Krooninen sairaus

tiivistelmä

N-Myc alavirtaan säädelty geeni 2 (

NDRG2

) on ehdokas tuumorisuppressorigeeniä, jolla on tärkeä rooli valvoa kasvaimen kasvua. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia ilmaus

NDRG2

geenin virtsarakon syöpä (BC) kudoksiin ja useat virtsarakon syövän solulinjoista, ja etsimään sen kliinisten ja patologisten merkitystä. Yhdeksänkymmentäseitsemän virtsarakon syöpä ja 15 normaalissa virtsarakossa kudosleikkeiden analysoitiin takautuvasti kanssa immunohistokemiallisesti. Ihmisen virtsarakon syövän solulinja T24 infektoitiin LEN-

NDRG2

tai LEN-LacZ. Vaikutukset

NDRG2

ilmentymisen vaikutus T24-soluissa ja T24 nude mouse -ksenografteja mitattiin solujen kasvukäyrät, kasvaimen kasvukäyrät, virtaussytometria analyysi, Western blot ja Transwell määritys.

NDRG2

oli hyvin ilmaistu normaalissa virtsarakossa kudoksessa, mutta poissa tai harvoin ilmaistaan ​​cacinomatous kudoksissa (χ

2 = 8,761, p 0,01).

NDRG2

taso oli negatiivisesti korreloivat kasvaimen ja patologinen vaiheessa (r = -0,248, p 0,05), sekä lisääntynyt c-myc tason (r = -0,454, p 0,001). Ilmaisu on

NDRG2

oli alhainen kolmessa BC solulinjat. T24-soluissa tartunnan LEN-

NDRG2

estivät leviämisen sekä

in vitro

ja

in vivo

, ja

NDRG2

yliekspressio voi estää kasvaimen kasvua ja invaasio

in vitro

.

Citation: Li R, Yu C, Jiang F, Gao L, Li J, Wang Y, et al. (2013) yli-ilmentyminen N-Myc Loppupään-valvotuilla Gene 2 (NDRG2) Säätelee leviämisen ja invaasion Virtsarakon syövän solut

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 8 (10): e76689. doi: 10,1371 /journal.pone.0076689

Editor: Raffaele Calogero, University of Torino, Italia

vastaanotettu: toukokuu 27, 2013; Hyväksytty: 26 elokuu 2013; Julkaistu 16. lokakuuta 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus työ tukee taloudellisesti National Natural Science Foundation of China (31070681). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ilmaantuvuus virtsarakon syöpä kasvaa. Arviolta 386300 uutta tapausta ja 150200 kuolemantapauksia virtsarakon syövän tapahtui vuonna 2008 maailmanlaajuisesti [1]. Miehillä, virtsarakon syöpä on neljänneksi yleisin syöpä vasta eturauhas-, keuhko-, ja peräsuolen syöpien osuus 7% kaikista syöpätapauksista Yhdysvalloissa [2]. Yli 75% tapauksista, diagnoosi tehdään varhaisessa vaiheessa taudin (vaiheiden Ta ja T1). Vaikka se oli saanut asianmukaista hoitoa, viiden vuoden eloonjäämisaste hinnan patologinen T2 sairaus on 52-77%, T3 tauti 40-64%, ja T4 tai imusolmuke-positiivisen tauti 26-44% [3]. On numero hoitotoimenpiteiden tämän sairauden hoidossa; Kuitenkin yleinen eloonjäämisaste ei ole parantunut viimeisten kahdenkymmenen vuoden aikana. Siksi perustaa uuden hoitomuodon käyttää antioncogene agentti parantaa eloonjäämisaste potilaiden on erittäin toivottavaa.

N-myc alavirtaan säädellä geenin 2 (

NDRG2

) kuuluu NDRG perhe, johon kuuluu neljä jäsentä:

NDRG1, NDRG2, NDRG3

ja

NDRG4

. Sekvenssihomologia ihmisen sisällä

NDRG

perhe on 57-65% ja

NDRG

perhe on tutkittu joissakin ihmisen syövän ja hermoston häiriöt [4]. Koska geeni säädellä alavirtaan Myc,

NDRG2

ilmentyminen on vahvistettu vähennetään monenlaisia ​​karsinoomat, mukaan lukien kilpirauhasen syöpä, maksasyöpä, meningiooma, haimasyöpä ja eturauhassyöpä [5-11]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että

NDRG2

voisi olla tärkeä rooli valvoa sairastuvuuteen syöpäkasvainten.

NDRG2

on vahvistettu osallistuvan solujen kasvua ja erilaistumista puolestaan ​​

NDRG2

ilmentymistä korkealaatuisesta gliooma on osoitettu liittyvän selviytymisen [12,13].

