Krooninen sairaus

tiivistelmä

Functional geneettistä vaihtelua tärkeä rooli muokkaamisessa fenotyypin erot yksilöiden kautta vaikuttavien geenien ilmentyminen, ja siten, hyvin todennäköisesti vaikuttaa tautiherkkyyteen, kuten syövän alttius. Yksi kriittinen kysymys tämän aikakauden postgenomiikan laajuinen yhdistys tutkimukset (GWAS) on, miten arvioida toiminnallista merkitystä geenimuunnelmat tunnistettu GWAS. Nykyisessä tutkimuksessa, jossa lymfoblastisolulinjoissa (LCL) 74 ei-liittyvä naisten familiaalinen munasarjasyövän ja 47 sukulaiskontrolleista Hyväksytty sukupuolen ja rodun, selvitimme assosiaatiot seitsemän munasarjasyövän riski variantteja tunnistettiin GWAS (

rs3814113

on 9p22.2,

rs2072590

2q31,

rs2665390

3q25,

rs10088218

,

rs1516982

,

rs10098821

on 8q24.21, ja

rs2363956

19p13) ja koko genomin mRNA: n ilmentymisen profiilit. Havaitsimme 95 merkittävää trans-yhdistyksiä permutaatio tasolla 0,001. Verrattuna muita riskejä variantteja,

rs10088218

,

rs1516982

, ja

rs10098821

8q24.21 oli eniten merkitseviä (25, 16, ja 38, vastaavasti). Kaksi mahdollista cis-yhdistysten välillä ei havaittu

rs10098821

ja

c-Myc

, ja

rs2072590

ja

HS.565379

(permutoituina P = 0,0198 ja 0,0399, vastaavasti). Pathway rikastamiseen analyysi osoitti, että useita keskeisiä biologisia reittejä, kuten solukierron (P = 2,59 x 10

-06), jne, oli merkittävästi yliedustettuna. Lisäkarakterisointia merkittäviä assosiaatioita mRNA: t ja riskien alleelit saattavat helpottaa ymmärtämään toimintoja GWAS löydettiin riskin alleelien geneettinen etiologiassa munasarjasyöpä.

Citation: Zhao H, Shen J, Wang D, Gregory S, Medico L Hu Q, et ai. (2012) assosiaatioiden Gene Expression variaatiot ja munasarjasyöpä Risk alleelit tunnistaa Genome Wide Association Studies. PLoS ONE 7 (11): e47962. doi: 10,1371 /journal.pone.0047962

Editor: Yi Xing, University of Iowa, Yhdysvallat

vastaanotettu: May 1, 2012 Hyväksytty: 19 syyskuu 2012; Julkaistu: 02 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (5R01CA136483 jotta HZ ja P30 CA016056 Roswell Park Cancer Institute); Ralph Wilson Medical Foundation (jotta HZ); Department of Defense munasarjasyövän Program (OC073116 jotta HZ), ja Roswell Park Alliance Foundation (jotta HZ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Äskettäin genomin laajuinen yhdistys tutkimukset (GWAS) jotka ovat tunnistaneet useita geneettisiä muutoksia, jotka antavat vaara ihmisten syövän [1] – [3]. Kuitenkin suurin osa riski variantteja tunnistettiin GWAS oleskella intergeenisessä, introni, ja muut ei-koodaavia alueita genomin [4]. Siksi havaittu järjestöt ovat vielä käännettävä täyttä ymmärrystä geenien ja geneettisten elementtien välittävä sairaus alttius. Miten tutkia toiminnallista merkitystä näiden GWAS osuu asettaa suuri haaste tässä post-GWAS aikakauden. Yksi vaihtoehdoista voi olla tutkinnan genetiikkaa geeniekspression. Useat maamerkki tutkimukset ovat yksiselitteisesti osoittaneet, että monet transkriptien ihmisen genomin vaikuttavat periytyvät vaihtelu [5] – [9]. Toiminnallinen geneettinen vaihtelu, joka johtaa geeniekspression muutoksia, voi olla kriittinen rooli päätettäessä fenotyypin eroja yksilöiden, ja näin, on hyvin todennäköisesti vaikuttaa taudin alttius. Sinänsä tutkimalla yhdistysten välisen geneettisen vaihtelun ja geenin ilmentyminen voisi mahdollisesti auttaa priorisoimaan hienoksi kartoitus pyrkimyksiä ja tarjoavat oikotien taudin biologiaa.

