Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mitokondrioiden fissio on prosessi, johon lohkaisu mitokondrioiden pilkkoutuvat pienemmiksi ja säätelee GTPaasi Dynamin liittyvä proteiini 1 (Drp1). Korkeammalla mitokondrioiden fissiotuotteiden liittyy apoptoosin syöpäsoluissa. Kuitenkin nykyisten menetelmien tarkasti mitata mitokondrioiden fissio, jotta voidaan verrata terapeuttisia jotka kohdistuvat tässä prosessissa ovat usein epäselviä tai tukeutua subjektiivisesta arvioinnista. Mitokondriot ovat myös alttiita aggregaation, jolloin tarkka analyysi vaikeaksi. Ohessa kuvataan parannettua lähestymistapaa kvantifiointiin mitokondrioiden pirstoutumisen osallistuu useita erot nykyisiä menetelmiä. Ensin solut altistetaan Sytologisten sentrifugoimalla, mikä vähentää solujen z-akselin korkeus ja hajoaa yksittäiset mitokondriot helpottaa havainnointia. Kolme kaupallisesti saatavilla fluoresenssin analyysityökaluja levitetään sitten yksikäsitteistänyt jäljellä mitokondrioiden klustereita, jotka vaativat vielä tarkastusta. Lopuksi, cut-off pisteytys on sovellettu, joka voidaan räätälöidä yksittäisen solun tyyppi. Tuloksena lähestymistapa mahdollistaa tehokkaan ja objektiivisen arvioinnin mitokondrioiden pirstoutumista hoitovasteen. Käytimme tätä tekniikkaa kokeellinen kysymys liittyy chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä (OVCA) soluja. Sisplatiini ja phytochemical piperlongumine havaittiin aiheuttaa sekä mitokondrioiden fissio- ja apoptoosin chemosensitive soluissa, kun taas vain piperlongumine pystyi saamaan aikaan nämä soluvasteita solunsalpaajaresistentti soluissa. Piperlongumine indusoiman apoptoosin näytti välittävän Drp1 riippuvainen mitokondrioiden fission koska apoptoottisen vasteen lievitti läsnäolo Drp1 inhibiittorin mDivi-1. Tutkimuksemme tarjoaa perustan entistä objektiivinen lähestymistapa kvantifiointia mitokondrioiden pirstoutumista, ja kuvataan tarkemmin on potentiaalinen vaikutusmekanismi varten piperlongumine hoidossa solunsalpaajaresistentti OVCA.

Citation: Farrand L, Kim JY, Im -Aram A, Suh JY, Lee HJ, Tsang BK (2013) parannettu Quantitative toimintamalli arviointi mitokondrio sirpaloitumisominaisuuksien solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 8 (9): e74008. doi: 10,1371 /journal.pone.0074008

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 toukokuu 2013; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2013; Julkaistu: 09 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Farrand et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia World Class University (WCU) ohjelma (R31-10056) kautta National Research Foundation Korean rahoittama opetus-, tiede- ja teknologia ja Kanadan Institutes of Health Research (MOP-119381). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mitokondrioita dynaamisia organelles useimmissa eukaryoottisoluissa, jotka käyvät läpi prosessit fissio (eriytettävä rakenteisiin) ja fuusio (sulautuvat kahden tai useamman vierekkäisen rakenteita). Fissio tiedetään ennen apoptoosin useissa solutyypeissä, ja sen ajatellaan helpottaa vapautuu nopeammin mitokondrioiden pro-apoptoottisia tekijöitä, kuten sytokromi c ja smac [1]. Kuitenkin tarkka määrällinen mitokondrioiden fissio on teknisesti haastavaa, koska pelkkä määrä läsnä monissa solutyypeissä, ja niiden morfologiset ominaisuudet. Solut tyypillisesti vaihtelevalla fissio riippuen solutyypistä ja ympäristötekijöiden [2].