(A) ilmaus tasot

NDRG2

proteiinin väheneminen samalla aste maligniteetin virtsarakon syöpä lisääntyy (X400) (1). Normaali virtsarakkokudos; (2) Virtsarakon papilloomavirus (T0-Ta); (3) Korkean tason virtsarakon syöpä (T2-T4). (B) ekspressio tasot c-Myc-proteiinin kasvaa, kun aste maligniteetin virtsarakon karsinooma kasvaa (x400) (4). Normaali virtsarakkokudos; (5) Virtsarakon papilloomavirus (T0-Ta); (6) Korkean tason virtsarakon syöpä (T2-T4). Osat (B) (4-6) peräisin samasta parafiiniblokit kuin (A) (1-3), vastaavasti.

Vaikka useat tutkimukset ovat tutkineet funktio

NDRG2

yhteistä kasvaimissa, ei ole ollut toiminnallinen luonnehdinta mahdollista roolia

NDRG2

geenin virtsarakon syöpään. Siksi tavoitteena nykyisen oli tutkia roolia

NDRG2

ihmisen virtsarakon syöpä. Ensin tutkimme ilmaus

NDRG2

ihmisen virtsarakon syöpä kudoksia ja verrattuna normaaliin virtsarakon kudoksiin immunokemian. Olemme havainneet, että ilmentymisen taso

NDRG2

BC kudoksissa oli alhaisempi kuin normaaleissa kudoksissa. Seuraavaksi käytimme virtsarakon syöpä solulinjoja malleina vaikutuksen arvioimiseksi

NDRG2

syöpäkasvainten kasvuun, erilaistumiseen ja invaasio

in vitro

ja

in vivo

. Tuloksemme viittaavat siihen, että

NDRG2

on potentiaalia antioncogenic rooli virtsarakon syöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Kliininen Näytteitä

Formaliinifiksoidusta ja parafinoidut lohkot virtsarakon syöpä kudoksia arvottiin kerättiin 112 potilaiden ja verrokkien (keski-ikä 63,4 vuotta, vaihteluväli 21-81 vuotta) osastolta Urologiset Kirurgian Xijing Hospital, FMMU (Xi’an, Kiina) vuodesta 2008 vuoteen 2011.These näytteiden käsitti 15 normaalissa virtsarakossa kudoksissa, 20 virtsarakon papilloomavirus (T0-Ta), 38 matalan tason virtsarakon syöpä (Tis-T1) ja 39 korkean tason virtsarakon syöpä näytettä (T2-T4). Kirjallinen suostumus saatiin kuhunkin aiheeseen. Tutkimus hyväksyttiin eettisen komitean Xijing Hospital, Xi’an, Kiina.

(A) Reaaliaikainen PCR-analyysi

NDRG2

mRNA ilmaisun. (B) Expression taso

NDRG2

proteiinin analysoituna Western blot. Kaikki määritykset toistettiin toisistaan ​​riippumatta vähintään kolme kertaa. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD (** p 0,001) ..

immunohistokemia (SP: streptavidiini-perosidase) B

Hiiren anti-ihmisen

NDRG2

monoklonaalinen vasta-aine ja c-Myc monoklonaalinen vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology Company (Santa Cruz, USA.). Immunohistokemia kit ostettiin Boster Company (Wuhan, Kiina). Immunohistokemia värjäys suoritettiin valmistajan ohjeita. Seuraavat valmisteet tehtiin kustakin kudoksesta lohko: dia värjätty HE (patologisen vaihe tarkastettiin patologit), dia inkuboidaan anti

NDRG2

vasta-levyllä inkuboidaan c-myc-vasta-ainetta.

jotta tarkasti määrittää positiivisen ilmaisun ja minimoida väärien positiivisten määrä, käytimme kaksi arbitory puolikvantitatiivinen pisteytystä arvioida, missä määrin ja intensiteetti värjäyksen kolmella patologia itsenäisesti. Peli määriteltiin seuraavasti: (1) laajuus värjäys pisteytys: 0 piste värjäystä 5%, 1 piste värjäys 6%: sta 25%, 2 pisteen värjäys 26%: sta 50%, 3 piste värjäystä 51 % 75%, ja 4 pisteen värjäystä 75% (2). Värjäytymisen intensiteetti pisteytys: 0 piste negatiivista värjäystä, 1 piste heikosti positiivista värjäytymistä, 2 pistettä kohtalainen värjäystä ja 3 pistettä vahvaa värjäytymistä (tan). Kunkin näytteen tulokset johdettu kahdesta pisteytysjärjestelmät olivat kerrotaan. Tulokset määrityksen jaettiin neljään tasoon: negatiivinen (0-1, -), heikosti positiivinen (2-4, +), positiivinen (5-8, + +), vahva positiivinen (9.-12, + + +) . Kuvaus suoritettiin valomikroskoopilla (Olympus, Nagano, Japani) ja lasketaan tilastollinen analyysi.