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä, on yksi yleisimmistä gynekologisia maligniteetteja naisilla [ ,,,0],10]. Suvussa on vahvin riskitekijä munasarjasyöpä. Verrattuna 1,6% elinikäinen riski sairastua munasarjasyöpään väestössä, naisten yksi ensimmäisen asteen sukulainen munasarjasyövän on 5% riski. Familiaalinen klustereiden kanssa autosomaalinen hallitseva rakenteessa perintö (perinnöllinen munasarjasyöpä) tulokset ituradan mutaatioiden otaksuttu tuumorisuppressorigeeneille (APT), kuten

BRCA1 /2

ja

MLH1 /MSH2

geeneihin [11] – [14]. Kuitenkin tunnetut mutaatiot

BRCA1 /2

ja mismatch korjaus (

MMR

) geenejä voidaan vain selittää pienen osan familiaalinen yhdistäminen munasarjasyöpä (5-13%). Tämä viittaa siihen, että muut geneettiset tapahtumat voivat myötävaikuttaa familiaalinen munasarjojen syöpiä. Useita GWAS ovat tapahtuneet munasarjasyövän ja useita riskejä variantit on tunnistettu, mukaan lukien

rs3814113

9p22,

rs2072590

2q31,

rs2665390

3q25,

rs10088218

,

rs1516982

,

rs10098821

8q24, ja

rs2363956

19p13 [1] – [3]. Kuitenkin toiminnallinen merkitys näiden riskien variantteja ei juuri tunneta. Täten tutkimalla yhdistysten välillä geenien ilmentymisen ja munasarjasyövän riskiä alleelit tunnistaa GWAS voisi auttaa yhteyden riski variantteja niiden otaksuttu kohdegeenien /selostukset ja biologisia polkuja.

Tutkia assosiaatiot geenien ilmentymisen ja munasarjasyövän riskiä alleeleja saimme koko genomin mRNA ilmaisun profiileja 121 ei-tarpeeton lymfoblastoidisolulinjat (LCL) johdettu 74 ei-liittyviä familiaalinen munasarjasyöpä potilaille, jotka ovat ei-kantajia tunnettuja

BRCA1 /2

ja

MMR

geenimutaatioita, sekä 47 ei-syöpä jotka eivät liity perheen valvontaa. Me genotyyppi seitsemän munasarjasyövän riski variantteja löydettiin peräisin GWAS näissä 121 solulinjoissa ja tutkittu niiden yhteenliittymien kanssa geenien ilmentyminen vaihtelut. Tietääksemme tämä on ensimmäinen genominlaajuisia tutkimuksessa arvioitiin assosiaatioita mRNA ilmaisun vaihtelut LCL familiaalinen munasarjasyövän tapauksissa ja GWAS löysi munasarjasyövän riski alleelien [1] – [3].

Tulokset

lymfoblastisolulinjoissa olivat peräisin verinäytteistä 74 ei-liittyvä naisten familiaalinen munasarjasyövän ja 47 un liittyviä syöpä-vapaa ohjaimet rekrytoitiin GRFOCR (katso menetelmät). Geeniekspressioprofiilit luotiin käyttäen Illumina ihmisen HT-12 v3 Expression BeadChips. Olemme suodatettiin käsitellyt tiedot sisällyttää geenien ilmentymistä taustan yläpuolelle vähintään 25% näytteistä (n = 121). Yhteensä 10435-mRNA: n geenien tarkasteltiin yksityiskohtaisemmin.