Suurin osa nykyisistä lähestymistapoja mittaamiseen määrällisesti mitokondrioiden fissio ovat muunnelmia kaksi kattavia strategioita [2] – [7] . Ensimmäinen lähestymistapa edellyttää mittaamista pituuksien yksittäisten mitokondrioita asteen määrittämiseksi fissio [3] – [5]. Olemme havainneet, että yhdistämällä mitokondrioiden [6], [7], erityisesti kelauksen ja knotting rakenteiden [8], sekä suuri määrä mitokondrioiden fragmenttien kunkin solun sisällä tekee tästä lähestymistavasta epäkäytännöllisen ainakin joidenkin solutyyppien. Se ei myöskään ota huomioon 3-ulotteisen rakenteen mitokondriot soluissa, joka ei salli mittauksen pitkin z-akselin, jos yhden 2-ulotteinen kuva on käytetty. Toinen lähestymistapa vaatii subjektiivinen mitokondrioiden morfologia, ja vaatii operaattorin näyttää kuvat, joiden katsotaan edustavan solujen putkimainen tai hajanainen mitokondrioita (muita termejä käytetään kuvaamaan morfologia sisältää pitkänomainen, sulatettu, väli-, rytmittävät ja ”rakeinen”) . Kvantifiointi käyttämällä tätä lähestymistapaa perustuu olennaisesti mielipiteitä tarkkailija, ja jokainen solu on luokiteltu mukaan edustavan kuvan se muistuttaa enemmän [9] – [11]. Merkittävä huolenaihe soveltamisessa tämä tekniikka on sen riippuvuus subjektiiviseen päätöksestä, joka esittelee vaihtelua yksittäisten tarkkailijoita. Perinteinen immunosytokemiassa in Chambered aluksiin tuottaa myös kuvia, jotka sisältävät tyypillisesti vähintään joitakin mitokondriot, jotka ovat epätarkkoja aikana fluoresenssikuvantamisella, ja siksi epätäydellinen esitys koko näytteen.

Esillä olevan tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää parannettu kvantitomtimenetelmä aste mitokondrioiden pirstoutumista soluissa, ja soveltaa sitä verrataan vaikutus phytochemical piperlongumine mitokondrion fissioon chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpäsoluja

in vitro

. Vaikka määrällisesti mitokondrioiden pirstoutuminen olisi mahdollisesti selittää pienten mitokondrioiden palasia esiintyy johtuen synteesi uusia mitokondrioita ja pirstoutumisen aiheuttamat mitophagy yhdistettynä lisävalidointia käyttäen sopivia markkereita, tarkempi arvioita laajuutta mitokondrioiden fissio voidaan tehdä. Meidän menetelmässä Sytologisten sentrifugointia, joka kaappaa apoptoottisia ja terveitä soluja käyttäen 3-ulotteinen imaging (via konfokaali laser mikroskopian z-pinoaminen), ja tuottaa litistetty solujen hajallaan mitokondrioita, jotka on helpompi erottaa kuvantamisen aikana. Tapauksissa mitokondrioiden aggregaatiota, kolme kaupallisesti saatavilla ohjelmistoja (fluoresenssin voimakkuuden profilointi, Orthogonal leikkauksessa ja Heat Mapping) käytetään selkeyden vuoksi klustereiden ja tunnistaa numerot yksittäisten mitokondrioita. Lisäksi raja-pisteytystekniikkaa levitetään tehokkaammin arvioida solujen olevan joko hajanaista tai putkimainen.

pyrki osoittamaan käytännön soveltaminen uuden lähestymistavan, käyttämällä sitä tutkia roolia mitokondrion fissio in solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä (OVCA). Kestävyys CDDP (sisplatiini: cis-diamminedichloroplatinum (II)) munasarjasyövän on merkittävä este onnistuneen hoidon [12]. Vaikka osallistuminen mitokondriot kaspaasi-välitteistä apoptoosia on tutkittu laajasti, rooli mitokondrioiden morfologian chemoresistance vielä täysin ymmärretä. Piperlongumine on luonnollinen ainesosa Long Pepper (

Piper longum

L.) ja on raportoitu olevan useita bioaktiivisia vaikutuksia myös trombosyyttiaggregaation esto [13], downregulation androgeenireseptoreita [14] ja laaja vaikutuksia vastaan ​​erilaisia ​​solunsalpaajaresistentti syöpäsolutyyppien indusoimalla reaktiivisia happiradikaaleja [15]. Olemme hakeneet edellä kuvattu kvantitatiivinen tapa verrata vaikutuksia CDDP ja piperlongumine mitokondrion fissio ja apoptoosin chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti OVCA solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

CDDP ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Piperlongumine ostettiin Tocris Bioscience (Bristol, UK). Anti-GAPDH, anti-Drp1 ja anti-fosfo-Drp1 (Ser637) vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling Technology (Beverly, CA, USA). Anti-TOM20 vasta-aine oli Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Alexa Fluor® 488 sekundäärinen vasta-aine, TEMED, RPMI 1640 media, naudan sikiön seerumia ja pidentää Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Reagent DAPI olivat Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Kaikki vasta-aineet laimennettiin Dako Antibody Laimennin (Dako # s0809) Agilent Technologies (Glostrup, Tanska). Täydellinen Mini proteaasiestäjäseostabletit tabletit ja PhosStop fosfataasinestäjällä cocktail tabletteja saatiin Roche Applied Sciences (Penzberg, Saksa).

