Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on tuhoisa ihmisen pahanlaatuisen ja voitto toiminnallisten mutaatioiden

K-ras

onkogeeni on havaittiin 75% -90%: lla potilaista. Tutkimukset ovat osoittaneet, että onkogeeniset

ras

ei vain voi edistää solujen kasvua tai elossa, mutta myös apoptoosin, riippuen olosuhteista. Käyttämällä haimasyövän solulinjoissa tai ilman ilmentäviä mutatoituja

K-ras

, osoitimme, että esto endogeenisen PKC-aktiivisuuden herkistyneet ihmisen haimasyövän soluja (MIA ja PANC-1) ilmentävät mutatoitunut

K-ras

apoptoosin, joka ei ollut apoptoottista vaikutusta BxPC-3 haimasyövän soluja, jotka sisältävät normaalia Ras sekä ihmisen keuhkon epiteeli- BAES-2B-soluja. Tässä apoptoottisen prosessin taso ROS nostettiin ja PUMA oli yliaktiivista p73-riippuvainen muodin MIA ja PANC-1-soluissa. Sen jälkeen, kaspaasi-3: pilkottiin. Täyden apoptoosin induktio tarvitaan aktivointi sekä ROS- ja p73-välitteisen reittejä. Tiedot viittaavat siihen, että PKC on ratkaiseva tekijä, joka selviytyy poikkeavaan

K-ras

säilyttää homeostaasiin haimasyöpäsoluissa kätkeminen mutatoitunut

K-ras

. Kuitenkin tukahduttaminen tai tappio PKC häiritsee tasapainoa ja aloittaa apoptoottisen kriisi, jossa ROS ja p73 näkyvät mahdolliset, keskeiset tavoitteet.

Citation: Shen L, Kim SH, Chen CY (2012) herkistyminen ihmisen Haimasyöpä Solut, mutaation

K-ras

apoptoosiin. PLoS ONE 7 (7): e40435. doi: 10,1371 /journal.pone.0040435

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 6 kesäkuu 2012; Julkaistu: 25 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Shen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tuettu sisäisellä JCRT (Joint Center for Sädehoito, Harvard Medical School) ja National Institute of Health 1RO1CA100498 myönnettiin Chang Yan Chen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysit, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on sairaus, jossa on synkkä näkymät. Yhdysvalloissa noin 33000 potilasta haimasyöpä vuosittain ja lähes yhtä monta kuolee tästä pahanlaatuinen sairaus [1] – [3]. Maailmanlaajuisesti haimasyövän aiheuttaa merkittävän määrän kuolemia vuosittain. Useita ominaisuuksia tämän tuhoisan sairauden vastaavat korkea kuolleisuus, mikä johtuu vaikeuksista havaita esiasteleesioita tai huomaamatta oireita kunnes myöhemmissä vaiheissa. Syöpä usein tapahtuu mikro-etäpesäke, joka on vastuussa huono ennuste tämän taudin. Lisäksi kehittyneen haimasyövän on usein resistentti tavanomaisille kemoterapiaa tai sädehoitoa. Kaikki nämä osoittavat kiireellistä kehittää uusia strategioita käsitellä tätä kuolemaan johtava sairaus.

Genetic, epigeneettiset ja ympäristötekijät ovat mukana synnyssä ja kehittämisessä haimasyövän [1]. Patogeneesin tämä tauti on kautta kertymistä geneettisten ja molekyylitason muutoksia, jolloin viat kasvuun, tarttuvuus ja integrointi pancreases. Molekyyli muutokset tässä ihmisen pahanlaatuisen on osoitettu esimerkiksi muutokset kasvuun liittyviä molekyylejä, tuumorisuppressorit ja solukierron sääntelyviranomaiset [4] – [7]. Häiriöt solunsisäinen, mitogeenisesta signalointireitteihin tai lisääntymistä rajoitukset antavat etua kasvainsoluihin niiden kasvua tai selviytymistä. Kasvutekijän reseptorin (EGFR) perhe on solukalvon glykoproteiini ja sen osoitettiin olevan ratkaiseva rooli haimasyövän aloittamisen ja kehittämisen [8] – [10]. Jäsenet EGFR on raportoitu usein yli-ilmentynyt haimasyövän soluja, jotka accordantly aktivoitu sen alavirran signalointireittejä, kuten Ras ja ERK, edistämään solujen kasvua ja selviytymistä [11].