Kunkin näytteen, seitsemän variantteja tunnistettiin kolme munasarjasyöpä GWAS genotyypitettiin käyttäen StepOnePlus ™ Real Time PCR-järjestelmä ja määritykset-on-Demand SNP-genotyypin tuotteet (katso menetelmät). Arvioimme mahdollisia vaikutuksia näiden GWAS löydettiin varianttien munasarjasyövän, suorittamalla yhdistys analyysi analysoida korrelaatioita mRNA ilmaisun muunnelmia ja variantti genotyypit. Merkitseviä tunnistettiin arvioimalla suhteita muunnelmia mRNA ekspressiotasoja (iän ja tapaus-verrokki tila oikaistu) ja variantti genotyyppien kautta 10000 yhdistelmää. Määrä merkittäviä yhdistyksiä permutaatio kynnys 0,05, 0,01 ja 0,001 on yhteenveto taulukossa 1. Luettelo valituista kärkipään merkitseviä (permutoituina P ≤ 0,001 ja r

2≥0.095) on esitetty taulukossa 2. yksi merkittävimmistä yhdistysten on havaittu

rs10098821

ja

IER3

geeni (permutoituina P 0,0001).

IER3

, on stressi-indusoituva välittömän varhaisen reagoinnin geeni, jonka tehtäviin kuuluu solujen lisääntymisen ja apoptoosin sääntelyä. On havaittu, että tämä geeni on pro-apoptoottisten kehittämisessä munasarjasyöpä [15].

rs10098821

selittää noin 13%: n vaihtelu

IER3

n ilmentymistaso mitattuna tarkistetaan r

2.

Mielenkiintoista, kolme muunnokset 8q24 lokuksesta, eli

rs10098821

,

rs10088218

ja

rs1516982

, oli suurin merkitseviä kaikkien seitsemän variantteja. Tällä 0,05 permutaatio kynnys, useita merkittäviä assosiaatioita nämä kolme vaihtoehtoa oli 959, 821 ja 618. Määrä oli 251, 194 ja 139 on tiukemmat permutaation kynnys 0,01, ja 38, 25 ja 16 kynnyksellä 0,001 . Nämä kolme vaihtoehtoa jakaa useita merkittäviä mRNA geeniekspression yhdistyksiä. Tällä 0,05 permutaatio kynnys, kolmesataakaksitoista mRNA: t, joiden osuus 33% mRNA korreloi

rs10098821

, 38% mRNA korreloi

rs10088218

, ja 50% mRNA korreloivat jossa

rs1516982

, korreloivat kaikki kolme variantteja (kuva S1). Esimerkiksi tasot

Fance

(Fanconin anemia, komplementaatioryhmä E) ilmentyminen merkitsevästi liittyy

rs1516982

(permutoituina P = 8,0 x 10

-4 oikaistuna r

2 = 10,3%),

rs10098821

(permutoitu P = 0,0037, oikaistu r

2 = 7,0%) ja

rs10088218

(permutoitu P = 0,0312, oikaistu r

2 = 3,4%), mutta mikään neljästä muusta SNP (kuva S2).

Havaitsimme kaksi mahdollista

cis

-associations jossa variantti genominen sijainti on 1 Mb ympäri anturin kohdistaminen geeni . Yksi

cis

-yhdistys on välillä

rs10098821

ja

c-Myc

geeni, joka on 806 kb päässä variantti (permutoiduista P = 0,0198, kuvio 1), ja toinen on välillä

rs2072590

ja

HS.565379

, joka on 697 kb päässä variantti (permutoiduista P = 0,0399, ei ole esitetty).

rs10098821

selitti noin 4,0%: n vaihtelu

c-Myc

ilmentyminen mitattuna tarkistetaan r

2. Yksilöiden T variantin alleelien on tilastollisesti merkitsevästi vähemmän ilmaus

c-Myc

verrattuna niitä ilman T variantti alleelien.

rs2072590

selitti noin 4,4%: n vaihtelu

HS.565379

ilme.