Solulinjat ja kulttuurin

CDDP-herkän ihmisen OVCA solulinja (OV2008) [16] ja sen kestävä vastine (C13 *) [17] olivat lahjoja Tohtorit Rakesh Goel ja Barbara Vanderhyden (Ottawa Hospital Cancer Center, Ottawa, ON, Kanada), ja viljeltiin kuten aiemmin raportoitu [18]. Ne ovat munasarjojen endomet- adenokarsinooma alkuperää levyepiteelikarsinooma erilaistumista.

anneksiini V apoptoosimäärityksessä

OVCA solut värjättiin FITC-konjugoidulla anneksiini V (Bioline, Lontoo, Iso-Britannia) ja propidiumjodidin määrittämään osa soluista, jotka olivat alussa ja lopussa vaiheissa apoptoosin [19]. Värjätyt solut analysoitiin sitten käyttäen BD FACSCalibur -virtaussytometrillä (BD Biosciences) ja CellQuest /ModFit ohjelmisto.

immunoblottauksella ja Immunofluoresenssimikroskopia

Immunoblottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Band tiheydet analysoitiin ja kvantitoitiin käyttäen BioRad ChemiDoc XRS + ja Image Lab V3.0 (Hercules, CA, USA). OV2008 solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 8-Kaivokammio dioja, inkuboitiin asianmukaisten fluoresenssi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita ja värjättiin pidentää Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Reagent DAPI (sininen, tumaväriä). Ne kuvattiin välittömästi Zeiss LSM700 konfokaalinen varustettu Zeiss T-PMT digitaalikamera (Zeiss, Oberkochen, Saksa).

Sytologinen Sentrifugointi ja kiinnitys Solujen

Solut ympättiin varten 12 h RPMI-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää 6-kuoppaisille levyille. Hoidon jälkeen Testi aineita, ne otettiin talteen sen jälkeen, kun 2 minuutin inkuboinnin 0,025% trypsiiniä (200 ui) kanssa 37 ° C: ssa. Trypsinoimalla suoritettiin nopeasti minimoimiseksi mitokondriovaurioita ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 10% FBS: ää RPMI 1640-solut pestiin varovasti 1 ml: lla PBS: ää (900 x

g

, 1 min; kaikki PBS suodatettiin 0,45 mikrometrin ruiskun suodatin, Sartorius Biotechnology, Göttingen, Saksa) ja solupelletti huolellisesti suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan tuoretta PBS: ää. Viisikymmentä mikrolitraa suspensiota sentrifugoitiin (900 x

g

, 4 min) käyttäen Sytologisten kanavat yhdessä silaanilla päällystettyjä lasilevyjä ja Whatman suodatinpaperin (Hanil Science Cytospin Sytologisten sentrifugin, Daejeon, Korea). Sitten solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 4 ° C: ssa 24 tuntia. Sitten ne pestiin (3 x 5 min) PBS: ssä, varovasti sekoittaen, läpäiseviksi 0,02% Triton-X laimennettu PBS (inkuboitiin 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa), ja altistetaan toiselle PBS pesun (3 x 5 min). Soluja inkuboitiin TOM20 (mitokondrion tuonti reseptorin alayksikköä) vasta-aineen (1:250, 24 h, 4 ° C), pestiin PBS: llä ja inkuboitiin Alexa Fluor® 488 sekundaarisen vasta-aineen (huoneenlämmössä, 1 tunti). Sitten solut pestiin PBS: ssa ennen kiinnitystä peitelasilla käyttäen pidentää Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Reagent DAPI, ja konfokaali kuvantaminen aloitetaan välittömästi.

