Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tällä hetkellä ei molekyyli kohdennettuja hoitoon pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) kaltaisia ​​käytetään menestyksellisesti vastaan ​​ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Tämä epäonnistuminen johtuu meidän kyvyttömyys tunnistaa kliinisesti relevantti alatyyppejä tämän taudin. Siten järjestelmällisempi lähestymistapa lääkekehityksen varten SCLC tarvitaan. Tältä osin kaksi kattavia tutkimuksia äskettäin julkaistu

Nature of the Cancer Cell Line Encyclopedia ja Cancer Genome Project, tarjoavat runsaasti tietoja, jotka koskevat lääkeaineen herkkyys ja genomista profiileja monia erilaisia ​​syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa olemme louhitaan nämä kaksi tutkimusta varten uusia terapeuttisia aineita SCLC ja tunnistettu lämpösokkiproteiinit, sykliiniriippuvainen kinaasien ja polo kaltaiset kinaasit (PLK) houkuttelevina molekyylikohteista vähän nykyisen kliinisen tutkimuksen toiminnan SCLC. Merkillistä, meidän analyysit osoittivat, että useimmat SCLC solulinjojen ryhmittyneet yhdeksi, hallitseva alaryhmä joko geenin ilmentymisen tai CNV analyysejä, mikä johtaa meidät ottamaan farmakogenomiset lähestymistapa tunnistaa alaryhmiä huumeisiin herkkien SCLC-soluja. Käyttäen PLK inhibiittorit esimerkkinä tunnistimme ja validoitu geeni allekirjoituksen huumeiden herkkyyden SCLC solulinjoissa. Tämä geeni allekirjoitus voi erottaa osapopulaatioiden joukossa ihmisen SCLC kasvaimissa, mikä viittaa sen potentiaalia kliinistä hyötyä. Lopuksi circos tontteja rakennettiin antamaan kattavan kuvan siitä, miten transkription, kopiomäärä ja mutaatiostatuksesta tekijät vaikuttavat PLK herkkyyttä SCLC solulinjoissa. Yhdessä tutkimuksessa hahmotellaan lähestymistapa ennustaa huumeiden herkkyyttä SCLC uusia kohdennettuja terapeuttisia.

Citation: Wildey G, Chen Y, paaston I Stetson L, Pink J, Barnholtz-Sloan JS, et al. (2014) farmakogenominen lähestymistapa tunnistaa Drug Herkkyys Small keuhkosyöpä. PLoS ONE 9 (9): e106784. doi: 10,1371 /journal.pone.0106784

Editor: Gagan Deep, University of Colorado Denver, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 28, 2014; Hyväksytty: 31 heinäkuu 2014; Julkaistu: 08 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Wildey et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: tukemana avustuksia yliopistollisen sairaalan Seidman Cancer Center ja National Cancer Institute U01 CA062502 (GW, AD), translationaalinen Research Core Facility (IL , JP) ja Biostatistiikka Bioinformatics Core Facility (YC, JSB-S) Case Kattava Cancer Center (National Cancer Institute P30 CA043703), ja National Science Foundation Graduate Research -jäsenyysohjelma (LS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) edustaa 15% kaikista keuhkojen karsinoomat ja diagnosoidaan tyypillisesti silloin, kun tauti on metastasized [1], [2]. Valitettavasti on ollut vain vähäisiä parannuksia hoidon taso SCLC kolmen viime vuosikymmenen ajan [3] – [5]. Tällä hetkellä ei ole molekyyli kohdennettuja hoitoon SCLC samanlaisia ​​kuin käytetty menestyksekkäästi vastaan ​​ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), kuten erlotinibi kohdentaminen mutantti-EGFR tai crizotinib kohdentamisessa EML4-ALK fuusioproteiinit [6], [7] . Leikkaus on harvoin suoritetaan tämän taudin (vain 1% tapauksista), rajoittamalla saatavuutta kasvainkudoksen kattavaksi genomista analyysejä. Lisäksi nämä kaksi uraauurtava genomiikan hiljattain julkaistuissa tutkimuksissa SCLC ovat tuottaneet vain vähän terapeuttista käsityksen tämän taudin ja ovat pääasiassa analysoitu harvinainen SCLC voida leikata, mikä ei edusta klassista, laajalti metastaattisen SCLC näkyvillä arjen kliinisessä käytännössä [8] [9].

erilainen lähestymistapa huumeiden löytö SCLC on tarpeen, mikä voi olla kaivostoiminnan saatavilla tietokantojen lääkeherkkyyksiä SCLC solulinjoissa. Toisin sanoen, kuten useimmat SCLC solut ovat peräisin metastaasien tai Pleuraeffuusiot, ne voivat olla edustava laaja taudin SCLC ja siihen liittyvän huumeiden heikkoudet. Tältä osin kaksi kattavaa huumeiden seulonta tutkimusten äskettäin julkaistu

Nature of the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) [10] sekä Cancer Genome Project (CGP) [11], tutkittiin huumeiden herkkyys syöpään solulinjoja, mukaan lukien keuhko-, ja yrittäneet yhdistää nämä genomisen profiileja. Genominen profiilit sisältyvät DNA mutaatiostatuksesta riippumatta, geenien ilmentyminen ja kopioluvun vaihtelu (CNV) tiedot.