HS.565379

on todettu olevan kudosspesifisen ilmentymisen kohdun ja kohdun kasvainten perustuvat EST-pohjainen geenin ilmentymisen profilointi [16].

boxplot esittää suhdetta log

2 jäännösten

c-Myc

ekspressiotasot (ikä- ja tapaus-verrokki status) ja genotyyppi

rs10098821

.

rs10098821

selitti noin 4,0%: n vaihtelu

c-Myc

ilmentyminen mitattuna tarkistetaan r

2.

Sitten tutkimme, onko ovat merkittäviä assosiaatioita nämä seitsemän variantteja ja tunnetaan munasarjasyövän riski geenejä, kuten

BRCA1 /2

,

MMR

geenejä,

p53

,

jne.

Emme havainneet mitään merkittävää yhteyttä näiden varianttien ja

BRCA1 /2

geenejä. Kuitenkin löysimme useita merkittäviä assosiaatioita varianttien ja

MMR

geenien ja

p53

geenin (kuva S3). Esimerkiksi löysimme ilmentymistason

MLH1

geeni liittyy merkittävästi

rs2072590

vaihtoehtoa 2q31 loci (permutoituina P = 0,0049, kuva 2).

rs2072590

selitti noin 8,3%: n vaihtelu

MLHL1

n ekspressiotason. Ilmaisu on

p53

geeni liittyy merkittävästi

rs2665390

(permutoituina P = 0,018, säädetty r

2 = 0,036),

rs1516982

(permutoitu P = 0,028, säädetty r

2 = 0,035), ja

rs10088218

(permutoitu P = 0,049, säädetty r

2 = 0,025). Lisäksi ilmaus

MSH5

geeni liittyy merkittävästi

rs2363956

(permutoituina P = 0,0056, oikaistu r

2 = 0,075).

boxplot esityksiä suhde log

2 jäännösten

MLH1

ekspressiotasoja (ikä- ja tapaus-verrokki status) ja genotyyppi

rs2072590

.

Lopuksi, biologisesti luonnehtinut kyseisiä mRNA geenejä merkitsevästi yhteydessä GWAS löysi munasarjasyövän riski alleelit tutkitaan tässä, teimme Gene ontologia (GO) rikastamiseen analyysi käyttäen NCBI DAVID työkalun [17] Kuten taulukosta 3, luettelo on täydennettävä GO biologinen prosesseja ovat ”cell cycle” (P = 2,59 x 10

-6), ”apoptoosin säätelyyn” (P = 4,37 x 10

-5), ja ”ohjelmoidun solukuoleman” (P = 6,93 x 10

-5). Molekyylitasolla toiminnon tasolla merkittävästi rikastettu GO termejä sisältää ”nukleotidin sitovat” (P = 7,43 x 10

-9), ”ATP: n sitoutuminen” (P = 3,94 x 10

-7), ”transkriptiotekijän sitova ”(P = 1,19 x 10

-5) ja” DNA helikaasiaktiivisuutta ”(P = 3,41 x 10

-4).

keskustelu

geneettinen etiologia familiaalinen munasarjasyövän on edelleen mysteeri. Tunnettuja mutaatioita

BRCA1 /2

ja

MMR

geenejä voidaan vain selittää pienen osan familiaalinen yhdistäminen munasarjasyöpä. Tulokset viimeaikaisista GWAS tutkimukset ovat tunnistaneet useita yhteisiä geneettisiä variantteja annetaan riski munasarjasyöpä [1] – [3]. Kuitenkin useimmat näistä variantit eivät ole proteiinia koodaavia alueita, joten toiminnallinen merkitys näiden varianttien on suurelta osin tuntematon. Nykyisessä tutkimuksessa esitetään yritys leikellä geneettinen alttius familiaalisen munasarjasyövän, sekä selvittää mahdolliset toiminnalliset merkitystä tunnistetun riskin variantteja GWAS. Erityisesti tutkimme assosiaatiot seitsemän merkittävää variantteja tunnistettiin munasarjasyöpä GWAS ja globaalin mRNA: n ilmentymisen.

