Krooninen sairaus

tiivistelmä

kemokiinin CXCL12 ja reseptori CXCR4 ovat nousseet lupaavia terapeuttisia kohteita munasarjasyöpä, sairaus, joka on edelleen synkkä ennuste. CXCL12-CXCR4 signalointi asemia lisääntymistä, eloonjääntiä, ja invaasion munasarjasyöpäsoluja, mikä johtaa kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. Dalmatialaistäpläisiä CXCR4 useita keskeisiä toimenpiteitä munasarjasyövän viittaavat siihen, että estämällä tämän reitin parantaa tuloksia potilailla, joilla tämä sairaus. Määrällisesti CXCL12-CXCR4 signalointi soluun perustuvissa määrityksissä ja elävä hiiri malleja munasarjasyöpä, kehitimme napsahduksen kuoriainen punainen lusiferaasin täydentämisen avulla toimittaja joka havaitsee aktivoituminen CXCR4 perustuu rekrytointi sytosolin adapterin proteiini β-arrestin 2. Sekä kaksi- kolmiulotteinen ja kolmiulotteinen soluviljelmissä, loimme että bioluminenssin tämän toimittaja mittaa CXCL12-riippuvaista aktivoitumista CXCR4 ja eston tämän reitin kanssa AMD3100, kliinisesti hyväksymä pieni molekyyli, joka estää CXCL12-CXCR4 sitova. Käytimme tätä kuvantamisjärjestelmä määrittää CXCL12-CXCR4 signalointi hiirimallissa metastaattisen munasarjasyövän ja osoittivat, että hoito AMD3100 keskeyttää tämän reitin

in vivo

. Yhdistelmähoitoa AMD3100 ja sisplatiinin merkittävästi vähentynyt tuumorikuorma hiirillä, vaikka erot kokonaiselossaolo eivät olleet merkitsevästi suurempi kuin hoidon kummallakaan aineella yksinään. Nämä tutkimukset luoda molekyylikuvantaminen toimittaja analysointijärjestelmä CXCL12-CXCR4 signalointi munasarjasyövän, jota voidaan käyttää tutkimaan biologian ja terapeuttinen kohdistaminen tämän reitin soluun perustuvissa määrityksissä ja elävät hiiret.

Citation: Salomonnson E , Stacer AC, Ehrlich A, Luker KE, Luker GD (2013) Imaging CXCL12-CXCR4 Signaling munasarjasyövässä Therapy. PLoS ONE 8 (1): e51500. doi: 10,1371 /journal.pone.0051500

Toimittaja: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 elokuu 2012; Hyväksytty: 01 marraskuu 2012; Julkaistu: 23 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Salomonnson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Tutkimus oli avustuksin National Institutes of Health (NIH R01CA136553, R01CA136829, ja P50CA093990) ja Department of Defense (W81XWH-09-1-0128). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kemokiinin CXCL12 (SDF-1) ja sen reseptori CXCR4 ovat vahvasti sekaantuneet keskeisiksi tekijöiksi kasvain aloittamisesta ja vatsaonteloon etäpesäke munasarjasyöpä [1]. CXCL12 erittyy ≈70-90% munasarjasyöpä soluja, samoin kuin mesoteelisolujen sisällä vatsakalvon ihmisten ja hiirillä [2] [3] [4] [5]. Potilaat, joilla on korkeimmat CXCL12 ilmentymisen munasarjasyöpäsoluja on merkittävästi huonompi ennuste, korostaen biologinen merkitys tämän signalointi molekyylin taudin etenemistä [6]. Vaikutukset CXCL12 on munasarjasyöpä näyttävät välittyvän CXCR4, yksi kahden tunnetun reseptorien tämän kemokiinin. Monistus CXCR4 on varhainen tapahtuma pahanlaatuisen transformaation munasarjaepiteelisoluilla, viittaa siihen, että CXCL12-CXCR4 on kriittinen patogeneesi tämän taudin [7]. Noin 60% munasarjasyöpäpotilaalle on CXCR4 pahanlaatuisia soluja, ja nämä potilaat ovat merkittävästi vähentäneet eloonjäämiseen [4]. CXCL12 signalointi kautta CXCR4 edistää proliferaatiota, invaasio ja etäpesäkkeiden munasarjasyöpäsoluja, jotka kaikki edistävät aggressiivisempi sairaus. Haitalliset vaikutukset CXCL12 on munasarjasyöpä voi myös johtua vaikutuksista strooman osastoon kasvain microenvironment, kuten tehostetusta angiogeneesi ja rekrytointi immunosuppressiivisten solujen [8] [9] [10] [11].