Vaikka erilaisia geneettiset poikkeava merkkiaineita on tunnistettu ihmisen haimasyövän vaurioita, yleisimmät mutaatiot tunnistettiin

K-ras

ja tapahtumia tiiviisti seuraavien olivat inaktivaatiota tuumorisuppressorien p16, ARF, p53 ja Smad4 [ ,,,0],12] – [14]. K-Ras kuuluu Ras perheen proteiineja, jotka ovat pieniä sytoplasmisen GTP: n sitoutumista proteiineihin [15]. Konstitutiivisesti aktiivinen Ras kumppaniaan GTP, ja annetaan hallitsematonta mitogeeniset stimuloivaa signalointi loppupään -efektiboksejamme kuten Raf /MAPK, PI3K /Akt, JNK /p38 ja RalGDS. Hiirimallissa haimasyövän osoitti, että ehdollinen ilmentymä onkogeenisessä alleelin

K-ras

pystyi muodostamaan ennalta ductal vaurioita, jotka etenivät invasiivisen ja metastaattisen syövän alhaisella taajuudella. Samanaikainen tyrmäys P14 ja ARF edistettävä ja muuttaneet näitä ennalta vaurioita erittäin invasiivisia ja metastaattinen syövät [12] – [14]. Nämä tulokset osoittavat, että K-Ras aktivaatio indusoi ennen haiman vaurioita ja tuumorisuppressoreita (kuten p14 tai ARF) funktio rajoittaa pahanlaatuinen konversio näiden lähtöaineiden [12] – [14]. Kuitenkin, se ei ole täysin selvitetty, jos nämä solunsisäisiä reittejä haiman syöpäsoluissa voidaan uudelleen suunnata päälle solukuolemaohjelma.

On hyvin tunnettua, että Ras voi edistää paitsi soluproliferaatiota tai erilaistumista, mutta myös ohjelmoidun solukuoleman. In APO1-välitteisen apoptoosin, ligaatio APO1 (apoptoosin antigeeni 1) -reseptorin aiheutti kertyminen kalvon lipidien ja aktivointi keramidin, joka puolestaan ​​edistää Ras aktiivisuus apoptoosin [16], [17]. Lymfosyyteissä, Ras tärkeä rooli IL-2- välitteisen apoptoosin, mikä varmistaa tehokkaan liikevaihdon lymfosyyttien [18], [19]. Äkillinen aktivointi Ras alavirtavaikuttajainhibiittorit MAP kinaasireitin edistetään solujen apoptoosiin [20], [21]. Vastauksena stressiin liittyvät stimulaatio, JNK ilmestyi toimimaan alavirtaan Ras ja indusoida apoptoosia soluissa, kun jännitys on jatkuva [22]. Me kertoi, että onkogeeniset Ha-Ras herkistyneet ihmisen tai hiiren solujen apoptoosin endogeenisen PKC: n aktiivisuutta on vaimennettu [22]. Tässä apoptoottisen prosessin taso ROS nostettiin ja kaspaasi Cascade laukaisi [22]. Nykyinen tutkimus, jonka tavoitteena on edelleen testataan onko

K-ras

mutaatio oli synteettisesti tappava menetys PKC haiman syöpäsoluja.

PKC (proteiinikinaasi C) perhe koostuu yli 11 isoformeja että luokitellaan perusteella niiden biokemiallisten toimintojen ja rakenteiden osaksi klassista (cPKCs: α, β ja γ jotka ovat forboliesterillä ja kalsiumista riippuvan), romaani (nPKCs: δ, ε, η ja θ jotka ovat phobol esterin riippuvainen ainoastaan ) ja epätyypillinen PKCS (aPKCs: ζ ja λ jotka ovat riippumattomia forboliesterin ja kalsium). Mitogeenisiä ärsykkeitä (kuten kasvutekijöitä), lisäämällä kalvon DAG (diasyyliglyseroli-), aktivoi PKC. Vaikka tutkimukset ovat osoittaneet, että PKC on osallisena forboliesterillä-välitteisen mitogeenisia vasteita, nyt on selvää, että PKC aktivointi voi estää solujen kasvua tai jopa laukaista apoptoosin, riippuen eri isoformien, ero kytkentä efektoreiden [23], [24] . Esimerkiksi PKC α usein välittää proliferatiivisia tai kasvaimia synnyttäviä vasteita. Suolen tai maitorauhasen soluja, samalla isoformit PKC osallistua antiproliferatiivisia vasteita. Kuitenkin eri PKC-isoformien samantyyppistä solujen voisi toimia vastakkaisesti. Hiiren NIH3T3, rotta R6 tai normaalin ihmisen paksusuolen epiteelisolut, yliekspressio PKC δ aiheutti kasvun pysähtymisen ja lisäävät PKC-taso e aloittanut muutosprosessin [25] – [27]. Kehittyvät todisteet viittasivat vahvasti siihen, että PKC δ toimii usein tuumorisuppressorina [24], [28]. Tutkimukset osoittivat, että PKC ö ei ollut ainoastaan ​​negatiivinen säätelijä solusyklin etenemisen tai positiivinen välittäjänä apoptoosin, mutta myös sulatettu joka kestää hyvin ihokasvaimesta edistämiseen aiheuttama DMBA-forboliesterillä eläinmalleissa [29], [30].