Tässä tutkimuksessa olemme nimenomaan uutettu tiedot SCLC solulinjoissa Näistä tutkimuksista ja hahmotella bioinformatiikan lähestymistapa tunnistaa uusia hoitomuotoja SCLC käyttäen polo kaltainen kinaasi (PLK) estäjiä esimerkkinä.

tulokset

Aluksi etsimme yleiskuva SCLC lääkeaineen herkkyys CCLE [10] ja CGP [11 ] tutkimukset. Oli 53 ja 31 SCLC solulinjat testattiin kasvun esto 24 ja 92 huumeiden näissä tutkimuksissa vastaavasti. Tulokset on esitetty kuvioissa 1 (CGP) ja S1 (CCLE), kuten boxplots. Taulukko Numeerisen datan lääkkeen tehokkuus, sekä harha solulinjoja, on myös esitetty taulukoissa S1 (CGP) ja S2 (CCLE). Tämä graafinen analyysi pystyimme tunnistamaan lääkkeitä, jotka olivat jokseenkin tehoaa useimpiin SCLC soluja. Me määritelty ”tehokas” huumeiden kuin ne, jotka aiheuttavat kasvun estäminen useimmissa soluissa pienillä annoksilla (mediaani IC

50≤1 uM), jota edustaa paklitakseli. ”Tehoton” huumeita, edustaa erlotinibi ja sunitinibi, ei tuottanut kasvun estäminen useimmissa SCLC soluissa (IC

50≥8 uM), vaikka ”harha” saattaa olla läsnä. ”Valikoiva” huumeita, edustaa rapamysiini, osoitti pitkä boxplot ja voidaan pitää voimassa vain osan SCLC solulinjoissa.

on 31 solulinjoja pienisoluinen keuhkosyöpä. Boxplots osoittavat huumeiden listattu x-akselilla ja vastaava IC

50-arvot (uM) listattu y-akselilla. The ’katto’ lääkeaineiden tehoon asetettiin 8 uM; jos IC

50 kaikkien testattujen solujen oli yli tämä keskittyminen riviäkään näyttäisi yläosassa kuvaajan. Tämä merkitsee tehoton lääke. Sen sijaan, jos kaikki testattu solut olivat herkkiä tietyn lääkkeen, kapea laatikko ja hiuksenhienosti juoni näyttäisi alareunassa kaavion. Rivi yksittäisten laatikoiden edustaa mediaani IC

50 arvo kaikkien testattujen solujen ja ympyrät edustavat ”harha” soluja, joiden IC

50-arvot eivät kuulu 25-75% kvantiili kaikista IC

50 mitatuista arvoista, että huumeiden (edustaa laatikko).

kuten taulukosta 1, lääkkeet luokitellaan ”tehokas” useimmille SCLC soluja ovat CGP-60474, CDK-estäjä; BI-2536 ja GW-843682X sekä PLK-inhibiittorit; bortetsomibi, proteasomin estäjä; ja elesclomol, Hsp70-estäjä. Lisäksi useat lääkkeet kohdistuvat PI3K-AKT-mTOR-reitin kuuluvat tähän ryhmään, mukaan lukien A-443654, temsirolimuusia ja NVP-BEZ235. Kaksi lääkkeet mediaani IC

50 aivan 1 uM kuuluvat AZD-7762, joka on CHK estäjä; ja JW-7-52-1, joka on mTOR-estäjä. HSP90 (17-AAG) ja HDAC (panobinostat) estäjät saattavat myös edustaa ”tehokas” huumeita, vaikka niiden tehokkuus vaihteli kahdessa tutkimuksessa. ”Tehokas” lääkitystä kuljettaa paras translaation potentiaalia.