kvantifiointi mitokondrio Fissio

Kun Sytologisten Sentrifugoinnin kiinnitys ja immunovärjäyksen solut, 3-ulotteinen kuvaa yksittäisten solujen saatiin käyttäen konfokaalimikroskopialla päällekkäin vähintään 12 poikkileikkauksen otettuja kuvia välein pitkin Z-akselia, ja joka kattaa koko solun tilavuus. Standard valotusasetukset mukana pikseli viipymäajan on 50 mikrosekuntia ja kentän mitat 300 x 300 mikrometriä. Vähintään 100 solua per hoitoryhmä arvioitiin mitokondrioiden fissioon kussakin toistossa, jossa johdettujen tilastojen kolme riippumatonta rinnakkaista. Kukin yksittäinen solu analysoitiin luokiteltiin joko hajanaista tai ei-hajanaiset mukaisesti, onko se täyttänyt cut-off pisteet 8. Solut, jotka täyttivät määritelmä hajanaisia, siis sisälsivät 8 tai useamman yksittäisen mitokondrion fragmentteja, jotka olivat kukin 3 mikrometriä pituus pisimmästä akselilla. Tapauksissa epäselvyys johtuu yhdistäminen mitokondriot, kolme kaupallisesti saatavilla ohjelmistotyökaluja sisältyvät Zeiss LSM ohjelmistopaketti (fluoresenssin voimakkuuden profilointi, Orthogonal leikkausnopeudesta ja Heat Mapping) käytettiin ratkaista epävarmuustekijöitä. Fluoresenssi Intensity Profilointi mahdollistaa havaitsemisen fluoresoivasti leimattua mitokondrioiden rajoja (merkitty TOM20), sellaisena kuin se ilmenee teräviä nousee tai laskee fluoresenssin intensiteetti [20]. Operaattori piirtää suoran viivan kautta tahansa alueen kuvan, ja automaattisen kuvaaja fluoresenssin voimakkuutta on rakennettu. Orthogonal leikkausnopeudesta mahdollistaa minkä tahansa alueen kuvan tarkastettava peräisin x- tai y-akselin point-of-view (POV). Tämä luo virtuaalisen poikkileikkauksen näkökulmasta ja antaa tietoa mitokondriaalisen rajoja, jotka normaalisti peitettynä katsottaessa perinteisestä ylhäältä alaspäin POV. Heat Mapping väri-koodit kaikki loisteputki esineitä 3-ulotteinen kuva asennon mukaan esineen pitkin z-akselia. Visualisoinnissa mitokondriot, työkalu on eniten hyötyä erottamista toisistaan ​​mitokondrioita, jotka sijaitsevat vastakkaisilla puolilla ytimen (ja muutoin esiintyvät yksikössä mitokondrioita). Useimmissa tapauksissa nämä työkalut ei tarvittu tunnistamaan hajanainen mitokondrioita, kuten Sytologisten sentrifugoimalla hajottivat soluelimiin helpottaa näkemistä. Mitokondrioiden morfologia vähintään 80 solua per hoitoryhmä määritettiin, jossa sokko tarkkailija identiteetin hoitoryhmissä. Kvantitatiivinen olivat peräisin kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Tilastollinen analyysi suoritettiin yksisuuntainen, kaksisuuntainen tai kolmitie varianssianalyysi käyttäen SigmaPlot ohjelmistoa (versiot 12; Systat Software, Chicago, IL, USA). Erot useiden koeryhmään määritettiin Bonferronin post-hoc-testi. Tilastollinen merkittävyys päätellä osoitteessa

p

0,05.

Tulokset

Sytologinen Sentrifugointi Parantaa Mitokondrioiden Imaging lisäämällä erottavan väliset etäisyydet Yksittäiset Mitochondria

Ensimmäinen verrattiin sytologisten sentrifugaatiolla konfokaali kuvanlaatu mitokondrioita. Optimointi paljasti, että ihanteellinen roottori asetukset Sytologisten sentrifugin kuvantamiseen OV2008 solujen sisältyi 900 x g spin 4 minuuttia. Kaikki seuraavat kokeet toteutettiin käyttäen näitä asetuksia. Ilman sentrifugoinnin, mitokondriot havaittiin yhdistää tiiviisti tumaan ja curl kohti kulma katselu linssin (kuva 1, kuva S1A). Side profilointi soluja ilman sentrifugoimalla paljasti suuren z-akselin korkeus on vähintään 8 mikrometriä, jolloin yksittäiset eroa erillisten mitokondrioita vaikeaa. Kun sisällyttäminen sentrifugointivaiheessa, mitokondriot erotettiin edelleen tumasta, ja lisääntynyt etäisyydet syntyi yksittäisten mitokondrioita. Sentrifugoitiin solujen esiin alentuneen z-akselin korkeus on noin 3 mikrometriä, jolloin helpommin havainto yksittäisten mitokondrioiden rakenteiden (kuvio 1 B, kuviot S1B-C). Vertailu kuvanlaadun ja ilman sentrifugoinnin ja samoilla kuvantamisen asetuksia, paljasti, että sentrifugointi parantaneet selkeyttä mitokondrioiden piirteitä (kuvio 1 C). Tämä johtui osittain siitä, että ilman Sentrifugoinnin loisteputki kuvien mukana korkeampi ”out-of-keskittyä” taustan fluoresenssi (esim. Alkaen mitokondrion jotka eivät olleet selvästi näkyvissä z-akselin tasossa, jossa kuva otettiin). Sentrifugointi parantaa kuvan tarkennusta tasoittamalla solu ominaisuudet samassa polttotasoilmiöksi.