ylikuulumisen PKCS ja Ras signalointireitteihin on havaittu [31]. Eri tyyppisiä soluja, PKC ja Ras vuorovaikutuksessa joko hierarkinen lineaarinen tai osuuskunnan samansuuntaiset. Vastauksena mitogeenisesta stimulaatiota PKC fosforyloitiin eri seriinitähteiksi ja myöhemmin liittyvät SH2 domeenin Grb-2. Monimutkainen myös Grb-2 /Sos oli puolestaan ​​muodostuu aktivoida Ras signalointi T-lymfosyyteissä [32]. PKC: n aktivaation ja Ras lymfosyyteissä oli silloin mahdollisuus hankkia PI3 kinaasi tuottaa PIP3 ja edelleen aiheuttaa erilaisia ​​proteiinikinaasi kaskadeja, joka johtaa aktivoitumiseen AKT ja Rac edistää solujen kasvua liittyvää toimintaa. On myös raportoitu, että kautta vaikuttavien Rel toiminnan, PKC oli negatiivinen vaikutus Ras-välitteisen signaloinnin [31]. Tietyissä pahanlaatuisten solujen, PKC aktivoitiin ja pystyvät välittämän Bcl-2 fosforylaatio eloonjäämisen edistämiseksi [33], [34]. Estämällä proapoptootti- signalointireittien, PKC aiheuttama aktivaatio Bcl-2 ehdotettiin merkittävä rooli keuhkojen kasvaimien syntyyn. PKC-proteiinin inhibitio farmakologisin inhibiittorit viljellyissä ihmisen keuhko- syöpäsoluja laukaista apoptoottisen vasteen [35]. Nykyinen tutkimus osoitti, että Ras ensisijaisesti aiheuttaman apoptoosin haiman syöpäsoluissa kätkeminen aktiivinen

K-ras

jälkeen saarron PKC. Meidän tiedot osoittivat, että yhteistyö PKC esiintyi ratkaisevaa haimasyöpäsoluissa kätkeminen mutatoitunut K-Ras hengissä.

Tulokset

herkistyminen haimasyöpäsoluissa kätkeminen mutaation K-ras apoptoosiin jälkeen hoito jossa GO6976

kaksintaistelu toiminnot Ras edistää solujen kasvua ja apoptoosi dokumentoitu hyvin [20], [22]. Aikaisemmin osoitimme, että co-eston PKC α ja β ilmentymistä tai aktiivisuutta oli tappava hiiren soluja yliekspressoivien

v-ras

[22], [28]. Koska

K-ras

mutaatiot havaitaan useimmissa haiman adenokarsinooma leesioiden [1], se johti meidät tutkimaan herkkyyttä haimasyövän soluja apoptoosin vasteena käsittely GO6976 (PKC-inhibiittorin, joka on spesifinen PKC a ja β). Ilmaisu ja aktivoinnin tilan K-Ras eri ihmisen haimasyövän solulinjoissa ja ihmisen keuhkojen epiteelisoluissa testattiin. Taso Ras ilmentymistä ihmisen haimasyövän MIA tai PANC-1-soluissa oli verrattavissa keuhkojen epiteelin BEAS-2A-soluissa ja hieman alennettu määrä Ras havaittiin haimasyöpä BxPC-3-solut (Fig. 1A). Tämän jälkeen lysaatit näitä soluja saostettiin RBD (Ras sitovan domeenin Raf) GST-fuusioproteiini testata aktivoinnin tilan Ras. Aktivoitu Ras on yhteistyössä saostettiin fuusioproteiini MIA ja PANC-1-soluissa, mutta ei BxPC-3 tai BEAS-2B-soluja (Fig. 1 B). Suuruus Ras aktivaation MIA oli korkeampi kuin PANC-1-soluissa.

. Ilmaisu Ras tutkittiin immunoblottauksella analyysi ihmisen haimasyövän BxPC-3, MIA, PANC-1 tai keuhkoepiteelisolujen BEAS-2B-soluja. Poimuihin ekspressiotasoja Ras haiman syöpäsoluja suhteessa, että BEAS-2B-soluja mitattiin ja ilmoitettu. Tasainen panostus koko proteiinien kaistaa kohti määritettiin β-aktiini. B. Ras GTP-sitovaa aktiivisuus oli toimenpide näissä soluissa Ras-GTP määrityksessä. Blotti uudelleen testattiin anti-Ras-vasta arvioida tasaisesti lastaus koko proteiineja.