Kuten odotettua, olemme havainneet useampien kaukaisten (

trans

-) kuin paikallinen (

cis

-) yhdistykset. Niistä kaksi tunnistettu

cis

-associations, yhdistyksen välillä

rs10098821

klo 8q24 ja

c-Myc

on erityisen mielenkiintoinen. Yhteinen variantteja 8q24 on aikaisemmin osoitettu antavan alttiutta useita syövän fenotyyppejä, mukaan lukien eturauhas-, kolorektaalisen, rinta- ja virtsarakon syövät [18] – [23], ja edellinen toiminnalliset tutkimukset ovat ehdottaneet, että yhteinen variantteja tällä alueella voi liittyä transkription sääntely

c-Myc

[24] – [25]. Useimmat riski yhdistykset 8q24 sijaitsevat 5 ’on

c-Myc

, mutta kolmen tärkeimmän SNP munasarjasyövän hoitoon hajallaan näennäinen geeni aavikko joka on 700 kb 3′

c-Myc

, mikä viittaa siihen, että joko

c-Myc

ei ehkä kohteena alttius geenin munasarjasyövän tai että variantit tällä alueella ovat myös omiaan kaukaisilla sääntelyn

c-Myc

. Aikaisemmassa tutkimuksessa [2], Goode et ai verrattuna

c-Myc

ilmentymistä 48 normaalissa munasarjan epiteelin solulinjojen välillä yksilöille

rs10098821

variantti alleeleja ja niitä, joilla on ainakin yksi

rs10098821

variantti alleeleja. Käyttämällä

GAPDH

ohjearvon mRNA, he huomasivat, että ne, ilman

rs10098821

variantti alleelit olivat korkeammat

c-Myc

ilmaisun kuin ne, joissa on vähintään yksi

rs10098821

variantti alleelit (mediaani suhteellisen ilmaisun: 0,97 vs 0,62). Kuitenkin ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,43). Samanlaisia ​​havaintonsa, olemme havainneet, että yksilöille

rs10098821

variantti alleelien oli merkittävästi korkeammat tasot

c-Myc

ilmentymisen verrattuna niitä, joilla on ainakin yksi

rs10098821

variantti alleelit (permutoituina P = 0,0198). Kuten olemme edellä todettiin,

rs10098821

on 3 ’on

MYC

ja sijaitsee noin 0,8 Mb pois. Miten tämä SNP saattavat vaikuttaa

MYC

ilme on vielä epäselvä.

Näiden merkitykselliset yhdistysten koulutusjakson analyysi, olemme havainneet, että geenit merkitsevästi yhteydessä GWAS löysi munasarjasyövän riski alleelit rikastetaan useissa keskeisiä biologisia reittejä, kuten solusykliä, soluvastetta stressiin /vahinkoja, energia-aineenvaihduntaan, transkriptiotekijä sitova,

jne

. Mielenkiintoista, parhaiten tunnettu familiaalinen munasarjasyöpä geenejä (

ts.

,

BRCA1 /2

ja

MMR

) ovat keskeisiä toimijoita näillä keskeisillä reittejä. Esimerkiksi on osoitettu, että

BRCA1

on keskeinen säätelijä tunnistava DNA stressin /vaurioita ja myöhemmin edistää solukierron pysähtymisen [26]. Vaikka yhdistys analyysi ei voi paikantaa tarkka toimintoja näiden GWAS löysi variantteja, se sisältää luettelon mahdollisista biologisista väyliä joka voisi keskittyä tulevaisuudessa analyysiin.