(A) 3-ulotteinen ylhäältä ja sivulta profiileja käsittelemättömien OV2008 solujen kanssa ja ilman sytologiseen sentrifugoimalla ennen kiinnittämistä. Keltainen nuolet osoittavat tyypillisiä erottamista välillä näkyviä mitokondrioita sentrifugoinnin jälkeen. (B) Orthogonal osissa samat kuvat nähdään (A) otetaan identtisillä kameran valotuksen asetuksia. Solut kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä ja värjättiin ydin- (DAPI, sininen) ja mitokondrioiden (TOM20, vihreä) signaali. (C) Vertailu mitokondrioiden kuvanlaadun tavanomaisten immunosytokemian ja sytologiseen sentrifugoimalla lähestymistapoja. Kuvia klassisen putkimainen ja hajanainen mitokondrioiden morfologia muuttuu näkyvästi terävämpi sentrifugoinnin jälkeen johtuen minimointiin fluoresenssin peräisin tausta lähteistä kuin polttotasoilmiöksi. Laajentuminen tuman jälkeistä sentrifugointia johtuu litistyminen solujen keskihakuisvoiman. Mittaviivat = 5 mikrometriä.

fluoresenssivoimakkuus profilointi, Orthogonal leikkausnopeudesta ja Heat Mapping työkalut sallivat nopean Erottelu Yksittäiset mitokondrio Fragments sisällä Kiviaines

huomata, että vaikka sentrifugointivaihe parantanut kyky erottaa mitokondriot, joissakin tapauksissa yhdistäminen mitokondrioiden ilmestyi väistämätöntä huolimatta pyrkimyksiä ratkaista ongelman. Otimme kolme fluoresenssi analyysityökaluja (fluoresenssin voimakkuuden profilointi, Orthogonal leikkausnopeudesta ja Heat Mapping) täydentämään määrällistä mitokondrioiden läsnä aggregaatteja. Nämä työkalut tarjoavat enemmän tietoa paikkatietojen suuntautumisen mitokondrioiden kalvot, jolloin täsmennyssivulta fluoresoivien signaalin, joka voi muuten tuntua sekavalta. Fluoresenssi Intensity Profilointi (Zeiss LSM ohjelmistopaketti) on työkalu normaalisti käytetään määrittämään signaali-tausta suhteet eri fluoresoiva kuvan eri alueilla [20]. Tämä työkalu voidaan vaihtoehtoisesti käyttää määrittämään useita yksittäisiä mitokondriot aggregaatin, kuten fluoresenssin voimakkuus on suoraan verrannollinen mitokondrioiden kalvot. Avoimien peittokuvat, mitokondrioiden määrä voidaan ekstrapoloida suurissa ryhmissä yksinkertaisella jako piikin signaalin fluoresenssin voimakkuus on saatu yhdestä mitokondrioissa (kuvio 2A). Lämpö Mapping antaa tietoja z-akselin mitokondrion paikoissa käyttäen värikoodattu spektrin (kuvio 2B, kuviot S2A-C) [21]. Mitokondriot, jotka ovat päällekkäin tai litteä takana tai edessä tumassa voidaan helposti tunnistaa niiden värin tehtävän. Lopuksi, Orthogonal leikkausnopeudesta (Zeiss LSM) tarjoaa poikkileikkausnäkymiä tahansa x-y sijainti näkökulmasta kohtisuorassa z-akselia, jolloin tiivis tarkastus mitokondriaalisen rajoja, joka muuten olisi peitettynä perinteisestä ylhäältä alaspäin näkymä (kuvio 2C). Riittävän korkea resoluutio, ja optimaalinen laajeneminen sytoplasman kautta sentrifugoinnista huomasimme, että nämä fluoresenssia työkaluja tarvitaan vain 10% tapauksista, joissa päätös ei päästy takia epäsäännöllinen mitokondrioiden aggregaatiota. Tehokas käyttö nämä työkalut ovat riippuvaisia ​​useita oletuksia, että esimerkiksi kaikki mitokondriot yhteenlaskettuina ovat yhtä värjätään, että fluoresoiva signaali on riittävän signaalikohinasuhteen ja että mitokondrioiden kalvot ovat erotettavissa vastaavia muutoksia fluoresenssisignaalissa.