Seuraavaksi tutkimme ilmaus PKC näissä soluissa sekä niiden vastaukset PKC-aktivaattori PMA (forboli myristaattiasetaatti) tai inhibiittori GO6976. Vastaava ilmaisu PKC-taso havaittiin kaikissa solulinjoissa (Fig. 2A). Induktio PKC: n aktiivisuutta PMA ja estävä vaikutus GO6976 PMA-indusoidun PKC: n aktiivisuutta tutkittiin myös käyttäen PKC kinaasiaktiivisuutta Kit (Fig. 2B). Käsittelemättömästä MIA tai PANC-1-solut, PKC: n aktiivisuutta oli hieman suurempi kuin käsittelemättömissä BxPC-3 tai BEAS-2B-soluja. Käsittely PMA kasvanut dramaattisesti aktiivisuutta tämän kinaasin kaikissa solulinjoissa, joka estyi GO6976, mikä osoittaa, että PKC oli toiminnallinen kaikissa soluissa testataan.

. Solulysaatit eristetty käsittelemättömästä soluja immunoblotattiin anti-pan-PKC-aine.

β

aktiini määrittämiseen käytettiin yhtä suuri kuormitus koko proteiinia kaistaa kohti. B. Solulysaatit soluista kanssa tai ilman sitä käsiteltiin PMA: lla tai PMA: lla plus GO6976, immunosaostettiin anti-pan-PKC-vasta-ainetta. Immunokompleksit inkuboitiin [

32P] γ-ATP ja peptidisubstraatit analysoida PKC: n aktiivisuutta. Virhepalkit edusti SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3,

ρ

0,05).

PKC ja Ras ovat ratkaisevia solunsisäisiä signaalimuunta- ja osallistua lähettämällä signaaleja säädellä erilaisia ​​biologisia tai patologis-biologisia vaikutuksia. Apoptoosin PKC tukahduttaminen on raportoitu hiiren tai ihmisen soluja, jotka ilmentävät onkogeenisen

ras

[20], [22], [28]. Testata, onko GO6976 kykeni indusoimaan apoptoosin haimasyövän solulinjoissa tai ilman ilmentävät mutatoitua

K-ras

, anneksiini V-määritys suoritettiin (Fig. 3A ja B). GO6976 hoito dramaattisesti herkistyneet MIA ja PANC-1 soluja apoptoosin ja ollut mitään osuutta apoptoosin in BxPC-3-soluissa, jotka sisältävät normaalia Ras signalointi sekä ihmisen keuhkoepiteelisolujen BEAS-2B-soluja. Erityisesti MIA soluista, joissa Ras aktiivisuus oli korkeampi olivat alttiimpia GO6976 indusoiman apoptoosin kuin PANC-1-soluissa. Sen määrittämiseksi, Ras oli vastuussa apoptoosin, famesyylitransferaasin estäjä (FTI) tukahduttaa Ras aktiivisuutta käytettiin (Fig. 3C). Kun läsnä on FTI, GO6976 käsittely ei kyennyt indusoimaan apoptoosin MIA tai PANC-1-soluja. Tiedot ehdotti, että mutatoitunut K-Ras, yhdessä menetys PKC toiminto, ilmestyi tappavia ja tämä tappava reaktiota voidaan säädellä mutatoitunut Ras.

. Soluja käsiteltiin GO6976 (1 uM) 48 tuntia ja sitten kerätään anneksiini V-määrityksellä. Virhepalkit ovat SD 5 itsenäisestä kokeesta (n = 5,

ρ

0,05). B. profiilit solujen jälkeen värjättiin anneksiini V C. Soluja käsiteltiin FTI 30 minuuttia ennen GO6976 hoitoa. Sen jälkeen, anneksiini V: määritys suoritettiin. Virhepalkit ovat SD 5 itsenäisestä kokeesta (n = 5,

ρ

0,05).

lisääntymisen merkkejä ROS jonka GO6976 in Haimasyöpä Solut, mutaation K-ras varten apoptoosin induktio

ROS (reaktiivisia happiradikaaleja) tiedetään tarvitaan solujen kasvuun ja päinvastoin jatkuvasti lisääntynyt ROS osoitettiin voi aiheuttaa DNA-vaurioita tai laukaista apoptoosin [36]. Tutkimukset paljastivat, että ROS soluissa, jotka ilmentävät onkogeenien (esimerkiksi

ras

) olivat usein täydennetty, mikä saattaa johtua suuri metabolinen tarpeisiin neoplastisen kasvun [36]. ROS tasoilla haimasyövän ja BEAS-2B-soluja mitattiin normaaleissa kasvuolosuhteissa tai sen jälkeen hoidon GO6976 (Fig. 4A). Jokin verran ROS havaittiin MIA tai PANC-solut, jotka oli dramaattisesti kohonnut lisäyksen jälkeen GO6976. ROS oli lähtötasolle hoitamattomilla BxPC-3 tai BEAS-2B soluja ja hoidon PKC estäjä ei vaikuttanut ROS tuotantoa tai kertymistä.