Gene joukko tietoja on käytetty laajasti syöpätutkimuksessa tunnistaa ilmaisua ”allekirjoitukset”, jotka voivat olla joko prognostisia tai ennakoivaa kasvaimen käyttäytymisen. Siksi tutkimme jos geeniekspressiota klustereiden voitaisiin käyttää tunnistamaan alaryhmiä huumeisiin herkkien SCLC solulinjat, erityisesti lääkkeitä, jotka osoittivat laajaa teho valikoiman vastaan ​​SCLC-solujen kuvassa 1. Käytimme tietoja CGP tutkimuksessa, koska se sisälsi suurimman lääkeaineen määrästä arkaluonteisuuden data. Valvomaton yksimielisyys klusterointi geenien ilmentymisen tulokset osoittivat, että kolme klustereita SCLC solut olivat optimaalisia (kuva 2). Oli 1006 merkittäviä geenejä, jotka määritellään geenin ilmentymisen alatyyppeihin (Kruskal-Wallisin testi p-arvo 0,05, lueteltu taulukossa S3. Sitten visualisoida vaikutus geenien ilmentymisen ryhmittely lääkkeen tehosta käyttäen mosaiikki juoni (kuva 3). In tontille käytimme väriskaalan joka jakautuu huumeiden herkkyys kuuteen ryhmään. Drugs, listattu y-akselilla, ryhmiteltiin mukainen kohdemolekyyleihin. Solut, listattu x-akselilla, ryhmiteltiin käyttäen samaa luokkaa kuin saadut mukaan ilman valvontaa ryhmittely niiden geenien ilmentymisen. Asiaan ei näytä olevan mitään korrelaatiota huumeiden herkkyys geeniekspression klustereiden kuitenkin huumeiden herkkyys näytti sattumanvaraisesti jakautunut kaikkien solulinjojen tahansa lääkettä. Tämä graafinen analyysi teki esiin useita kohdennettuja aineet poikkeuksellisen laaja-alainen teho vastaan ​​SCLC solulinjoja. Nämä lääkkeet mukana bortetsomibin, BI-2536 ja GW-843682X, sekä HSP estäjä elesclomol ja CDK-estäjä CGP-60474, vaikkakin alhaisempi teho. Nämä lääkkeet ovat samat kuin taulukosta 1.

valvomaton konsensus klusterointi suoritettiin käyttäen kaikki 31 solulinjoja (vain 27 oli geeniekspression tietoja, 3 niistä ovat päällekkäisiä, ja keskimääräiset arvot saatiin lisäanalyysiä ) ja osoittivat, että 3 klustereita oli optimaalinen tätä aineisto. Tämän tehtävän, epäparametrinen yksisuuntainen ANOVA (Kruskal-Wallisin testi p-arvo 0,05) suoritettiin näitä 3 klustereihin ja 1006 merkittäviä geenejä saatiin. Heatmap tuotettiin näiden merkittävien geenien.

Drug herkkyys oli värikoodattu legendan mukaan alareunassa. Lääkkeet on ryhmitelty pitkin y-akselin mukaan niiden kohdemolekyyliin. Solut on järjestetty pitkin x-akselia identtinen niiden geenien ilmentymistä klusterointi tunnistetaan kuviossa 2.

seuraavan määritetään, onko CNV klusterointi voitaisiin käyttää tunnistamaan alaryhmiä lääkkeen herkkien SCLC-solulinjat. Kolme klustereita jälleen tunnistettiin käyttäen kaikkia 426 kuulusteltiin geenit (kuva 4); mutta siellä ei näytä olevan mitään korrelaatiota geenien ilmentymisen ja CNV klusterointi. Uudelleenjärjestely mosaiikki tontin kuviossa 3 CNV klusterointia ei myöskään tullut esiin korrelaatiota (kuva S2). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että lääke-herkkien SCLC solut eivät klusterin alaryhmiin joko geenin ilmentymisen tai CNV. Tämän vuoksi päätimme käyttää farmakogenomiset lähestymistapaa luonnehtia alaryhmiä SCLC-solujen.

valvomaton konsensus klustereiden suoritettiin käyttäen kaikki 30 solulinjoissa 426 geenin kopio numeroita, ja 3 klustereita osoitettiin olevan optimaalinen tietoaineiston. Kaikki nämä 426-geenejä käytettiin generoimaan lämpökartta. CNV data uudelleen koodattu mukaan seuraavan säännön: 0-täydellinen menetys; 1-osan menetys; 2-ei muutosta; 3~7-osittainen voitto; suurempi tai yhtä suuri kuin 8-täydellinen voitto.

analyysien tunnistaa PLK esto on lupaavia tehoa ja vähän kliinisen tutkimuksen toimintaa SCLC. Siksi käytimme PLK esto esimerkkinä, miten käyttää CGP aineistoja kehittää genomista profiilia SCLC huumeiden herkkyys. Ensin pyrki vahvistamaan tehoa PLK estäjien SCLC. Näissä validointi kokeita käytimme SCLC solulinjoissa sekä estäjiä, jotka olivat erilaisia ​​kuin alkuperäisessä tutkimuksessa korostamaan tehoa näiden uusien terapeuttisten aineiden kanssa. SCLC solulinjoja käytettiin H1048, H1688, SW1271 ja DMS454. PLK estäjät mukana BI-6727 (volasertib) ja ON-01910 (rigosertib). Näissä kokeissa irinotekaanin toimi positiivisena kontrollina, kun taas erlotinibin toimi negatiivisena kontrollina. Tulokset on esitetty kuviossa 5. On selvää, että IC

50-arvot PLK-inhibiittorit useimmissa solulinjoissa on välillä 10-100 nM, tukee hypoteesia, että SCLC solut ovat yleisesti herkkiä PLK-inhibiittorit.