(a) Fluoresenssin intensiteetti profilointi yhden solun hajanainen mitokondrioita. Intensiteetti mitokondrion signaalin lineaarisen profiilin valitsema operaattori (vaaleansininen nuoli) on edustettuna kvantitatiivisesti. (I) Emission huippu yhden mitokondrioissa osoitetaan graafisesti, (keltainen nuoli). (Ii) Erillään mitokondriot ovat ilmeisiä itsenäisinä huiput. (Iii) korkea-piikit (keltainen nuoli) viittaavat siihen, että läsnä on useita mitokondrioita, päällekkäin sentrifugoinnin aikana. 3D-kuvadatan kerrostunut läpinäkyvästi, yksittäisten mitokondrioiden määrä on suoraan verrannollinen fluoresenssin voimakkuus. (B) Heat kartoitus yhden solun käsiteltiin CDDP (10 uM, 12 h). Erot z-akselin sijainti arvot mitokondrioiden fragmentit edustettuina värejä. (I) suurennus (keltainen laatikko) paljastaa erillistä mitokondrioita eri z-akselin korkeus (vihreä vs. oranssi). (Ii) käänteisfaasi-kuva samasta solun (i), mikä osoittaa edelleen yksittäisiä fragmentteja (syaani vs sininen, keltainen nuoli). (C) Orthogonal jakso työkalu esittää poikkileikkauksia yhden solun pitkin y- akselin (upotettavat pilkullinen keltainen laatikko, suurennettu vihreänä laatikko) ja x-akselin (entisestään, kun punainen laatikko). Y. (i) suurennus (vihreän laatikon) y-akselin kohtisuora osuus. (Ii) suurennus (punainen laatikko) x-akselin kohtisuora osuus. Keltainen nuolet osoittavat tilat erottaa yksittäisiä mitokondrioita.

soveltaminen Cut-off Tulospalvelu Mahdollistaa erotteleminen sisältävät solut eriasteisia mitokondrio Fissio

Vaikka on mahdollista määrittää täsmällisesti mitokondrioiden määrä missä tahansa tietyssä solussa, se on aikaa vievää ja hankalaa, jos arvioidaan suuri määrä soluja. Seuraavaksi me keksineet puolikvantitatiivinen lähestymistapa tehokkaamman ja vähemmän työvoimavaltaista arvioida kuvien. Me eteni arvioimalla mitokondrioiden fenotyypin (putkimainen tai hajanaiset) perustuva cut-off pisteet määritelty vähimmäismäärä mitokondrion fragmentteja tietyksi läsnä jokaisessa solussa. Ankaruutta luokittelu määräytyy cut-off pisteet valitaan (kuva 3). Jos 8 tai enemmän mitokondriot, jotka olivat kukin lyhyempiä kuin 3 mikrometriä pitkiä havaittiin kaikkialla solussa, koko solun täyttäisi ”hajanaista”. Kriteerien täyttymistä tekee edelleen arvioida jäljellä mitokondrioiden tarpeeton (kuvassa 3).

Kuvassa kolme solua vaihtelevalla fissio. (I) cut-off pisteet 2 (tulos on ”kyllä”, jos 2 tai useampi mitokondrio-fragmentit todetaan jotka ovat 3 mikrometrin pituisia pisimmästä akseli) asettaa kaikki 3 solutyyppejä samaan luokkaan. (Ii) cut-off pisteet nostettiin 5 erottaa Cell erilaisina soluihin B ja C (a luokittelukriteeri Cell nimellä ”putkimainen”) (c) cut-off pisteet 10 paikkaa Solut ja B samaan ryhmään, erotuksena Cell C. useamman kuin yhden cut-off pisteet mahdollistaa eron eriasteisia mitokondrioiden fissio.

Kemosensitiivisyys CDDP ja Piperlongumine liittyy mitokondrioiden fissio

seuraava soveltaa tätä tekniikkaa tutkia vaikutuksen piperlongumine ja CDDP (0 ja 10 uM, 12 h) mitokondrion fissioon chemosensitive (OV2008) ja solunsalpaajaresistentti (C13) OVCA soluja (kuva 4). Molemmat yhdisteet aiheutti nousua mitokondrioiden fissio ja apoptoosin pitoisuudesta riippuvalla tavalla OV2008. Kuitenkin vain piperlongumine oli sama vaikutus C13, mikä viittaa siihen, että viimeksi mainittu ei ainoastaan ​​edistää apoptoosia vaan myös indusoi mitokondrioiden fissioon solunsalpaajaresistentti OVCA soluissa. Vähintään 100 solua per hoitoryhmä arvioitiin mitokondrioiden fissioon kussakin rinnakkaisnäytteessä, jossa johdettujen tilastojen kolme riippumatonta rinnakkaista.