Central toiminnot CXCL12-CXCR4 signalointi pahanlaatuisten solujen ja kasvaimen microenvironment asentoon tämä signalointi akseli keskeisenä tavoitteeksi parantaa hoitoa munasarjasyöpäpotilaalle. Hiirimalleissa, me ja muut ovat osoittaneet, että esto CXCL12-CXCR4 signalointia RNA-interferenssi vastaan ​​CXCL12 tai pieni molekyyli estäjä CXCL12-CXCR4 sitoutuminen (AMD3100) rajoittaa kasvua munasarjasyöpäsolujen implantit [12], [13], [14 ]. Inhiboiva CXCL12-CXCR4 signalointi ulottuu myös eloonjäämistä hiiriä munasarjasyöpä. Kuitenkin vaikutukset Monoterapiassa ovat vaatimattomia, mikä viittaa siihen, että kohdistaminen CXCL12-CXCR4 yhdessä toisen aine voi olla enemmän hyötyä.

perustaminen, että yhdiste tehokkaasti osuu sen aiottu kohde on välttämätöntä lääkkeiden kehittämisen prekliinisissä mallien ja kliinisissä kokeissa. Analysoida farmakodynamiikkaa aineiden kohdistaminen CXCL12-CXCR4 signalointi hiirimalleissa munasarjasyöpä, kehitimme napsahduksen kuoriainen lusiferaasin täydentämisen avulla toimittaja kuvan ja määrällisesti aktivointi ja esto tämän reitin

in vivo

. Tässä järjestelmässä, CXCR4 ja sytosolin sovitin proteiini β-arrestin 2 fuusioidaan aktiivinen amino (CBRN) ja karboksi (CBC) terminaalin fragmentteja click beetle punainen lusiferaasin. Reportteri mittaa CXCL12 aktivointi CXCR4 perustuvaa signalointia rekrytointi sytosolin adapterin proteiini β-arrestin 2 tähän reseptoriin. Rekrytointi β-arrestin 2 on yhteinen, varhainen tapahtuma aktivointi kemokiinireseptoreita ja suuremman perheen seitsemän transmembraanisen reseptorien [15]. Lusiferaasin kanssa komplementaatiota järjestelmä, vuorovaikutukset CXCR4 ja β-arrestin 2 Liuota aktiivinen click kuoriainen lusiferaasi tuottaa valoa, joka tarjoaa kuvantamisen metriikka CXCR4 signaloinnin ehjien solujen, kolmiulotteinen sferoidiviljelmiä, ja elävät hiiret. Sferoidia ovat tärkeä välimuoto standardin kaksiulotteinen Soluviljelymäärityksistä ja tuumoriksenografteissa koska kasvain pallosia jäljentää rajoitettu diffuusio yhdisteiden kasvainten muodostuminen munasarjasyövän rakeita vesivatsanestesupernatan- potilailta. Koska lusiferaasi komplementaatio korjautuu, tämä kuvantamisen toimittaja myös voidaan käyttää mittaamaan Yhdisteiden vaikutukset estämällä CXCL12-CXCR4 signalointi

in vitro

ja

in vivo

.

Käytimme tätä kuvantaminen reportteri analysoida CXCL12-CXCR4 signalointi munasarjasyövän ja vahvistaa, että AMD3100, pieni molekyyli estäjä CXCR4, lohkojen reseptorin aktivoitumista kasvaimessa mikroympäristössä. Tällä kuvantamisjärjestelmä totesimme, että yhdistelmähoito AMD3100 ja sisplatiinin merkittävästi pieneni tuumoritaakka hiirimallissa ihmisen munasarjasyövän kanssa vatsaonteloon etäpesäkkeitä. Nämä tulokset perustaa uusi molekyylikuvantaminen menetelmä analysoida CXCL12-CXCR4 signalointi munasarjasyövän ja ehdottaa mahdollisia terapeuttista hyötyä yhdistää selektiivisen eston tämän kemokiinireseptorin polkuun kemoterapeuttisten standardilääkkeiden.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidit

tuottaa fuusioita CXCR4 kanssa N-terminaalinen fragmentti click beetle punainen lusiferaasi (CBRN) (Promega), amplifioimme CXCR4 PCR ja kloonattiin tuote Xhol ja Agel sivustoja EGFP-N1 (Clontech). Käytimme PCR monistaa DNA-sekvenssin aminohappoja 2-413 click beetle punainen lusiferaasi (CBRN) ja kloonattiin tämän tuotteen AgeLllä ja Notl EGFP-N1 [16]. Tämä kloonausstrategiaan poistaa EGFP vektorista. Olemme monistetun sekvenssin aminohappoja 395-542 click beetle lusiferaasin (CBC) PCR: llä ja kloonattiin tuote osaksi Agel: llä ja Notl-EGFP-N1 luoda fuusion C-päähän β-arrestin 2 (lahja Robert Lefkowitz). Siirtämään konstruktioita päässä EGFP-N1 selkäranka lentivirusvektorilla FUW, käytimme PCR monistamaan DNA-sekvenssin ja lisää Xbal kloonausta varten. Konstrukteja käytetään tässä tutkimuksessa on esitetty yhteenvetona kuviossa 1 (Fig. 1A), ja PCR-alukkeita, joita käytetään kloonaukseen on lueteltu taulukossa 1.