On olemassa useita rajoituksia tämän tutkimuksen. Ensinnäkin monet mRNA: t ilmentyvät kudoksen rajoitetusti. Tulokset LCL tässä tutkimuksessa todennäköisesti edustaa pienessä määrässä mRNA ilmaisun muunnelmia. Myös kykymme tutkia genetiikkaa mRNA ilmaisun rajoittaa se, että me vain tutkittu seitsemän variantteja analyysissa, vaikka nämä seitsemän variantteja on liitetty munasarjasyövän riskiä viime GWASs. Toiseksi vaikutukset transkriptio runsaus saattaa olla hienovarainen ja samalla alle kynnysarvo mikrosirun alusta, ja näytteen kokoa tutkimuksessamme on suhteellisen pieni. Kolmanneksi, on olemassa huoli siitä, mitä tuloksista oikeastaan ​​tarkoittaa mitattaessa ilmentymistä ei-kasvainkudoksessa yhdellä ajankohtana. Lopullisena päämääränä tutkimuksen tarkoituksena on tunnistaa periytyvän geneettisen tekijöitä mRNA: n ilmentymisen normaaleissa kudoksissa sijaan somaattinen korjauksilla mRNA geeniekspression tuumorikudoksissa. Tutkimukset ovat osoittaneet, että ainakin osa mRNA: n geenin ilmentyminen on geneettisesti määritetty. Siksi jopa yhdellä kertaa pisteen ei-kasvainkudoksessa, mitä olemme havainneet tämän tutkimuksen silti tarjoaa hyödyllistä tietoa siitä, miten mRNA ilmaisu on geneettisesti säädeltyä. Forth, tiettyjä vaikutuksia saa paljasti tietyissä yhteyksissä, kuten häiriön tietyn reitin, ja saattaa tapahtua muutoksia geenien transkriptien välittävät muutoksia MikroRNA tai ei-koodaavat RNA: t sijaan suoria vaikutuksia geenejä. Näissä tapauksissa, vaihtoehtoiset määritykset vaaditaan sotkea näitä geenejä. Lopuksi merkitseviä eivät lisäksi toiminnallisesti tunnusomaista koska kaikki alkuun yhdistysten ovat trans-yhdistyksiä. Toistaiseksi on vielä puutetta perustettu kokeellisia menetelmiä arvioida trans-sääntelyn välillä SNP ja geenien ilmentymisen.

parhaan tietomme mukaan tämä tutkimus tarjoaa ensimmäisen arvion ekspressiotason vaihtelu ihmisen kypsän mRNA: iden in LCL alkaen familiaalinen munasarjasyöpä potilailla ja terveillä sukulaiskontrolleista. Lisätutkimuksia tarvitaan sen geneettisen syitä ja biologiset seuraukset, jotka liittyvät tunnistettuihin merkittäviin yhdistysten. Merkitseviä tunnistettu tässä tutkimuksessa saattavat helpottaa ymmärtää paremmin geneettistä etiologiaa familiaalinen munasarjasyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimus Väestö

Tämä tutkimus on hyväksynyt Institutional Research Board (IRB) Roswell Park Cancer Institute. Kirjallinen tietoon perustuva suostumus on saatu kaikista koehenkilöistä. Tiedot ja näytteet naisilla munasarjasyövän ja niiden sukulaisia, jotka olivat syöpää vapaa saatiin Gilda Radner Familial munasarjasyöpä Registry (GRFOCR). Seitsemänkymmentä neljä ei-liittyvä naisten familiaalinen munasarjasyövän sisällytettiin tässä tutkimuksessa tapaukset. Ne tunnistettiin perheet perinnöllinen munasarjasyövän, joissa ainakin kaksi ensimmäisen tai toisen asteen sukulaiset oli epiteelin munasarjasyöpä diagnosoitu iässä tahansa. Kaikki naiset olivat ei-kantajia

BRCA1 /2

tai

MLH1 /MSH2

mutaatioita. Ajan, eri menetelmiä on käytetty määrittämään mutaation asema

BRCA1 /2

in GRFOCR näytteissä. Koottujen näytteiden ennen vuotta 2002, mutaatio asema määritettiin seulomalla kaikki eksonit ja introni /eksoni pujontaliitosten on

