tasot mitattiin kaksi reportteri-järjestelmän. Tämä tutkimus osoittaa, että läpikirjoittautumisesta indusoijat, kuten aminoglykosidien ja negamycin, voi aktivoida APC tuumorisuppressorigeeniä syöpäsoluissa. Se tarjoaa järkevä strategia tunnistaa potilaat todennäköisesti reagoivat ja siten todennäköisemmin hyötyvät hoidon läpikirjoittautumisesta indusoijien. Tuoreessa tutkimuksessa on tarjonnut proof-of-periaate, että uudelleen ilmaus täyspitkän APC proteiinia hoidon jälkeen läpikirjoittautumisesta indusoijien pienentää kasvaimen kokoon vierassiirrännänmallissa hiiren [12]. Lisäksi olemme hiljattain osoittaneet, että solujen käsittely kuljettaa nonsense-mutaatio p53 tuumorisuppressorigeenin johtaa uudelleen ilmentymisen täysipituinen proteiini kykenee laukaisemaan apoptoosin kasvainsoluissa viljelmässä [11]. Kaikki nämä tiedot viittaavat siihen, että molekyylit asiakkuutta stop-kodonin läpikirjoittautumisesta voitaisiin mahdollisesti käyttää paitsi geneettisten sairauksien hoidossa, vaan myös monipuolistaa nykyistä arsenaali syövän hoitomuotoja ja niin rationaalinen pohja uusien yksilöllisten strategioita.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja soluviljelmä

Kaikki solut viljeltiin DMEM GlutaMAX (Invitrogen), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS, Invitrogen) ja 100 U /ml penisilliini /streptomysiiniä. Soluja inkuboitiin kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5,5% CO

2, 37 ° C: ssa. NIH3T3 (ystävällisesti Marc Sitbon) solut alkion hiiren fibroblasteissa. LoVo (APC R1114X ja del 1 bp 1430, ystävällisesti Françoise Praz, [30]) ja DLD-1 (APC del 1 bp 1406, ystävällisesti Françoise Praz, [31]) solut ovat epiteelisolut, jotka ovat peräisin ihmisen paksusuolen ja peräsuolen adenokarsinooma. HeLa (APC WT) solut ovat epiteelisolut, jotka ovat peräisin ihmisen kohdunkaula-adenokarsinooma (saatiin ystävällisesti Fabrice Lejeune).

läpikirjoittautumisesta kvantifiointiin soluviljelmässä

Täydentävät oligonukleotideja, jotka vastaavat nonsensemutaatiota upotettu niiden luonnollisessa yhteydessä (sekvenssit taulukossa 1) hybridisoitiin ja liitettiin pAC99 kaksi reportteriplasmidia, kuten aiemmin on kuvattu [32]. Tämä kaksinkertainen reportteri sallii määrällisesti stop-kodonin läpikirjoittautumisesta kautta mittaus lusiferaasia ja beeta-galaktosidaasia (sisäinen kalibrointi) toimintaa, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Läpikirjoittautumisesta tasot nonsensemutaatiota analysoitiin läsnä ollessa tai puuttuessa gentamisiini. NIH3T3-solut elektroporoitiin 20 ug reportteri-plasmidin, ja seuraavana päivänä solut huuhdottiin ja tuoretta väliainetta, kanssa tai ilman gentamisiini, amikasiini, negamycin tai G418 täydentämistä, lisättiin. Näissä kokeissa ei ole solun myrkyllisyyttä ei havaittu annoksilla antibiootteja käytetään. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, solut kerättiin ja lyysattiin trypsiini-EDTA: ta (Invitrogen). Beeta-galaktosidaasi ja Lusiferaasiaktiivisuudet määritettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [32]. Läpikirjoittautumisesta tehokkuutta arvioitiin laskemalla suhde lusiferaasin beeta-galaktosidaasin aktiivisuus, joka saadaan testi-konstrukti ja normalisoimalla se suhteen suhde saadaan lukukehyksessä ohjaus konstrukti. Kunkin konstruktin, vähintään viisi itsenäistä transfektio suoritettiin kokeita. Sillä läpikirjoittautumisesta kvantifiointi DLD-1, samaa protokollaa käytettiin paitsi, että kalsiumfosfaatti-menetelmää käytettiin transfektioon. Kunkin konstruktin, ainakin kolme riippumatonta transfektio suoritettiin kokeita.

ekspressioplasmidirakenteet

pCMV APC WT luovutti ystävällisesti Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins Oncology Center, Baltimore). Mutageneesi suoritettiin fragmentin APC-geenin luomiseksi APC L360X nonsense-mutaatio (pCMV APC L360X). Sekvenssi uudelleen asetettu fragmentti varmistettiin.