Cell Culture

valitsimme ihmisen T24, 5637 ja BIU-87 solujen rivit käytettävien tutkimuksessa. Nämä solulinjat on aiemmin vahvistettu asianmukaiset solulinjoja tutkimuksen virtsarakon syöpään. Koska normaali valvonta, päätimme ihmisen virtsarakon cell (SV-HUC-1). Kaikki solulinjat ostettiin Cell Bank, Kiinan tiedeakatemia, Shanghai, Kiina. Soluja viljeltiin RPMI1640-(Gibco), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Holly lehtiä Hangzhou, Kiina). Kaikki solulinjat viljeltiin steriileissä olosuhteissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

(A) havaitseminen lentiviruksen infektion tehokkuuden, ja vaihe kontrasti (vasen) tai GFP (oikealla) kuvat olivat saadaan neljä päivää sen jälkeen infektion. (B) Reaaliaikainen PCR-analyysi

NDRG2

mRNA: n ekspressio in T24-soluissa. (C) Western blot-analyysi

NDRG2

proteiinin ilmentymisen. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD (** p 0,01) ..

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen TRIzol reagenssia (Takara Bio, Japani) ja käänteistranskriboitiin käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Fermentas) mukaan valmistajan ohjeiden. Käytetyt alukkeet olivat seuraavat: GAPDH, 5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3 ’ja 5′-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3’;

NDRG2

, 5′-GCCCAGCGATCCTTACCTACC-3 ’ja 5′-GGCTGCCCAATCCATCCAACC-3’. Vahvistusta ohjelma koostui polymeraasin aktivoinnin 95 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 15 sekuntia, pariutuminen ja ekstensio 59 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Suhteellinen ekspressiotasoja normalisoitiin käyttäen vertailevaa kynnyssykli (2

-ΔΔCt). Real-time PCR suoritettiin käyttäen CFX96 Touch PCR -järjestelmää (Bio-Rad). Kaikki edellä mainitut kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Western-blottaus-analyysi

Kaikki solut kerättiin eksponentiaalisen vaiheen ja sitten koko proteiini uutettiin lyysipuskurilla, joka sisälsi 1% Tween 20, ja lopuksi kvantitatiivisesti BCA-määrityksellä. Yhtä suuri määrä proteiineja, 20 pg altistettiin 10%: n pitoisuus SDS-PAGE. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE sisällä geelit siirrettiin nitroselluloosalle (NC) kalvoja (Amersham, St. Giles, UK). Sen jälkeen, NC kalvot estettiin 5% rasvatonta maitoa 1 h huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin sitten hiiren anti-humaani

NDRG2

-vasta-ainetta (1: 800) (Santa Cruz, USA) yön yli 4 ° C. GAPDH-proteiinin tunnistus käytettiin sisäisenä kontrollina. Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa, siirretään blotit, jotka sisältävät

NDRG2

kaistoja visualisoitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) -konjugoitu anti-hiiri- tai anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (laimennus 1: 2000, Santa Cruz) 2 tunnin ajan huonelämpötila. Tehostetun kemiluminesenssin (ECL) järjestelmän tunnistus ratkaisut (Pierce, NJ) levitettiin sitten, ja kvantifioidaan Kodak Digital Science ID-ohjelmisto (Kodak, NY).

lentivirustartunnat Infektio

Tuottaa lentivirus 293T-solut ko-transfektoitiin PLEN-GFP-

NDRG2

tai PLEN-GFP-Lacz, joka monistettiin

E. coli

DH5, puhdistetaan käyttäen Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA), ja transfektoitiin 70% konfluentteja 293T-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Lentivirusvektorikonstruktit hiukkaset kerättiin supernatantista 72 tunnin transfektion jälkeen ja puhdistettiin ultrasentrifugaatiolla. Nämä hiukkaset ovat jäljempänä LEN-

NDRG2

, ja LEN-Lacz (negatiivinen kontrolli). Pysyvästi tartunnan T24 solut valittiin käyttämällä blastisidiinia, laskemalla vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) -positiivinen soluja fluoresenssimikroskopian (Olympus, Japani), joka kohdistuu pienin pitoisuus blastisidiinia, kun sarja titraus, vaaditaan tappamaan infektoitumattomiin T24 soluja. Solulinjaa jaettu seuraaviin kolmeen koeryhmään: 1)