A) Paneeli osoittaa lentivirusvektorit ja transdusoitu stabiilisti käytettäviä soluja kuvantamismenetelmin. B) Kaaviokuva click beetle punainen täydentämisen avulla järjestelmään. N- ja C-terminaaliset fragmentit click beetle punainen lusiferaasin on fuusioitu C-päät CXCR4 ja β-arrestin 2, vastaavasti. CXCL12 sitoutuminen CXCR4 aiheuttaa rekrytointi β-arrestin 2 aktivoituun reseptoriin, jossa palautetaan click kuoriainen punainen lusiferaasin valon tuottamiseen.

Solut

HeyA8 munasarjasyöpäsoluja (edellyttäen Gordon Mills, MD Anderson Cancer Center) on vakaasti transdusoitiin rekombinantti lentiviruksien varten CXCR4-CBRN ja Ar-CBC (HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC) [17]. Käytimme lentiviruksen transduktion perustaa populaatioiden HeyA8 solujen vakaasti ilmentävät CXCL12 fuusioitu

Gaussia

lusiferaasia (HeyA8-CXCL12-GL), fuusioitumatonta

Gaussia

lusiferaasia (Hey-GL), ja tulikärpäsen lusiferaasi ja vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) (HeyA8-FL /GFP) [18], [19]. Olemme myös transdusoiduissa HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC ja HeyA8-CXCL12-GL solujen fluoresoivan proteiinin eqFP650 [20]. Kuvio 1 esittää luettelon transdusoitu stabiilisti solujen käytetty tässä tutkimuksessa (Fig. 1A). Kaikki solut ylläpidettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia, 1% glutamiinia ja 0,1% penisilliiniä /streptomysiiniä.

Virtaussytometria

Ehjä solut värjättiin vasta-aineen kanssa CXCR4 (klooni 12G5 , R tai 2) HeyA8-FL /GFP-soluja yhdistetään yhtä paljon joko HeyA8-CXCL12-GL tai HeyA8-GL-soluissa, vastaavasti, solujen elinkelpoisuuden määrittämi- seksi vasteena sisplatiinin. Sillä kokeiluja AMD3100, kasvavien pitoisuuksien yhdistettä lisättiin pallosia vuorokauden kuluttua kylvö roikkuu pudota levyjä. Inkuboimme sferoidit AMD3100 tai ajoneuvon yhden tai kaksi päivää ennen määrällisesti bioluminesenssin. HeyA8-FL /GFP-solujen sferoidit joko HeyA8-CXCL12-GL tai HeyA8-GL soluja käsiteltiin yhden tai kahden päivän kasvavien pitoisuuksien kanssa sisplatiinia. Kvantitoimme fluoresenssia eqFP650 koskevasta IVIS Spectrum ennen määrällisesti bioluminenssina lisäämisen jälkeen 6 ug /ml lusiferiini kuhunkin pallomainen. Me normalisoitui bioluminesenssi fotonivuon fluoresenssiin radianssin huomioon erot solujen lukumäärän.

Eläinkokeet

Kaikki eläinkokeiden hyväksyi Michiganin yliopistossa komitean käytön ja hoidon Animals. Eläimet siirtyneiden klorofylli-vapaa chow (Research Ruokavalion) kaikkien tutkimusten minimoimiseksi taustan fluoresenssia kuvantamistutkimukset. 2.5 x 10

5 solua kutakin HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC ja HeyA8-CXCL12-GL solua injektoitiin intraperitoneaalisesti 100 ul 0,9% NaCl osaksi 5-7 viikkoa vanha nainen NOD /SCID