. Solut käsiteltiin GO6976 tai yhdessä käsiteltiin GO6976 plus NAC (2,5 mM). Sen jälkeen, kun värjätään DCF tasot ROS solut analysoitiin virtaussytometrillä. B. Solut käsiteltiin GO6976 (1 uM) tai GO6976 plus NAC. Sen jälkeen näytteet kerättiin ja niille on anneksiini V-määrityksellä. Virhepalkit ovat SD 5 itsenäisestä kokeesta (n = 5,

ρ

0,05).

Voit selvittää ROS ollut merkitystä apoptoosin seuraavista PKC esto haiman syöpäsoluissa ilmentävät mutatoitunut

K-ras

, anneksiini V määritys suoritettiin (Fig. 4B). Jälleen, MIA ja PANC-1-solut olivat herkkiä GO6976 hoitoon, joka oli osittain, mutta merkittävästi estänyt NAC (N-asetyyli-L-kysteiiniä, joka on ROS-estäjä). Koska NAC ei täysin tukahdutetaan apoptoosia näissä soluissa, se ehdotti osallistumista muiden reittien suorittaessaan tämän solukuoleman ohjelma. Johdonmukaisesti, haimasyövän soluja ilman ekspressoivat mutatoitunut

K-ras

tai ihmisen keuhkon epiteeli- BEAS-2B-soluja, jotka eivät reagoi GO6976 sekä yhdistelmä hoitoon GO6976 plus NAC.

aktivointi kaspaasi 3 tässä Lethal Reaction Tapahtui MIA tai PANC-1 solut

Caspase perheeseen kuuluu yli 10 jäsentä [37]. Vastauksena apoptoottisia ärsykkeille, kaspaasi-3: n osoitettiin toimivan henkivartijan kaspaasien Cascade loppuunsaattamiseksi solukuolemaohjelmassa [37]. Tässä prosessissa, kaspaasi-3: n tarvitse lohkaista pieneen, aktiivinen fragmentti. Testata aktivoinnin tilan kaspaasi 3, läsnä ollessa pilkottiin kaspaasi 3 MIA tai PANC-1-soluja analysoitiin immunoblottauksella (Fig. 5A). Sen jälkeen, kun hoidon GO6976, pieni, pilkottiin kaspaasi-3 oli todellakin läsnä näissä kahdessa haimasyövän soluja. Aktiivinen muoto tämän kaspaasin oli havaitsematon GO6976 saaneilla BxPC-3 tai BEAS-2B-soluja (tietoja ei esitetty). Tarkastella lähemmin kaspaasi 3 samoissa kokeellisissa asetusta, kaspaasi 3 aktiivisuus analysoitiin (kuvio. 5B). Käsittelyn jälkeen inhibiittorin aktiivisuus tämän proteaasia yläreguloituja MIA ja PANC-1-soluissa, jotka oli osittain tukahdutettiin lisäämällä NAC. Johdonmukaisesti, aktiivisuus kaspaasi 3 puuttui GO6976 saaneilla BxPC-3 soluja ilman ilmentävät mutatoitunut

K-ras

tai BEAS-2B-soluja. Tulokset viittasivat siihen, että kaspaasi 3 osallistui suorittamisesta GO6976 aiheuttaman apoptoosin haimasyöpäsoluissa kätkeminen kasvaimia synnyttävän

K-ras

.

. Kanssa tai ilman GO6976 hoitoa, solulysaatit valmistettiin ja immunoblotattiin anti-kaspaasi-3-vasta-aine. B. Solut altistettiin hoidon GO6976 tai GO6976 plus NAC. Sen jälkeen, anneksiini V:-määritys suoritettiin. Virhepalkit edustavat SD 3 erilliselle kokeelle (n = 3,

ρ

0,05).

lisääntymisen merkkejä apoptoottisen Factor PUMA on p73-riippuvaisen Fashion aikana GO6976- aiheuttaman apoptoosin

p73 kuuluu p53 perheeseen ja homologiaa p53 paitsi niiden sekvenssit, mutta myös transaktivointidomainien, DNA: ta sitovaan tai oligomerisaatioon toimintoihin [38]. In p73-välitteisen apoptoosin, apoptoottisten liittyvä tekijä PUMA on usein säädelty [38]. Raportoimme aikaisemmin, että kun PKC esto, p73 hiiren fibroblasteissa ektooppisesti ilmentävät

Ha-ras

aktivoitiin ja vastaa aloittamista apoptoosin [28]. Tänä solukuoleman prosessi, p73 oli fosforyloitu seriinitähteiksi [28]. Voit testata, onko p73 fosforyloitui GO6976 saaneilla MIA tai PANC-1-soluissa, immunoblot-analyysi tehtiin (Fig. 6A). Fosforylaatio p73 oli tapahtunut sen seriini tähteet käsitellyissä soluissa, mutta ei kontrollisoluissa. GO6976 välittämän p73 fosforylaation ei muuttanut lisäämällä NAC. Myöhemmin ilmentymistä p73-säänneltyjen