NDRG2

ryhmä (LEN-

NDRG2

infektoiduista soluista), 2) Lacz ryhmä (LEN-Lacz-tartunnan soluja), ja 3) CON ryhmä (ei-infektoituneita soluja). Sekä Reaaliaikainen PCR ja Western blot vahvisti, että olemme menestyksellisesti tartunnan T24 soluja lentiviruksen ja yli-ilmentyminen

NDRG2

oikein tartunnan jälkeen. Olemme myös varmistettu tasauspyörästön ilmaus proteiinien korreloivat solusyklin vaiheessa, apoptoosin ja solumigraatio ja invaasiota (solusyklin proteiini: cyclinD1, CDK4; apoptoosia proteiini: p21, solumigraatioon ja invaasio proteiini: MMP-2 ja MMP-9) .

solukasvuneston testit

in vitro

Tämä testi mukana MTT määrityksissä, Pesäkkeenmuodostusta määritykset ja virtaussytometria analyysi (FCA) (BD Biosciences, NJ). Kukin määritys levitettiin kunkin kolmen ryhmän (tyhjä kontrolli, LEN-LacZ, negatiivinen kontrolli ja LEN-

NDRG2

, koeryhmän). Kokeet toistettiin viisi kertaa (1). MTT-analyysi: Kaikki solut, mukaan lukien tartunnan, kasvatettiin eksponentiaaliseen vaiheeseen ja irrotetaan trypsiinikäsittelylle. Elävät solut (2000 solua /ml) inokuloitiin 96-kuoppaisille levyille ja jokainen ryhmä oli kuusi reduplicative kuoppiin. Eri ajankohtina, MTT-reagenssia lisättiin 20 ui /kuoppa (5 mg /ml) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 150 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO), jota seurasi ravistelu 10 min. Absorbanssi (A) arvot mitattiin autokinetic entsyymin lisäämisen metriä (Bio-Rad, USA) 490 nm: n aallonpituudella. Cell kasvukäyrät sen jälkeen vedettiin perustuu keskimäärin arvot (2). Pesäkemuodostusta: Solut ympättiin kuuteen kuoppaiset levyt (200 solua /kuoppa) (kolme kahtena kuoppaa) ja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Kahden viikon kuluttua solut kiinnitettiin metanolilla 20 minuutin ajan ja värjättiin sitten Giemsa 20 min. DDH

2O käytettiin solujen pesuun kolme kertaa, jolloin saatiin puhdas tausta. Pesäkkeiden lukumäärä ja solujen määrä kussakin pesäke laskettiin ja analysoitiin tilastollisesti (3). FCA: T24 soluja (1 x 10

6 solua /kuoppa) maljattiin kuuden hyvin kulttuuri ruokia lentiviruksen tartunnan LEN-

NDRG2

. Kolme ryhmää solut kerättiin 48 tunnin kuluttua, ja 72 vastaavasti ja lopuksi sentrifugoitiin ja kiinnitetään 95% etanolilla. Sen jälkeen kun oli inkuboitu yön yli 4 ° C: ssa, solut värjättiin 0,5% propidiumiodide (10 ui) läsnä ollessa 0,01% RNAasi A ja 0,1% Triton X-100, sitten mitattiin virtaussytometrillä.

(A ja B) Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä. Säätelyä

NDRG2

estää pesäkkeiden muodostumista. (C) Solu kasvukäyrät T24 solujen MTT-menetelmällä. Kaikki määritykset toistettiin toisistaan ​​riippumatta vähintään kolme kertaa. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD (* = p 0,001).

Muuttoliike ja Invasion Analyysit

Invasion määrityksessä Matrigel päällystetty kalvo ja migraatiokokeessa ilman matrigeelin kalvo suoritettiin käyttäen 24-kuoppaista Transwell lisää (8 um huokosia suodattimet, BD Biosciences, Bedford, MA), jotka suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eksponentiaalisen vaiheen solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen (2 x 10

5 solua /ml) seerumittomassa väliaineessa, sitten ympättiin ja suspendoitiin uudelleen 200 ul: elatusaineeseen ylemmässä kammiossa. Seuraavaksi elatusainetta 20% FBS: ää on sijoitettu pohjalle hyvin. Transwell-inkuboitiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 ilmakehässä yön yli. T24 Solujen annettiin kulkeutua huokoisen pohjaan kalvon. Inkuboinnin jälkeen solut pohjassa kalvon kiinnitettiin metanolilla 5 minuutin ajan ja värjättiin sitten Kristallviolet. Lukumäärä hyökkääviä soluja tai vaeltavien solujen määritettiin mikroskoopilla klo 400x suurennos kummallakin kalvolla ja laskettiin keskimääräinen lukumäärä solua kohti kentän. Kaikki määritykset toistettiin ainakin kolme kertaa itsenäisesti.