IL2rγ

– /- naarashiirillä (Taconic). Inhiboida CXCL12 sitoutumista CXCR4, käytimme 5 päivän, 1,0 ul /tunti osmoottiset pumput (kokeilua varten on esitetty kuviossa. 5) tai 14 päivän, 0,5 ul /tunti osmoottiset pumput (kokeilua varten on esitetty kuviossa. 6) (Alzet) ladattiin 25 mg /ml AMD3100 tai 0,9% NaCl ajoneuvon ohjaus. Nämä pumput toimittaa 1,25 tai 0,625 ug AMD3100 /g /tunti kullekin hiirelle. Pumput istutettiin ajoittain merkitty tekstissä kunkin luku. Hoitoon tutkimukset on esitetty kuviossa 6, me hiiriin on injektoitu 4 mg /kg sisplatiinia tai sovitettu ajoneuvon i.p. 5 päivän välein. Sisplatiini tai PBS ajoneuvon injektiot jatkuivat koko kahden viikon ajan joka osmoottista infuusiopumppua olivat paikoillaan. Kaikki hiiret saivat aktiivista yhdistettä (AMD3100 ja /tai sisplatiini) tai sovitettu ajoneuvon molemmille kuljetusreittejä (osmoottinen infuusiopumppua ja i.p. injektio). Esimerkkeinä vehikkelikontrollihiiret saivat osmoottisia pumppuja 0,9% NaCl ja i.p. injektiot PBS, kun taas hiiret AMD3100 hoitoryhmän osmoottisia pumppuja kanssa AMD3100 ja i.p. PBS: llä.

Mouse kuvantamisen

Bioluminescence kuvantaminen on tehtävä sellaisen IVIS spektri (Perkin Elmer). Fluoresenssikuvantamiseen ja kovakuoriainen lusiferaasin kuvantamisen lusiferiini suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Imaging tietoja määrällisesti fluoresenssin säteily tai fotonivuon, vastaavasti. Tiedot click kuoriainen punainen lusiferaasin komplementaation normalisoituivat yhteensä kasvaintaakkaa arvioidaan fluoresenssin eqFP650.

Tilastot

Kuviot ja tilastolliset analyysit valmisteltiin GraphPad Prism. Soluviljelmätutkimukset tehtiin 3-5 kertaa, kun taas eläinten tutkimukset suoritettiin kahdesti. Tulokset esitettiin graafisesti keskiarvoja standardin keskivirhe (SEM). Paria tulokset analysoitiin Mann-Whitneyn U-testi määrittää tilastollisesti merkitseviä eroja. Kaplan-Meier eloonjäämiskäyrien analysoitiin Gehan-Breslowin-Wilcoxonin testi.

Tulokset

Klikkaa kovakuoriainen täydentämisen avulla reportterina vuorovaikutusta CXCR4 ja β-arrestin 2

CXCL12 sitoutuminen reseptori CXCR4 johtaa rekrytointi sytosolin adapterin proteiini β-arrestin 2 aktivoituun reseptoriin. Jotta kuvan ja lukuina keskeinen vaihe signaalin siirtoon, käytimme äskettäin kuvatun proteiinin fragmentti täydentämisen avulla määritys perustuu napsautuksella kuoriainen punainen lusiferaasia [16]. Tässä järjestelmässä, CXCR4 on fuusioitu N-terminaalinen fragmentti click beetle lusiferaasin (CXCR4-CBRN) ja β-arrestin 2: n C-terminaalinen fragmentti tämän entsyymin (Ar-CBC) (Fig. 1 B). Rekrytointi β-arrestin 2 CXCR4 kokoontuvat myös lusiferaasi fragmenttien tuottamiseksi bioluminenssina kvantitatiivisena mittana tämän proteiinin vuorovaikutusta CXCR4 signalointi.

transdusoidut HeyA8 munasarjasyöpäsoluja kanssa lentivirusvektoreita varten CXCR4-CBRN ja Ar- CBC. HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC solujen fosforyloitu AKT vastauksena inkubointia CXCL12 määritettynä Western blottauksella, joka osoittaa, että nämä solut aktivoituvat tunnetun alavirtavaikuttajainhibiittorit CXCL12-CXCR4 (Fig. 2A). Verrattuna vanhempien HeyA8 solujen HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-solut osoittivat suurempaa aktivoitumista AKT vastauksena CXCL12, sopusoinnussa transdusoivaa lisäaineryhmiin CXCR4 osaksi kuvantamisen toimittaja soluja. Olemme myös osoittaneet, että HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC soluilla aikariippuvainen aktivointi kinaasien ERK1 /2, joka estyi saturoituvalle (1 uM) pitoisuus CXCR4 estäjän AMD3100 (Fig. 2B). HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-solut yli-ilmentävät β-arrestin 2-CBC suhteessa endogeeniseen proteiiniin määritettynä Western-blottauksella.

A) HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC ja vanhempien HeyA8 soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla CXCL12 10 minuuttia. Western blot kokosolulysaateille osoittaa fosforyloidun ja yhteensä AKT, vastaavasti. Käytimme GAPDH latauskontrollina. Kaavio osoittaa suhteelliset kaistaintensiteettejä fosforyloidun AKT kussakin solulinjassa normalisoida koko AKT ja GAPDH. B) HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-soluja käsiteltiin 100 ng /ml CXCL12-α 0, 5, 15, tai 30 minuuttia puuttuessa tai läsnä on 1 uM AMD3100. Kokosoluliuotteista koetettiin fosforyloidun ja koko ERK1 /2, vastaavasti. Lysaatit myös analysoitiin Western blot ekspressioon β-arrestin 2-CBC ja endogeenisen β-arrestin 1 ja 2. GAPDH on esitetty latauskontrollina. C) Virtaussytometria CXCR4: n ekspressio useissa erilaisissa HeyA8 solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa. Tumma viiva ja katkoviivoilla histogrammit merkitsevät isotyyppikontrolli ja värjäys CXCR4-vasta-aine.

käytetään virtaussytometrialla arvioida ilmentyminen solun pinnalla CXCR4 HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-soluja, kuten sekä vanhempien HeyA8 solut ja solut stabiilisti transdusoitiin

Gaussia

lusiferaasia (HeyA8-GL), CXCL12 fuusioitu Gaussia lusiferaasia (HeyA8-CXCL12-GL) tai tulikärpäsen lusiferaasi ja GFP (HeyA8-FL-GFP). Kaikki solut ilmensivät samalla tasolla solun pinnalla CXCR4 (Fig. 2C). Vaikka transdusoitujen CXCR4-CBRN, HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-solut oli tasoja solun pinnalla CXCR4, jotka olivat verrattavissa vanhempien HeyA8 soluja, todennäköisesti koska yli-ilmentyminen β-arrestin 2 aiheuttaa sisäistämisen tämän reseptorin solun pinnalla. [24], [25].

CXCL12 asemat komplementoinnin välillä CXCR4 ja β-arrestin 2

Voidakseen todeta, että bioluminenssin HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC solujen toimenpiteiden aktivointi CXCR4 signalointi käsittelimme yksikerroksisiin näiden solujen kasvavien pitoisuuksien kanssa CXCL12: ssa 60 minuuttia. Me käsitellään rinnakkain soluviljelmät kanssa estävä pitoisuus (1 uM) ja CXCR4 estäjän AMD3100 tai ajoneuvon hallinnan itämisajan aikana [26] [27]. Hoito CXCL12 tuotti konsentraatiosta riippuvaisen kasvu bioluminenssin yhdistys CXCR4-CBRN ja Ar-CBC saavuttaen huippunsa 3-kertainen induktio 1 ug /ml CXCL12 (Fig. 3A). Vertailun vuoksi soluja käsiteltiin AMD3100 osoitti vain pohjapinta bioluminesenssi, jossa ei ole vastausta CXCL12.

A) HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-solut maljattiin kaksiulotteinen viljelmiä 96-kuoppalevyillä ja inkuboidaan yhä pitoisuudet CXCL12-α: n läsnä ollessa 1 uM AMD3100 tai ajoneuvon hallinnan. Tietoja graafisesti keskiarvoja luminesenssi suhteessa soluihin, joita ei ole käsitelty CXCL12 (n = 4 per ehto). Virhepalkkeja tarkoittavat SEM. B) HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC-soluja käsiteltiin 100 ng /ml CXCL12 kasvavien ajanjaksojen ajan, kun läsnä oli 1 uM AMD3100 tai ajoneuvon hallinnan. Tietoja graafisesti keskiarvoja ± SEM luminesenssi suhteessa soluihin, joita ei ole inkuboitu CXCL12 (n = 4 per ehto). *, P 0,05; **, P 0,01.

Myös inkuboitiin HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC soluja 100 ng /ml CXCL12 ja 1 uM AMD3100 tai ajoneuvon hallinnan lisäämiseen aikoja kautta 4 tuntia ennen mittaamista lusiferaasiaktiivisuus. Suhteessa käsittelemättömät solut, soluja inkuboitiin 100 ng /ml CXCL12 ja ajoneuvon hallinnan osoittivat ajasta riippuvaa nousua bioluminesenssi, korkeimmillaan noin 2-kertainen induktio 2 tuntia ja sitten laskussa vaatimattomasti (Fig. 3B). AMD3100 täysin tukossa vaikutukset CXCL12 on bioluminenssin täydentämisen avulla välillä CXCR4-CBRN ja Ar-CBC. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että bioluminenssin HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC solujen vastaa CXCL12 ja vahvistaa, että tämä reportteri järjestelmä voi mitata estämällä CXCL12-CXCR4 signalointi.