PUMA

geenin MIA tai PANC-1-soluissa tutkittiin reaaliaikainen PCR-analyysi (Fig. 6B). Taso geenin ilmentymisen soluissa lisäsi merkittävästi käsittelyn jälkeen GO6976. Ylössäätelyyn geenin oli jälleen muuttumattomana, kun läsnä on NAC, mutta täysin tukahdutti ohimenevä infektio

shRNA-p73

. Johdonmukaisesti, proteiini ilmentyminen täydennetty käsittelyn jälkeen PKC-inhibiittorin (Fig. 6B). Käyttöönotto

shRNA-p73

soluihin esti myös induktion PUMA proteiinia, joka ei vaikuttanut lisäämällä NAC (tuloksia ei ole esitetty). Vaikutti siltä, ​​että PUMA oli mukana akselin p73-välitteisen signaloinnin tässä apoptoottisen prosessin.

. Kanssa tai ilman hoitoa GO6976 tai GO6976 plus NAC, lysaatit immunosaostettiin anti-p73-vasta-ainetta. Immunopresipitaatit alistettiin sitten immunoblottauksella käyttäen anti-fosforyloitu seriini-vasta-ainetta. Taso Immunosaostumien arvosteli uudelleen luotaa blot anti-p73-vasta-ainetta. B. Total RNA: t soluista tai ilman käsitelty GO6976, GO6976 plus NAC tai GO6976 plus

shRNA-p73

infektio eristettiin. Sama määrä RNA: iden oli käänteistranskriptoitu, ja ilmaus

PUMA

testattiin RT-PCR: llä. C. kanssa tai ilman GO6976 hoitoa, MIA tai PNAC-1 solut altistettiin immunoblottauksella analyysi PUMA ilmaisua. Yhtä suuri kuormitus koko proteiinien määritettiin rep-koettimena blotti anti-β-aktiini-vasta-aine.

yhteistyön ROS ja p73 varten induktio GO6976-välitteistä apoptoosia

on tunnettua, että useita, apoptoottiset signalointireittien ovat integroitu koko suorittamisen solukuoleman ohjelman. Koska ROS ja p73 ilmestyi osallistu apoptoosin in GO6976 saaneilla haimasyöpäsoluissa kätkeminen mutatoitunut

K-ras

, ensin testata, jos p73 ollut mitään rooleja ylösajon ROS haiman syöpäsoluissa ( kuva 7A). Jälleen kohtalainen joukossa ROS havaittu hoitamattomilla MIA tai PANC-1-soluissa, nosti edelleen jälkeen PKC esto. Ohimenevä infektio

shRNA-p73

ei ollut vaikutusta induktion ROS, mikä viittaa siihen, että p73 meidän kokeellisen ympäristössä ei ollut mukana ROS signalointi. Myöhemmin kaspaasi-3-aktiivisuus analysoitiin jälkeen knockdovvn p73 tai yhteistyössä estäminen p73 ja ROS (Fig. 7B). Käyttöönotto

shRNA-p73

osittain esti kaspaasi-3 GO-6976-käsitelty MIA tai PANC-1 ja aktiivisuus tämän proteaasin poistetaan kokonaan sen jälkeen, kun yhteistyössä tukahduttaminen p73 ja ROS. Esiintyminen apoptoosin sen jälkeen, kun samat käsittelyt analysoitiin sitten anneksiini V-määrityksellä (Fig. 7C). Knockdovvn

p73

osittain esti GO6976 aiheuttama apoptoottisen prosessin MIA tai PANC-1-soluissa. Koska sekä

p73

ja ROS, GO6976 voinut käynnistää apoptoosin näissä soluissa. Tiedot ehdotti, että ainakin kaksi apoptoottista reittiä: p73 ja ROS osallistui tähän tappavan reaktion.

taso ROS soluissa käsitelty GO6976 tai GO6976 plus

shRNA-p73

infektio oli analysoidaan. Virhepalkit edustavat SD 3 erilliselle kokeelle (n = 3,

ρ

0,05). B. kaspaasi 3 soluissa käsitelty GO6976, GO6976 plus

shRNA-p73

infektio tai GO6976 plus NAC plus

shRNA-p73

infektio määritettiin. Virhepalkit edustavat SD 3 erilliselle kokeelle (n = 3,

ρ

0,05). C. anneksiini V määritystä MIA ja PANC-1-solut käsiteltiin GO6976, GO6976 plus

shRNA-p73

infektio tai GO6976 plus NAC plus

shRNA-p73

infektio suoritettiin. Virhepalkit edustavat SD 3 erilliselle kokeelle (n = 3,

ρ

0,05).