Kasvu inhiboitumismääritykset

Vivo

Kuusi viikkoa vanhoja BALB /c-nude-hiiriä ostettiin Shanghai Experimental animal Center, Shanghai, Kiina. LEN-

NDRG2

ryhmä ja LEN-Lacz ryhmä solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen 1 x PBS ja pitoisuus säädettiin 5 x 10

7 millilitrassa, 200 ui solu ratkaisu (1 x 10

7 solua) injektoitiin subkutaanisesti vasemman kyljissä nude-hiirissä. Hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään: LEN-

NDRG2

ja LEN-LacZ (n = 5 ryhmää kohden). Kun keskimääräinen koko ympättiin kasvaimet saavuttivat 300 mm

3 (laskettuna yhtälöllä: V [mm

3] = ab

2/2)

in vivo

, hiiret tapettiin katkaisemalla kaula ja kasvainten näytteet kerättiin, valokuvattiin ja mitattiin niiden määrät ja paino. Hiiret anatomized tarkistamaan oliko etäpesäke muihin elimen ja imusolmuke. Ilmaus

NDRG2

proteiinin ympättiin kasvainten nude-hiirten havaittiin Western blot. Muut merkkiaineita proteiinin ilmentyminen mitattiin myös, kuten solusykliä proteiini: cyclinD1, CDK4; apoptoosin proteiini: p21; Solujen migraation ja invaasion proteiini: MMP-2, MMP-9.

(A) T24cells tartunnan LEN-

NDRG2

lentivirukselle olivat ilmeisesti pidätettiin G0 /G1cycle. (B): n prosenttiosuudet apoptoottisten solujen LEN-

NDRG2

ryhmät olivat suurempia kuin muissa kahdessa ryhmässä (1-3). 48 h infektion jälkeen (4-6); 72 h infektion jälkeen; (1 ja 4) nollakoe (PBS); (2 ja 5) LEN-LacZ; (3 ja 6) LEN-

NDRG2

. Kaikki määritykset toistettiin toisistaan ​​riippumatta vähintään kolme kertaa. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD.

Group

NDRG2 (-) B NDRG2 (+) B

X

2

arvo

p arvo

normaali tissue312Bladder carcinoma59388.761 0.01Table 1. Expression of NDRG2 normaalissa virtsarakon kudosten ja virtsarakon syöpä kudoksiin.

CSV Download CSV

tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS17.0 ohjelmistoa (SPSS yritys, IN). Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe, jotka ovat peräisin vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Immunohistokemiaa erot ryhmien validoitiin käyttäen Chi-square testejä ja Pearsonin korrelaatiota. Varianssianalyysi (ANOVA), Student-Newman-Keuls (SNK) testit ja epäparametrinen testi suoritettiin sen määrittämiseksi, oliko eroja analyysitulokset

in vitro

ja

in vivo

määrityksissä.

P

-arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

taajuus positiivinen ilmaus

NDRG2

virtsarakon syöpä kudoksissa oli 39,17 % (38/97), joka oli alhaisempi kuin normaalissa virtsarakon kudoksissa (80%, 12/15), (χ

2 = 8,761,

P

0,01) (taulukko 1).

NDRG2

ilmaisua, sekä taajuus ja tasoilla, ei korreloi sukupuolen tai iän, mutta käänteisesti verrannollisia pathologic vaiheessa (r = -0,248,

P

0,05) (taulukko 2) . Immunohistokemia osoitti, että

NDRG2

proteiinin positiivista oli värjäämällä sytoplasmassa normaaleissa kudoksissa ja virtsarakon karsinooman (kuvio 1A). Ilmentymistasojen

NDRG2

virtsarakon syöpä oli korreloi käänteisesti c-Myc virtsarakon karsinooman (r = -0,454,

P

0,001) (kuvio 1 B).

(A) vaikutus

NDRG2

ilmentymisen vaikutus G1 solusyklin ja apoptoosisäätelijät analysoituna western blot. (B) suhteellinen kvantitointi proteiinin ilmentymisen, normalisoitu GAPDH tasolle. Kuvassa taipumus kunkin ryhmän kuten on osoitettu. Kaikki määritykset toistettiin toisistaan ​​riippumatta vähintään kolme kertaa. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD (** p 0,01) ..

kliinis

Expression taso NDRG2

r-arvo

p-arvo

Ominaisuudet –

+

++

+++

Sukupuoli 401173Female 1912500.320.759Age ≤60years231061 60 vuotta 361362- 0.0490.637Grade Papilloma10442Low22961High271020-0.2480.014Table 2. suhde ilmentymisen NDRG2 ja virtsarakon karsinooman ominaisuudet.