BRCA 1/2

yhdistelmällä SSCP ja HD analyysi. Lisäksi eksoni 11

BRCA1

analysoitiin proteiini katkaisun testi lopetuskodonia tuottaa mutaatioita. Jos muutoksia havaittiin, muuttuneen fragmentti sekvensoitiin. Vuodesta 2002 sekvensointi eksonien ja pujontaliitosten käytettiin. Viime 5 vuotta, kaikki näytteet (vanha ja uusi) ei näy mutaatiota tutkittiin

BRCA1

laajamittainen uudelleenjärjestelyjä. Syöpä-vapaa valvontaa GRFOCR olivat perheen sukulaisia ​​tapauksissa, myös äidit, siskot, veljen,

jne.

Kuitenkin tässä tutkimuksessa, päätimme käyttää sukulaiskontrolleista. Sukulaiskontrolleista ovat naisia, jotka eivät ole sukulaisia ​​tapauksia Tässä tutkimuksessa käytettiin. Neljäkymmentäseitsemän sukulaiskontrolleista sisällytettiin. Tapaukset ja verrokit Hyväksytty sukupuolen ja rodun. Kaikki tapaukset ja kontrollit olivat valkoisia naisia. Mediaani-ikä on syöpä diagnoosi 74 tapauksessa oli 47 (vaihteluväli 21-85), kun taas mediaani-ikä 47 tarkastuksia aloituspaikkojen GRFOCR oli 58 (vaihteluväli 26-89). Kaikki oppiaineista lahjoitti verinäytteitä, kun ne oli otettu GRFOCR. LCL -soluja perustettu EBV transformaatio käyttämällä eristetty lymfosyytit verinäytteistä. Tutkimuksen hyväksyi institutionaalisten IRB lauta.

lymfoblastisolulinjoissa (LCL) kulttuurin ja RNA

LCL -soluja ylläpidettiin RPMI 1640 (GIBCO BRL) johon oli lisätty 15% vasikan sikiön seerumia ja antibiootteja 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehän tilan ja 95%: n kosteudessa. Solun totaali-RNA: t eristettiin LCL käyttäen TRIzol reagenssia protokollien mukaisesti valmistajan toimittamat (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). Puhdistettu RNA: t käsitellään edelleen poistaa kontaminoivat DNA: ta (DNA-free-sarja, Ambion, Inc., Austin, TX, USA). Laatu ja määrä RNA arvioitiin 260/280 suhde käyttämällä NanoDrop spektrofotometrisesti (NanoDrop ND-1000 Technologies Inc.) ja Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).

Genotyyppausanalyysiin munasarjasyövän riski alleelit

Seven SNP, joka tunnistetaan 3 munasarjasyöpä GWAS, sisällytettiin Genotyyppausanalyysiin. Ne ovat

rs3814113

9p22.2,

rs2072590

2q31,

rs2665390

3q25 että intronin TCDD-indusoituvan poly (ADP-riboosi) polymeraasin (

TIPARP

) geeni,

rs2363956

19p13 vuonna ankyriiniproteiinista toista ja LEM domain sisältää 1 (

ANKLE1

) geeni,

ja rs10088218

,

rs1516982

, ja

rs10098821

8q24.21.

rs2363956

on nonsynomous SNP, joka johtaa Leu Trp aminohapon muutos. Genotyyppausanalyysiin suoritettiin käyttäen StepOnePlus ™ Real Time PCR-järjestelmä ja määritykset-on-Demand SNP genotyypin tuotteista fluorogeenisen polymeraasiketjureaktio alleelinen syrjintä (Applied Biosystems). Kukin PCR-reaktio levyn mukana negatiiviset kontrollit, positiiviset kontrollit, ja tuntemattomia näytteitä. Vähäinen alleelifrekvenssit kullekin SNP tapauksissa ja sukulaiskontrolleista olivat 0,346 /0,298 (P = 0,65) ja

rs3814113

, 0,3 /0,368 (P = 0,84) ja

rs2072590

, 0,081 /0,060 (P = 0,60) ja

rs2665390

, 0,149 /0,107 (P = 0,13) ja

rs10088218

, 0,167 /0,119 (P = 0,06) ja

rs1516982

, 0,127 /0.071 (P = 0,07) ja

rs10098821

, ja 0,432 /0,488 (P = 0,20) ja

rs2363956

. Genotyyppaustulokset tiedot on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus (GEO) kanssa hakunumerolla GSE37582.