Drug vaikutuksia pallomainen kulttuuri

Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että palloset ja vastaavia kolmiulotteisia soluviljelmäjärjestelmiä ovat fysiologisia malleja huumeiden kohdistaminen ja tehokkuus, johtuen tekijöistä kuten suora solujen väliset vuorovaikutukset ja rajoitettu diffuusio yhdisteiden [28], [29]. Lisäksi, munasarjasyöpä soluja potilailla, muodostavat rakeita askites, jotka voivat aiheuttaa esteen lääkeaineen [30]. Mallintaa kasvain microenvironment munasarjasyöpä

in vivo

, käytimme pallosia of HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC soluissa yhdistettynä yhtä paljon HeyA8-CXCL12-GL soluja, toisto- ihmisen munasarjasyövän jossa kasvain solut erittävät CXCL12 ja /tai ilmaista CXCR4. Vaikka vanhempien HeyA8 solut eivät ilmennä CXCL12 määritettynä QRT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty), HeyA8-CXCL12-GL solut erittävät noin 12 ng /ml CXCL12 24 tunnin aikana, joka on verrattavissa raportoidut arvot muille munasarjasyöpäsoluja jotka erittävät tämä kemokiinin endogeenisesti [19] [31]. Käsittelimme sferoidit kasvavilla pitoisuuksilla AMD3100 24 tuntia ennen määrällisesti bioluminesenssin. Suhteessa sferoideja käsitelty ajoneuvon hallinnan, AMD3100 esti bioluminenssin yhdistys CXCR4-CBRN ja Ar-CBC. Lusiferaasiaktiivisuutta alkaen Komplementointitutkimusten reportteri laski ≈50% vuonna palloset käsiteltiin 1 uM AMD3100 (p 0,05) (Fig. 4A). Havaitsimme samanlaisia ​​tuloksia, kun laajennettava inkuboinnit kaksi päivää AMD3100 (tuloksia ei ole esitetty). Esto CXCR4, joiden määrää Komplementointitutkimusten määrityksessä, oli vähemmän tehokas palloset verrattuna yksikerrosviljelmään, mikä viittaa siihen, että kolmiulotteinen arkkitehtuurin rajoja tunkeutuminen AMD3100 kaikkiin soluihin. Kuitenkin toteamme, että sferoidiviljelmiä testata vaikutukset krooninen altistuminen CXCL12 sijaan akuutti lisäämällä kemokiinin kuten tehdään kaksiulotteinen kulttuuri, mikä myös voi myötävaikuttaa eroihin tehoa AMD3100.

A) Sferoidiviljelmiä of HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC ja HeyA8-CXCL12-GL soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan kasvavien pitoisuuksien kanssa AMD3100. Tiedot piirrettiin keskiarvoina ± SEM luminesenssi klikkauskustannuksille kuoriainen komplementaation suhteessa sferoideja käsiteltiin vain ajoneuvon ohjaus (n = 10 palloset per kunnossa). B) HeyA8-FL-GFP-soluja viljeltiin, kuten sferoidit HeyA8-CXCL12-GL tai HeyA8-GL-solut ja sitten käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla sisplatiinia 24 tunnin ajan. Tiedot piirrettiin keskiarvoina ± SEM tulikärpäsen lusiferaasi luminesenssi suhteessa sferoideja ei sisplatiinia (n = 10 palloset per kunnossa). *, P 0,05.

Testasimme suojaavia vaikutuksia CXCL12 sytotoksisuutta vastaan ​​peräisin sisplatiinin, standardi kemoterapeuttisen lääkkeen munasarjasyöpä. Näissä kokeissa käytettiin HeyA8-FL-GFP-soluissa, jotka ilmentävät endogeenisesti CXCR4: ää (ks. 2C). Tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuus on suoraan verrannollinen määrä tuumorisolujen, joka tarjoaa helpon määrityksen solujen elinkelpoisuutta ehjä pallosia [32]. Olemme syntyy sferoidit yhdistämällä HeyA8-FL-GFP-solujen HeyA8-CXCL12-GL tai HeyA8-GL-soluissa, vastaavasti, ja sitten käsiteltiin sferoidit yhä sisplatiinin 24 tuntia. Vuonna pallosia, jotka sisältävät HeyA8-CXCL12-GL soluja, HeyA8-FL-GFP solut suojataan hieman vastaan ​​sytotoksisia vaikutuksia sisplatiinin, vaikka vain 10 uM teimme havaita merkittäviä eroja sytotoksisuuden suhteen pallosia, jotka sisältävät HeyA8-GL solut (p 0,05) (Fig. 4B). Laajuus sytotoksisuus oli verrattavissa seuraavat lääkehoitojen 48 tuntia (dataa ei esitetty). Nämä tutkimukset osoittavat, että CXCL12 antaa hyvin vaatimaton suojan sisplatiinin pallosia koostuu yksinomaan munasarjasyöpä soluja.