Tulokset esitetään n (näytteiden lukumäärä). Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin Pearsonin korrelaatiokerroin testi. CSV Lataa CSV

Sekä western blot ja Real-time PCR osoitti, että kaikki kolme BC solulinjoissa oli pienempi ekspressiotasot

NDRG2

proteiini ja mRNA kuin normaalin ihmisen virtsarakon soluja (SV-HUC-1). Niistä kolme BC solulinjat, T24-solut olivat pienimmät ekspressiotasot (kuvio 2A, B).

(A) Invasion analyysi T24 käsiteltyjen solujen LEN-

NDRG2

. Invaasio Kyky arvioitiin käyttäen TranswellTM päällystetty Matrigel. Invasiivisuus ja LEN-

NDRG2

ryhmä soluja oli huomattavasti pienempi kuin muissa kahdessa ryhmässä. ** P 0,001. (B) Migration analyysi T24 soluja käsiteltiin LEN-

NDRG2

. Siirtyminen Kyky arvioitiin käyttäen TranswellTM päällystämättömän kanssa Matrigeliä. Migraatio kyky LEN-

NDRG2

ryhmä soluja oli huomattavasti alhaisempi kuin muissa ryhmissä. ** P 0,001. (C ja D) Expression of MMP-2 ja MMP-9 mitattiin jälkeen T24 soluja infektoitiin LEN-

NDRG2

. LEN-

NDRG2

ryhmä vähensi MMP-2 ja MMP-9 ilmentymisen verrattuna muihin ryhmiin (** p 0.01).

Group

G0/G1

G2/M

S

Apoptosis

Control48h62.42±2.053.55±0.5534.03±1.655.53±0.6272h69.84±2.602.79±0.4427.73±0.905.57±0.59LEN-LacZ 48h48h64.24±1.923.56±0.5632.21±0.666.49±1.2572h69.63±2.403.08±0.4027.29±0.616.52±1.17LEN-NDRG2 48h48h71.40 ± 0.378.50 ± 0.4720.10 ± 0.3010.25 ± 2.4372h77.61 ± 0.997.05 ± 0.1515.34 ± 0.1712.88 ± 3.01Table 3. osuus Cell cycle vaiheen ja solujen indusoiman apoptoosin LEN- NDRG2 on T24-soluissa.

CSV Lataa CSV

(A) LEN-

NDRG2

tukahdutti kasvainten kasvua verrattuna LEN-LacZ. lisäksi unsuppressed kasvaimen kasvua, LEN-LacZ ryhmässä oli todettu imusolmukemetastaaseja. (B) kasvaimen kasvu käyriä. (C) tunnusluvut kasvaimen massojen hiiren massat eri ryhmissä. (D) massat kasvaimia kahdessa ryhmässä. käyrät ja histogrammit piirrettiin perustuvat keskiarvoihin ( n = 5) kahteen ryhmään. tulokset on esitetty keskiarvona ± SD (*, ** p 0,001).

on osoitettu fluoresenssimikroskopialla että infektion tehokkuudesta oli korkea olento yli 95% (kuvio 3A). Reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että mRNA: n ilmentymisen tasot

NDRG2

on LEN-

NDRG2

ryhmässä oli merkittävästi korkeampi kuin LEN-Lacz (negatiivinen ryhmä) ja CON ryhmät (

P

0,05) (kuvio 3B). Western blot-analyysi osoitti, että

NDRG2

proteiinipitoisuutta LEN-

NDRG2

ryhmässä oli suurempi kuin että LEN-Lacz ja CON ryhmiä (kuvio 3C). LEN-

NDRG2

aiheuttivat myös yli-ilmentyminen

NDRG2

in T24-soluissa. Solun kasvukäyrät ja pesäkkeiden muodostuminen osoitti, että yli-ilmentyminen

NDRG2

voi tukahduttaa kasvua T24-solujen enemmän kuin muissa kahdessa ryhmässä. Solussa kasvukäyrät määrityksissä, inhibitio alkoi kolmantena päivänä ja tuli ilmeisesti sen jälkeen (F≥44.58,

P

0,01) (kuvio 4). Kilpailuvirasto osoitti, että T24 soluja LEN-

NDRG2

voisi lisätä osuutta solujen G

0 /G

1 verrattuna LEN-LacZ ryhmien ja negatiivinen kontrolli, joka osoittaa, että ovexpression on

NDRG2

oli tehnyt T24 soluja pidättämään G1 syklin (48 h: F = 41.92,

P

0,01; 72 h: F = 24.11,

P

0,01). (Kuvio 5, taulukko 3.) western blot osoitti, että yli-ilmentyminen

NDRG2

vaimentua CDK4 ja cyclinD1, kun taas, sää- p21 T24-soluissa (kuva 6a, b).