Adherentit soluja inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla lääkkeitä 24 tuntia. Soluviljelmän elatusaine korvattiin ja solujen elinkelpoisuus mitattiin DNA-määrityksellä sen jälkeen, kun 48 tunnin inkuboinnin jälkeen. Kukin lääkepitoisuus analysoitiin käyttämällä viisi rinnakkaista. Tulokset edustavat vähintään 2 kokeita.

Aluksi pyrimme tunnistamaan geenin allekirjoitus, joka voisi ennustaa herkkyyttä PLK estäjien potilasaineistoihin, koska kaikki SCLC-solujen osoitettiin vastaava herkkyys. Vertasimme geeniekspression data viiden herkimpien SCLC-solujen (H82, H446, H526, COR L88, IST SL1) kanssa viiden vähiten herkkä SCLC solulinjoissa (DMS114, H64, DMS79, H2171, IST SL2); kuten määritelty CGP niiden BI-2536 IC

50-arvot. Olemme tunnistaneet listan 185 geeniä, jotka olivat merkittävästi ilmentyvät eri näiden kahden ryhmän (lueteltu taulukossa S4). Nämä 185-geenejä käytettiin suorittamaan ilman valvontaa ryhmittely kaikkien SCLC solulinjoissa, jolloin heatmap kuviossa 6. On huomattava, että viisi vähiten (vihreä top box) ja useimmat (punainen top box) herkkiä solulinjoja ryhmittyneet vastakkaisissa päissä heatmap kun taas kaikki muut solut (keltainen laatikot osoittavat väli herkkyys harmaa kenttä osoittaa tuntematon herkkyys) ryhmittyneet keskellä. Me seuraavaksi suoritetaan leave-one-out analyysi PLK geenin allekirjoituksen kanssa 26 käytettävissä solulinjat. Tämän analyysin muodostimme 26 lämpökarttoja, jossa kussakin lämpökarttaraporteiksi herkkä ja resistentit solut pysyivät ryhmitelty yhteen paitsi kolmessa lämpökarttoja; jossa yksi tai kaksi herkkiä solulinjoja luokiteltu väärin. Resistentit solut aina ryhmitelty yhteen. Siksi uskomme, että tämä PLK geeni allekirjoitus on vankka luokittelua herkkiä tai resistenttejä SCLC solulinjoissa.

Viiden SCLC solulinjat osoittavat eniten (H2171, H64, IST-SL2, DMS-114, DMS-79 ) ja vähiten (IST-SL1, COR-L88, H526, H446, H82) resistenssi PLK estäjä BI-2536 on CGP tutkimuksessa käytettiin standardeja tunnistamaan geenin allekirjoituksen PLK herkkyys. Kaikki SCLC solulinjojen CGP tutkimuksessa, joka sisälsi geenin ilmentyminen tietoja alistettiin sitten ilman valvontaa klustereiden. Heatmap esittää tämän analyysin. Värillinen laatikot yläreunassa heatmap osoittavat CGP BI-2536 herkkyys. Vihreä = kestävä solu, punainen = herkkiä soluja, keltainen = solu välituotteiden, mutta tiedetään, herkkyys, harmaa = solu testaamattomia herkkyys mutta geenien ilmentyminen tietoja.

vahvistaa, että PLK geeni allekirjoitus tekee itse asiassa ennustaa herkkyys PLK estäjiä, määritimme tehoa PLK estäjä BI-6727 solulinjassa, H1092, joka oli geenien ilmentyminen tietoja, mutta ei PLK herkkyys tietoja CGP tutkimuksessa edustaa harmaa ruutuun yläosassa kuviossa 6. Kuten valvontaa, käytimme yksi resistentti solulinja, DMS79 (vihreän laatikon), ja kaksi herkkä solulinjoista, H82 ja H526 (punaiset laatikot). Nämä solut valittiin, koska ne kaikki kasvoivat suspensiossa ja voivat joutua samanlaisia ​​lääkehoidon protokollia. Tulokset, esitetty kuviossa 7, osoittaa, että H82 ja H526-solut olivat herkkiä PLK estäjä BI-6727 ottaa DMS79-solut eivät, samanlaisia ​​tuloksia on raportoitu BI-2536. Lisäksi se osoittaa, että H1092-solut, joissa ei tunneta PLK herkkyys, olivat enimmäkseen resistenttejä BI-6727, kuten DMS79 soluja, kuten on ennustettu, että heatmap.

Suspension soluja jatkuvasti inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla lääkkeitä 72 h, kun solujen elinkyky mitattiin MTS-määrityksellä. Kukin lääkepitoisuus analysoitiin käyttämällä viisi rinnakkaista. Tulokset edustavat 2 kokeita.