In vivo

kuvantamiseen CXCR4 ja β-arrestin 2 komplementaatiolle munasarjasyövän

Käytimme ihmisen -tuumoriksenografti malli metastasoituneen vatsaonteloon munasarjasyöpä selvittää, missä määrin komplementaatio välillä CXCR4 ja β-arrestin 2 havaitsee CXCR4 aktivointi ja esto

in vivo

. Teemme yhteistyötä ruiskutetaan sama määrä HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC ja HeyA8-CXCL12-GL solut intraperitoneaalisesti hiirille ja käytetään bioluminesenssi kuvantamisen määrällisesti rekrytointi β-arrestin 2 CXCR4. Perustason olosuhteissa, meillä havaitaan heti bioluminenssin täydentämisen avulla välillä HeyA8-CXCR4-CBRN ja Ar-CBC (Kuva. 5A), mikä osoittaa aktiivisen CXCR4 signalointi pahanlaatuisia soluja. Sitten satunnaisesti erotetaan hiiret ryhmiksi käsitelty viiden päivän ajan joko AMD3100 tai ajoneuvon hallinnan toimitetaan osmoottiset infuusiopumpuissa. Ei ollut fenotyyppinen näyttöä myrkyllisyydestä hiirillä, joille AMD3100. Hiiret käsiteltiin AMD3100 oli suhteellisesti vähemmän kasvua munasarjasyöpäsoluja kuin eläimillä, jotka saivat ainoastaan ​​ajoneuvon hallinnan kuin sen määrä fluoresenssilla kaukaa punainen fluoresoiva proteiini eqFP650 ilmaistu pahanlaatuisten solujen (kuvio. 5B) (p 0,05). Käyttämällä fluoresenssia eqFP650 normalisoimaan erojen kokonaismäärät munasarjasyöpäsoluja, bioluminenssin vuorovaikutuksesta CXCR4-CBRN kanssa Ar-CBC oli merkittävästi pienempi hiirillä, jotka saivat AMD3100 viiden päivän verrattuna ajoneuvon ohjaus. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, hyödyllisyyttä tämän kuvantamisjärjestelmä mittaamiseksi farmakologisen kohdentamista CXCL12-CXCR4 merkinanto- ja tuloksena vaikutukset kasvaimen kasvun

in vivo

(Fig. 5c) (p 0,05).

A) kuvat ovat hiirten vatsaonteloon implanteilla HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC ja HeyA8-CXCL12-GL soluissa. Kuvat saatiin ennen ja jälkeen, 5 päivää hoidon osmoottiset pumput, jotka sisältävät AMD3100 tai ajoneuvon hallinnan. Mittakaava kuvaa valikoimia fotonivuon arvot näkyvät pseudovärin kuvia. B) Fluoresenssi alkaen munasarjasyöpäsoluja mitattiin elävien hiirillä, joita hoidettiin AMD3100 tai ajoneuvon hallinnan. Kaavio osoittaa keskiarvot + SEM fluoresenssin suhteessa arvoihin mitattiin vuorokautena 0 ennen hoidon aloittamista. Nuolet osoittavat kaudella, osmoottiset pumput olivat paikoillaan. C) määrälliset fotonivuon tiedot click kuoriainen punainen täydentämisen avulla hoidettujen hiirien AMD3100 tai ajoneuvon hallinnan, vastaavasti. Data normalisoitiin kasvain fluoresenssin kullekin hiirelle ja piirretään keskiarvoina + SEM (n = 7 hiirtä ryhmää kohti). *, P 0,05.

yhdistelmähoitoa AMD3100 ja sisplatiinin vähensi kasvaintaakkaa

aiemmin osoitettu, että yksittäinen aine hoito AMD3100 yksin vaatimattomasti eloonjäämistä hiirten vatsaonteloon levitetään munasarjasyöpä [14]. Oletimme, että yhdistetyn hoidon AMD3100 ja standardi kemoterapeuttisen lääkkeen parantaisi merkittävästi kasvaimen valvontaa ja selviytyminen, perustuu tutkimuksiin leukemiassa osoittavat, että CXCL12 kasvaimen mikroympäristössä antaa resistenssin standardin sytotoksisten lääkkeiden [33]. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me istutettiin hiirten HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC ja HeyA8-CXCL12-GL soluissa. Viikon kuluttua istuttamalla kasvaimia meidän satunnaistettiin hiirillä neljään hoitoryhmään: 1) ajoneuvon hallinnassa; 2) AMD3100 toimitetaan kahden viikon osmoottisten infuusiopumpuille; 3) sisplatiinia annettiin 4 mg /kg i.p. 5 päivän välein; ja 4) yhdistetty AMD3100 ja sisplatiinia. Jatkoimme sisplatiini injektiot kautta kahden viikon toimituksen ajan AMD3100 pumput ja sitten lopetettiin kaikki terapia.