(A) Kuvat ovat putkimaisia ​​ja hajanainen mitokondriot chemosensitive soluissa (OV2008) ja niiden kestävä kollegansa (C13). Mitokondrioita ja tumat värjättiin TOM20 (vihreä) ja DAPI (sininen), tässä järjestyksessä. (B) vaikutus piperlongumine ja CDDP mitokondrion fissioon OV2008 ja C13-solut, arvioituna yhdellä cut-off pisteet 8 (sisältävien solujen 8 tai useamman mitokondrion fragmentteja 3 mikrometriä pitkiä luokiteltiin ottaa hajanaiset mitokondrioita). (C) vaikutus CDDP ja piperlongumine apoptoosiin, joka arvioidaan anneksiini V määrityksellä (*,

p

0,05; **,

p

0,01; ***,

p

0,001 verrattuna vastaaviin käsittelemätön kontrolli).

CDDP ja Piperlongumine aiheuttama mitokondrioiden fissio- ja Apoptosis ovat Drp1 riippuvaista Chemosensitive OVCA

vastauksena erilaisiin solutyyppeihin stressi, Drp1 aktivoidaan defosforylointia Ser637. Tämän jälkeen sen rekrytointia mitokondriot, jossa se oligomerizes tarjoamaan mekaanisen lujuuden tarvitaan fissioon esiintyy [22]. Oletimme, että jos Drp1 riippuva mitokondrion fissio on määräävä tekijä chemosensitive vasteen, sekä CDDP ja piperlongumine hoito tulisi johtaa defosforyloitumista Drp1. Tämä oli todellakin tapahtunut OV2008 soluissa (kuvio 5A). Vielä tärkeämpää on, hoito OV2008-solujen farmakologisesti estäjä Drp1, mDivi-1, vaimensi merkittävästi sekä mitokondrioiden ydinfission ja indusoiman apoptoosin kahden yhdisteen (kuvio 5B). Tämä data tukee kausaalinen yhteys fissio ja apoptoosin. Vähintään 100 solua per hoitoryhmä arvioitiin mitokondrioiden fissioon kussakin rinnakkaisnäytteessä, jossa johdettujen tilastojen kolme riippumatonta rinnakkaista.

(A) CDDP (10 uM) ja piperlongumine (10 uM) alassäädetty fosfo -Drp1 (Ser637) pitoisuus OV2008 soluissa

in vitro

. (B) (i) vaikutus mDivi-1 (0-10 uM) on CDDP- ja piperlongumine aiheuttama mitokondrioiden fissio ja (ii) apoptoosin arvioimana anneksiini V määrityksellä (**,

p

0,01; ***,

p

0,001 verrattuna vastaaviin DMSO ohjaus käsitelty sama mDivi-1 pitoisuus, #,

p

0,05 verrattuna vastaaviin PL tai CDDP hoidon puuttuessa mDivi-1).

Drp1 riippuvainen mitokondrioiden fissio on määräävä Piperlongumine aiheuttama apoptoosi solunsalpaajaresistentti OVCA

aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että mitokondrion halkaiseminen liittyy kemosensitiivisyys, kun taas CDDP vastus on merkitty puute tällaisen toiminnan (kuva 4). Meidän vieressä pyrittiin määrittämään, onko piperlongumine aiheutti apoptoosin solunsalpaajaresistentti C13 * soluihin Drp1 riippuvan mitokondrioiden fissio. Pitoisuus-vaste-analyysi osoitti, että piperlongumine, mutta ei CDDP, indusoi defosforylaatiota Drp1 at Ser637 (kuvio 6A). Lisäksi on Drp1-inhibiittori mDivi-1 osittain myös heikennetyn piperlongumine aiheuttamaa mitokondrioiden fission ja apoptoosia (kuvio 6B). Vähintään 100 solua per hoitoryhmä arvioitiin mitokondrioiden fissioon kussakin rinnakkaisnäytteessä, jossa johdettujen tilastojen kolme riippumatonta rinnakkaista.