Se oli kiinnostavaa määrittää, onko PLK geeni allekirjoitus oli läsnä potilaan kasvaimissa ja voitaisiin mahdollisesti käyttää ennustamaan kasvaimen herkkyys PLK estäjiä. Suurin tutkimus SCLC kasvain geenin ilmentyminen on, että Rudin et al. [8], joka analysoi 30 ensisijainen kasvaimia RNAseq. Siksi uutetaan laskenta tiedot 185 koettimet läsnä meidän PLK allekirjoitus (joka edustaa 173 geenit; vain 169 geenien havaittiin ja käytettiin päässä Rudin aineisto) ja vakio normalisoitu luoda korvike PLK geeniekspressiota paneelit näistä kasvaimista. Tämä normalisoitu data alistettiin sitten valvomatta klustereiden tuottaa heatmap kuvassa 8. Olemme myös tähän analyysissä H82 SCLC solulinja, joka oli RNAseq tietoja Rudin -tutkimukseen ja myös vahvistanut meille kuviossa 7 olevan herkkiä PLK estäjä BI-6727. Tulokset osoittavat kaksi tärkeää seikkaa: ensinnäkin, alatyypeistä SCLC kasvaimia voidaan tunnistaa käyttämällä PLK geeniä allekirjoitus, ja toiseksi, H82 solulinja tiedot ryhmittyneet keskuudessa osajoukko kahdeksan ensisijaisen kasvaimia. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että PLK-geenin allekirjoitus generoidaan käyttäen SCLC solulinja tiedot voivat olla hyödyllisiä ennustettaessa herkkyydestä kasvaimia PLK-inhibiittorit.

RNAseq tiedot Rudin et ai. [8] muutettiin laskea tietoja. Tiedot geenit, jotka kuuluivat PLK geenien ilmentymisen allekirjoitus poimittiin ja käytettiin ilman valvontaa konsensus klusterointi SCLC kasvaimia ja H82 solulinjassa. Punaisia ​​laatikko yläosassa heatmap ilmaisee sijainnin H82 solulinjan, joka oli CGP solulinja todennettu PLK herkkä.

Lopuksi käytimme circos tonttien [12], on esitetty kondensoituu kuvassa 9 ja täyden näkymän kuvassa S3, visualisoida genominen erot SCLC solulinjojen herkkiä ja vastustuskykyisiä PLK estäjä BI-2536. Merkillistä, circos tonttien osoitettava, että kaikki resistenttien solujen hallussaan nonsense tai lukukehysmutaatioita joko

TP53

tai

RB1 ​​

, ja joskus molemmat geenit, kun taas kaikki herkät solut näkyvät mutaatioita tuntemattoman proteiinin merkitys (introni ja missense), tyypillisesti vain yksi näistä geeneistä. Yhtä lukuun geenin mutaatioista oli homotsygoottinen, mikä osoittaa, että resistenttien solujen todennäköisesti ei ole toiminnallista RB1 tai TP53 proteiinia. Kaikki herkät solut näyttämään

MYC

(H82, H446),

MYCN

(H526, IST SL1) tai

MYCL

(CORL88) vahvistus, kun taas vain yksi resistentti solulinja näytöt

MYC

vahvistus (H2171). Siellä näyttää myös olevan vähän tai ei lainkaan uudissuonittumista X-kromosomissa herkkien solujen suhteessa resistentit solut, jotka tyypillisesti näyttää joitakin CNV menetys. Geenit kromosomissa 13 yleensä yläreguloituja PLK herkkien solujen ja vaimentua in PLK resistentit solut, kun taas geenit sijaitsevat kromosomissa 19. yleensä vaimentua in PLK herkkien solujen ja yläreguloituja PLK resistentit solut. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että geenin ilmentymistä, CNV ja mutaatiostatuksesta riippumatta voivat kaikki osaltaan herkkyyttä SCLC solujen PLK esto.

Circos tontit esitetään (vasemmalta oikealle, listattuihin järjestyksessä) viiden eniten herkkä (H82, H446, H526, COR-L88, IST-SL1) ja useimmat kestävät (DMS-114, H64, DMS-79, H2171, IST-SL2) SCLC-solujen BI-2536 kasvun estäminen, kuten määritelty CGP tutkimus. Ulompi musta rengas tarkoittaa kromosomin sijainti; seuraava sisärengas osoittaa ilmentymisen tason PLK allekirjoituksen geenien; ja sisempi kaikkein rengas osoittaa CNV. CNV data uudelleen koodattu mukaan seuraavan säännön: 0 täydellinen menetys; 1 osittainen menetys; 2 ei muutosta; 3~7 osittainen voitto; suurempi tai yhtä suuri kuin 8 täydellinen voitto. Keskiössä on mutaatio asema geenien (avoin kolmio: introni SNP, musta ympyrä: missensemutaatio SNP, musta neliö: hölynpölyä SNP, punainen kolmio: runko-shift lisäys, vihreä kolmio: runko-shift poistetaan). Kaikki mutaatiot olivat homotsygoottisia paitsi runko-shift lisäys.