Käytimme bioluminenssin HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC analysoida CXCR4 signalointi

in vivo

ja fluoresenssikuvantamiseen varten eqFP650 määrällisesti kasvaintaakkaa ajan. Laskimme ala käyrän bioluminenssi ja fluoresenssia ja jota käytetään suhteet näiden parametrien arvioimiseksi inhibition CXCR4 ajan (Fig. 6A). Hiiret käsiteltiin AMD3100 tai yhdistelmä AMD3100 ja sisplatiinin oli huomattavasti pienempi bioluminenssin CXCR4-CBRN ja Ar-CBC komplementaation suhteessa yleisen tuumorikuorma, joka osoittaa, että tämä lääke onnistuneesti lohkot CXCR4 signalointi munasarjasyöpäsoluja

in vivo

(p 0,01).

A) Pinta-ala käyrän alla analyysin kuvantamisen tietojen suhteet click beetle punainen lusiferaasin komplementoinnin varten CXCR4 ja β-arrestin 2 normalisoitu eqFP650 fluoresenssi (kasvaintaakkaa) hiirillä istutettu HeyA8 -CXCR4-CBRN /Ar-CBC ja HeyA8-CXCL12-GL soluissa. Tiedot näkyvät ryhmille hoidettiin ajoneuvon hallinnan, AMD3100, sisplatiini, tai molemmat AMD3100 ja sisplatiini kaksi viikkoa alkaa viikon kuluttua implantoivien soluja. Kaavio osoittaa keskiarvot + SEM (n = 7 hiirtä ryhmää kohti). *, P 0,05. B) Pinta-ala käyrän alla analyysi fluoresenssin eqFP650 tuotettu ihonalaista munasarjasyöpäsoluja aikana kokeen. Kaavio osoittaa keskiarvoja + SEM. *, P 0,05, **, p 0,01. C) Kaplan-Meier-käyrät selviytyminen vehikkelillä hoidetut hiiret, AMD3100, sisplatiini, tai AMD3100 ja sisplatiinia. Kaikissa hoitoryhmissä poikkeavat auton ohjaus (p 0,05), mutta ei toisistaan.

hiiret hoidettiin ainoana lääkkeenä AMD3100 tai sisplatiini oli vaatimaton, mutta merkittävää, vähennyksiä kasvaintaakkaa mitattuna fluoresenssikuvantamisella yli aikana kokeessa (Fig. 6B) (p 0,05). Vertailun vuoksi yhdistelmähoito sekä AMD3100 ja sisplatiinia vähensi kokonaismäärät HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC solujen suhteessa ajoneuvon ohjaus- tai kummallakaan lääkkeellä yksinään (p 0,01 ja p 0,05, vastaavasti). Nämä erot olivat ilmeisiä, vaikka hiiret saivat vain kaksi viikkoa hoidon näitä lääkkeitä. Hiiret, joihin oli istutettu HeyA8 munasarjasyöpäsoluja kehitetty askites, mutta ei ollut eroa koko kehon painot useissa eri ryhmissä (tuloksia ei ole esitetty). Oli suuntaus parantaa hengissä hiirissä, joita käsiteltiin sekä AMD3100 ja sisplatiini (Fig. 6C). Kuitenkin eroja AMD3100, sisplatiini, ja yhdistetyt AMD3100 ja sisplatiinin eivät olleet merkittäviä, vaikka kaikki hoidot parannettu selviytymisen suhteessa ajoneuvon ohjaus (p 0,05).

Keskustelu

Munasarjasyöpä on edelleen johtava kuolinsyy peräisin gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia, joiden kokonaispituus viisi vuotta selviytymisen ≈50%. Huonon ennusteen munasarjasyövän johtuu osittain siitä, että useimmilla potilailla esiintyy edennyt sairaus liittyy vatsaonteloon, maksan tai systeeminen etäpesäkkeitä [34]. Munasarjasyöpä aluksi on herkkä kemoterapia platina-pohjainen huumeita, vaikka useimmat potilaat relapsi lääkeresistentissä kasvainsolut kuluessa noin vuoden.