Keskustelu

Haimasyöpä on tuhoisa ihmisen pahanlaatuisen ja yksi johtavista syistä syövän kuolema [1]. Ennuste tämä tauti on synkkä, koska niillä ei ole tehokkaita hoitoja. Tiedetään, että voitto toiminnallisten mutaatioiden

K-ras

tapahtuu alkuvaiheessa ihmisen haimasyövän potilaat tai hiiri malleja, jotka oli muodostettu tyrmäys tuumorisuppressorigeeneille on

p16, Arf

, tai

p53

, vastaavasti tai yhdistelminä [12] – [14]. Nämä havainnot osoittavat, että on tärkeää K-Ras synnyssä ja kehittämisessä haimasyöpä. Päämääränä oli tutkia uuden strategian kohdistaminen onkogeenisten Ras haiman terapeuttisten. Tämä tutkimus osoitti, että poikkeava, mutatoitunut

K-ras

pystyi jälleen suora haimasyöpäsoluissa kohti apoptoosiin jälkeen tukahduttamista PKC. Tässä apoptoottisen prosessin useita signalointireittien olivat mukana. Käsittelyn jälkeen PKC-inhibiittorin, taso ROS haiman syöpäsoluissa, jotka ilmentävät mutatoitua

K-ras

lisättiin, johon liittyy apoptoosin. Kuitenkin lisäämällä NAC osittain estetty solukuoleman. P73 fosforyloitiin ja PUMA-geeni ja proteiinin voimistunut. Lisäksi kaspaasi 3 pilkottiin toteuttamista varten solukuoleman ohjelman. Yhteistyössä estyminen ROS ja p73 saavuttaa lopullinen saarto vaikutus apoptoosin GO6976 saaneilla haimasyöpäsoluissa kätkeminen mutatoitunut

K-ras

. Siten meidän tutkimus osoittaa, että poikkeava Ras yhdessä menetys PKC on synteettisesti tappava haiman syöpäsoluja. Tiedot ehdotti myös mahdollisen tasapainon Ras ja PKC joka määrittää kynnys apoptoosin soluissa.

Mutaatiotutkimukset aktivointien

ras

geenit ovat yksi tärkeimmistä tapahtumia aloittamisen ja kehittämisen erilaisten ihmisen maligniteettien [15]. Vuonna muutosprosessi, nousee jatkuvasti Ras aktiivisuuden päälle eri alavirtavaikuttajainhibiittorit reittejä, mikä johtaa fosforylaatioon ketjureaktion aktivointiin pro-kasvun transkriptiotekijöitä [39]. Huolimatta olennaisesti mukana solujen kasvuun ja erilaistumiseen, hyperaktiivinen Ras tietyissä olosuhteissa, voidaan uudelleen suunnata apoptoosin. Lukuisat tutkimukset ovat korostaneet roolit Ras säätelyssä apoptoosin [20]. Erityisesti on havaittu, että hoidot, joissa PKC: n estäjät voivat aiheuttaa apoptoosia hiiren fibroblasteja tai rotan keuhkojen epiteelisoluissa yli-ilmentävät onkogeenisen

ras

[22], [28]. Tässä osoitamme, että PKC-aktiivisuuden haiman syöpäsoluissa kätkeminen mutatoitunut

K-ras

oli hieman lisätty, jotka saattavat olla tarpeen selviytyä poikkeavasti korkea Ras aktiivisuus elossa. Sen jälkeen kun PKC tukahdutettiin, mutatoitunut K-Ras ei ylläpitää korkeaa aineenvaihdunnan tarpeisiin syöpäsolujen ja tappava reaktio aloitettiin. Koska suuri osuus ihmisen syövissä kätkeminen kasvaimia synnyttävän

ras

, PKC näyttää ihanteellinen solunsisäisen kohde apoptoosin, joilla on alhainen tai ei mitään myrkyllisiä vaikutuksia ympäröiviin normaaleissa kudoksissa tai soluissa.

Yli 11 seriini /treoniini-proteiinikinaasien kuuluvat PKC perheeseen, joista jotkut ovat rakenteellisesti erillisiä tai toiminnallisesti erilaisia. Kuitenkin on toiminnallinen redundanssi Näistä PKC-isotsyymien palauttaa normaalin fysiologisen tilan, kun yksi tai useampi PKC-isotsyymien tippuu tai funktionaalinen. Roolit PKC-isoformien sääntelyssä solujen kasvua tai kuolema ovat varsin kiistanalainen, riippuen erilaisia ​​soluja tai solujen yhteyksissä. Esimerkiksi on ehdotettu, että PKC α, β, ö hallussaan kaksintaistelu rooleja säätelyssä syövän kehittymisen tai ohjelmoidun solukuoleman, mikä osoittaa monimutkaisuus näiden PKC-isotsyymien [24]. Cross-neuvottelut keskuudessa PKC-isoformit ja muiden solunsisäisten signaalimuuntajia olivat usein läsnä hierarkian järjestyksessä tai eri osastoihin ohjata solujen saavuttaa eri tuloksia. Se oli myös osoittanut, että PKC ja Ras signalointireitteihin oli liitetty toisiinsa, etenkin lymfosyyteissä [24], [40]. Mitogeenisen stimulaatio, SH2 sitoutumiskohdat PKC fosforyloitiin, joka puolestaan ​​rekrytoi Grb2 /SOS monimutkainen ja edelleen aktivoidaan Ras signalointi T-lymfosyyteissä [24]. PKC ilmoitettiin säätelee negatiivisesti Ras koulutusjakson kautta vaikuttaa sen efektori Rel [24]. NIH3T3-soluissa ektooppisesti ilmentävät