(EN) vaikutus

NDRG2

yliekspressio solusyklin, apoptoosin ja etäpesäkkeiden sääntelyviranomaisten analysoituna western blot. (B) suhteellinen kvantitointi proteiinin ilmentymisen, normalisoitu GAPDH tasolle. Western blotit analysoitiin Kodak Digital Science yksiulotteinen ohjelmisto. Kuvassa taipumus kunkin ryhmän kuten on osoitettu. Kaikki määritykset toistettiin toisistaan ​​riippumatta vähintään kolme kertaa. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD (* p 0,01).

Transwell muuttoliike määritykset ja Matrigel-päällystetty transwell invaasio määritykset suoritettiin T24-soluissa. Edustava mikroskooppivalokuvat otettiin alapinnan transwell suodattimen, ja solut, jotka vaelsivat tai tunkeutuneet värjättiin Kristallviolet. Kuten kuviossa 7A, invasiivista potentiaalia, joka määritetään solujen kykyä hyökätä Matrigel este, oli myös merkittävästi vaimentaa

NDRG2

-overexpressing solut (

P

0,01 ). Lisäksi pakko ilmaus

NDRG2

in T24-soluissa merkittävästi tukahdutti muuttoliikkeen kautta Transvvell- (P 0,01) (kuvio 7B).

western blot määrityksissä verrattuna LEN-Lacz ryhmä ja tyhjä valvonnan ryhmä LEN-

NDRG2

voi estää MMP-2, MMP-9-proteiinin ekspressiotaso T24 solussa (kuvio 7C, D). MMP-2 ja MMP-9 olivat erittäin ilmaistaan ​​virtsarakon syövän etäpesäkkeitä, joten

NDRG2

todennäköisesti esti etäpesäkkeiden virtsarakon syövän säätelemällä MMP-2 ja MMP-9.

kasvaimen kasvukäyrät tehtiin mittaamalla kasvainten koon. Kaikki karvattomia hiiriä selvisi jälkeen injektiota lentiviruksen. T24-soluja injektoitiin 2 viikkoa myöhemmin, kasvaimen tilavuus kaksi ryhmää alkoi näkyä eri tavalla. Kolmesta viikosta, ero kasvaimen tilavuuden alkoi näkyä tilastollinen merkitsevyys (F≥31.65, p 0,001) (kuvio 8B). Verrattuna LEN-Lacz ryhmä, kasvaimen painoa LEN-

NDRG2

oli merkitsevästi kevyempiä (F≥39.82, p 0,001) (kuvio 8D). Suhde kasvaimen painon hiiri paino osoitti, että fyysinen kunto hiiristä LEN-

NDRG2

ryhmä oli paljon parempi kuin hiiret LEN-LacZ ryhmä (F = 39,81, p 0,001) (kuvio 8C), mikä osoittaa, että yli-ilmentyminen

NDRG2

voi tukahduttaa kasvainten kasvua. Kun anatomizing hiiret, ipsilateral imusolmukemetastaaseja näkyivät LEN-LacZ ryhmä, mutta ei muita elimiä olivat mukana; kuitenkin, että LEN-

NDRG2

ryhmä ei mitään metastaattista vaurio havaittiin (kuvio 8A). Western blot osoitti, että

NDRG2

proteiini säädelty kasvaimissa LEN-

NDRG2

ryhmä, ja että yliekspressio

NDRG2

vaimentua cyclinD1, CDK4, MMP-2, MMP-9; ja ilmen- tymisen lisääntymisen p21

in vivo

(kuvio 9A, B).

Keskustelu

Noin 75% kaikista virtsarakon syöpäpotilailla toistuu ensimmäisten 5 vuotta [14], tämä korkea toistumisen virtsarakon syövän ja sen merkittävistä metastaattinen potentiaali tehneet potilaiden hoidon ja ennusteen kannekelpoisia. Siksi lisätä varhaisen diagnoosin korko ja myös luoda uusia hoitomenetelmiä tarvitaan pikaisesti tutkimuksen kautta virtsarakon syöpään.