Keskustelu

pienisoluinen keuhkosyöpä on sairaus kiireesti uusia lääkehoitoja. Valitettavasti rajallinen saatavuus kasvainkudoksen estää hankinnan täydellisen genomisen analyysejä tarvitaan tunnistamista ja tunnustamista uusien lääkekykyprofiili tavoitteita tämä syöpä. Siten vaihtoehtoiset lääkekehityksen strategioita on kehitettävä vasta ymmärrystämme genomiikan ajo SCLC voi alkaa lähentää että NSCLC, joka hyötyy laajat analyysit suuret ikäluokat potilaan kasvaimia, kuten The Cancer Genome Atlas (TCGA).

tässä raportissa olemme ottaneet bioinformatiikan lähestymistapa lääkekehityksen varten SCLC by data mining kaksi suurta lääkeseulontamenetelmä tutkimukset viljellyissä solulinjoissa CCLE [10] ja CGP [11]. Mallina järjestelmä, SCLC solulinjat säilyttävät geenimutaatio profiileja (COSMIC) ja kopioi numero muuttuu [13], [14] samankaltainen kuin ihmisen SCLC. Siksi olemme uutettu ja analysoitu tietokokonaisuuksien SCLC solulinjojen tunnistamiseksi lääkeherkkyyksiä erityisesti tätä tautia, koska tämä ei ollut tarkoituksena alkuperäisen tutkimuksista, joka oli yhdistää dataa lukuisista solulinjojen tunnistamiseksi genomista tekijöitä huumeiden herkkyys. Havaitsimme polo kaltaisia ​​kinaasien houkuttelevina molekyylikohteista vähän nykyisen kliinisen tutkimuksen kokemusta SCLC. Kasvun esto PLK inhibiittorit vahvistivat tutkimuksessamme, käsitellään huolenaiheet tuoreessa raportissa noin epäjohdonmukaisuus huumeiden vastetiedot suurissa lääkeseulontamenetelmä tutkimuksissa [15]. Translationaalinen potentiaalia PLK estäjien hoidossa SCLC tukee meidän osoitus siitä, että lääke herkkyys profiilia SCLC solulinjojen heijastaa havaitaan kliinisesti metastasoineeseen SCLC kasvainten [16]. Eli useimmat solut olivat erittäin herkkiä topoisomeraasin ja mikrotubulusten estäjiä, kemoterapia-aineiden, joilla on aktiivisuutta kemiallis-naiivi SCLC; Sen sijaan monet tyrosiinikinaasiestäjiksi olivat tehottomia.

CGP Tutkimuksessa tunnistettiin myös lääkeherkkyyksiä että yleensä klusterin kaikissa solulinjoissa (ks Supplement taulukko 1 viite 11) ja lääke herkkyys profiilin SCLC-solujen, kuten taulukossa 1 on esitetty, on hyvin samanlainen kuin klusterin 4 CGP tutkimuksen [klusteri 4 = GW-843682X (PLK1), BI-2536 (PLK1 /2/3), A-443654 (AKT1 /2/3), epotiloni B (mikrotubuluksia), CGP-60474 (CDK1 /2/5/7/9), paklitakselin (mikrotubuluksia) ja MS-275 (HDAC)]. Vaikka on epäselvää, jos nämä huumeiden klusterit osoittavat yhteinen suunnattu polku (t), joka johtaa kasvun estäminen, nämä klusterit voivat tarjota käytännöllinen lähtökohta testata kombinatorisista lääkehoitoa synergististä aktiivisuutta SCLC. Todellakin, meidän omat alustavat tiedot osoittavat synergian PLK ja CDK-inhibiittorit.

Olemme kehittäneet pitkälle integroitu analyysi PLK herkkyyden SCLC solulinjoissa, graafisesti kuviossa 9 circos tontteja, joka sisältää geenin ilmentymistä, CNV ja geenimutaatio tiedot. Analyysi tämän syvyyden ei ole koskaan aiemmin sovellettu SCLC, ja osoittaa, mitä voidaan saavuttaa kyselemällä yhden solun linjaa ja huumeiden luokkansa CCLE ja CGP aineistoja. Lisäksi meidän havainto, että PLK geeni allekirjoituksen SCLC solulinjoissa hajautumista SCLC tuumorinäytesylinterin ekspressioprofiileja (kuva 8) osoittaa selvästi, että nämä solut säilyttävät kasvain fenotyyppejä. Ominaisuuksia circos tonttien kuten kaksinkertainen mutaatio molempien

TP53

ja

RB1 ​​

vuonna PLK resistentit solut, sekä vastavuoroinen ilmaus PLK allekirjoituksen geenien kromosomien 13 ja 19, ovat helposti ilmeinen ja on tutkittava suurempia ikäluokat määrittää niiden yksittäisten edistävät yleisiä PLK estäjä herkkyys. Yhdessä tämän tyyppinen analyysi voi auttaa tunnistamaan alkupään genomista tapahtumia, jotka korreloivat loppupään fenotyypit kuten PLK herkkyys.