(A) Piperlongumine muttei CDDP (0-10 uM) down-regulation fosfo-Drp1 (Ser637) pitoisuus. (B) (i) vaikutus mDivi-1 (0-10 uM) on piperlongumine aiheuttama mitokondrioiden fissio ja (ii) apoptoosin, joka arvioidaan anneksiini V määrityksellä (**, p 0,01; ***, p 0,001 versus vastaavaan DMSO ohjaus käsitelty sama mDivi-1 pitoisuus, #,

p

0,05; ##,

p

0,01, ###,

p

0,001 verrattuna vastaavaan PL tai CDDP hoidon puuttuessa mDivi-1).).

keskustelu

Vaikka määrällisesti mitokondrion fissio on toteutettu useita hyvin suunniteltu tutkimusten kuvaukset julkaistun lähestymistavat ovat hiukan epäselvä ja subjektiivinen [2] – [7]. Toteamme kaksi suuria vaikeuksia tarkasti määrällisesti fissio. Ensimmäinen on aggregaatio mitokondriot, erityisesti tuman ympärillä, joka tekee eron erillisten organelles vaikeaa. Toinen on aika, joka kuluu määrällisesti mitokondriot, vaikka kaikki yksittäiset fragmentit voidaan erottaa käyttämällä kehittyneitä 3-ulotteinen kartoitus tekniikoita.

Olemme tietoisia, että on olemassa useita julkaistuja automatisoituja menetelmiä, jotka olemme tutkineet ja todettu mielenkiintoinen. Uskomme kuitenkin, että nämä menetelmät vaativat laajoja taustatietoja laskennallisen algoritmeja, jotta voidaan hyödyntää tehokkaasti. Yksi menetelmä käyttää automaattisia loisteputki sykkivä 30 Hz ja työllistymistä tietokoneavusteinen analyysi [23]. Meidän yrittää ohjeiden tarjoamia tutkijat, löysimme huomattavia vaikeuksia tulkita useita ohjeita, jotka edellyttävät huomattavaa taustatietoa, ja voineet saada aikaan mitään merkityksellistä tietoa. Sukupolvi synteettistä binary kuvan kuin testi malli edellyttää myös laajaa tuntemusta asianmukaisen mitat mitokondriot jokaisessa solussa tyyppi, vaatimus ei tarvita lähestymistapamme.

Toinen mielenkiintoinen laskennallinen lähestymistapa [24] sisältää automatisoituja alatyypitys mitokondrioiden morfologia. Olemme myös yrittäneet palkata microp ohjelmiston kirjoittanut kirjoittajat meidän kokeellisen tarpeisiin, mutta se oli samalla erittäin vaikeaa meille oppia johtuen teknisistä (laskennallinen tieto) tarvitaan. Mikro edellyttää, että käyttäjä onnistuneesti kalibroida ohjelmisto ennen käyttöä.

Tässä tutkimuksessa olemme käsitelleet yhdistäminen soveltamalla Sytologisten sentrifugointivaiheen joka litistää solulimassa tasoa pitkin luistin ja tekee eron yksittäisten mitokondrioiden huomattavasti helpompaa. Kysymys Aikarajoitteiden käsiteltiin soveltamalla cut-off pisteytys mahdollistaa vähemmän työvoimavaltaisia ​​luokittelun mitokondrioiden fenotyyppejä. Vaikka tarkin menetelmä kvantifiointiin fissio olisi ehdoton lasken kokonaismäärästä yksittäisiä fragmentteja, tarvittava aika tekee tästä lähestymistavasta epäkäytännöllinen, erityisesti tutkimuksia, jossa on suuri otoskoko. Meidän Ehdotettu lähestymistapa mahdollistaa hankintaan mitokondrioiden fissio tietojen verrattavissa tarvitaan ennen tutkimuksen malleja [2] – [7], mutta tarkempia ohjeita riippumattomien toistettavuutta. Katsaus uuteen lähestymistapaan on esitetty kuvassa 7.

Vaikka lähestymistapamme tarjoaa selviä etuja, me myös huomata useita mahdollisia sudenkuoppia. Monimuotoisuus mitokondrioiden morfologian poikki solutyyppejä on merkittävä ja saattaa vaatia hienosäätö ja validointi protokollaa. Esimerkiksi jotkut solutyypit voi olla suuri määrä mitokondrioita ja suhteellisesti vähemmän määrä sytoplasmassa. Tällaisissa tapauksissa, huolellinen optimointi sentrifugin vaiheen ja suurempi määrä z-akselin kuvaa solua kohti voi olla tarpeen. Korkeampi sentrifugia nopeudet parantaa mitokondrioiden hajonta, mutta voi myös edistää repeämään ytimen (kuvassa S3). Olemme myös yrittäneet käyttää lähestymistapaa

in vivo

OVCA kasvainnäytteestä värjättiin TOM20, ja totesi, että kyvyttömyys sentrifugoidaan kiinteiden kasvainten yhdistettynä liialliseen epäspesifisen taustan signaali tehnyt mahdotonta.