NDRG2

on ehdokkaana tuumorisuppressorigeeniä, ja joukko tutkimukset ovat vahvistaneet, että sillä on tärkeä rooli solujen lisääntymisen, apoptoosin ja etäpesäkkeiden [15,16]. Tuloksemme nykyisessä tutkimuksessa saadut virtsarakon syöpään tukevat näitä varhain havaintoja.

osoitti, että

NDRG2

tärkeä rooli virtsarakon syöpä, joka on samanlainen kuin sen rooli muut pahanlaatuiset kasvaimet. Immunohistokemia tulokset osoittivat, että positiivinen ilmentymistason

NDRG2

virtsarakon syöpä kudoksissa oli merkittävästi pienempi kuin normaalissa virtsarakon kudoksissa. Ilmentymistasojen

NDRG2

pieneni aste virtsarakon syöpä maligniteetti lisääntynyt. Olemme myös havainneet, että ilmaus

NDRG2

oli korreloi käänteisesti c-Myc, samanlainen kuin muissa kasvainsoluissa. Samaan aikaan

NDRG2

ekspressiotasot virtsarakon syövän solulinjoissa (T24, 5637 ja BIU-87) oli alhaisempi kuin normaalissa virtsarakossa solulinja (SV-HUC-1).

lentivirukset ovat olleet osoitettu olevan sopiva geeniterapiaan, koska ne voivat tasainen integroitua isäntäsolun genomiin antaa pitkäaikaisen ilmentymisen kohdegeenin lisäksi, lentivirukset on vahvistettu olevan asteittain turvallinen kehittämällä split midijärjestelmiä vektorin tuotannon estämiseksi sukupolven jakautumiskykyisten virus [17].

Tarkastus Liu et al. osoittivat, että

NDRG2

oli uusi kohdegeenin joka säätelee p53 ja

NDRG2

mRNA ja proteiini tasoja voi olla säädellään ylöspäin p53-riippuvainen tavalla. Ja he lisäksi kertoivat, että hiljentäminen

NDRG2

vaimentaa p53-välitteisen apoptoosin [18]. Samalla todettiin, että

NDRG2

voisi ajan säädellä p53 rintasyöpäsoluissa [19]. Nämä tiedot viittasivat vahvasti siihen, että

NDRG2

oli tärkeä säätelevä tekijä tuumorisolujen apoptoosin. Samaan aikaan, CDC20 on säännelty p53 estää pahanlaatuisten syöpäsolujen kasvua [20]. Sykliini D1 on tärkeä rooli solusyklin, sitoutuu sykliiniriippuvaisiin kinaasien (CDK4 /6), ja edistää fosforylaatiota RB1, orchestrating etenemisensä G1 rajoitus kohta [21].

NDRG2

voi säädellä ilmentymistä proteiinien (p21, cyclinD1 ja CDK4) virtsarakon syöpä soluihin ylössäätöä p53. Käytimme lentivirusta välittämää

NDRG2

yliekspression strategia inhiboimaan T24 soluja, edistää niiden apoptoosia sekä

in vitro

ja

in vivo

; Tämä mekanismi on demostracted säätelemällä ilmaus proteiinien p21, cyclinD1 ja CDK4, jotka ovat tärkeitä solujen apoptoosin ja sykli.

Viime aikoina useat raportit viittaavat siihen, että

NDRG2

voisi olla tärkeä rooli estymiseen tuumorimetastaasin. On todettu, että

NDRG2

voisi antagonisoida muuntavat factorβ1 välittämä kasvainsolun invaasiota nimenomaan alaspäin säätäminen ilmentymisen matriisimetalloproteinaasin 2 ja laminiini 332 koulutusjakson komponenttien samanaikaisen tukahduttaminen Rho GTPaasi toiminnan maksasolukarsinoomat [22 ]. MMP-2 ja MMP-9 oli korkea ekspressio lihaksissa-invasiivisia virtsarakon syövän ja metastasoituneen virtsarakon syövän [21,23]. Tässä tutkimuksessa western blot-määritys osoitti, että LEN-

NDRG2

in T24-soluissa liittyi vähentää merkittävästi MMP-9 ilmaisun ja laskee hieman MMP-2: n ilmentymisen viittaa siihen, että

NDRG2

-overexpression voi säätelemään MMP-2 ja MMP-9 ja estää hyökkäys kyky metastaattisen virtsarakon syövän soluissa. Tätä päätelmää tukevat sekä

in vivo

ja

in vitro

määrityksissä. Olemme epäillään, että ilmaus

NDRG2

merkittävästi vaimentaa MMP-2 ja MMP-9 säätelemällä NF-kB signalointi virtsarakon syövän solujen [24].

Yhteenvetona, olemme osoitti antioncogenic rooli

NDRG2

kehittämisessä ja hyökkäys virtsarakon syöpään. Koska

NDRG2

on osallisena monessa syövän etenemisen, kuten solun kasvussa, solusyklin säätelyssä, invaasio ja maahanmuutto, se edustaa lupaava terapeuttinen kohde virtsarakon syöpään. Kuitenkin enemmän tutkimuksia tarvitaan edelleen selvittämiseksi edelleen mekanismia

NDRG2

. Tutkimus tähän suuntaan lopulta tarjoavat uusia keinoja varhaisen diagnoosin, uusi hoito ja leikkauksen jälkeisen näyttöä virtsarakon syöpään.