Se raportoi äskettäin, että mutaatiot

PLK1

itse geenin olivat ensisijaisesti vastuussa hankittu resistenssi on BI2536 viljellyssä ihmisen paksusuolen syövän solulinja [17]. Tämä tuskin on vastus mekanismin SCLC solulinjoissa koska CCLE mainitaan ainoastaan ​​neljä solulinjoja yhdellä

PLK

mutaatio kaikki neljä PLK perheenjäsenet (PLK1-4) ja 53 SCLC solulinjoissa tutkittiin. Mikään näistä PLK mutatoitujen solulinjat mukana tutkimuksessamme. Meidän PLK geeni allekirjoitusta ei kuitenkaan sisälly geenit kromosomeissa tyypillisesti poistettu (4q, 13q) ja vahvistetaan (19p) in SCLC [9], [13], [14], vaikka meidän circos tonttien paljasta mitään selvää yhteyttä näiden kahden välillä. Mielenkiintoista, kromosomi Xq, jota ei yleensä pidetty tärkeänä alueen CNV vuonna SCLC, oli asuu useita merkittävimmistä differentiaalisesti ilmentyvien geenien, jotka käsittävät PLK geeni signature- kaikki olivat jäseniä MAGE-A, tai melanoma- liittyvä antigeeni-A, subfamily. Tämä alaryhmä geenien sijaitsee kromosomissa Xq28 ja ilmentyy vain kiveksissä itusolut ja kasvainsoluissa [18]. Vaikka niiden biologinen toiminto on epäselvä, ne ovat luokka kasvaimen antigeenejä, joita aktiivisesti tutkitaan immunoterapian kohteena [19], [20]. MAGE-A-geenit yläreguloituja PLK herkkien solulinjojen suhteessa PLK erottelua solulinjoissa. Lisäksi nämä ilmaisu kuviot voivat korreloida CNV, kuten herkkien solujen osoitettiin vähän CNV X-kromosomissa, kun taas useimmat resistentit solut osoittivat joitakin CNV menetys. Testaamme parhaillaan tärkeyttä tämän geeniperheen biomarkkerina on PLK herkkyys.

aikana tutkimuksemme raportin Sos et al. [21] julkaistiin PNAS että nimenomaan tutkia vain SCLC solulinjoja (44 yhteensä) lääkeaineen herkkyys. Niistä 267 yhdisteet testattiin tässä tutkimuksessa vain 13 tutkittiin myös vuonna CCLE ja /tai CGP tutkimuksia. Mielenkiintoista on, että kun Sos et ai. etsinyt huumeiden herkkyys erityisesti

MYC

-amplified solulinjoja, he myös löysivät PLK estäjä BI-2536 on aktiivinen, samanlainen kuin meidän tuloksia, mutta ei jatkanut sitä edelleen. He osoittivat myös, että suurin osa soluista herkkiä Aurora-kinaasi-inhibiittori VX-680 osoitti

MYC

-amplification. Mielenkiintoista, CGP myös kaksi Aurora estäjät (VX-680 ja ZM-447439) tutkimuksessaan; kuitenkin, se ei löytänyt mitään merkittävää klusterointi PLK Aurora estäjät, mikä osoittaa mitään yhteyttä näiden kahden luokkaa estäjien kun analysoidaan väestössä syövän solulinjoista.

Tässä tutkimuksessa olemme johdonmukaisesti tunnistettu kolme alatyyppiä SCLC solulinjojen avulla ilman valvontaa kasautumiseen joko geenin ilmentymisen tai CNV aineistoja päässä CGP tai CCLE (kuva S4 ja taulukko S3) tutkimukset. Merkillistä, ei ollut juurikaan vastaavuutta näiden kahden analyysin paitsi että suuri enemmistö soluista ryhmittyneet yhteen hallitseva alatyyppi, kun taas loput solut jakautuvat epätasaisesti kaksi pientä alatyyppiä. Geenien ilmentyminen ja CNV alatyyppejä ei myöskään osu huumeiden herkkyys yleensä (katso kuviot 3 ja S2) tai PLK herkkyys erityisesti. Tämä viittaa siihen, että kattava genomiikka lähestymistapaa, kuten circos käyräanalyysillä, vaaditaan kriittisesti tekijöitä huumeiden herkkyys ja muita fenotyyppejä SCLC. Tämä integroitu lähestymistapa voi auttaa valitsemaan SCLC potilaat, jotka hyötyisivät eniten monoterapiana huumeiden kuten HDAC [22] ja PLK [23] estäjiä, jotka laajasti katsoen tehokasta kaikkialla SCLC solulinjoissa mutta osoittavat rajoitettu toiminta kliinisissä tutkimuksissa.