Gene Expression Microarray

Kaksisataa nanogrammaa kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä leimattiin ja hybridisoitiin päälle Illumina ihmisen HT-12 v3 Expression BeadChips mukaan valmistajan suositusten (Illumina Whole-Genome Gene Expression Guide). Ilmaisu profiilit on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus (GEO) kanssa hakunumerolla GSE37582.

Tilastollinen analyysi

raaka intensiteetti Illumina ihmisen HT-12 v3expression array skannattiin ja purkaa käyttäen BeadScan, jossa data korjataan taustan vähentäminen on GenomeStudio moduulissa. Lumi paketin R-pohjainen Bioconductor Package käytettiin normalisoimaan log

2 transformoitu intensiteetti tietoja käyttämällä kvantiiliestimaattorilla normalisointi algoritmi. Tietojen laadunvalvonta, me ulkopuolelle koettimet kanssa tunnistus P-arvon 0,05 (P arvot syntyi BeadStudio ohjelmistot) vähintään 25% (n = 121) näytteistä. Yhteensä 10435-mRNA: n geenien läpäissyt laadunvalvontaa askel ja käytettiin loppupään analyysiä. Yhdistyksen SNP genotyypin kanssa jäännösten ekspressiotason ikä- ja tapaus-verrokki tila laskettiin käyttäen lineaarista regressiomallia edellä kuvatulla tavalla (27). Kymmenen tuhannen permutaatiot ilmaisun fenotyyppien suhteen SNP genotyyppiä tehtiin (28-29). Johtaa P-arvot oikaistu useita testaus, me määritetty prosenttiosuus kertaa ulos 10000 permutaatioiden että havaitut P-arvo ylittyi permutoitua tietojen analysoinnin.

tukeminen Information

Kuva S1.

Venn-kaavio, joka esittää päällekkäisyyttä mRNA geenien merkittävästi (permutoituina P 0,05), joka liittyy kolmen GWAS löydetty SNP: iden välillä 8q24 lokukseen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0047962.s001

(TIF) B Kuva S2.

Merkittävät assosiaatioita genotyyppien kolmen muunnelmia 8q24 locus ja

Fance

ilme fenotyyppejä. Boxplot osoittaa suhde log

2 jäännösten

Fance

ekspressiotasoja (ikä- ja tapaus-verrokki status) ja genotyyppi

rs1516982

(top, permutoituina P = 8,0 × 10

-4 oikaistuna r

2 = 10,3%),

rs10098821

(keskimmäinen, permutoituina P = 0,0037, oikaistu r

2 = 7,0%) ja

rs10088218

(alhaalla, permutoituina P = 0,0312, oikaistu r

2 = 3,4%).

doi: 10,1371 /journal.pone.0047962.s002

(TIF) B Kuva S3.

Merkittävät assosiaatioita varianttien genotyyppien ja

p53

ilme fenotyyppejä. Boxplot osoittaa suhde log

2 jäännösten

p53

ekspressiotasoja (ikä- ja tapaus-verrokki status) ja genotyyppi

rs2665390

(top, permutoituina P = 0,0181 oikaistuna r

2 = 3,6%),

rs1516982

(keskimmäinen, permutoituina P = 0,0279, oikaistu r

2 = 3,5%) ja

rs10088218

(alhaalla, permutoituina P = 0,0494, oikaistu r

2 = 2,5%).

doi: 10,1371 /journal.pone.0047962.s003

(TIF) B