Western-blot-analyysi

LoVo-soluja käsiteltiin G418 (200 ug /ml) 72 tuntia. Kasvualusta korvattiin ja tuoretta antibiootteja lisättiin joka päivä. Soluja käsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [11]. Kokonaisproteiinia tasot määritettiin Bradford-reagenssilla (Biorad) ja uutteet denaturoitiin inkuboimalla Laemmli-puskuriin 5 minuutin ajan 90 ° C: ssa. Olemme suoritettiin 100 ug kokonais-proteiinin SDS-PAGE-määrityksellä NuPAGE: Novex 3/8% Tris /asetaatti pre-cast geelit (Invitrogen). Proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille yön yli, kuten valmistajan suosittelemia. Membraanit tyydyttynyt inkuboimalla 1 h TBS: ssä, jota oli täydennetty 5% rasvatonta maitojauhetta, ja inkuboitiin ensisijaisen monoklonaalinen vasta-aine, FE-9 (N-terminaalinen epitooppi kartoitus aminohappotähteiden 1 ja 35 APC; Calbiochem, 1 /100). Membraanit pestiin kolme kertaa TBS: ssä, jota oli täydennetty 1% rasvatonta maitojauhetta, ja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri-IgG: tä (1/2500) tai alkalinen fosfataasi-konjugoitua anti-hiiri-IgG: tä (1/7000) Promega ) 45 minuuttia. Ne pestiin kuusi kertaa ja kemiluminesenssi tunnistettiin ECL Western blotting tunnistus reagenssit (Amersham, GE Healthcare).

Protein -aktiivisuusmäärityksiä

biologinen aktiivisuus APC arvioitiin kanssa pTOPGlow vektorin (ystävällisesti Dr. Marc Van de Wetering, University Hospital Utrecht, Alankomaat).

DLD-1-soluja kotransfektoitiin pCMV L360X (4 ug), pTOPGlow tai pFOPGlow (10 ug) ja pCMVLacZ (2 ug) , jonka kalsiumfosfaattimenetelmällä. Kukin DNA sakka jaettiin kahteen kuoppiin kuuden kuoppalevylle. Antibiootit (10 ug /ml 200 ug /ml G418: aa, 800 ug /ml gentamysiini, 2 mg /ml amikasiini; 1 mg /ml negamycin) lisättiin välittömästi transfektion jälkeen, lukuun ottamatta G418, joka lisättiin päivänä. Kasvualusta korvattiin päivittäin ja tuoreet antibiootteja lisättiin. Olemme valmistaa proteiini-uutteet 48 tuntia transfektion jälkeen, ja mitattiin entsymaattisia toimintoja.

LoVo-soluja, antibiootteja (G418 pitoisuuksina 50, 100 ja 200 ug /ml; 1 mg /ml negamycin) lisättiin päivää ennen transfektio ja jokaisena seuraavana päivänä. LoVo-soluja kotransfektoitiin, kalsiumfosfaattimenetelmällä menetelmä, jossa TOPGlow tai FOPGlow (10 ug) ja pCMVLacZ (2,8 ug) normalisoimaan transfektiotehokkuuden, solujen elinkelpoisuus ja proteiini uuttamalla vaihtelua. Kukin DNA sakka jaettiin kahteen kuoppiin kuuden kuoppalevylle. Kolme päivää transfektion jälkeen, proteiini-uutteet valmistettiin ja entsymaattiset aktiivisuudet mitattiin.

Kunkin solulinjan, vähintään kolme riippumatonta transfektio suoritettiin kokeita.

siRNA transfektiot

LoVo-solujen, proteiinien aktiivisuus määritettiin edellä kuvatulla tavalla. Solut transfektoitiin siRNA kohdistaminen mRNA APC (Dharmacon ON-TARGET plus J-003869-12) tai NS, nontargeting (Dharmacon ON-KOHDE plus valvoa siRNA # 1), kun läsnä on DharmaFECT Duo (Thermo Scientific 1.3 ug siRNA kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyllä), 24 h kuluttua niiden alkuperäisestä transfektiosta, kuten edellä on kuvattu. Transfektoidut solut inkuboitiin välittömästi väliaineessa tai ilman G418: aa (200 ug /ml) täydentämistä. Kolme päivää transfektion jälkeen solut kerättiin ja lusiferaasia ja beeta-galaktosidaasin aktiivisuudet määritettiin, kuten edellä on kuvattu. Ainakin neljä itsenäistä transfektio suoritettiin kokeita.

Kiitokset

Haluamme kiittää kaikkia jäseniä laboratorio- ja Mounira Amor-Guéret (Institut Curie, CNRS, Orsay) ja hyödyllisiä keskusteluja. Kiitämme myös Julie FRUGIER tekniseen tukeen.