Muita ainutlaatuisia lähestymistapoja on toteutettu tunnistaa uusia ja tehokkaita hoitoja SCLC. Jahchan et ai. tunnistettu yllättävä herkkyys SCLC solujen trisyklisiä masennuslääkkeitä huume uudelleenasemointiin tutkimus, jota käytetään bioinformatiikan löytää lääkkeitä, jotka indusoi muutoksia geenien ilmentyminen vastakkainen geeniekspressioprofiili SCLC-solujen [24]. Käänteisfaasi-proteiinijärjestelmiä (RPPA) käytettiin tunnistamaan PARP1 ja EZH2 mahdollisina terapeuttisina tavoitteet SCLC [25]. Loppujen lopuksi on tarpeen paljastaa taustalla biologiaa SCLC jos toivomme tehdä parannuksia tämän sairauden hoitoa samanlainen NSCLC. Valitettavasti vain noin viisikymmentä SCLC kasvaimet ovat läpikäyneet kattavan genomisen analyysin älypuhelimiin enemmistön ollessa ensisijainen, varhaisen vaiheen tauti [8], [9]. Siksi välitön terapeuttinen edistyminen tällä alalla riippuu löytö mallissa järjestelmissä, kuten yhden kuvattu tässä, jonka jälkeen validointi potilasaineistoihin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja kasvun estäminen tutkimukset

Kaikki solut hankittiin ATCC kasvatettiin suositellussa alustassa. Solujen lisääntyminen määritettiin kvantitatiivisesti fluoresoivat DNA-määritys [26] varten tarttuvat solut tai MTS-määritys käyttämällä CellTiter 96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay Kit Promega Corp. (Fitchburg, WI) suspensiosoluille. Solut lisättiin 96-kuoppaisen levyn 100 pl täydellistä alustaa. Lääkettä, joka sisältää alustaa lisättiin ilmoitettuina pitoisuuksina yhden päivän kuluttua kylvö. Irinotekaani saatiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), kun taas kaikki muut lääkkeet saatiin Selleck Chemicals (Houston, TX). Inkubaation jälkeen kolme päivää 37 ° C: ssa, määritys suoritettiin seuraten valmistajan ohjeita. Jotta DNA-määritys, fluoresenssi mitattiin 355/460 nm: n virityksellä /emissiosuodattimia kun absorbanssi MTS määrityksessä mitattiin 490 nm: ssä. Molemmissa määrityksissä mitattiin 96-kuoppaisella levylukijalla. Kukin koetilalle analysoitiin käyttämällä viisi rinnakkaista. Lääkettä, joka sisältää väliaine poistettiin tarttuneet solut sen jälkeen, kun 24 tunnin inkuboinnin ja korvattiin 100 ul: lla täydellistä alustaa, kun taas suspension solut kasvatettiin jatkuvassa lääkkeen läsnä ollessa 72 tuntia.

Aineistot

käyttäjän julkiset CCLE ja CGP huumeiden herkkyys (IC

50), geenien ilmentyminen, CNV, ja mutaatio data on ladattu https://broadinstitute.org/ccle (CCLE) ja https://cancerrxgene.org (CGP) [10], [11]. RNAseq saatujen tietojen tutkimuksessa Rudin et al. [8] ladata Euroopan Genome tietokantaan. Kaikki tiedot manipulointi ja tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SAS versiossa 9,3 (SAS Institute Inc., Cary, NC) tai R 2.15.3 (https://www.r-project.org/).

IC

50 data-analyysi

SCLC vain, 24 huumeiden ja 53 solulinjoja mukana CCLE, kun taas 92 huumeita ja 31 solulinjoja mukana CGP. Kaikki IC

50 yli 8 uM CGP olivat kynnystetty 8 uM. Boxplots vedettiin IC

50 kahdesta aineistot vastaavasti käyttämällä R (https://www.r-project.org/). Mosaic tontteja piirretään proc sgrender SAS versiossa 9,3 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

Geenien ilmentyminen analysointi

normalisointi geenien ilmentyminen tietojen (Affymetrix U133 Plus 2.0 CCLE , Affymetrix U133A varten CGP) mukana neljä vaihetta: 1) raakadataa normalisoitiin kautta vankka multi-array keskiarvo (RMA) menetelmä; 2) luotaa ilman geenin nimi poistettiin; 3) geeni aineistolla saatiin laskemalla keskiarvo koetin arvo kussakin geenissä ja 4) geeni tason tietojen Sitten standardin normalisoitu geenin. Sillä geenien ilmentyminen tietojen CCLE mukana 51 solulinjoissa, kun taas CGP mukana 30 solulinjat, joista kolme solulinjoissa oli päällekkäisiä mittauksia. Keskiarvon kaksoiskappaleet osuus 27 ainutlaatuinen solulinjoja varten CGP. Valvomatta konsensus ryhmittely suoritettiin normalisoitu geenin tasolla datan R paketti ”konsensus Cluster Plus”;