v-Ha-ras

, p73 toimi alavirtaan PKC-a ja β ja anturina määrittämään kynnys apoptoosin [22]. Käyttämällä PKC estäjä GO6976 joka estää forboliesterillä riippuvainen PKC-isoformit, me tässä tutkimuksessa osoitti, että haimasyövän soluja hyperaktiivinen K-Ras voitaisiin tehokkaasti herkistyä apoptoosin. Tutkimus osoittaa keskeisiä PKC isoformin (t) säätelyssä tämän apoptoottisen prosessi on käynnissä.

ROS toimii usein solunsisäinen signaalinmuuntajana kasvutekijöiden [36]. Jotkut mitogeenisia ärsykkeitä voivat lisätä tasolle solunsisäisten ROS, mikä muuttaa rakennetta solun tukirangan ja edelleen indusoimaan muutoksen [36]. PC12-soluissa, Ras osoitettiin upregulate ROS-tuotanto EGF stimulaation [41]. Tutkimukset osoittivat myös, että onkogeenien (esimerkiksi

myc

tai

ras

) kautta jatkuvasti vääristäviä valtion solunsisäisten redox, pystyivät aiheuttamaan kromosomipoikkeamia sittemmin häiritä geneettinen eheys edistää kasvaimien syntyyn [36 ]. Huolimatta säätelevät solujen lisääntymistä ja transformaatio, lisääntyminen ROS ehdotettiin olla pakollista rooli apoptoosin [22]. In TNFa aiheuttama ohjelmoidun solukuoleman, NF-KB ja JNK yhteistyössä edistää ROS, mikä puolestaan ​​johtaa kaspaasi Cascade ja mitokondrioiden depolarisoitumisen [42]. Kohdunulkoinen ilmaus

Ha-ras

hiiren fibroblasteissa solukuolema kautta synnyttämään ER (Endoplasmakalvosto) stressi ja aktivoimalla UPR (avattuna proteiini vaste) [22]. Nykyinen tutkimus osoitti, että vaikka ROS kohtalaisesti koholla haimasyöpäsoluissa ilmentävät mutatoitunut

K-ras

normaaleissa kasvuolosuhteissa, esto PKC vakavasti häirinnyt tasapainoa redoksitilassa ja indusoi merkittävän kerääntymistä ROS vuonna solut. Siten PKC näyttää tärkeä tekijä ylläpitää homeostaasiin haimasyöpäsoluissa kätkeminen poikkeava

K-ras

.

p73 kuuluu p53 proteiinit ja jakaa rakenteellisen ja toiminnallisen homologin kanssa p53 [38]. Tutkimukset osoittivat, että p73 oli merkittävä rooli DNA vahinkoriskitekijät tai stressin aiheuttama apoptoosin. Nuclear c-Abl aktivoitiin genotoksinen stressi ja edelleen fosforyloituu p73 ja apoptoosin [43]. Tässä solukuoleman prosessi, ydin- c-Abl vuorovaikutuksessa p73 ja entisestään tehostaa p73-säännelty toimintaa. Se oli myös osoittanut, että vastauksena ionisoivan säteilyn tai sisplatiinihoitoon, p73 oli keskeinen rooli välittämistä apoptoottisen signalointi [44]. Hiiren fibroblasteja yli-ilmentävät

v-Ha-ras

, PKC δ vuorovaikutuksessa ja edelleen aktivoidaan p73 laukaisemaan apoptoottinen kriisi [28]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että p73-fosforyloitiin haiman syöpäsoluissa kätkeminen mutatoitunut

K-ras

, ja sen jälkeen upregulated tason ilmentymisen apoptoottisen tekijän PUMA. Taustalla olevaa mekanismia, jolla PUMA osallistuu tähän apoptoottisen prosessin vielä tutkittava tarkemmin.

Yhteenvetona geneettisiä mutaatioita

K-ras

näkyvät ainutlaatuisesti läsnä 90% ihmisen haimasyövän vaurioita ja tämä tauti on yksi johtavista syistä syövän kuoleman. Näin ollen on olemassa kiireellinen tarve löydöt tehokkaita hoitoja kliinisesti.